CN1217698C - 应用h2受体激动剂和其它t细胞活化剂激活和保护t细胞(cd4+和cd8+) - Google Patents

Abstract

本发明涉及促进患者T细胞活化的方法，包括：鉴别需要增强T细胞活性的患者，给患者施用有效量的T细胞活化组合物，和给患者施用有效量的可以抑制细胞间活性氧代谢产物产生或释放的化合物。本发明还涉及使用H2受体激动剂增强疫苗的有效性。

Description

应用H2受体激动剂和 其它T细胞活化剂激活和保护T细胞(CD4+和CD8+)

                     发明领域

本发明涉及治疗癌症或病毒性疾病的方法，其中单独服用组胺或H₂受体激动剂或与另外的试剂联用。服用不同试剂不仅使T细胞激活并免于单核细胞/巨噬细胞(MO)的有害和抑制效应，而且也刺激了T细胞抗癌和抗病毒的特性。另外，作为组胺或H₂受体激动剂的一个直接效应，抗原呈递细胞在给T细胞呈递抗原方面会更有效。也设想优选地以协同方式与H₂受体激动剂联用其它的T细胞激活剂，该化合物刺激细胞毒性T细胞(CTLs)的细胞毒活性和其它T细胞活性。这类免疫刺激化合物的代表包括细胞因子、肽、黄酮类化合物、疫苗和疫苗佐剂。可与本发明的方法一起使用的其它类试剂包括化学治疗剂和/或抗病毒剂。本发明也设想与上述化合物联用活性氧代谢物清除剂。

                     发明背景

免疫系统已经发展了识别和摧毁出现在宿主体内的异质细胞或器官的复杂机制。调理机体的免疫机制是对恶性肿瘤和病毒性感染达到有效治疗的一条诱人的途径。

依据介导应答的物质，免疫系统有两种对异质的应答：体液应答和细胞介导的应答。体液应答由抗体介导而细胞介导的应答所涉及的是归为淋巴细胞的细胞。最近的抗癌和抗病毒策略集中在运用细胞介导的宿主免疫系统作为抗癌或抗病毒治疗的一种手段。对免疫系统的简要概述将有利于在上下文中安插本发明。

免疫应答的产生

免疫系统从三个阶段发挥作用以保护宿主免遭异物的伤害；识别阶段，激活阶段和效应阶段。在识别阶段，免疫系统识别和传导体内的外来抗原或侵袭者的出现。外来抗原可以是例如肿瘤细胞的细胞表面标记或病毒蛋白。一旦系统发现侵袭物，免疫系统的细胞增殖和分化以应答侵袭物诱导的信号。最后一个阶段是效应阶段，免疫系统的效应细胞应答并中和已发现的侵袭物。

一大批效应细胞完成对侵袭物的免疫应答。一种效应细胞，B细胞产生拮抗宿主遭遇的外来抗原的抗体。结合补体系统，抗体指导摧毁带有目标抗原的细胞或器官。

另一种效应细胞是自然杀伤细胞(NK细胞)，一种具有自发识别和摧毁各种病毒感染细胞和恶性肿瘤细胞的能力的淋巴细胞。NK细胞识别靶细胞的方法还了解不多。

另一类效应细胞，T细胞，分为三亚类，每一类在免疫应答中扮演不同角色。辅助型T细胞分泌细胞因子以刺激发动有效免疫应答必需的其它细胞的增殖，而抑制性T细胞下调免疫应答。第三类T细胞，细胞毒性T细胞(CTL)，能直接裂解在其表面呈递有外来抗原的靶细胞。

主要组织相容性复合体和T细胞目标识别

T细胞是抗原特异性免疫细胞，在应答特异性抗原信号时起作用。B淋巴细胞和其产生的抗体也是抗原特异性实体。不过，不象B细胞，T细胞不应答游离状态或溶解状态的抗原。T细胞应答抗原时，它需要和抗原与呈递复合体结合，即主要组织相容性复合体(MHC)结合。

MHC复合体蛋白提供T细胞将外来细胞和天然或“自身”细胞区分开的手段。有两类MHC，I类MHC和II类MHC。辅助性T细胞(CD₄ ⁺)主要同II类MHC蛋白反应，而细胞毒性T细胞(CD₈ ⁺)主要和I类MHC蛋白反应。两类MHC复合体均是跨膜蛋白，其结构的主要部分在细胞的外表面。另外，两类MHC都在其胞外部分有多肽结合裂缝。天然或外来的蛋白质小片段正是和该裂缝结合而呈递到胞外环境中。

称为抗原呈递细胞的细胞(APCs)运用MHC复合体向T细胞呈递抗原。T细胞识别抗原，抗原必须呈递于MHC复合体以供识别。这种必要条件称为MHC限制，它是T细胞区分自身与非自身细胞的机制。如果抗原不被可识别的MHC复合体呈递，T细胞不会同抗原信号识别和作用。

与可识别MHC复合体结合的多肽特异性T细胞与这些MHC-多肽复合体结合，并进入免疫应答的下一阶段。

调节免疫应答的细胞因子

上述各种效应细胞的相互作用受各种不同化学因子作用的影响，这类化学因子在需要时增强或减弱免疫应答。这些化学调节剂可能由效应细胞本身产生，可以影响与该因子产生细胞相同或不同的免疫细胞的活性。

一类免疫应答的化学调节剂是细胞因子，即刺激在免疫系统的细胞组成中增殖反应的分子。

白细胞介素-2(IL-2)是一种由T细胞合成的细胞因子，其被首先确定协同T细胞应答抗原时的扩增。(Smith，K.A.Science240：1169(1988))。已经清楚地知道IL-2的分泌是细胞毒效应T细胞(CTLs)完全发育所必需的，CTLs在宿主防御病毒过程中起重要作用。一些研究也表明IL-2具有抗癌作用，使之成为一种诱人的治疗恶性肿瘤的试剂。(见如Lotze，M.T.等，在″白细胞介素2″，ed.K.A.Smish，Academic Press，Inc.San Diego.CA，P237(1988)；Rosenkerg，S.，Ann.Srugery 208：121(1988))事实上，已经运用IL-2治疗患有恶性黑色素瘤、肾细胞癌和急性骨髓性白血病的患者。(Rosenberg，S.A.，等，N.Eng.J.Med.316：889-897(1987)；(Dutcher，J.P.，等，J.Clin.Oncol.7：477-485(1989)；Foa，R.，等，Br.J.Haematol.77：491-496(1991))。

另一种有望成为抗癌和抗病毒剂的细胞因子是α-干扰素。α-干扰素(IFN-α)是干扰素I型细胞因子，已被用于治疗白血病、骨髓瘤和肾细胞瘤。已表明干扰素I型细胞因子能增加I类MHC分子的表达。因为大多数细胞毒性T细胞(CTLs)识别与I类MHC分子结合的抗原，I型干扰素可通过增强CTL-介导的杀伤效应来延长细胞介导的免疫应答的效应阶段。同时，I型干扰素可以通过阻止II类MHC-限制的辅助性T细胞的活化来抑制免疫应答的识别阶段。IL-12，IL-15和各种黄酮类化合物也能增强T细胞应答。

组胺激动剂治疗的体内结果

组胺是一种生物胺，也就是说是一种在脱羧后具有由药理受体介导的生物活性的氨基酸。已经清楚地证实组胺在速发性超敏反应中的作用。(Plaut，M.和Lichtenstein，L.M.1982组按和免疫应答(Histamine and immune ranponse)。在 组胺受体药理学 (Pharmacology of Histamine Receptors)中，Ganellin，C.R.和M.E.Parsons.eds.John Wright&Sons，Bristol pp392-435)

检验是否能将H₂受体激动剂或拮抗剂应用到癌症治疗中产生了矛盾的结果。一些报道表明在患有恶性肿瘤的宿主中单独服用组胺抑制了肿瘤生长。(Burtin，Cancer Lett.12：195(1981))。另一方面，有报道称组胺在啮齿类动物中加速肿瘤生长。(Nordlund，J.J.等，J.Invest.Dermatol 81：28(1983))。

同样，在评价组胺受体拮抗剂的效应时也得到矛盾的结论。一些研究表明组胺-受体拮抗剂在啮齿类动物和人类抑制肿瘤的发展。(Osband，M.E.，等，Lancet1(8221)：636(1981))。另一些研究报道了这样治疗增强了肿瘤的生长甚至可以诱发肿瘤。(Barna，B.P.，等，Oncology 40：43(1983))。

H₂受体激动剂和IL-2的协同效应

尽管在单独服用组胺时产生矛盾的结论，近来的报道清楚地显示组胺与细胞因子协同作用提高NK细胞的细胞毒性。例如，应用组胺类似物的研究表明组胺的协同效应是通过单核细胞的细胞表面H₂-受体发挥的。(Hellstrand，K.等，J.Immunol.137：656(1986))。

当与细胞因子联用时，组胺的协同效应好像是由于抑制了由细胞毒性细胞和其它细胞一起介导的细胞毒性的作用。单独的NK细胞的体外研究证实了当采用IL-2时，会刺激细胞毒性。不过，单核细胞的出现，会抑制IL-2诱导的NK细胞的细胞毒性的提高。(见美国专利号(U.S.Patent Number)5,348,739，在此引入作为参考)。

