CN1225006A - 含有六亚甲基四胺或其衍生物的隔离霜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及皮肤用防护剂,特别涉及能防止有毒化学品在皮肤中渗透的外部用组合物,如隔离霜。制剂中可包含能与烷基化试剂如硫芥子气反应的六亚甲基四胺或其衍生物或类似物,并且它们适于配制成外用组合物。该制剂中还可包含全氟化聚合物,对于一定范围的有毒化学品,它是有效的隔离化合物。

Description

说明书 含有六亚甲基四胺或其衍生物的隔离霜

本发明涉及护肤剂，具体涉及能防止有毒化学品在皮肤中渗透的外部用组合物，例如隔离霜。

人们在许多场合会接触到具有一定毒性，并会渗入皮肤的化学品或化学试剂。时常需要或要求皮肤尽可能不与这些化学品接触。

例如，许多挥发性农药对其施用者存在潜在危害。这些农药的实例包括挥发性杀虫剂，特别有机含磷杀虫剂，如异丙胺磷或避蚊胺。在其它工业操作中，与化学溶剂如丙酮、氯仿、甲醇、己烷、苯和甲苯接触的工人也需要进行防护。

化学战中会采用能渗入皮肤的高毒性挥发性化学品。其中包括沙林毒气、索曼(甲氟磷酸异己酯)和塔崩(二甲氨基氰磷酸乙酯)以及含硫芥子气和路易斯毒气。

硫芥子气(SM)是用于化学战的糜烂性毒气。它是一种强力烷基化试剂，一般认为由于其能令活细胞成分烷基化而对活体组织有毒(FoxM.和Scott M.Mut.Res(1980)75,131-168)。发现硫芥子气能令DNA、RNA和蛋白质烷基化(Paprimeister B.等人，(1991)《对芥子气的医学防护》(CRC出版社)91-122)，而细胞成分的烷基化和糜烂作用之间的因果关系仍有待证实。

虽然认为可通过面罩、炭防护服、手套形式的防护层防护这些化学毒气，但这些手段并非在所有情况下都有效。采用隔离霜能增进防护服中炭层的作用，并且在含化学毒气的环境下，需要用手灵活性地执行任务时，能在短时间内不戴手套。

常规的隔离霜是在皮肤和周围环境之间形成被动隔离层，它能防止化学品向皮肤的常规渗入。膏霜基质由水包油型或油包水型乳化体构成(Barry B.W(1983)Drugs Pharmaceutical Sci 18 296-350)。油包水型乳化体不适用于隔离霜，因为留在皮肤上的油层会令皮肤缺乏触觉。仅用水包油型膏霜时，需要在皮肤上涂敷和存留的涂层厚度要大于0.56毫米才有效。而更现代的基于聚硅氧烷衍生物的膏霜只要涂敷极薄层就能对常规化学品对皮肤的渗透提供有效防护(EP-A-0401840、日本专利申请57-266110)。

在膏霜中加入能与特定的靶化学基团反应的活性化合物，可以使被动隔离霜转变为主动隔离霜，它能令有毒化学品的特定基团在到达皮肤生命层之前就发生多价螯合并失活。

已经对能在硫芥子气与细胞结构接触之前就令其失活的活性分子的用途进行了研究。在PCT GB91/01462和GB90148994.5中已经公开了一系列含硫羟基的化合物用以进入活细胞并对活性化合物如硫芥子气加以防护。

已知增高谷胱甘肽(GSH)和GSH合成酶(Evans等人，CancerRes.472525-2530,Ahmed S.等人，J.Biol.Chem.26215048-15053,以及Ahmed S.等人，J.Cellular Physiol.131,240-246)水平能使细胞培养物对氮芥子气具有抵抗力。在尝试细胞培养物针对硫芥子气进行防护的在先研究中，Gross C.L.和Smith N.J.(Proc.1993 Med.Def.Bioscience Rev.(US Army Medical Research and DevelopmentCommand)1 141-147)发现，用10mM L-氧噻唑烷-4-羧酸酯预处理人体淋巴细胞48小时，然后与10μM硫芥子气接触，经48小时后的存活率比仅经硫芥子气处理的细胞的存活率高20％。其它尝试保护人淋巴细胞培养物的方法(Gross等人，Cell Biology andToxicology(1993)9 259-268)，是采用N-乙酰基半胱氨酸(10mM)增进细胞内GSH水平，之后与硫芥子气接触48小时，与对照培养物相比，存活率进增高15-19％。

角质层是皮肤上的死皮层，起到防止化学品渗入的隔离作用(Tregear R.T.(1996)Theoretical Exp.Biol.5,21-22)。角质层由皮肤表皮层活细胞的死“蛋白形骸细胞”构成，周围是产生表皮细胞的独特皮脂混合物(Wertz等人，(1989)“角质层：生物和生化研究”见《透皮药物释放》1-22页，Hadraft J和Guy R A.编)。

已经有人采用六亚甲基四胺用于家兔和人体对致死量光气的防护(Diller W.F.J.Occ.Med(1978)20 189-193)。

本发明涉及具体用于防护硫芥子气的外部用组合物。本发明具体涉及防护硫芥子气的活性隔离霜。

本发明提供了一种外部用组合物，其中包含六亚甲基四胺或其类似物或衍生物。

六亚甲基四胺具有以下结构(Ⅰ)：

一般认为因为六亚甲基四胺的结构包含四个亲核含氮基团，与鸟嘌呤的7位氮的电子结构相似，与常用的单官能团硫醇配位体相比，它能更有效地中和硫芥子气的双官能团。

适用的六亚甲基四胺类似物是含有能与六亚甲基四胺笼形结构共轭的有机基团的化合物，例如式(Ⅱ)所示的化合物。

其中R¹是有机基团，并且X是阴离子。

下文中用#符号表示六亚甲基四胺基团。

适用的R¹基的实例包括含1-50个碳原子(例如1-32个碳原子)的任意取代的直链或支链的烃链，如烷基链。具体说，烃链可被一个或多个取代基取代或未经取代，取代基选自芳基如苯基和/或卤原子如氟、氯、溴，特别是氟，其中芳基可任意被卤素取代。R¹基具体是氟苄基或(CH₂)_nCH₃基团，其中n为8-20，适宜约为17。

