CN1223590A - 被动服用的可提高饲料转化效率的抗体 - Google Patents

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Abstract

一种提高哺乳动物例如猪中饲料转化效率的方法,其中给哺乳动物喂养的饲料中含有以脲酶作为抗原产生的抗体。

Description

被动服用的可提高饲料转化效率的抗体
                          发明背景
发明领域
一种可提高动物中饲料转化效率的饲料添加剂。
背景讨论
在动物产业中，抗生素通常用于防止感染、提高动物生产性能和治疗感染性疾病。而用于代替抗生素来提高动物生产性能的替换方法还无法商业性地获得。
目前，用于动物生产的大多数抗生素与用于人类治疗的不同。然而，由于出现对用于动物的任何抗生素都有抗药性的多抗性细菌，使得曾一直用于人类治疗的抗生素不再能够使用。持续使用抗生素作为预防剂或生长促进剂也导致了动物农产品中的药物残留问题与日益增长的环境污染问题。研究表明，所服用抗生素的75％可通过尿和粪排回到环境中(Addison,1984)
已经有人证明了给母鸡注射外源抗原会产生特异性抗体，并且抗体将沉积在蛋黄中。当口服刺激时，动物可产生对沙门氏菌、大肠杆菌以及其他类型细菌的特异性抗体(Rick等，1988；Neighbor等1991)。当把这些抗体施用于动物后，再用细菌去感染，该抗体可防止感染(Bartz等，1980；Sherman等，1983；Tacket等，1988；Kuhlmann等，1988；Yolker等，1988；Shmidt等，1989；Wiedemann等，1990；Hatta等，1993a和1993b；Kuroki等，1993)。Pimentel等在1991年与Pimentel及Cook在1988年报道，注射了刀豆脲酶的母禽所产的小鸡与幼禽加快了生长。
抗体防止感染至少有两种可能的机理。已有报道说抗体能通过阻碍细菌附着于肠壁而减少胃肠道中细菌的数目。抗体也可以通过与肠壁上的特异受体或者与细菌本身结合，阻碍细菌增殖，从而降低细菌的数目(Ishida等，1992)。抗体预防疾病的两种作用机理都是可减少菌苗数。而且抗体不会导致抗性菌株的出现，也不会因为在动物农产品中有讨厌的残留物而留下威胁。
                        发明概述
一种提高哺乳动物饲料转化效率的方法，包括用一种含有有效剂量的抗体的饲料喂养哺乳动物，该抗体可结合脲酶。
                   发明的优选实施方案
本性涉及一种通过在动物饲料中添加可结合脲酶的抗体而提高动物中饲料转化效率的方法。用于获取抗体的优选抗原是可从Sigma化学公司商购的刀豆脲酶。我们已发现，当用含有抗脲酶的抗体(其剂量为每公斤饲料中抗体提取物为25-500mg，优选25-100mg/kg)的饲料连续喂养哺乳动物特别是猪三至四周，则其饲料转化效率有所提高。在猪中饲料转化效率平均提高9到15点，或者更多。抗体提取物在例2中有描述。作为一个替代的方法，如例7中所述，可不需先分离抗体而是直接将蛋干燥并混入饲料中。如果用含有抗脲酶抗体饲料喂养牛或羊，其生长也伴有有所提高的饲料转化效率。
喂养含有抗脲酶抗体的家禽饲料后，家禽包括鸡和火鸡的生长率和饲料转化效率均有所提高。
可通过给动物比如啮齿类动物或兔等注射脲酶，然后收集含有抗体的血清而得到抗脲酶抗体。然而，这种方法花费较高，并且对动物刺激太大。
现已有一种非刺激性而且较经济可行的一般方法可用于生产抗体。据观察，蛋中含有50-150mg的各种抗体。当用一特殊抗原注射母禽时，从蛋中所分离的抗体的10-20％对该抗原有特异性(Losch等，1986；Kuhlmann等，1988；Bardsallet all,1990；Gassmann等，1990)。蛋中产生的免疫球蛋白种类鉴定为IgY，它与哺乳动物产生的IgG相类似。小猪以与同源性猪抗体相似的方式吸收蛋黄抗体。Wiedemann等(1990)观察到用含有抗体的冻干蛋黄来喂养的8周大的小猪，则在其整个末端空肠都发现有抗体。当给动物提供可降低胃内酸度的碳酸氢钠，则可提高抗体的活性。据报道相对于喷雾干燥的强化抗体，包含于喷雾干燥的整个蛋中的抗体更耐肠内酸性的降解。Yokoyama等(1993)报道在给小猪(28日龄)口服小鸡抗体两小时后，从其胃直至回肠内均有活性抗体。在一相关研究中，Ishida等(1992)证明了用注射了人类肠细菌的超免疫牛产生的乳汁喂养8和18月龄的小鼠，其肠内肠杆菌的生长受到显著抑制。将鸡抗体包裹于脂质体中可使其进一步免于胃酸和胰酶水解。
以前关于鸡抗体在预防猪中细菌感染的功效的研究已有报道。在体外研究中，Jungling等(1991)观察到蛋黄抗体能有效降低产肠毒素的大肠杆菌粘附到分离的猪肠细胞上。体内测试中，含有抗大肠杆菌抗体的喷雾干燥蛋黄提取物预防了新生小猪和牛犊内大肠杆菌病(Yokoyama等，1992和1993,Erhard等，1993)并降低了猪腹泻天数(Kellner等，1994)。