当单核细胞未出现时，组胺不能影响或轻微抑制NK介导的细胞毒性。(Hellstrand，K.，等，J.Immunol.137：656(1986)：Hellstrand，K.和Hermodsson，S.，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.92：379-389(1990))。然而，当单核细胞存在时给药组胺和IL-2与当单核细胞存在时只给IL-2相比，NK细胞显示了更高的细胞毒性水平。Id.因此，组胺和IL-2联用治疗协同提高NK细胞的细胞毒性不是因为组胺直接作用于NK细胞而是由于对单核细胞产生的拮抗信号的抑制。

不局限于一个特定的机制，相信单核细胞对NK细胞的细胞毒性的抑制作用是由于其产生了活性氧代谢物如H₂O₂。过氧化氢可能在细胞内产生。或者，H₂O₂可被定位于MO细胞表面的酶催化。两种H₂O₂的来源都被认为对细胞间H₂O₂浓度有贡献。

粒细胞在体外也显示了能抑制IL-2诱导的NK细胞的细胞毒性。H₂受体好像参与转导组胺的协同效应以克服粒细胞介导的抑制作用。例如，H₂受体拮抗剂雷尼替丁可以阻断组胺对粒细胞介导的抗体依赖的NK细胞细胞毒性的抑制作用，而H₂受体激动剂dimaprit则可模拟其作用。与组胺和IL-2能完全或接近完全抵消单核细胞介导的NK细胞抑制作用相反，这样的治疗只能部分抵消粒细胞介导的NK细胞抑制作用。(美国专利号5,348,739；Hellstrand，K.，等，抗体依赖的粒细胞，单核细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性的组胺性调节.J.Leukoc.Biol 55：392-397(1994))。

正如上述实验所示，采用组胺和细胞因子的治疗是有效的抗癌、抗病毒策略。美国专利号5,348,739揭示了在接种黑素瘤细胞系前，给药组胺和IL-2的小鼠免于肺转移病灶的发展。其还显示了，单独给药组胺可以延长静注单纯疱疹病毒(HSV)的动物存活时间，并发现联用组胺和IL-2对动物的存活时间有协同作用。(Hellstrarol，K.，等，组胺在自然杀伤细胞介导的对小鼠的II性单纯疱疹病毒感染保护中的作用。Clin.Diagn.Lab.Immunol，2：277-280(1995))。

以上结果证实采用组胺和IL-2联用的策略是治疗恶性肿瘤和病毒感染的有效手段。

现在有望成为有效抗癌和抗病毒剂的几种免疫细胞刺激化合物的治疗可行性由于免疫系统的负性调节而降低。因此，有必要找到使免疫细胞刺激化合物的治疗可行性最大化的方法。

                     发明概述

本发明与促进病人体内T细胞活化的方法相关，包含：确定需要增强T细胞活性的病人，给病人服用有效剂量的T细胞活化组合物以及给病人服用有效剂量的抑制细胞间(intercellular)活性氧代谢物(ROM)产生或释放的化合物。

本发明还包含疫苗佐剂、疫苗、肽、细胞因子或黄酮类化合物。用于本发明的疫苗佐剂可以选自卡介苗(BCG)、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热敏性毒素(LT)、分枝杆菌71-KDa细胞壁结合蛋白、微乳剂MF59、聚(丙交酯-并-乙交酯)(PLG)的微粒，以及免疫刺激复合体(ISCOMS)。用于本发明的疫苗可以选自流感病毒、人类免疫缺陷病毒疫苗、肠炎沙门氏菌疫苗、乙型肝炎疫苗、支气管炎博德特氏菌(Boretella bronchiseptica)疫苗、肺结核疫苗、同种异型肿瘤疫苗以及自身肿瘤疫苗。

本发明设想使用各种细胞因子和黄酮类化合物。细胞因子选自IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β或IFN-γ。黄酮类化合物选自醋酸黄酮和4-醋酸呫吨酮。这些化合物给成人的每日给药剂量在1000至600,000U/kg。

本发明还设想使用能有效抑制细胞间过氧化氢的产生或释放的化合物，这些谷物选自组胺、5-羟色胺、地马普替(dimaprit)、可乐定、苯甲唑林、双咪硫胍、4-甲基组胺、氨乙吡唑及组胺同系物。这些化合物对一个成年人的给药剂量是0.05～50mg。这些化合物依据病人体重按1至500μg/kg剂量给药。

本发明设想在1小时内完成T细胞激活化合物和过氧化氢清除剂的给药。或者，在24小时内完成T细胞激活化合物和过氧化氢清除剂的给药。

本发明的方法还设想服用有效剂量的细胞间过氧化氢清除剂。清除剂选自过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸盐过氧化物酶。对于成年人过氧化氢清除剂的给药量为约0.05至500mg/天，可能是单独给药也可能是联用这类化合物。

除上述讨论的化合物外，本发明设想给药各种化学治疗剂。当化学治疗剂是抗癌剂时，可选自环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、雌氮芥、异环磷酰胺、松龙苯芥、马利兰、帖太帕、卡氮芥、罗氮芥、甲氮蝶呤、硫唑嘌呤、硫嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、长春碱酰胺、鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙、更生霉素、阿霉素、克鲁诺霉素、艾比鲁霉素、博来霉素、尼托霉素、顺氯氨铂、卡伯帕丁、甲基苄肼、阿莫克林、米托失特隆、三苯氧胺、尼鲁特米德及氨基乙哌啶酮。使用这些药剂的传统剂量。

当化学治疗药剂是抗病毒剂时，可选自碘苷、三氯胸苷、阿糖腺苷、无环鸟苷、溴乙烯去氧尿苷、三唑核苷、膦酰基三钠、金刚烷胺、金刚乙胺、(顺式)-9-(2′，3′-二氢丙基)-腺嘌呤，4′，6′-二氯黄酮、AZT、3′(-叠氮-3′-脱氧胸苷)、苷昔韦洛、地达诺新(2′，3′-双脱氧肌醇，或ddI)、扎西他宾(2′，3′-双脱氧胞苷或ddC)双脱氧腺苷(ddA)、尼弗拉平，HIV蛋白水解酶抑制剂及其他病毒蛋白水解酶抑制剂。使用这些药剂的传统剂量。

本发明的方法还设想了同时给药抑制细胞间过氧化氢的产生和释放的T细胞激活组合物和化学治疗剂的步骤。

                     附图简述

图1A图示描述了在单核细胞存在和不存在情况下，单独使用IL-2或IFN-α或和H₂-受体激动剂、组胺联用时，CD₃ ⁺淋巴细胞活化的百分比。给淋巴细胞(lymph：空白柱)或淋巴细胞和单核细胞(lymph+mono：涂色柱)加入培养基作为对照(med)，IL-2(100U/ml)，IFN-α(100U/ml，IFN)和/或组胺(50μM；h)。用包含所有存活淋巴细胞的门控在FACSan流式细胞仪上(BectonDickinson，Stockholm，Sweden)检测CD69表达以测定CD3⁺淋巴细胞的活化。柱图显示了治疗下CD69细胞表面标记的出现，用CD69⁺呈递细胞占从11位献血者收集的整个CD3⁺呈递细胞数(±s.e.m.)的平均百分比表示。空白星号(☆)代表加MO或不加MO培养的细胞的统计比较(Mann-Whitney U-test)。涂色星号(★)代表加组胺或不加组胺培养的细胞的比较。★或☆P＜0.05(CD8⁺细胞：培养基加MO对不加MO；CD4⁺细胞：组胺加MO对不加MO；CD4⁺和CD8⁺细胞：IL-2加MO对不加MO；CD3ε⁺细胞：培养基加MO对组胺加MO；CD4⁺和CD8⁺细胞：IL-2加MO对组胺、IL-2加MO；CD4⁺细胞：IFN加MO对组胺+IFN加MO)。P＜0.01(CD3ε⁺细胞：介质加MO对不加MO；CD3ε⁺细胞和CD56⁺细胞：IL-2加MO；CD56⁺细胞：IL-2加MO对组胺、IL-2加MO；CD3ε⁺细胞和CD56⁺细胞：IFN加MO对组胺、IFN加MO)★★★或☆☆☆P＜0.001(CD3ε+细胞：IL-2加MO对组胺+IL-2加MO。

图1B生动地描述了在单核细胞存在和不存在时，单独使用IL-2、α-干扰素或与H2受体激动剂、组胺联用，CD4⁺T细胞活化的百分比。该图数据和标记与图1A的相同。

图1C图示了在单核细胞存在或不存在时，IL-2或IFN-2单用或与H₂受体激动剂组胺联用时CD₄ ⁺T细胞的活化百分比。图中的参数和符号同图1A。

图2以直方图形式生动地描述了抗体标记的淋巴细胞的FACS筛选结果。淋巴细胞和MO在微量平板上培养；并如图1A所述用IL-2和或组胺处理。PE缀合的抗CD3ε⁺的单克隆抗体标记的细胞和抗CD69的FITC标记的单克隆抗体。门控存活的CD3ε⁺淋巴细胞，测定相对荧光强度和染有抗CD69的细胞百分比超过50,000例。各个图表表示(A)淋巴细胞+IL-2(B)淋巴细胞+MO+IL-2，(C)淋巴因子+组胺+IL-2，(D)淋巴细胞+MO+IL-2+组胺。

图3生动描述了在单核细胞存在时，用α-干扰素(100U/ml，涂色柱)，IL-2(100U/ml，空白柱)，培养基(med)，组胺(50μM；h)和/或雷尼替丁(50μM；ran)在37℃时处理16小时，CD3ε⁺淋巴细胞和CD56⁺自然杀伤细胞的活化百分比。柱图显示CD69的表达，且代表三个相似的实验。如图1A所述门控CD3ε⁺T细胞和CD56⁺自然杀伤细胞，与MO一起培养，并用α-干扰素处理(100U/ml，涂色柱)。