这些化合物的其它实例包括下式所示的化合物：

(#)-CH₂(CH₂)₂₂CH₃

(#)-CH₂(CH₂)₁₄CH₃其中#代表六亚甲基四胺基团。

选择适用的阴离子X，从而使式(Ⅱ)的化合物成为适于药用的盐，特别应适于局部涂敷，例如是卤素离子，如I^-和Br^-。

适用的六亚甲基四胺衍生物由六亚甲基四胺与常用的隔离霜成分(如棕榈酸或硬脂酸)、角质层常规成分(胆甾醇或神经酰胺)或长链脂族大分子共轭而成。适用的长链脂族分子含有16-32个碳原子。适用的具体的脂族分子为含16-32个碳原子的脂肪酸。

式(Ⅱ)的六亚甲基四胺类似物可由六亚甲基四胺与式(Ⅲ)所示的化合物或其盐制备而成：

                     Y-R¹(Ⅲ)其中R¹的定义如式(Ⅱ)，Y是离去基团，此后如必要，可将一种盐转化成不同的盐。

适用的离去基团Y包括卤素如氟、氯或溴，特别是溴，以及甲磺酸盐和甲苯磺酸盐。该反应适于在加热条件下在有机溶剂(例如氯仿、醇如甲醇或乙醇、乙腈)中进行，温度以溶剂的回流温度为宜。

式(Ⅲ)的盐可根据所加入成分的特性而定，可以是易得的任何盐。然后可经离子交换过程将其转化成不同的可药用盐，例如化合物可经本领域常规的离子交换柱进行转化。

适用的组合物还包含膏霜基质。

这些组合物在皮肤细胞结构和外部环境之间形成一层活性隔离层，隔离层位于死皮层，即角质层部位。这是通过在角质层表面涂敷一薄层隔离霜基质，其中的分子与硫芥子气反应并发生螯合而达到的。

该组合物还适于包含其它活性成分，特别是其它亲核清除剂。这类物质之所以适用是由于硫芥子气易于与生物体中多种亲核基团反应。认为其中最重要的是核酸中鸟嘌呤残基的7位氮，以及肽和蛋白质中所含的半胱氨酸的硫羟基。正是硫芥子气对前述生物配位体的亲和力决定了在与硫芥子气接触前采取防护措施的必要性。由于硫芥子气含有双官能团，它能与生物分子发生交联，与鸟嘌呤残基形成DNA交联结构(Papirmeister B等人，《对芥子气的医学防护》(CRC出版社1991)106页)。

适用于本发明组合物的其它优选类反应试剂，包括含有亲核的氮和/或硫原子的化合物，优选含氮的化合物。

含硫亲核化合物的实例包括谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸酯，例如WO 92/04024中所示的化合物。

当将两种不同的亲核(即含硫或含氮)化合物用作细胞外清除剂时，在研究中发现与仪采用一种化合物相比它们具有意外增高的防护作用。因此优选同时含有含氮和含硫亲核化合物。因此该组合物包含六亚甲基四胺或其衍生物或类似物和GSH的混合物。此外，上述的硫醇盐形式的共轭试剂也适用，例如胆甾醇或神经酰胺的硫醇衍生物。

另外，发现采用配位体混合物能增强防护介质对硫芥子气引起的细胞毒性的减低作用，而不会有协同细胞毒性作用。

隔离霜中的小分子会扩散进皮肤内部并被血液吸收，这会造成局部刺激或全身性毒性。因此，在优选实施方案中膏霜中包含不会渗入皮肤的亲油大分子，整个过程中它都会将活性成分留在皮肤表面，或限制在皮肤上表层，直到表皮组织正常循环而脱落。

因此在优选实施方案中，本发明的活性隔离霜的制备如下：制成含有适用的活性成分和亲油大分子的复合物，将所得的复合物加入隔离霜基质中。

本发明的特定实施方案是一种活性隔离霜，其中包含存在于水包油型乳化体膏霜基质中的六亚甲基四胺。

但是，业已发现特别适用于本发明的组合物的载体包括全氟化聚合物。

这种化合物表面能低，从而能防止挥发性化学品在外用组合物和皮肤中扩散。实际上，发现该化合物单独使用时也能作为有效的活性隔离霜。这构成了本发明的另一方面。

适用的全氟化聚合物是式(Ⅳ)所示的化合物：

CF₃O-[CF(CF₃)CF₂O]_n-[CF₂O]_m-CF₃    (Ⅳ)

其中n和m独立地选自4-150,6-140为宜。

适用的式(Ⅳ)化合物呈油性。这类化合物的实例列于下表：

化合物号	n	m
			1	140	13
2	40	11
			3	25	6
4	18	8
			5	6	6
6	25	9
			7	14	6
6	16	6

这些化合物可购自Aldrich Chemical Company(Gillingham,Dorset)，产品以商标名“Fomblin”^TM销售。其它的式(Ⅳ)化合物可由常规方法制备。

与常规的水包油型乳化体相比，全氟化合物能形成显著改善的防护硫芥子气的隔离层，在某些情况下能捕获硫芥子气并增进其渗透速率。

本发明组合物包含大量全氟聚合物，例如包含多至100％(重量)全氟化物。组合物以包含30-100％(重量)全氟化物，优选超过50％(重量)为宜。当采用100％全氟化物时，其中应包含油。

除上述六亚甲基四胺或其类似物或衍生物，所述组合物还可包含其它活性试剂，它们能与化学品反应并与之螯合从而防止化学品与皮肤接触。

组合物中还可包括那些能在硫芥子气等与细胞结构接触之前，就令硫芥子气活性分子失活的化合物。这些化合物包括上述PCTGB91/01462和GB90148994.5或WO 92/04024中公开的化合物。适用于本发明组合物的特定的活性成分是丁二酮钾肟盐。

如前所述，如果含有活性化合物和全氟化合物的话，则活性化合物与全氟化物在上述隔离霜组合物中的重量比优选为5∶95-60∶40w/w，例如10∶90-60∶40w/w，最优选25∶75w/w。

组合物可以是水包油或油包水型乳化体形式。该乳化体中的其它成分包括乳化剂和常用于隔离霜类组合物的油类，如矿物油或硅油。但组合物优选是油剂而非乳液。

本发明组合物优选还包含低分子量的全氟化物如聚四氟乙烯。这些化合物会影响制剂的粘度，使其能具有更有效的隔离作用。这类适用的化合物可购自ICI plc.。这类化合物的分子量为10⁶数量级，粒度约为6微米。