尽管通常知道鸡抗体能保护接种动物免受细菌感染，却没有抗体显示出能提高饲料转化效率，即能将一定量的饲料转化为更多的体重增长。本发明提供了一种利用抗酶(脲酶)抗体以提高哺乳动物中饲料利用率(饲料转化效率)以及体重增长的方法，所述酶存在于哺乳动物胃肠道中。
下述范例性实施方案是对本发明的举例说明而非旨在限定。在对这些实施范例的描述中，本发明的其他特点也将是显而易见的。实施例1
A．这个实施例描述了抗脲酶的特异性抗体的制备。在17周龄(将母鸡置于笼中)时，给母鸡注射0.2mg的Ⅱ-c型脲酶(Sigma ChemicalCompany)。将酶溶解于0.2ml磷酸缓冲盐溶液(PBS:pH7.3)和0.2ml完全弗氏佐剂中制备接种物。将抗原制剂肌肉内注射入两个位点，在右和左每一胸肌注射0.2ml。每只母鸡总共注射0.4ml抗原制剂。第二次注射安排在第一次注射后5-6周(约50％的蛋产量)。第二种抗原制剂中，用不完全弗氏佐剂代替完全弗氏佐剂。每两个月或是当确定抗体效价低时给母鸡再次注射抗原制剂。用ELISA方法每4周测定抗体效价。在第二次注射1周后收集含有特异性抗体的蛋。为了将外界污染减至最小，将母鸡保持于隔离的房间里。它们处在类似于商业化装置般有序的接种程序之下。
B．在另一实验中，给母鸡注射三次抗原，增加了蛋中抗脲酶的平均产量。实施例2
照Kwan等(1991)建议的方法纯化抗体。简而言之，1体积的实施例1A中的蛋黄与9体积的蒸馏水混合，置于4℃过夜。接着将含水部分以4000rpm离心10分钟，并用奶酪布过滤除去多余的脂肪。将液体冷冻以备将来冷冻干燥之用。冷冻干燥后，抗体经热处理(50℃～70℃1小时)以提高稳定性。用ELISA鉴定抗体活性。在进行ELISA之前，用Bradford法测定蛋提取物中蛋白质浓度并调节至1mg/ml。实例施3
以下是ELISA的操作步骤：
1．用溶于碳酸盐缓冲液的100μl脲酶溶液(10μg/ml)覆盖平板。用棋盘滴定法测定确切的抗原浓度。在4℃下温育过夜后，该平板用1.5％牛血清白蛋白于室温封闭4小时。
2．每孔加入100μl浓度为每毫升1毫克蛋白的蛋提取物，将平板置于室温下温育30分钟。
3．用PBS-Tween20溶液洗涤平板。将100μl连有辣根过氧化物酶的稀释度为1∶20,000的兔抗鸡IgG加入每个孔中。将该板在室温下温育30分钟。用棋盘滴定法测定酶-抗体连接物的准确浓度。
4．用PBS-Tween洗涤平板，然后向每孔加入100μlTMB底物。将平板在室温下温育15分钟。
5．用100μl2M硫酸终止反应。
6．用ELISA平板读数计在455nm下对平板读数。
7．最后稀释度的反比确定为效价，其中最后稀释度是指该免疫蛋在该稀释度下的O.D.值与未免疫的对照的O.D.值相似(O.D.＜.100)。实施例4
此研究用表说明了在哺乳动物饲料中加入纯化抗体的效果。两个实验均用初生的(6周龄)小猪。对照和经抗体处理的饲料均使用4周。抗体剂量是50mg/kg食物。水和饲料均无限制地供给。每星期测量饲料摄入量和体重，每星期计算饲料转化并表示为饲料摄入/体重增长量。这两个实验结果列于表1至表4
表1(实验1)
    体重增加(千克/周)
抗体浓度(毫克/千克饲料) 1 2 3 4 总计
    0     3.90     3.97     5.27     5.17     18.31
    50     4.73     4.69     5.22     4.90     19.54
每个实验组由3只猪的两次重复实验值组成。实验前称量动物体重，并根据性别和体重分配到猪圈中。
表2(实验1)
    饲料转化
抗体浓度(毫克/千克饲料) 1 2 3 4 总计
    0     1.74     1.49     1.94     1.93     1.79
    50     1.31     1.74     1.84     1.68     1.65
表3(实验2)
    体重增加(千克/周)
抗体浓度(毫克/千克饲料) 1 2 3 4 总计
    0     3.89     4.00     4.93     5.50     18.32
    50     4.39     4.39     4.84     5.24     18.86
表4(实验2)
    饲料转化
抗体浓度(毫克/千克饲料) 1 2 3 4 总计
        0     1.34     1.89     1.94     2.08     1.84
       50     1.15     1.73     1.93     2.08     1.74
实施例5