图4生动描述了过氧化氢酶对MO诱导的细胞因子的活性抑制的恢复。淘析淋巴细胞和MO一起培养，并如图1A所述用IL-2处理。以0～200U/ml使用过氧化氢酶。利用流式细胞术门控所有存活的细胞来检测CD3ε⁺T细胞的CD69的表达。数据表示CD3ε⁺淋巴细胞的CD69±s.e.m的平均表达量。

图5A生动地描述了H₂受体激动剂保护T细胞和自然杀伤细胞免于MO诱导的细胞死亡。如图1A所述门控CD3ε⁺T细胞和CD56⁺自然杀伤细胞。细胞和MO一起培养，并在37℃用培养基(med)，IL-2(100U/ml)和α-干扰素(100U/ml；IFN)，处理16小时，联用或不联用(空白柱)组胺(50μM)。用流式细胞术根据减小的前散射光和增加的侧散射光测量细胞死亡。该数据表示了具有各个表型的细胞死亡的平均百分比±s.e.m，是根据运用从多达11位献血者收集的细胞的实验得出的。涂色星号P＜0.05指CD3ε⁺T细胞和CD56⁺NK细胞之间的统计学比较。涂色星号(★)指与组胺一起培养的细胞和不与组胺一起培养的细胞的比较。★P＜0.05，★★P＜0.01，★★★P＜0.001。

图5B生动地描述了H₂受体激动剂保护T细胞和自然杀伤细胞免于MO诱导的细胞死亡。如图1A所述门控CD4⁺和CD8⁺/56⁺T细胞。细胞和MO一起培养，并用在37℃用培养基(med)，IL-2(100U/ml)和α-干扰素(100U/ml；IFN)，处理16小时，联用或不联用(空白柱)组胺(50μM)。用流式细胞术根据减小的前散射光和增加的侧散射光测定细胞死亡。该数据表示了具有各个表型的细胞死亡的平均百分比±s.e.m，是根据运用从多达11位献血者收集的细胞的实验得出的。空白星号C；P＜0.05指CD3e⁺T细胞和CD56⁺NK细胞之间的统计学比较。涂色星号(★)指与组胺一起培养的细胞和不与组胺一起培养的细胞的比较。★P＜0.05，★★P＜0.01，★★★P＜0.001。

图6生动地描述了体外疫苗诱导的人单核细胞的增殖。二盐酸组胺(0.05M)存在(涂色柱)或不存在(空白柱)的情况下，用流感疫苗(以指示的终稀释浓度)处理富含单核细胞和T细胞的淋巴细胞混合物。用培养基(Med)做对照。柱代表对3位健康献血者3H-TdR±s.e.m的6份重复分析的每分钟平均计数

                     发明详述

本发明与单独施用组胺或H₂受体激动剂或与其他试剂联用来治疗癌症或病毒性疾病的方法有关。施用各种试剂不仅导致T细胞的活化，保护T细胞免于单核细胞/巨噬细胞的损害性和抑制性效应，而且刺激这些细胞的抗癌和抗病毒特性。另外，在有疫苗成分存在情况下施用组胺，导致在单核细胞存在时淋巴细胞增殖的增加。也设想最好与H₂受体激动剂以协同方式添加其他T细胞活化试剂，这些试剂刺激细胞毒性T细胞(CTLs)的细胞毒性和其他的T细胞活性。这些免疫刺激化合物的代表包括细胞因子、多肽、黄酮类化合物、疫苗和疫苗佐剂。其他类可用于本发明的试剂包含化学治疗剂和/或抗病毒试剂。本发明的方法中也设想与上述化合物联用氧自由基代谢物清除剂。本发明的方法对治疗肿瘤疾病和病毒性疾病有益。

设想在治疗患有不同肿瘤疾病和病毒性疾病的个体时，本发明力求刺激并增强细胞介导的免疫以达到目标。细胞介导的免疫(CMI)包含T淋巴细胞介导的对异物的免疫应答。CMI应答不同于抗体介导的体液免疫，因为用于CMI的活性剂是T细胞而不是抗体蛋白。

细胞介导的免疫通过细胞毒性T细胞或CTLs识别和摧毁表面展示“异质”抗原的细胞产生作用。在本发明中异物可以是肿瘤细胞或病毒感染的细胞。像这样，CMI发挥作用将异质细胞从体内清除。例如，CMI以感染了病毒的细胞为目标，而不是阻止细胞的感染。细胞介导的免疫，不象体液免疫可对防止病毒感染有效，而是保持对已形成的病毒感染防御的基本机制。它在与肿瘤疾病的斗争中也很关键。所以，本发明的增强T细胞活性方面对抗肿瘤疾病和病毒疾病非常适合。

如上讨论，免疫系统包含许多不同类细胞。每一种都保护自体免受异质侵袭。免疫系统的一些细胞产生氧自由基代谢物(ROM)。如过氧化氢，次卤酸以及往这方面发展的氢氧根。以往的观察发现，自身单核细胞/巨噬细胞(MO)有效地抑制人自然杀伤细胞(NK)在体外应答细胞因子刺激(如IL-2或IFN-α)引起的活化。(综述见，Hellstrand，K.，等，Scand.J.Clin.Lab Invest.57：193-202(1997))。过氧化氢或其他MO产生的活性氧代谢物(ROM)传导抑制信号。(见Hellstrand，K.，et al.，J.Immuno.，153：4940-4947(1994)；Hansson，M.，等，J.Immuno.156：42-47(1996)。加入减少过氧化氢浓度的过氧化氢清除剂和/或加入抑制过氧化氢释放的化合物，如组胺或H₂-受体激动剂，都已显示清除了MO的抑制效应。同前。

对实验肿瘤模型和人肿瘤疾病的观察，认为T细胞是重要的应答不同细胞因子如，IFN-α和IL-2抗肿瘤特性的效应细胞。(Sabzevari，H.，等，Cancer Res.53：4933-4937，(1993)；Hakansson，A.，等，Br.J.Cancer 74：670-676，(1996)；Wersall和Mellstedt，Med.Oncol.，12：69-77，(1995))。

本发明也与一种或多种引起T细胞活化或刺激的T细胞活化化合物联用减少ROM浓度的化合物的方法部分相关。本发明，通过施用影响ROM的化合物，T细胞活化化合物，和/或抗癌症和抗病毒化合物，提供了靠增加T细胞数目和特异性活性治疗肿瘤疾病和病毒性感染的方法。

本领域已知许多T细胞活化化合物能激活和刺激T细胞活性。可以运用该领域熟知的这些物质的剂量、给药途径、使用和服用方案。总的来说，白细胞介素、细胞因子和黄酮类化合物已显示刺激T细胞的活化作用。合适的化合物的例子选自IL-1，IL-2，IL-12，IL-15，IFN-α、IFN-β、IFN-γ和醋酸黄酮、4-醋酸呫吨酮及其类似物或衍生物。

也可考虑一些疫苗和疫苗佐剂作为T细胞活化化合物。此处设想的化合物包括许多疫苗和疫苗佐剂，其在免疫过或接种过疫苗的个体体内有助于服下的抗原诱导快速、有效、持久的T细胞介导的免疫应答。具有说明性的疫苗包括流感疫苗、人免疫缺陷病毒疫苗和各种抗癌治疗性疫苗如该领域已知的同种异型肿瘤和自身肿瘤疫苗。

本发明也涉及各种疫苗佐剂的使用。这些试剂包括卡介苗(BCG)，百日咳毒素(PT)，霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热敏性毒素(LT)、分枝杆菌71-KDa细胞壁结合蛋白、疫苗佐剂水包油型微乳剂MF59、由生物可降解聚合物聚(丙交酯-并-乙交酯)(PLG)制备的微粒、具有30-40nm笼状结构的免疫刺激复合体(isocoms)，(由佐剂QuilA的葡糖苷、胆固醇和可整合抗原的磷脂组成)，和其他在本领域中已知的合适的化合物和组合物。可服用足够量的该类化合物引发已免疫个体的有效的免疫应答。

本发明设想并公开了许多不同的T细胞活化化合物。可使用这些化合物形成T细胞活化组合物，作为本发明达到活化病人T细胞的一个步骤。本发明设想可互换使用T-细胞活化化合物和T细胞活化组合物的术语。可使用本领域已知的该类化合物传统的使用剂量，给药途径和服用方案。

H₂-受体激动剂、组胺和其他适用于本发明具有H₂-受体激动剂活性的化合物是本领域已知的。适用化合物的例子包括具有类似于组胺或5-羟色胺化学结构但不负面影响H₂-受体活性的化合物。

适用化合物选自组胺、地马普替、可乐定、苯甲唑啉、双咪硫胍、4-甲基组胺、氨乙吡唑、组胺同系物、H₂-受体激动剂、8-OH-DPAT、ALK-3、BMY7378、NAN190、麦角乙脲、d-LSD、flesoxinan、DHE、MDL72832、5-CT、DP-5-CT、ipsapirone、WB4101、酒石酸麦角胺、丁螺旋酮、麦角苄酯、spiroxatrine、PAPP、SDZ(-)21009和butotenine。

各种有效催化细胞间H₂O₂分解的过氧化氢(H₂O₂)清除剂也是本领域已知的。适用化合物从过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、维生素E、硒、谷胱甘肽及抗坏血酸中挑选。