本发明人研究了六亚甲基四胺防护硫芥子气对培养物细胞毒性作用的能力，以及防止硫芥子气渗入离体皮肤试样的能力，以便对将其用于预防硫芥子气引起的皮肤损伤的实用性进行评估。体外实验中，采用玻璃扩散池测定经放射性标记的硫芥子气对人体角质层的渗透作用。

在细胞培养研究中，将猴病毒角化细胞-14(SVK-14是经猴病毒40转化的人体角化细胞系)培养物，用于比较采用含硫和含氮的预防混合物和仅采用一种活性化合物时对硫芥子气的防护作用。已知有丝分裂的活性细胞对DNA烷基化成分如硫芥子气的作用更为敏感(FoxM.&Scott M.等人，Mut.Res.75 131-168)，这是因为交联DNA损伤的形成会阻碍细胞有丝分裂，导致代谢失衡和细胞死亡(Cohen等人，Proc,NY Nat.Acad.Sci40 885-893)。

与上述Gross等人研究中采用静止外周血淋巴细胞相比，本发明研究中使用活性有丝分裂中的角化细胞衍生细胞系进行研究具有几个重要优点：首先，SVK培养物的上皮形态学表明它是硫芥子气致毒重要靶物质(即基础表皮、中间层(broncho-epithelium)和角质层)的更好模型；第二，SVK是附着(attach)的细胞系，可用于研究与硫芥子气接触后细胞内的特定反应；最后，由于SVK培养物具有有丝分裂活性，根据上述原因，它们对硫芥子气更为敏感。

总之，与采用外周血淋巴细胞相比，采用SVK培养物时推测出的预防效果更强。所以，与前述的提高细胞内GSH水平的研究相比，本发明研究中观察到的SVK培养物的防护水平会高得多。

在本发明试验中，对与硫芥子气接触96小时后的预处理培养物的测定表明：与那些直接与硫芥子气接触物相比，经预处理的培养物的存活率显著提高。采用中性红试验(NR)测定培养物的存活率。其中包括对胞内囊泡(如溶菌体)中中性红染料的吸收量的测定，从而能测定出细胞活性和细胞膜完整性。

经4mM谷光甘肽(GSH)/10mM六亚甲基四胺(HMT)预处理的培养物中存活细胞为63.3％，而直接与硫芥子气接触的培养物中存活细胞为33.5％，这在分别对与硫芥子气接触和经预处理培养物进行的显微照相过程(未包括在本发明内)中有所反映。与硫芥子气接触的细胞吸收了染料，但细胞形态学发生剧烈变化(细胞质扩展和溶菌体在肿大的细胞核周围积累)表明这些细胞实际上并非处于存活和增殖状态。与此相比，经预处理的培养物表现出由单层保护层对细胞起防护作用，原生质细胞数目大量减少，而溶菌体在细胞质中扩散更强。

经龙胆紫染色DNA测定细胞数。与空白对照组相比，经4mMGSH/10mM HMT预处理的SVK培养物其细胞生长率并无显著改变，但经预处理的培养物和那些直接与硫芥子气接触的培养物的差别很明显。不仅各时间点有一定保存细胞数目，而且培养物细胞减少率也低，并且经96小时后细胞的最终数量也以和空白对照组差不多的生长速度再生。在72小时间点，单独采用8mM GSH或10mM HMT的效果不及将其共用的效果，单独采用的存活率为19.8％或22.6％，而共用时为29.8％。在72小时，采用16mM GSH的存活率与SM对照组相比增高20.6％(p＜0.001)，而在72小时采用20mM HMT不能改变硫芥子气的毒性(P＞0.05)。与单独较高浓度使用GSH或HMT这两种预防剂之一相比，将其共用能对培养物产生更强的防护作用。

下文也描述了采用玻璃扩散池经体外实验，测定放射性标记的硫芥子气在胶乳薄膜和人体表皮层膜中的渗透作用。

在扩散池体系中，化学品通过膜的扩散(渗透物)，借助化学品本身的载体和膜之间进行分配；然后在膜和受体流体之间分配来进行。当膜两侧渗透物(通常与浓度同义)的热力学活性相等时，该系统处于平衡状态，则受体流体中的渗透量不会再发生变化。

在下文中的某些扩散研究中，由通过以下等式计算出的阻滞指数(RI)来表示各组合物减缓化学品在膜中渗透速率的能力：

RI=J_max(对照组)/J_max(处理组)其中J_max是硫芥子气在对照(未经处理)的和经处理的膜中的最大渗透速率。

当化合物与渗透物在膜表面反应并形成不会渗入膜的产物时，达到平衡的受体流体中渗透物的总量就会降低。在这种情况下，若渗透物以未稀释液体形式应用时，如果产物的存在能降低渗透物的热力学活性，则所测出的其最大渗透速率只会降低。

当采用放射性标记测定渗透物在受体室中的含量时，无法将未反应的渗透物和产物区分开来。因此如果产物也渗入渗透层中，测出的最大扩散速率和渗透总量将会增高。

当将存在于膏霜基质中的活性防护剂涂敷在膜上时，渗透物会分布在膏霜中，然后为进入受体室而渗入膜中。因此渗透物在膏霜中的分布借助改变渗透物在膜中的分配，从而改善渗透速率。活性防护剂对存在于膏霜基质化学环境中的渗透物必需仍具有反应活性。

在下文所述的扩散研究中，在未影响其最大流动速率的情况下仅用HMT预处理的表皮膜中硫芥子气渗透总量的减少，证实了关于HMT与硫芥子气反应形成不能渗入膜的产物的假设。

将HMT与水包油型膏霜基质混合仍能减少渗透总量表明，在该介质中任何反应仍能进行。发现在膏霜基质(如购自Arco Skin CareProducts,Hull的Stokoderm产品)中最大流动速率的减少可能是因为硫芥子气从膏霜基质分配入表皮膜降低的缘故。任何反应产物从膏霜基质中向膜分配的可能性不能忽视，这就解释了含有蜂蜡和Brij52[聚氧乙烯(10)鲸蜡醇醚]的水包油型乳化体中所测定的最大渗透速率的轻微增高现象。