用断奶的猪进行实验。用对照食物或抗体混合物喂养猪六个星期。将50mg抗体提取物混入1千克细磨的玉米中，接着与1吨饲料相混。饲料和水均无限制地供给。在2、4、6周测体重，结果示于表5。
表5
    每天体重增加(克) 相对于对照增加的百分比
    天     对照     抗体
    1-14     163     203     24
    1-28     340     362     7
    1-42     414     461     11
实施例6
此实施例举例说明了含有脲酶特异性抗体的喷雾干燥蛋的制备。匀浆含有抗体的蛋，然后喷雾干燥。与冷冻干燥标准方法相比，蛋经喷雾干燥并未形响抗体活性。用于喷雾干燥的参数是：进气温度/出气温度为140℃/70℃，吹风机在50％载量，压缩机在75％载量，泵在30％载量，所有这些参数均得自实验室内使用的Virtis喷雾干燥仪。为了除菌并提高抗体稳定性(提高储存期限)，将经喷雾干燥的蛋在60℃下温育7天。我们已测试了抗体样品并发现这一过程没有降低抗体活性。
因为喷雾干燥产物含有脂肪，因而将1g产物与10ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)混合，再加入10ml氯仿。充分混合该悬液，接着在4000rpm离心以从脂成分中分离蛋白质。用牛γ-球蛋白作为蛋白质标准物，采用Bradford方法测定上清中蛋白质的含量。在按实施例1所述测定抗体活性和效价前将提取物用PBS稀释至1mg蛋白/ml。实施例7
用从6周龄至上市重量(200磅体重)的猪做两个实验。这次抗体不是从蛋黄中分离的，而是在对整个蛋(蛋白和蛋黄)进行匀浆并喷雾干燥(实施例6)得到的。与纯化的抗体活性相同的干燥蛋的量是250mg/kg饲料。结果示于表6和7。
动物：30只六周龄的猪(Dekalb株)，分两个测试组。每个测试组有3个重复小组，每小组5只猪。
表6
 17周体重(kg)   0-17周的增加量(kg) 总饲料摄入量(kg) 饲料转化
对照     93.95     83.49     217.7     2-61
抗体     99.74     89.42     22-3.5     2.50
表7
 15周体重(kg) 0-15周的增加量(kg) 总饲料摄入量(kg) 饲料转化
对照     97.00     81.32     209.2     2.58
抗体     98.37     82.77     198.4      2.40
实施例8
按照实施例4制备含有抗体的干燥蛋。将从初生阶段到上市阶段重量的猪在这个实验中保持16周。结果示于表8。
表8
总增重(kg) 总饲料摄入量(kg) 饲料转化
对照     1290     3470     2.69
抗体     1367     3624     2.65
实施例9
这个研究说明了在室温及高温下储存的喷雾干燥全蛋的抗体稳定性。喷雾干燥蛋样品(0.5-1.0gr)置于带帽小瓶(4ml)中，贮于室温(21℃)或37℃培养箱中，每星期均检查保存于这两种温度下的小瓶中的抗体活性。并与保存于0℃的样品的活性比较。结果示于表9。
表9
    残存抗体活性(％)
    周
    温度   0   1   2  3  6  9  12  18
    0℃  100  100  100  100  100  100  100  100
    21℃  100  98  100  98  96  94  95  85
    35℃  100  91  100   99  97  100  94  95
显然，受上述教导内容的启发，本发明可能有汗多修饰和变化。因此应理解在附加的权利要求范围内，除去文特别描述的方式之外，本发明还可按其它方式实施。
参考文献
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Claims (10)

1．一种提高哺乳动物中饲料转化效率的方法，包括用含有有效剂量的可结合脲酶的抗体的饲料喂养哺乳动物。
2．按照权利要求1的方法，其中脲酶为刀豆脲酶。
3．按照权利要求1的方法，其中每千克该饲料中含有25-100mg纯化的抗体。
4．按照权利要求1的方法，其中抗体是在蛋中产生的。
5．按照权利要求4的方法，其中抗体是在鸡蛋中产生的。
6．按照权利要求4的方法，其中将蛋经干燥后加入到饲料中。
7．按照权利要求1的方法，其中所说的哺乳动物是猪。
8．按照权利要求3的方法，其中用所说的饲料喂养所说的哺乳动物至少连续4周。
9．按照权利要求8的方法，其中所说的哺乳动物是猪。
10．按照权利要求6的方法，其中已对蛋进行冷冻干燥，并在50°-70℃加热以提高抗体稳定性。
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