可在体外或体内服用上述讨论的化合物。体外给药时，可使用任何一种无菌、无毒给药途径。体内给药时，通过皮下、静脉、肌肉、眼内、口服、粘膜或透皮途径方便地给药上述讨论的化合物，例如可通过注射或控释方式。控释机制的例子包括：聚合物、凝胶、微球、脂质体、片剂、胶囊、栓剂、泵激器、注射器、眼睛嵌入物、透皮制剂、洗剂、乳剂、透鼻喷雾剂、亲水咀嚼剂、微胶囊、吸入剂以及胶体药物分配系统。

本发明的化合物以药学上可接受形式和基本上无毒剂量服用。本发明设想了各种服用这类化合物的形式。可以在加或不加表面活性剂如羟丙基纤维素的情况下溶于水服用这类化合物。也设想使用分散剂，如运用甘油、液态聚乙二醇以及油的分散剂。也可在制剂中加入抗菌化合物。注射制剂包括无菌水溶液或在使用前需在无菌环境中稀释或悬浮的分散剂或粉剂。

也可在本发明的化合物中加入载体如溶剂或含水、乙醇多元醇、植物油以及类似物的分散介质。可用衣膜如卵磷脂和表面活性剂保持组合物合适的流动性。可以加入等渗剂如糖类或氯化钠和用于延缓活性化合物吸收的产品如单硬脂酸铝和明胶。根据本领域熟知的方法制备无菌注射溶液并在贮藏和/或使用前过滤。无菌粉剂可从溶液或悬浮液中抽真空或冻干。本发明也设想了缓释制剂。任何用于本发明的组合物中的材料应是药学上可接受的，并且采用的量基本上无毒。

尽管在一些这类化合物的跟踪实验中采用单一浓度，应理解在临床条件下，可以多种剂量在长时间内服用这些化合物。典型地，服用这类化合物达约一周，甚至长达一月或一年。在一些情况下，可中断服用这类化合物，然后在以后时间里再续用。这类化合物的日用剂量可按几种剂量或单一剂量服用。

另外，本发明的这类化合物可分别服用或作为单一组合物(联合)服用。如果分别服用，化合物可按时间上接近的方式服用，如在24小时内，这样增强细胞因子或其它化合物对T细胞的激活。更特殊的情况，这类化合物可以彼此在一个小时内施用。可运用局部或系统注射或灌注方式给药。也可运用其它给药方法。

本发明也设想联用具有T细胞活化或刺激特性的T细胞活化化合物，联用过氧化氢产生或释放抑制化合物，联用过氧化氢清除化合物，联用抗癌化合物，以及联用抗病毒化合物。可运用本领域熟知的传统的这类物质的剂量、给药途径和使用方案。例如，联用IL-2和IL-12激活T细胞。或者，采用疫苗或佐剂激活T细胞。另一例是在治疗阶段，与组胺一起联用H₂-受体激动剂如地马普替(SK&F，Hertfordshire，England)抑制单核细胞产生或释放过氧化氢。也设想联用各种过氧化氢化合物如过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶。本发明还设想通过联用上述讨论的所有不同化合物，配制出一种刺激T-细胞防御肿瘤和/或病毒性疾病的有效方法。

为统一剂量和服用途径，所有化合物制剂以单剂量形式提供。每一单剂量形式包括预算好的一定量的活性成分，其与一定量的药学上可接受载体一起能产生预想效果。因此这样一种单剂量确定了某一特定化合物的有效量。

用本领域已知的常规技术确定优选的化合物单剂量范围。IL-2，IL-12或IL-15按约1000到约600,000U/天服用。(18MIU/m²/天或mg/m²/天)。更优选的剂量是从约3000到约200,000U/kg/天，最优选的剂量是约从5,000到约10,000U/kg/天。

IFN-α、IFN-β和IFN-γ也可按剂量约10,000到约600,000U/kg/天服用，更优选的剂量是从约3,000到约200,000U/kg/天，最优选的剂量是约10,000到约100,000U/kg/天。

黄酮类化合物可按约1到约100,000mg/天服用，更优选的剂量是约5到约10,000mg/天，最优选的剂量是约50到约1,000mg/天。本发明的这些化合物的一般使用剂量在本文列出的范围之内。例如IL-2单独使用的一般剂量约300,000U/kg/天。IFN-α单独使用的一般剂量约45,000U/kg/天。IL-12在临床试验中以0.5-1.5μg/kg/天的剂量使用。Motzer，等，Clin.Cancer Res.4(5)：1183-1191(1998)。IL-1β在癌症病人中以0.005～0.2μg/kg/天使用。Triozzi，等，J.Clin.Oncol.13(2)：482-489(1995)。IL-15以25～400μg/kg/天剂量用于大鼠。Cao，等，Cancer Res 58(8)：1695-1699(1998)。

疫苗和疫苗佐剂以适于其各自激活T-细胞的量服用。每一个适当剂量由本领域熟知的常规技术确定。运用与确定适当的化学治疗剂量的相似的技术，部分依据某一特定剂量的耐受性和有效性来做剂量确定。

可以约0.05至约10mg/天的有效剂量服用抑制细胞间过氧化氢的形成或释放的化合物或过氧化氢的清除剂。更优选的剂量是约0.1到约8mg/天，最优选的剂量是约0.5到约5mg/天。或者，以每千克病人体重1至100微克服用这些化合物(1至100μg/kg/天)。不过，无论怎样，剂量依赖于服用的化合物的活性。先前的剂量对组胺，H₂-受体激动剂，其它细胞内H₂O₂产生或释放抑制剂或H₂O₂清除剂适用并有效。可运用本领域熟知的经验技术确定任何特定宿主的适用剂量。

本发明设想确定病人需要增强的T细胞活性和设想增加该病人的循环血中组胺或H₂-受体激动剂浓度达到最佳的有益的治疗水平以更有效地刺激T细胞活性。可通过在治疗阶段每天反复注射本发明中的化合物达到这样的水平。

癌症患者经常表现出血循环中组胺的水平降低。(Burtin等，.恶性实体肿瘤患者中降低的血液中组胺水平，Br.J.Cancer 47：367-372(1983))。因此，根据组胺与增强细胞毒性效应细胞介导的细胞毒性的试剂的协同作用，升高血液中组胺浓度至有益水平为癌症和病毒治疗提供了即时的实用性。在这些方案中，T细胞活性增强。例如，通过联用H₂-受体激动剂如组胺和与H₂-受体激动剂协同增加细胞毒性的试剂，提高细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的细胞毒活性，前者增加血循环中组胺至有益的水平可以提高后者的活性。

在本发明的一个实施方案中，按0.05至10mg/天剂量，服用H₂-受体激动剂可以使血循环中H₂-受体激动剂达到有益水平。另一个实施方案，在治疗1-4周，甚至长达52周阶段，每天注射给药H₂-受体激动剂几次。还有一个实施方案，每天多注射几次达1-2周。这种给药可每几周重复一次长达52周或更长时间。另外，给药频率根据病人对治疗的耐受力及治疗成功率变化。例如，可以每周三次给药，或者甚至是每天给药，长达24个月。

本发明的一个实施方案是设想对于各种癌症和肿瘤性疾病治疗的应用。本发明针对的恶性肿瘤包括，但不局限于原发和转移的恶性肿瘤疾病。血液恶性肿瘤如急性和慢性骨髓细胞性白血病、急性和慢性淋巴性白血病，多发性骨髓瘤、Waldenstroms氏大球蛋白血病、多毛细胞白血病、脊髓发育不全综合症、真性红细胞增多症、以及自发性血小板增多症。

可单独使用本发明的方法或与其它抗癌疗法联用。当与化学治疗方案联用时，H₂-受体激动剂和T细胞活化化合物与化学治疗剂一同服用。运用本领域熟知的这些物质的传统剂量、给药途径和使用方案。用于癌症治疗的代表化合物包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、雌氮芥、异环磷酰胺、松龙苯芥、马利兰、帖太帕(tiottepa)、卡氮芥、罗氮芥、甲氮蝶呤、硫唑嘌呤、硫嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、长春碱酰胺、鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙、更生霉素、阿霉素、克鲁诺霉素(clunorubicine)、艾比鲁霉素(epirubicine)、博来霉素、尼托霉素(nitomycin)、顺氯氨铂、卡伯帕丁(carbopaltin)、甲基苄肼、阿莫克林(amacrine)、米托先特隆(mitoxantron)、三苯氧胺、尼鲁特米德(nilutamid)及氨基乙哌啶酮。已确定了采用这些抗恶性肿瘤的化合物的程序。另外，也可和本发明一起使用其它癌症治疗化合物。

本发明设想治疗各种病毒性疾病。以下仅仅是对本发明有效的一些病毒性疾病的例子。由许多由单纯疱疹病毒或带状疱疹病毒引起的疱疹性疾病包括面疱疹、生殖器疱疹、唇疱疹、包皮疱疹、外生殖器疱疹、经期疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎、带状疱疹性眼炎以及带状疱疹。本发明对治疗每一种这样的疾病有效。

另一方面，本发明对引起肠道疾病的病毒有效，如轮状病毒介导的疾病。

另一方面，本发明对不同的血源性感染有效。例如，黄热病，登革热，埃博拉，克里来亚-刚果出血热，汉坦病毒疾病，单核细胞增多症和HIV/AIDs。

本发明的另一方面针对不同的肝炎病毒。这类病毒的代表包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和戊型肝炎病毒。