总之，硫芥子气细胞毒性的降低和在HMT存在下其在表皮膜中的渗透作用降低都证明了HMT或其类似物可用作隔离霜的活性组分。

如下文所述，本申请涉及的制剂可使硫芥子气在离体角质层中的渗透速率降低5倍，有时高达45倍，能将渗透总量降低90％。

通过以下实施例说明本发明。这些实施例将参照附图，其中：

图1所示的是：随时间变化，2()、10(■)、50(▲)和250(●)μM硫芥子气对SVK-14培养物存活率(中性红分析)的影响。所示数据为平均值±标准误差(n=8)，由与未处理对照组相比的百分比来表示。

图2所示的是：在将SVK-14培养物与10μM硫芥子气接触之前，用4mM GSH/10mM HMT混合物进行预处理对其存活率的影响。可通过中性红试验测定预处理培养物的存活率()和那些直接与硫芥子气接触的培养物的存活率(▲)。所示数据为平均值±标准误差(n=15)，由与未处理对照组相比的百分比来表示。

图3所示的是：在将SVK-14培养物与10μM硫芥子气接触之前，用4mM GSH/10mM删T混合物进行预处理对其细胞数的影响。可采用龙胆紫试验测定未经处理的对照组(△)、预处理对照培养物()、与硫芥子气接触的预处理培养物()和未经预处理而直接与硫芥子气接触的培养物(▲)的细胞数。所示数据为平均值±标准误差(n=l5)。

图4所示的是：经35S放射性标记过的硫芥子气在人体表皮膜中的渗透作用。各点为平均值±标准误差(n=4或6)；其中9表示对照组-无隔离霜；△表示单独应用HMT，

表示存在于Stokoderm基质中的HMT(HMT∶基质为20∶80w/w)，以及◇为含有聚四氟乙烯(PTFE)的Stokoderm基质中的HMT(HMT∶Stokoderm∶PTFE为20∶50∶30w/w)；

图5所示的是：经35S放射性标记过的硫芥子气在人体表皮膜中的渗透作用。各点为平均值±标准误差(n=4或6)；HMT按30％(重量)的比例与以下各膏霜基质混合：其中9表示对照组一无隔离霜；△表示50％(重量)水、5％(重量)蜂蜡、15％(重量)Brij 52和30％(重量)重质白矿油，

是50％(重量)水、5％(重量)蜂蜡、15％(重量)Brij 52和聚甲基氢硅氧烷，以及■是50％(重量)水、5％(重量)蜂蜡、15％(重量)Brij 52和30％(重量)Dow Corning出品的氟化硅油(氟化硅油300∶氟化硅油10000，1∶1)；可将链长为5-15kD的聚半胱氨酸30％加入以下膏霜基质中，其中◇是含50％(重量)水、5％(重量)蜂蜡、15％(重量)Brij 52和重质白矿油；

图6所示的是全氟化聚合物对硫芥子气渗透速率的减缓作用(以阻滞指数来表示)。“Stoko”是商购的水包油型乳化体构成的Stokoderm隔离霜的缩写，它也用于对照组(阳性对照组)；

图7所示的是3小时后渗入膜的硫芥子气的量，以占对照组量的百分比表示。

图8所示的是在开放环境下经Fomblin-Z-二醇^TM(●)、商购含活性硫醇酯的隔离霜(Stokoderm^TM)预处理，(▲)和未处理的对照组(◆)的人体皮肤中硫芥子气的渗透作用；

图9所示的是在开放环境下经本发明制剂预处理(▲)和未处理的对照组(◆)皮肤中硫芥子气的渗透作用；

图10所示的是放射性标记的硫芥子气在受体室(渗入的硫芥子气)、皮肤、供体室(已反应的硫芥子气)和蒸气中的分布百分比；以及

图11所示的是与放射性标记硫芥子气反应的HMT及其类似物试样的薄层色谱板的放射自显影照片。

实施例1

细胞培养实验

实验采用人体角化细胞培养物特别是SVK-14人体角化细胞。组织培养用塑料器皿可购自J.Bibby Science Products Ltd,Stone,Staffs。SVK细胞生长用培养基包含84％(体积)Dulbecco的改性的Eagle’s培养基(DMEM),16％(体积)胎肠血清(FCS)，其中包含100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺(下文称为SVK培养基)。将培养物保藏在经加湿的空气：二氧化碳之比为95∶5条件下的37℃保温箱。在150cm²烧瓶中令细胞生长并融合，从烧瓶中取出，在37℃下用胰蛋白酶/EDTA溶液(Sigma出品)培养5-10分钟，接种到96孔培养皿中(每孔40000-60000个细胞)，并附着24小时。

将含有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM中的GSH(8mM和16mM)和HMT(10mM和20mM)溶液混合形成下列四种溶液，下文称为防护：

1 4mMGSH,  5mMHMT；

2 4mMGSH,  10mMHMT；

3 8mMGSH,  5mMHMT；

4 8mMGSH,  10mMHMT；如上述制备防护培养基和8mMGSH和10mMHMT单一溶液，使用前经灭菌过滤。

首先通过同4种浓度(2,10,50和250μM)的硫芥子气的剂量应答曲线(最高至72小时处，图1)相比，来评估SVK-14细胞系与硫芥子气接触后的反应。采用中性红(NR)染料的存留量来测定与硫芥子气接触后各时间点的细胞存活率(Griffiths等人，Toxicology(1994)9011-27)。结果以同活对照(未与SM接触)培养物相比的百分比来表示。

可发现硫芥子气对细胞存活率的有害作用随时间和浓度而变化，达到LC₅₀(半致死浓度-将细胞培养物存活率降至对照物的50％时的浓度)所需的时间与所用的硫芥子气的浓度成反比(采用2,10,50和250μM硫芥子气，所需的时间分别为47、35、15和8小时)。然后采用10μM硫芥子气作为测定其对预处理物效果的标准剂量。

用100μl上述防护培养基之一或作为未处理对照组的100μl含100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM替换培养基对96孔培养皿进行预处理。在37℃、经加湿的空气∶二氧化碳之比为95∶5环境下将培养物在这些溶液中进行培养。1小时后在每孔中加入100μl溶于Hank缓冲盐溶液(HBSS)(10μM，用异丙醇稀释其50mM原溶液制成)的硫芥子气溶液，将培养皿在37℃、相同条件下再培养1小时。从孔中除去溶液，并加入100μlSVK培养基。将培养物在37℃、上述条件下培养最长达96小时。在选定时间点，采用中性红和龙胆紫试验测定存活率。