还有一方面，本发明对由病毒感染引起的呼吸道疾病有效。例子包括：鼻病毒感染(感冒)腮腺炎、风疹、水痘、乙型流感、呼吸道多核体病毒感染、麻疹、急性发热性咽炎、咽结膜热以及急性呼吸性疾病。

本发明的另一方面设想治疗不同癌症相关的病毒，包括：成年T细胞白血病/淋巴瘤(HTLVs)、鼻咽癌、伯基特淋巴瘤(EBV)、宫颈癌、肝细胞癌。

还有一方面，本发明对治疗病毒介导的脑炎有用，包括：圣路易斯脑炎、Western脑炎以及壁虱脑炎。

可单独使用本发明的方法或与其它抗病毒疗法联用。当与抗病毒化学治疗方案联用时，H₂-受体激动剂和T细胞活化化合物与抗病毒化学治疗剂一起服用。运用本领域熟知的这些物质的传统剂量、给药途径和使用方案。用于抗病毒化学治疗得到表化合物包括：碘苷、三氯胸苷、阿糖腺苷、无环鸟苷、溴乙烯去氧尿苷、三唑核苷、膦酰基三钠(trisodium phosphophonoformate)、金刚烷胺、金刚乙胺、(顺式)-9-(2′，3′-二氢丙基)-腺嘌呤，4′，6′-二氯黄酮、AZT、3′(-叠氮-3′-脱氧胸苷)、苷昔韦洛、地达诺新(2′，3′-双脱氧肌醇，或ddI)、扎西他宾(2′，3′-双脱氧胞苷或ddC)双脱氧腺苷(ddA)、尼弗拉平(nevirapine)，HIV蛋白水解酶抑制剂及其他病毒蛋白水解酶抑制剂。

本发明也设想与H₂-受体激动剂和/或ROM清除剂联用抗癌和抗病毒剂。

尽管不想限定本发明，但设想了本发明的方法通过改变抗原呈递力学提交T-细胞活性。一种理论提出抑制同是抗原呈递细胞(APC)的单核细胞/巨噬细胞向T细胞呈递抗原。这种抑制可能是由于产生ROM的MO代谢途径，ROM抑制MO抗原呈递代谢途径，抑制产生互相排斥抗原呈递或抑制MO的ROM产生状态。MO抗原呈递抑制的结果是T细胞数目在呈递抗原不存在和ROM存在情况下保持休眠状态。

根据这一理论，服用ROM产生和释放抑制化合物如组胺，可通过增加抗原呈递增加T细胞活性。产生ROM的单核细胞可能在组胺的有益浓度出现时有一个分子开关，组胺导致ROM产生的下调。在上述下调的互相排斥代谢状态，ROM产生的下调导致随后的抗原呈递途径的增加，因此抗原呈递增加。相应地，服用依赖抗原的T细胞激活剂如疫苗，可通过减少ROM产生和增加抗原呈递，来增加T细胞活性。

在另一个理论中，服用ROM产生和释放抑制化合物通过清除ROM诱导的T细胞抑制而增加T细胞活性。

以下讨论的例子采用了本发明的学说并显示了单核细胞/巨噬细胞(MO)，及特别是MO来源的活性氧代谢物(ROMs)，有效地抑制人T细胞应答体外给药T细胞活化化合物如IFN-α或IL-2引起的活化。而且，还表明当将H₂受体激动剂和H₂O₂加入淋巴细胞和MO的混合物中，对T细胞有保护作用。

为了确定本发明各种化合物对T细胞的作用，研究了CD69(Leu-23)抗原的表达，其系被诱导表达在成熟人T细胞表面的一种早期激活抗原。观察结果表明细胞因子诱导的T细胞活化在H₂受体激动剂或H₂O₂清除剂不存在时被MO完全抑制，T细胞活化是通过在与代表性细胞因子如IL-2或IFN-α一起培养后CD69出现反映的。不过，加入这类化合物会有效地逆转观察到的MO引起的抑制效应。另外的工作是研究在体外组胺对人淋巴细胞对流感病毒多价疫苗增殖应答的影响。在抗原和单核细胞存在时，在这些实验中服用组胺，表现出促进淋巴细胞的增殖。

                      实施例

本发明的方法应用导致T细胞刺激和/或活化的T细胞活化化合物H₂受体激动剂或H₂O₂清除剂和抑制剂来增强T细胞的活化和保护。为证明这类化合物的活化和保护性质，从捐献的血中提取淋巴细胞(包括T细胞)和单核细胞，并在其加入各种T细胞活化化合物如IL-2和/或IFN-α、疫苗、疫苗佐剂或其他免疫刺激剂，各种H₂受体激动剂如组胺以及各种H₂O₂清除剂如过氧化氢酶时，检测活化性质。

为研究在MO存在和不存在时T细胞活化性质，T细胞活化化合物、H₂受体激动剂和H₂O₂清除剂，外周静脉血均由在瑞典哥德堡，圣海伦医院血液中心从健康献血者新鲜制备的leukopacks获得。血液(65ml)于92.5ml Lscove’s培养基，35ml 6％葡萄糖(Kab；Pharmacia，Stockholm，Sweden)和7.5ml酸性柠檬酸葡萄糖(ACD)(Baxter，Deerfield，Illinois)混合。室温下培养15分钟后，将上清小心铺在菲可帕克(Ficoll-Hypaque)上。(Lymphoprep，Myegaard，Norway)。室温下以38Og离心15分钟后在界面收集单核细胞(MNC)，用PBS洗两遍。在补加10％人AB+血清的Lscove’s培养基中重悬。在整个进一步的细胞分离中，细胞悬液在硅烷化试管中保存。(Vacuette，Greiner，Stockholm)。

用逆流离心淘析技术(CCE)进一步将MNC分成淋巴细胞和单核细胞(MO)，该技术由Yasaka及其合作者首次报道。(Yssaka，T.等，J.Immunol.，127：1515)由Hansson.m.，等报道该技术的改良(J.Immunol.，156：42(1996)；由此被文献收录)。简言之，MNC在含0.05％BSA和NaCl缓冲的0.015％EDTA淘析缓冲液中重悬并用JE-68转子插入Beckman J2-21以2100rpm超离心。含＞90％MO的级分以18ml/min的流速获得。富含NK-细胞的淋巴细胞级分(CD3^-/56⁺表型)和T细胞(CD3⁺/CD56^-)以14-15ml/min的流速获得。含＜3％MO以及CD3ε^-/56⁺NK细胞(45-50％)、CD3ε⁺/56^-T细胞(35-40％)、CD3ε^-/56⁺细胞(5-10％)和CD3ε⁺/56⁺细胞(1-5％)的级分，由流式细胞仪判断。在一些实验中，用包被有抗CD56的dymabeads(Dynal A/S，Oslo，Norway)获得纯化的T淋巴细胞制剂，如Hansson，M.，等在上述收录文章中详述。

以下分级分离中，T细胞和NK细胞的淋巴细胞混合物置于不同的如下所述的实验条件下，并运用某些细胞表面蛋白质作为活化指标测定其活化。

通过存在于细胞表面的某些蛋白质鉴定淋巴细胞。不同的细胞表面蛋白质存在于不同淋巴细胞以及处于不同活化状态的淋巴细胞。将这些蛋白质归为CD类或“分化簇”，并且它们可以作为不同细胞的标记。特异性结合不同细胞表面蛋白质即CD标记的标记抗体可用于鉴定T细胞的种类及他们各自的活化状态。

在下述实验中，用CD3、CD4、CD8和CD69标记鉴别重要的T细胞。CD56是NK细胞的标记。CD3抗体对所用外周T细胞表达的一种抗体特异。CD4抗体对II类MHC限制性T细胞即T辅助性细胞上的标记特异。CD8抗体识别I类MHC限制性T细胞即CTLs或细胞毒性T细胞上的特异标记。CD69抗体识别活化的T细胞和其他活化的免疫细胞。最后，CD56识别NK细胞表面的异源二聚体。

如下实验中运用流式细胞术鉴别T细胞亚群。流式细胞术让研究人员通过运用许多标记探针在整体细胞中分化亚群来检测细胞。在试验中，用CD3标记来鉴别T细胞亚群，用CD4和CD8标记进一步鉴别T细胞亚群分成辅助性T细胞和CTLs。用CD69T细胞活化标记检测在MO中加入或不加入组胺和T细胞活化化合物的效应。用流式细胞术估算不同标记的表达。(如在Hellstrand，et al.Cell.Immunol.138：44-54(1991)中所述，本文引入作为参考文献)。

在实验中运用以下方案报告细胞群表面抗原的检测。用适当的异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)标记的单克隆抗体(Becton&Dickinson，Stockholm，Sweden；1μl/10⁶cells)在冰浴培养一百万个细胞，时间30分钟。细胞用PBS洗两遍，并用500μl无菌过滤PBS重悬，然后在带有Lysysll软件程序的荧光激活细胞分选仪上用流式细胞术分析。如不另外说明，流速调整至＜200细胞×S^-1且每个样品至少分析2×10³个细胞。

                       MO

在实施例1中，为研究MO对细胞因子诱导的淋巴细胞活化和成熟的作用，监测了T细胞上CD69的表达。将分离得到的外周血淋巴细胞与MO、T细胞活化化合物和/或H₂受体激动剂一起培养。该实施例的结果表明当加入不同的T细胞活化化合物时，分离得到的T细胞被活化。