发现在SVK培养物中加入硫芥子气(10μM)会使存活率随时间而平缓地减少，因此在24、48、72和96小时的存活率(经中性红试验测定，图2)降至对照组的85.7％、54％、40.8％和33.5％。这与含有4mMGSH/10mM HMT并与硫芥子气接触的培养物形成对比，该培养物在以上各时间点的存活率分别保持在99％、69.7％、58.3％和63.3％。因此与硫芥子气接触96小时后，预处理培养物的存活率是未经处理培养物的1.9倍(或提高89％)。采用ANOVA经Tukey post测试测出该差别很明显(p＜0.001)。

依照Gillies等人的方法(Analytical Biochem.(1986)159109-113)采用经0.1％(w/v)细胞核龙胆紫染色测定细胞数。结果用620nm下测出的光强度来表示。

结果见图3，尽管在96小时处预处理培养物的细胞数是未经防护的培养物的2.3倍(或高131％)，但这些结果在很宽范围相似。采用ANOVA经Tukey post测试测出该差别也很明显(p＜0.001)。

采用中性红试验(表1)和龙胆紫试验(表2)进行测定，证明其它含有不同GSH/HMT防护剂混合物的其它防护培养基对与硫芥子气接触的SVK细胞培养物的防护水平也类似。

表1与直接与10μM硫芥子气接触的培养物相比预处理培养物的相对存活率{专用}共用药物      24小时        48小时         72小时       96小时10μMSM            93.8±0.56    59.1±0.48    40.0±0.57    28.7±0.284 mM GSH/5 mM HMT  100.3±0.56^* 74.3±0.48^*  50.9±0.85^* 55.1±0.55^*+10μM SM10μM SM           85.7±1.4     54.0±0.52    40.8±0.83    33.5±0.274mM GSH/10mM HMT   99.0±1.4^*   69.7±1.82^*  58.3±0.56^* 63.3±0.53^*+ 10μM SM10μM SM           93.4±0.57    63.2±0.75    38.2±0.9     31.0±0.548 mM GSH/5 mM HMT  101.1±0.85^* 80.7±0.5^*  63.9±0.3^*   64.2±0.54^*+10μM SM10μM SM           101.9±2.3    70.2±0.72     35.3±0.91   26.9±0.558mM GSH/10mM HMT   116.4±2.3^*  84.9±0.96^*  65.0±0.96^* 62.4±1.1^*+10μM SM

平均值由15组培养物平均值及其标准误差来表示(以占对照组的百分比计)。*表示采用ANOVA经Tukey post测试测出的差别明显(p＜0.001)。

表2预处理培养物与直接与10mM硫芥子气接触的培养物的细胞数对照共用药物         24小时         48小时          72小时      96小时对照组          0.161±0.001  0.179±0.001  0.218±0.002  0.249±0.00110μM SM        0.132±0.002  0.069±0.001  0.056±0.001  0.052±0.0014mMGSH/5mMHMT   0.134±0.003  0.101±0.001^*0.099±0.001^*0.103±0.001^*+10μM SM对照组          0.178±0.002  0.200±0.002  0.223±0.002  0.244±0.00210μM SM        0.141±0.002  0.074±0.001  0.049±0.001  0.052±0.0024mMGSH/10mM HMT 0.162±0.002^*0.110±0.002^*0.094±0.002^*0.119±0.001^*+10μM SM对照组          0.151±0.002  0.162±0.004  0.186±0.003  0.228±0.00210μM SM        0.123±0.001  0.057±0.002  0.032±0.002  0.045±0.0018 mMGSH/5mM HMT 0.138±0.002^*0.080±0.002^*0.085±0.002^*0.115±0.002^*+10μM SM对照组          0.147±0.001  0.175±0.002  0.202±0.001  0.246±0.00110μM SM        0.125±0.001  0.067±0.001  0.047±0.001  0.042±0.0018mMGSH/10mM HMT 0.136±0.002^*0.110±0.002^*0.096±0.002^*0.104±0.002^*+10μM SM所示数据为15组培养物的平均吸光度(620nm)及其平均标准误差。*表示采用ANOVA经Tukey post测试测出直接与硫芥子气接触的组和经预处理再与硫芥子气接触的组之间的差别明显(p＜0.001)。

只采用8mM GSH进行预处理的培养物在与硫芥子气接触24、48、72小时后(96小时处未测定)，经中性红试验测定其存活率分别为111.2％、91％和60.8％，而与之对照的直接与硫芥子气接触的细胞培养物中，细胞在相同时间点的存活率分别为109.9％、68％和41％。只采用16mM GSH进行预处理的培养物在与硫芥子气接触24、48、72和96小时后经中性红试验测定其存活率仅分别为102.5％、86.8％、76.2％和80.7％，而与之对照的直接与硫芥子气接触的细胞培养物中，细胞在相同时间点的存活率分别为97.2％、74.5％、55.6％和49.1％。只采用10mM HMT进行预处理的培养物在与硫芥子气接触24、48、72小时后(96小时处未测定)，经中性红试验测定其存活率分别为88.9％、83.5％和59.4％，而与之对照的直接与硫芥子气接触的细胞培养物中，细胞在相同时间点的存活率分别为91.7％、71.4％和42.2％。只采用20mM HMT进行预处理的培养物在与硫芥子气接触24、48、72和96小时，后经中性红试验测定其存活率仅分别为93.9％、97％、89.2％和72.2％。采用20mM HMT和10μMSM进行处理的培养物在与硫芥子气接触24、48、72和96小时，后经中性红试验测定其存活率分别为96.8％、72.3％、41.6％和12.7％，而与之对照的直接与含硫芥子气接触的细胞培养物中，细胞在相同时间点的存活率为99.2％、63.0％、41.8％和30％。

采用龙胆紫染色时，对照组培养物和经防护培养基预处理的培养物证明在SVK细胞融合单层中可见上皮细胞卵石(cobblestone)形态，并且细胞质/细胞核之比一般较小。对这些培养物施用10μM硫芥子气会造成：

(1)细胞质/细胞核之比增大，并且细胞核肿大

(2)质膜水肿形成细胞碎片

(3)细胞体坏死

(4)细胞间接触和正常的上皮形态丧失

(5)细胞数全面减少

除以上特点之外，还发现经中性红染色的那些与硫芥子气接触的细胞中溶菌体在细胞核周围积累。这些观察到的变化是随时间改变的，在较长时间点(48-96小时)发现培养物逐渐破坏。

在与含硫芥子气接触之前将SVK培养物用上述防护培养基混合物任意之一进行处理，经龙胆紫染色，发现该处理会使培养物：

(1)仅出现有限的细胞质肿大现象

(2)保持上皮形态

(3)细胞坏死极少

(4)证明具有有丝分裂活性此外，经中性红染色表明细胞中溶菌体的分布更为分散。在与硫芥子气接触96小时后会发现这些特点。

经龙胆紫试验测定，在实验过程中由GSH、HMT或其混合物对SVK细胞培养物进行处理并未显著改变细胞的生长，对中性红的吸收量进行测定时，发现该处理对细胞功能也无显著改变，这说明这些化合物和混合物是适用于生物的。实施例2外用皮肤防护制剂

采用包含硬脂酸的隔离霜、防护化合物，以及任选成分聚四氟乙烯(PTFE)的混合物配制外用皮肤防护剂，其中隔离霜是以商标名Stokoderm出售的产品。该制剂的组成见下表4。

先将各化合物组分用液氮冷冻，然后用研磨机(A10型，IKALabortechnik,Neumagenstraβe,Germany)混合，共混合两分钟制备该制剂。

发现可采用低容积搅拌器更充分地混合各组分。该装置由不锈钢管构成，用螺丝拧进基座而使一端封闭，带有橡胶密封圈的旋转刀片与变速孔相连。将化合物置于管中，经旋转刀片进行混合。混合后拧开搅拌器底座，插入10毫升注射器的活塞，可使膏霜的回收率达100％。实施例3扩散研究

主要由角质层和相连的角质细胞构成的表皮膜，是通过缩腹部术从人体皮肤上得到的，并且没有明显的病理现象。将切除后的皮肤在-20℃下冷冻保存备用。将皮肤解冻，除去下层脂肪组织从而分离出上皮，并将其在60℃的水中浸泡45秒。然后用镊子刮下表皮层，悬浮于蒸馏水中，并将其置于铝箔上风干直至其中过量的水蒸发，然后在-20℃下冷冻保存备用。

采用上述的Franze型玻璃扩散池(Jenner等人，J.Pharm.Pharmacol.(1995)47206-212)对外用皮肤防护剂进行评估，其中该池可用扩散面积为2.54平方厘米。各扩散池中是置于金属网托上的表皮层，所述金属一网在上(供体)室和下(受体)室之间形成隔离层，两室中应先注入0.9％生理盐水。

采用上述的电阻法(Chilocott R.P.等人，Human andExperimental Toxicology,14(9)733页)测定各表皮层的整体性。认为电阻低于3.0欧姆的表皮层是受损的，不能用于本项研究。

经电阻测定后，用50∶50的含水乙醇替代受体室中流体，并除去供体室中的生理盐水。在表皮层表面涂敷200μl(体积)各制剂，涂敷厚度为0.78毫米。还将未配制的200mg防护化合物直接加于供体空气液滴传播形式的³⁵[S]硫芥子气(50μCi.ml^-1)。然后在闭合环境中进行实验，其中采用接触粘合剂(Bostik万能透明胶)由塑料盖密封受体室。

在60小时期间按规律时间间隔吸取受体室流体试样(20μl)。用等体积的50∶50含水乙醇替代各试样。采用RackβⅡ1215型闪烁计数计，在5毫升Emulsifier Safe闪烁合剂(CanberaPackard,Michigan,USA)中，经液体闪烁计数法测定各试样中的放射量。放射量与本研究开始时取出的供体室液体试样中测出的硫芥子气含量有关。

在Mitac 486DX微机上采用电子数据表程序(Excel,MicrosoftCorp.)对结果进行分析。由放射性标记的硫芥子气的渗透量随时间变化的示意图来表示该结果，参见图4和5。应用时，所得的最大渗透速率(J_max)、在6、12和24小时处的渗透量以及渗透总量均总结在表2和3中。

当单独采用HMT，或将HMT和Stokoderm膏霜基质共用于离体表皮层防止硫芥子气渗入时，48小时期间降低硫芥子气的渗透总量(图4)。

单独采用HMT可将渗透总量降至未经预处理对照组渗透总量的42％±14％，但与水包油型膏霜基质(Stokoderm)混合共用时，可将渗透总量降至未经预处理对照组渗透总量的17％±3％。与采用HMT∶Stokoderm相比，在HMT∶Stokoderm混合物中加入PTFE会增大硫芥子气的渗透量，但比单独采用HMT的渗透量低，为未经预处理对照组渗透总量的27％±10％(表3)。

表3

经以下外用皮肤防护剂预处理后渗透量的对照平均百分比一览表

预处理	渗透量对照百分比
					6小时	12小时	24小时	48小时
	HMT	116±124	103±64	60±28					42±14
Stokoderm基质中的HMT(HMT∶基质=20∶80w/w)					18±5	19±4	19±4	17±3
	含PTFE的Stokoderm基质中的HMT(HMT∶基质∶PTFE=20∶50∶30w/w)	61±26	71±30	46±12					27±10

渗透量对照百分比=在6、12和24小时处和实验结尾时，硫芥子气在预处理皮层中的渗透量与对照膜相比的百分比。

单独采用HMT对硫芥子气渗透最大流量无影响，但HMT和Stokoderm基质的混合物，或与含PTFE的Stokoderm基质的混合物可使最大流量分别为48±20μg/平方厘米·小时和178±86(未处理的对照组为233±181μg/平方厘米·小时)(表4)。

表4

经以下外部用皮肤防护剂预处理后硫芥子气渗透速率的定量分析结果

处理	Jmax(μg/平方厘米·小时)
		对照组(n)	233±181
Stokoderm基质中的HMT(HMT∶基质=20∶80w/w)(n)	48±20
		含PTFE的Stokoderm基质中的HMT(HMT∶基质∶PTFE=20∶50∶30w/w)	173±86
HMT(n)	345±278