T细胞活化化合物对分离得到的淋巴细胞CD69表达的影响

                       实施例1

在微孔板中，加或不加自身MO情况下，于37℃培养分离得到的外周血淋巴细胞16小时(150,000细胞/孔/总体积0.2ml)。同时用T细胞活化化合物如IFN-α(100U/ml)或IL-2(100U/ml)，H₂受体激动剂如组胺(50μM)或培养基对照处理细胞。培养完毕后，淋洗细胞两遍并用标记过的单克隆抗体一起培养，该抗体是T细胞表面标记CD3ε、CD4、CD8和CD69或NK细胞标记CD56的抗体(购自BectonDickinson，stockholm，Sweden)。通过淋巴细胞门控估算，不同抗原的表达(根据前散射和侧散射光)，并与纯的淋巴细胞组分(包含＜3％MO)和与自身MO一起培养的相应的淋巴细胞比较。运用流式细胞术研究了以下亚群：CD3e⁺/4⁺，CD3e⁺/8⁺及CD3E⁺/8⁺/56⁺。

未被刺激的CD3ε⁺T细胞表面CD69表达很低(～2％)。在MO不存在时，用IL-2处理后(100U/ml，16小时)，大约四分之一的CD3ε⁺细胞获得CD69。MO不存在时，用IL-2处理(100U/ml，16小时)，CD69表达。MO的加入(P＜0.005)大大减少了未被刺激和IL-2激活的CD3ε⁺细胞CD69表达。IFN-α对CD3ε⁺细胞CD69表达的诱导程度低于IL-2(-10％)，且加入MO对其形态无影响(图1A)。当研究CD3E⁺T细胞时，发现CD69的组成型表达低(＜1％)，在MO不存在时加入IL-2诱导20％CD3e⁺细胞表达CD69。MO抑制IL-2对CD69的诱导(P＜0.05)。发现IFN-α通过不同方式活化CD4⁺细胞。在无MO存在时，IFN-α在诱导CD4⁺细胞的CD69表达时不如IL-2有效(P＜0.01)，值得注意的是当加入MO时，IFN-α对CD4⁺细胞的CD69表达诱导水平有很大提高(P＜0.05；图1B)。

研究CD8⁺T细胞时，采用了避免被测细胞群受CD8⁺NK细胞污染的措施。在另一组实验里，用抗CD56包被的玻珠除去CD8⁺NK细胞。发现CD8⁺细胞上CD69的组成型表达明显高于CD4⁺细胞(P＜0.05)。在IL-2诱导CD69表达及MO抑制IL-2作用方面，未发现CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞有明显的质的区别。CD4⁺和CD8⁺T细胞的区别是加MO大大抑制了CD8⁺细胞上CD69的组成型表达(P＜0.05)(图1C)。CD3e⁺/8⁺/56^-T细胞的三色分析实验得出了相似结果。通过MO和淋巴细胞相混合的实验得到了图5的数据。

在无MO时，加入组胺并没有显著改变未被刺激或细胞因子活化的T细胞两种亚群的CD69的表达。不过，组胺抵消了MO诱导的对IL-2诱导T细胞CD69获得的抑制作用。图2表示在MO存在或不存在时培养门控的存活的CD3⁺淋巴细胞及对其用或不用组胺处理时，IL-2诱导CD69表达的直方图。当与IFN-α一起培养CD3^-和CD4^-T细胞时，发现当MO存在时，组胺对CD69表达的提高水平显著高于当MO不存在时。(图1A和B)。相反，组胺将IFN-α活化的CD8⁺细胞的CD69表达水平恢复至无明显失常的纯淋巴细胞表达的水平。(图1C)。

该实施例的结果表明自身MO大大抑制了细胞因子对T细胞的活化作用。因此，在受试淋巴细胞亚群中，除了IFN-α处理的CD4⁺细胞外，MO明显抑制了IL-2或IFN-α诱导的CD69的获得。

活性氧代谢物在单核细胞诱导的对T细胞活化抑制作用中的角色

为了探究活性氧代谢物在单核细胞诱导的对T细胞活化抑制作用中的角色，运用了分离得到的淋巴细胞研究了ROM、T细胞活化化合物，H₂受体激动剂以及过氧化氢清除剂的作用。

                     实施例2

在这一实施例中，如实施例1所述在37℃与MO一起培养淘析的淋巴细胞16小时。以10-200U/ml加入过氧化氢酶。即过氧化氢清除剂。以100U/ml加入IL-2。用流式细胞术监测CD3ε⁺T细胞的CD69表达。数据表示CD3ε⁺淋巴细胞的CD69的平均表达±s.e.m。

发现过氧化氢酶显著逆转MO对细胞因子诱导的CD69表达的抑制作用(图4)，但在MO不存在时，不影响对每种细胞的CD69表达的诱导。单独使用过氧化氢酶，浓度范围从0至200U/ml对表达了CD69标记的CD3ε⁺细胞百分比几乎无影响。不过，在IL-2存在时，过氧化氢酶对CD69表达有较大影响。更具体点，数据表明在过氧化氢酶不存在时单独用IL-2处理，只有比4％多一点的被处理CD3ε⁺细胞呈现CD69标记。不过，随着过氧化氢酶浓度从0增加至200U/ml，表达CD69标记的细胞的百分比也从起点增至约11％。

当过氧化氢酶和单核细胞存在时，IL-2的刺激作用大大提高。这些结果表明抑制T细胞活化作用的是MO产生的ROM，T细胞活化通过CD3⁺细胞上CD69的表达来衡量。过氧化氢酶即ROM的清除剂的已知作用是降低MO对T细胞活化的抑制作用。图4显示的数据表明通过过氧化氢酶清除ROM可以逆转T细胞活化的抑制。因此降低了MO对IL-2刺激的CD69表达的抑制作用。

H₂受体激动剂和拮抗剂对细胞因子诱导的T细胞CD69表达的作用

                       实施例3

为了探究H₂受体激动剂对MO诱导的以CD69表达为准的T细胞活化的抑制的作用，在37℃和MO一起培养CD3ε⁺T细胞16小时，并用IFN-α(100U/ml)，IL-2(100U/ml)，培养基，H₂受体激动剂(组胺)和/或H₂受体拮抗剂(雷尼替丁)处理。

组胺对细胞因子诱导CD69表达的作用是剂量依赖性的，组胺终浓度在0.1-50μM，ED₅₀约2μM。雷尼替丁即H₂型组胺受体拮抗剂，以等摩尔或低10倍的浓度完全拮抗组胺作用。相似浓度的AH20399AA不阻断组胺作用，AH20399AA是雷尼替丁的化学对照品，后者的硫酯基被酯基取代，因此其与H₂受体亲和力降低了＞50倍(Hellstrand，K.，等，J.leukoc.Biol.55：392(1994))。

这一实施例的结果表明，H₂受体激动剂组胺能特异性逆转MO对以CD69表达为准的T细胞活化的抑制作用。拮抗剂雷尼替丁验证了该作用的特异性。

         组胺保护T细胞免于MO诱导的细胞凋亡

                       实施例4

在这一实施例中，用细胞染色监测加入MO后淋巴细胞的调亡形态，染色是采用由磷酸盐缓冲液制备的含吖啶橙(10μg/ml；Sigma)和溴化乙锭(10μg/ml；Sigma)的混合染料。于硅烷化试管中，向25μl细胞悬液(1-2×10⁶ml)加1微升(1μl)混合染料。之后，取10μl细胞悬液于玻片上，随即用荧光显微镜(Nikon)以40倍(×40)放大率计数死亡、存活、调亡和非调亡细胞。(见Hellstrand，K.，等.J.Immunol.，153：4940-4947(1994)；Hansson，M.，等.J.Immunol.，156：42-47(1996))。

我们早已证实人T细胞和NK细胞对氧化性应激的敏感性不同。诱导调亡CD3e⁺T细胞比CD56⁺NK细胞需要约高5倍的外源性过氧化氢浓度。(见Hansson，M.，等，supra)。在加MO后通过门控非存活T细胞或NK细胞的方式监测淋巴细胞的细胞死亡。在这些研究中采用了凋亡减小前散射光和增加侧散射光的特点的门控。见Hansson，M.，等，supra；Mizgerd J.P.，等，J.Leukoc.Biol.59：189(1996)；本文引入作为参考文献录在此；门控也如实施例1所述)。正如吖啶橙和溴化乙锭传统染色法揭示，细胞绝大多数调亡了。

在淋巴细胞中加入MO显著诱导淋巴细胞的死亡。因此，在与自身MO一起培养过夜后，大部分的T细胞和NK细胞获得降低的前散射光和增加的侧散射光。当探究调亡的淋巴细胞群中T细胞和NK细胞标记时，发现NK细胞的频数明显比T细胞高。因此，在加入MO后，62％NK细胞和39％CD3ε⁺T细胞死亡，这种区别达到统计学显著性。(P＜0.05；图5A)。相似地，加入MO后，45-55％CD4⁺细胞或CD8⁺/56细胞死亡。CD4⁺细胞和CD8⁺细胞死亡倾向很相似(图5B)。带有CD69的T细胞或NK细胞的频数在死亡和存活淋巴细胞中相似。因此表明对CD69的诱导也同样发生在易于调亡的细胞中。

该实施例的结果表明组胺明显阻止＞80％的所有T细胞和NK细胞亚群由MO诱导的细胞死亡。同时加入IL-2或INF-α处理不影响MO诱导的细胞死亡和组胺发挥的保护作用(图6A和6B)。过氧化氢酶模拟组胺对MO诱导细胞死亡的作用。雷尼替丁则完全逆转其作用，但等摩尔或10倍低于组胺浓度的AH20399AA不能逆转其作用。

       联用H₂受体激动剂和T细胞活化化合物的治疗

上述讨论的增加血液H₂受体激动剂浓度在对被确认需要提高T细胞活性的病人的治疗中得到应用，通过以协同方式联用H₂受体激动剂和增加T细胞细胞毒性或活性的免疫刺激化合物提高CTL细胞毒性。如上述讨论，细胞毒性增强剂之一是IL-2。实施例5和6描述了治疗方法，通过服用H₂受体激动剂组胺达到有益浓度水平以提高IL-2活性。

                     实施例5

以药学上可接受形式，按剂量约0.2至2.0mg或3-10μg/kg将H₂受体激动剂组胺溶于无菌载体溶液中皮下注射，需要增强T细胞活性的患者，该病例病人是患有恶性肿瘤.同时，皮下给药IL-2，如人重组IL-2((Proleukin^，Eurocetus)或以27μg/kg/天连续灌注1-5天和8-12天。该剂量代表比本领域用此类方式给药剂量明显低的IL-2的总剂量。

每隔4-6周重复上述过程直至发现肿瘤疾病的客观消退，甚至在发现有部分或完全反应后继续这种治疗。对于有完全反应的病人，可以以两个循环之间更长的间隔进行这种治疗。

这种治疗也包括通过以0.2至2.0mg或3-10μg/kg注射组胺每天1次、2次或更多此周期性提高病人血液组胺水平，以规律性间隔如每天一次，每周两次或每周一次持续一至两周，以使血液中的组胺达到一个有益浓度。

                         实施例6

以27μg/kg/天给需要增强的T细胞活性的病人皮下注射或连续输注人重组IL-2(Proleukin^，Eurocetus)1-5天和8-12天，该病例病人感染了II型单纯疱疹病毒(HSV)。将组胺溶于无菌载体溶液以药学上可接受形式以0.2至2.0mg或3-10μg/kg给病人皮下注射以达到组胺的治疗血浓度。

每隔4-6周重复上述过程直至发现病症的客观消退。甚至在发现首次、再次或后来的完全症状消失后可继续这种治疗。

这种治疗也包括通过以0.2至2.0mg或3-10μg/kg注射组胺每天1次、2次或更多此周期性提高病人血液组胺水平，以规律性间隔如每天一次，每周两次或每周一次以达到一个有益的组胺浓度。

          联用H₂受体激动剂和T细胞活化化合物

也可采用联用增加T细胞数目、活性或作用的免疫刺激化合物的治疗使循环血中H₂受体激动剂如组胺的浓度达到有益水平。实施例7描述了如何进行这样的治疗。

                       实施例7

对需要增强的T细胞活性的患者以27μg/kg/天皮下注射或连续灌注人重组IL-2(Proleukin^，Eurocetus)1-5天和8-12天，患者需要增强T细胞活性是直接或间接由肿瘤疾病和/或病毒性感染如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)或I型或II型单纯疱疹病毒(HSV)或其他病毒性感染引起。另外，患者也可以适当途径如皮下注射接受日剂量6×10⁶U的α-干扰素。这种治疗也包括与IL-2和/或IFN-α联用每天以0.2至2.0mg或3-10μg/kg组胺注射一次、两次或更多次。

每隔4-6周重复上述过程直至发现肿瘤的客观消退或直接出现病毒性感染的改善。甚至在发现首次、再次或后来完全的消退后也继续这样的治疗。对于有完全反应的病人，可以在两次循环之间以更长的间隔进行这样的治疗。

该治疗也包括通过以0.2至2.0mg或3-10μg/kg剂量每天注射组胺一次、两次或更多次周期性升高病人血液组胺水平，以规律性间隔如每天一次，两周一次或每周一次持续一至两周，使血液组胺保持有益浓度如在0.2μmole/L以上。

另外，服用α-干扰素的频率根据病人对治疗的耐受性和治疗的成功性改变。例如，每周或每天三次服用干扰素，时间长达24个月。本领域常用的是运用熟悉的各种干扰素以达到有益的效果并使病人舒适。

              联用H₂受体激动剂和化学治疗剂

也可与化学治疗剂联用H₂受体激动剂治疗肿瘤或病毒性疾病。一般来说，在化学治疗期间循环血中的组胺水平会下降。低水平的循环血中的组胺可以导致单核细胞对CTL细胞毒性的抑制。因此，这些病人需要增强的T细胞活性。在化学治疗之前、当中、之后或整个过程中服用H₂受体激动剂象组胺增加血中组胺浓度至一个有益的水平可以消除单核细胞介导的抑制作用。

相应地，本发明设想联用化学治疗剂增加循环血中组胺水平。另外，该治疗也包括服用活化T细胞的免疫刺激剂如IL-2、IFN-α和/或疫苗或疫苗佐剂。

上面描述了用于肿瘤治疗和抗病毒治疗的代表化合物。在本发明中也应用其他肿瘤和抗病毒治疗化合物。相似地，也描述了恶性肿瘤和病毒性疾病，本发明的治疗方案对其有效并因此可能有指导性。应注意的是用于本发明的方法的这些抗癌和抗病毒化合物的量、给药途径和剂量方案是本领域熟知的。本发明旨在提高这些化合物的功效及其治疗结果。因此，设想与这些化合物联用的传统方法和本发明的方法足够达到预期治疗效果。

在治疗急性骨髓细胞性白血病时，为活化NK细胞联用组胺和IL-2证明是与传统化学治疗方法有效的联用。Brane和Hellstrand，Br.J.Heamatology，92：620-626(1996)。实施例8至10提出了与各种化学治疗剂和免疫刺激剂如刺激T细胞的IL-2联用本发明的H₂受体激动剂的程序。也赞同在单独使用化学治疗剂或免疫刺激剂的治疗中采用有益的血循环组胺水平。

                      实施例8

用IL-2对AML首次、再次或后来完全消退的病人治疗21天(35-50μg(相当于6.3-9×10⁵IU)皮下(s.c.)，每天两次，3-6周间隔后重复，并在恶化后继续。在循环血中，病人接受三周低剂量的包括16mg/m²/天阿糖胞苷和40mg/天硫代鸟嘌呤的化学治疗。同时，给病人每天两次按0.2至2.0mg或3-10μg/kg以药学上可接受形式皮下注射H₂受体激动剂如组胺以提高血循环中组胺至有益水平(0.2μmole/L以上)。在IL-2治疗阶段，按0.2至2.0mg或3-10μg/kg以H₂受体激动剂药学上可接受形式每天注射组胺两次，可以连续升高组胺水平至有益的水平。此后允许病人休息三至六周。

在第一循环中(循环#1)休息阶段后，开始第二循环(循环#2)。以H₂受体激动剂药学上可接受形式将其溶于无菌载体溶液，按0.5至2.0mg或3-10μg/kg每天皮下注射两次。服用阿糖胞甙(Cytarabine)(16mg/m²/天S.C.)和硫代鸟嘌呤(40mg/天，口服)21天(或直至血小板数目≤50×10⁹/l)。在中间的一周，给病人按0.2至2.0mg或3-10μg/kg以药学上可接受形式每天注射组胺两次以升高血循环中组胺至有益水平。在化学治疗的第三周末，给病人以0.2至2.0mg或3-10μg/kg以药学上可接受形式每天注射组胺两次，时间为一周。此后病人接受IL-2三周。允许病人休息三至六周。

此后开始第三循环(循环#3)。循环#3同循环#2。

或者，该治疗也包括以0.2至2.0mg或3-10μg/kg每天注射组胺一次、两次或更多次以达到周期性升高病人血液中组胺浓度至一个有益的水平，以规律性间隔如每天一次、每周两次或每周一次持续一至两周。另一种选择是以缓释剂或控释剂形式提供组胺。

                         实施例9

给患者以药学上可接受形式按0.1-5.0mg/天服用组胺或其他H₂受体激动剂，这些患者患有恶性肿瘤、肿瘤性疾病或感染了病毒如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或其他病毒，并暗示有T细胞活性缺陷。服用H₂受体激动剂一周至长达12个月以上或与抗病毒化合物和/或T细胞活化剂联用。

重复上述过程直至发现肿瘤客观的消退，或直至发生病毒性感染的好转。甚至在发现部分或完全反应后继续这种治疗。对于有完全反应的病人，在两个循环之间以更长间隔进行这种治疗。

该治疗也包括以0.1至5.0mg或1-50μg/kg每天注射组胺一次、两次或更多次；以规律性间隔如每天一次、每周两次、每周一次持续一至两周，周期性升高病人血液组胺水平以达到或保持血液组胺在一个有益的浓度。以药学上可接受形式如无菌载体溶液，以0.1-5.0mg/针每天皮下注射组胺1-4次以增加循环血中组胺至一个有益水平。

                         实施例10

按0.1至5.0mg或1-50μg/kg以药学上可接受形式给患者注射组胺或其他H₂受体激动剂，这些患者患有恶性肿瘤或由病毒如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)或I型或II型单纯疱疹病毒(HSV)或其他病毒引起的有T细胞活性缺陷的感染。同时，可以与H₂受体激动剂联用抗癌和/或抗病毒剂，使用本领域熟知的标准剂量、给药途径和方案。

每隔4-6周重复上述过程直至发现客观的肿瘤消退或直至病毒性感染发生好转。甚至在发现有部分或全部反应后继续这种治疗。对于有完全反应的病人，在两个循环之间以更长的间隔进行这种治疗。