括号中的号数表示用于研究的表皮层号。

将HMT加入含有水、蜂蜡、brij52和含有三种油(重质白矿油、聚甲基氢硅氧烷或氟化油)中的一种配成的水包油型膏霜，也可制成在48小时期间能将硫芥子气渗透总量降低的膏霜，但其不会减少最大渗透流速(图5)。实施例4

采用全氟化聚合物隔离霜进行的扩散研究

采用上述的Franze型玻璃扩散池(Jenner等人，J.Pharm.Pharmacol.(1995)47206-212)对外用皮肤防护剂进行评估，该池可用扩散面积为2.54平方厘米。本实施例中，各扩散池由置于金属网托上的乳胶膜(26％乙烯乙酸乙烯酯(EVA)橡胶，RMCSShrivenham)构成，它在上(供体)室和下(受体)室之间形成隔离层。

上述研究表明包含乳胶膜的该装置能提供一种能适用的模型，用于识别具有隔离功能的化合物和渗透速率，从而提供了评估化合物阻滞特性的定量方法。

在受体室中充入50∶50的含水乙醇。在上述膜表面涂敷200μl(体积)各制剂，涂敷厚度为0.8毫米。各组合物敷2小时后，在供体室加入20μl空气液滴传播形式的³⁵[S]硫芥子气(50μCi.ml^-1)。然后在闭合环境中进行实验，其中采用接触粘合剂(Bostik万能透明胶)由塑料盖密封受体室。

在8小时过程中按规律的时间间隔吸取受体室流体试样(20μl)。用等体积的50∶50含水乙醇替代各试样。采用RackbetaⅡ1215型闪烁计数计，在5毫升Emulsifier Safe闪烁合剂(CanberaPackard,Michigan,USA)中，经液体闪烁计数法测定各试样中的放射量。放射量与本研究开始时取出的供体室液体试样中测出的硫芥子气含量有关。

先以³⁵S-放射性标记的硫芥子气的渗透总量对时间作图得出结果。在前4小时中发现其是直线(最大渗透速率J_max)。由此可计算出阻滞指数，结果见图6。

另外，3小时后可计算出硫芥子气渗入膜的总量，并由占未处理对照组的百分比来表示。结果见图2。

从这些图可知，本发明组合物能提供具有显著隔离作用的隔离层，并且它们比市售的隔离霜更有效。实施例5

经全氟化聚合物隔离油和市售的隔离霜分别预处理的皮肤对硫芥子气渗透作用的比较

采用基本如以上实施例3中所述的方法，先用Fomblin-z-二醇^TM处理试样，2小时后加入液态硫芥子气，其效果见图8。在开放环境下进行实验(硫芥子气可从皮肤表面自由蒸发)，采用含有活性硫醇化合物的传统隔离霜(水包油型乳化体)，而未经处理的对照组用于对比。

发现在这些条件下水包油型膏霜会增进硫芥子气的渗透总量。实际上采用该膏霜进行“防护”的用户会吸收更高剂量的硫芥子气，并且与未保护的裸露皮肤相比可能会遭受更严重的皮肤损伤。相反，Fomblin能对皮肤提供长达35小时的防护作用。在最初12小时内该防护作用明显。此外，芥子气液滴易于从经Fomblin处理过的皮肤表面除去，这说明在皮肤表面的垂直方向几乎没有或完全没有硫芥子气渗入。经计算，Fomblin-z-二醇的最大防护作用(作为总芥子气渗透减小百分比测定)在3小时为92％，在12小时为84％，在24小时为61％。

实施例6

Fomblin和PTFE混合物的作用

在室温下，转速为1800 rpm的条件下，将76％Fomblin HC/RTM和24％PTFE(聚四氟乙烯)混合4小时制备制剂。用该制剂和未处理的对照组重复实施例5。结果见图8。

很明显，加入PTFE具有很大作用，经其预处理的皮肤比对照组中芥子气的渗透量约低75％，该降低作用在整个实验中一直存在(经45小时)。该制剂的最大防护作用(以硫芥子气渗透总量降低百分比计)在3小时为90％、12小时为90％，24小时和实验结尾为75％。

发现这比单独采用Fomblin HC/R的效果更好，这说明PTFE具有有益效果。实施例7

活性隔离霜的配制

制备以下制剂：

制剂A:93％Fomblin^TM HC/R

6.6％饱和HMT水溶液

0.4％Brij 30

0.4％鲸蜡醇在50℃下将少量体积的Fomblin HC/R^TM与Brij30和鲸蜡醇混合，并于室温下采用Hiedolf恒定转矩搅拌器以1800 rpm的转速恒定搅拌下，将该混合物加入到其余的Fomblin^TM HC/R和饱和的HMT溶液中。

制剂B:0.08％Brij 52

1.16％饱和HMT水溶液

98.76％Fomblin^TMHC/R其中，将Fomblin^TM HC/R加热至40℃，并加入Brij 52和HMT溶液。将在恒定搅拌(1800rpm)下的混合物加热至70℃，然后同样在恒定搅拌下冷却至室温。

在开放环境下采用该制剂进行上述实施例3的扩散研究。通过在实验结尾时不再有经放射性标记的硫芥子气渗入时，测定供体室相对于受体室、蒸气和皮肤中的放射量来对隔离霜的活性进行定性测定。结果见图10。

对照(未处理)组的皮肤表面(供体室)很少或没有硫芥子气，而两活性隔离霜制剂中都有放射性，这意味着经放射性标记的芥子气与HMT反应形成稳定、非渗透性的加成物。采用不含HMT的类似制剂时在供体室中的剩余放射量与对照组的相同，这进一步证实了以上论点。实施例8N-十八烷基六铵氯化物盐的制备

1-溴十八烷(12.0g)加入甲基异丁基酮中的碘化钠(5.5g)中，然后搅拌回流该悬浮液3小时。25分钟后悬浮液呈乳白色。通过用硫酸铜测定未反应的碘来测定转化率。转化率约达90％，该成分可不经进一步纯化直接应用。

先在氯仿(40ml)中将1-碘十八烷(粗品，13.3g)与六亚甲基四胺共同回流。悬浮液很快澄清，形成沉淀。冷却并搅拌40小时，过滤白色固体并用氯仿(2×7ml)和环己烷(7ml)洗涤，在30-40℃下真空干燥。产量为3.9g。

经银滴定法测定碘离子为24.03％；(理论值为24.37％)，即预定值的98.6％。熔点：146-150℃(分解)。经红外光谱法证实其结构。

可采用适宜的离子交换柱将产品转化成溴盐。实施例92-五氟苄基六铵溴化物的制备

在干燥玻璃器器中的氯仿(20ml)中，将α-溴-2,3,4,5,6-五氟甲苯(5.02g)和六亚甲基四胺(3.0g)共同回流。顶部通入氮气，采用干燥管保持无水条件。对悬浮液加温使其形成溶液。几分钟后形成沉淀，经40分钟过程不断变浓。温度升至比室温高3度。在室温下搅拌2.5小时，然后回流该悬浮液，并冷却。过滤该稠膏并用氯仿(3×5ml)洗涤。在30-40℃下真空干燥所得固体。产量：6.8g。熔点：206-208℃，(分解)。水溶性：20℃下1g产品溶于11ml水(相当于90mg/ml)。

采用过量的硝酸银溶液测定溴离子，然后用硫氰酸钾进行返滴定，得到的测定值为99.3％。经红外光谱法证实其结构。实施例10

HMT类似物的反应活性

以下对实施例8和9中制备的HMT类似物的反应活性进行测试。制备以下溶液：

a．四氢呋喃(THF)(10ml)中的HMT(140.19mg)。

b．THF(10ml)中的N-十八烷基HMT(406.70mg)

c．四氢呋喃(THF)(10ml)中的全氟苄基HMT(387.46mg)；

在各溶液中加入经放射性标记的硫芥子气(124.9μl)(³⁵S)。1小时后，取出20μl试样，分别置于二氧化硅薄层色谱板中(第2-4道)，加入1滴³⁵S硫芥子气(第1道)，然后采用四氢呋喃作为流动相进行40分钟色谱分析。然后取出薄层色谱板，并用Kodak Biomax x射线胶卷进行放射自显影。

薄层色谱法结果见图11。很明显，游离氢仅存在于对照试样中。含HMT活性化合物和十八烷基HMT以及全氟化苄基HMT类似物的溶液中无游离氢存在。

Claims (32)

1．一种外部涂敷用组合物，其中包含能与烷基化试剂反应的六亚甲基四胺(HMT)或其类似物或衍生物。

2．权利要求1的组合物，其中六亚甲基四胺的类似物是如式(Ⅱ)所示的盐：

(Ⅱ)其中R¹是有机基团，而X^-是阴离子。

3．权利要求2的组合物，其中R¹是含1-50个碳原子经任意取代的直链或支链烃链

4．权利要求3的组合物，其中烃链未经取代或可被一个或多个取代基取代，取代基选自芳基和/或卤素，其中芳基可任选被卤素取代。

5．权利要求4的组合物，其中R¹是氟苄基或(CH₂)_nCH₃基团，其中n为8-20。

6．权利要求2-5中任一权利要求的组合物，其中X^-是卤离子。

7．权利要求1的组合物，其中含有六亚甲基四胺的衍生物，该衍生物选自六亚甲基四胺与棕榈酸或硬脂酸、胆甾醇或胆甾醇的硫醇衍生物、神经酰胺或神经酰胺的硫醇衍生物、或含16-32个碳原子的脂肪酸所形成的共轭产物。

8．上述权利要求中任一权利要求的组合物，其中还含有全氟化聚合物。

9．上述权利要求中任一权利要求的组合物，其中还含有膏霜基质。

10．权利要求9的组合物，其中膏霜基质是水包油型乳化体。

11．权利要求9或10的组合物，其中膏霜基质包含聚甲氧基硅氧烷或硬脂酸。

12．权利要求9-11中任一权利要求的组合物，其中反应活性化合物与膏霜基质之比为10∶90-60∶40(重量)。

13．上述权利要求中任一权利要求的组合物，其中反应活性化合物与膏霜基质之比为25∶75(重量)。

14．上述权利要求中任一权利要求的组合物，其中还含有矿物油或硅油。

15．一种外用组合物，其中主要包含全氟化聚合物。

16．权利要求8或15的组合物，其中全氟化聚合物是油状物。

17．权利要求8、15或16任意之一的外用组合物，其中全氟聚合物如式(Ⅳ)所示：

CF₃O-[CF(CF₃)CF₂O]_n-[CF₂O]_m-CF₃    (Ⅳ)其中n和m独立地选自4-150。

18．权利要求17的外用组合物，其中n和m独立地选自6-140。

19．权利要求18的外用组合物，其中n和m分别为140和31；40和11；25和5；18和8；或6和6。

20．权利要求15的组合物，其中该组合物中含有高达100％(重量)的全氟化合物。

21．权利要求20的组合物，其中含有30-100％(重量)的全氟化合物。

22．上述任一权利要求之一的组合物，其中除HMT或其类似物或衍生物之外，还包含一种活性试剂，它能与化学品反应或发生螯合，从而防止化学品与皮肤接触。

23．权利要求22的组合物，其中所述组合物还包含能使硫芥子气失活或能与之螯合的试剂。

24．权利要求23的组合物，其中所述组合物还含有的试剂包括丁二酮钾肟盐。

25．上述权利要求中任一权利要求的组合物，其中还含有亲油大分子，该分子不会渗入皮肤，会令反应活性成分存留皮肤表面或限制在皮肤表层内，直到其经表皮组织常规循环而脱落。

26．上述权利要求中任一权利要求的组合物，其中还含有低分子量全氟化合物。

27．权利要求26的组合物，其中所述的低分子量全氟化物是聚四氟乙烯。

28．一种防止挥发性化学品渗入人或动物皮肤的防护方法，该方法包括在皮肤上涂敷权利要求1-27中任一权利要求的组合物。

29．权利要求28的方法，用于防护挥发性农药、工业溶剂或化学战毒剂的作用。

30．一种隔离霜，其中包含权利要求1-27任一项的组合物。

31．一种如权利要求2中定义的式(Ⅱ)所示新化合物。

32．一种制备权利要求2中定义的式(Ⅱ)所示化合物的方法，其中包括将六亚甲基四胺与式(Ⅲ)化合物或其盐反应：

                         Y-R¹    (Ⅲ)

其中R¹的定义如式(Ⅱ)，Y是离去基团，然后如果必要，可将该盐转化为不同的盐。

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