以药学上可接受形式如无菌载体溶液，按0.1至5.0mg或1-50μg/kg每天皮下注射组胺一次、两次或更多次，以规律性间隔如每天一次、每周两次、每周一次持续一至两周，以达到有益的血液组胺的浓度。

组胺对人单核细胞的流感病毒多价疫苗引起的增殖反应的影响

接种疫苗或感染对免疫的诱导包括T细胞对抗原的增殖反应。抗原诱导的淋巴细胞增殖需要单核细胞或其他向淋巴细胞呈递抗原的佐细胞结合主要组织相容性产物。单核细胞也向淋巴细胞的增殖提供重要的辅助信号。

已经描述了组胺，贮藏在循环的嗜碱性白细胞和与组织结合的肥大细胞中的生物性氨，对于免疫效应器机制的调节作用。Beer等，Adv.Immunol.35：209-263(1984)有所综述。已表明组胺能降低凝集素如植物凝集素及细菌毒素如A型葡萄球菌肠毒素引起的淋巴细胞增殖。Dohlsten等，Cellular Immunology 109：65-74(1981)。H₂型组胺受体介导组胺对淋巴细胞功能的这些或其他作用。

表明组胺抑制淋巴细胞增殖的报道的局限是运用了少量单核细胞。例如，在实体肿瘤中，经常发现单核细胞或单核细胞样细胞是最主要的浸润单核细胞型。Alexander等，Ann.NY Acad.Sci.276：124-33(1976)。

为了更充分专注于体内条件如在肿瘤组织中，对体外淋巴细胞和50％单核细胞的混合物研究了组胺对抗原诱导的淋巴细胞增殖的作用。将标准的多价人流感疫苗用作淋巴细胞的诱导剂。意外地，该数据表明组胺大大提高这种疫苗引起的增殖应答。

                     实施例11

如上所述获得外周静脉血样和制备MNC。如上述进一步分离细胞，以流速13-14ml/min回收富含T细胞(CD3⁺/56^-)的淋巴细胞级分。这一级分不含单核细胞。

当单核细胞存在(0.9×10⁵细胞/孔)或不存在时，以总体150μl在微平板培养富含T细胞的淋巴细胞(0.9×10⁵细胞/孔)。在培养开始加入二盐酸组胺(0.05mM)(Sigma Chemicals，st.Louis，USA)或培养剂(对照)，在37℃培养72-96小时。在所有的孔中以如下所述不同稀释浓度加入15μl多价流感疫苗。(Begrivac，Hoechst；购自SBLVaccine AB，Stockhoolm，Sweden)。为定量增殖数量，用³H-甲基-胸腺嘧啶(³H-TdR；比活2Ci/mole New England Nuclear Corp；1uci/2×10⁵细胞)脉冲标记细胞8小时。用带有自动细胞收获器的玻璃纤维滤器收集细胞。用固相闪烁照相术估计细胞吸收³H-TdR的量。

图6显示组胺对流感疫苗诱导的富含T细胞淋巴细胞的增殖的作用。在二盐酸组胺(0.05mM)存在(涂色柱)或不存在(空白柱)时用流感疫苗(按给定的稀释度)处理富含T细胞的淋巴细胞和单核细胞的混合物。用培养基(Med)做对照。柱代表的数据是在三个健康献血者中进行的6份重复分析得出的每分钟³H-TdR±s.e.m的平均计数并且反映DNA合成作为细胞增殖的一个标准。显示了从来至三个不同健康献血者(实验1-3)的细胞得出的结果。

显示的数据表明组胺对增殖应答有深远影响。在对照细胞中，即未用疫苗处理的细胞，组胺只轻微提高增殖。相似的，单独用疫苗只能轻微诱导增殖。相反，组胺在研究的所有疫苗的稀释度下大大促进疫苗诱导的增殖。疫苗和组胺联用的作用显著高于疫苗单独诱导的效果。(P＜0.01，在实验1和3中，以疫苗终稀释度为1/10，1/30，1/100和1/300；P＜0.05在实验3中以疫苗1/30稀释度)。而且，在疫苗稀释度为1/10(实验3)，1/30(实验1、2和3)，1/100(实验1、2和3)和1/300(实验1)时，疫苗和组胺处理的细胞的增殖明显高于(P＜0.05，P＜0.001)单独使用组胺诱导的增殖。观察得到的细胞增殖的明显增加表明联用疫苗和组胺导致富含T细胞淋巴细胞的增殖水平的增加。

                     结论

此处提供的数据证明MO抑制T细胞活化。MO对T细胞活化的抑制似乎应通过ROM的形成介导的。上述讨论的实验表明通过加入ROM形成抑制剂如组胺或ROM清除剂如过氧化氢酶逆转MO对T细胞的抑制。这些结果表明下调MO的抑制作用有助于T细胞的活化。

上述结果也表明当MO存在时CD3⁺T细胞对细胞因子的刺激不起反应。结果也表明组胺几乎完全抵消MO对细胞因子诱导CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞上CD69的获得的抑制作用。在MO存在时组胺对CD69表达的正相作用表明下调MO的抑制作用有助于以T细胞为效应细胞的抗癌或抗病毒治疗方案。

上述讨论的实验表明，与刺激或活化T细胞的免疫刺激化合物一起联用组胺能基本上增加刺激化合物引起的T细胞活化的水平。这些发现具有重要的临床意义。因为T细胞在免疫系统应答肿瘤和病毒感染时起关键作用。从上述显示的结果看很清楚：利用H₂受体激动剂和T细胞活化化合物的关系可增加治疗剂如抗病毒剂和抗癌剂的功效。

Claims (39)

1.T细胞活化组合物和抑制细胞间活性氧代谢物的产生或释放的组合物在制备用于在有此需要的病人中上调CD69在T细胞上的表达的药物中的应用。

2.权利要求1的应用，其中T细胞活化组合物包含疫苗佐剂、疫苗、肽、细胞因子或黄酮类化合物。

3.权利要求2的应用，其中疫苗佐剂选自卡介苗、百日咳毒素、霍乱菌毒素、大肠杆菌热敏性毒素、分枝杆菌71-kDa细胞壁相关蛋白、微乳剂MF59、聚(丙交酯-并-乙交酯)微颗粒和免疫刺激复合体。

4.权利要求2的应用，其中疫苗选自流感疫苗、人免疫缺陷性病毒疫苗、肠炎沙门氏菌疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、支气管炎博德特氏菌疫苗、肺结核疫苗、同种异型肿瘤疫苗和自身肿瘤疫苗。

5.权利要求2的应用，其中细胞因子选自IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β或IFN-γ。

6.权利要求2的应用，其中黄酮类化合物选自醋酸黄酮和4-醋酸呫吨酮。

7.权利要求1的应用，其中所述药物包含T细胞活化组合物，日剂量在1000和600,000U/kg之间。

8.权利要求1的应用，其中抑制细胞间活性氧代谢物产生或释放的组合物选自组胺、5-羟色胺、地马普替、可乐定、苯甲唑林、双咪硫胍、4-甲基组胺、氨乙吡唑及组胺同系物。

9.权利要求1的应用，其中所述药物包含0.05至50mg剂量的细胞间活性氧代谢物产生或释放的抑制剂。

10.权利要求1的应用，其中所述药物包含细胞间活性氧代谢物产生或释放的抑制剂，剂量为1至500μg/kg病人体重。

11.权利要求1的应用，其中所述药物包含T细胞活化组合物和细胞间活性氧代谢物产生或释放的抑制剂，并且在相隔1小时内服用。

12.权利要求1的应用，其中所述药物包含T细胞活化组合物和细胞间活性氧代谢物产生或释放的抑制剂，并且在相隔24小时内服用。

13.权利要求1的应用，其中所述药物还包括细胞间活性氧代谢物清除剂。

14.权利要求13的应用，其中清除剂选自过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶及抗坏血酸盐过氧化酶。

15.权利要求13的应用，其中所述药物包含剂量从约0.05至50mg/天的清除剂。

16.权利要求13的应用，其中将所述药物分别配制成T细胞活化组合物及细胞间活性氧代谢物抑制或清除组合物。

17.权利要求1的应用，其中所述药物还包含化学治疗剂。

18.权利要求17的应用，其中化学治疗剂包含选自环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、雌氮芥、异环磷酰胺、松龙苯芥、马利兰、帖太帕、卡氮芥、罗氮芥、甲氮蝶呤、硫唑嘌呤、硫嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、长春碱酰胺、鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙、更生霉素、阿霉素、克鲁诺霉素、艾比鲁霉素、博来霉素、尼托霉素、顺氯氨铂、卡伯帕丁、甲基苄肼、阿莫克林、米托先特隆、三苯氧胺、尼鲁特米德及氨基乙哌啶酮的抗癌剂。

19.权利要求17的应用，其中化学治疗剂包含选自碘苷、三氯胸苷、阿糖腺苷、无环鸟苷、溴乙烯去氧尿苷、三唑核苷、膦酰基三钠、金刚烷胺、金刚乙胺、(S)-9-(2′，3′-二氢丙基)-腺嘌呤，4′，6′-二氯黄酮、AZT、3′(-叠氮-3′-脱氧胸苷)、苷昔韦洛、地达诺新、扎西他宾、双脱氧腺苷、尼弗拉平，HIV蛋白水解酶抑制剂及其他病毒蛋白水解酶抑制剂的抗病毒剂。

20.权利要求17的应用，其中同时进行T细胞活化组合物，抑制细胞间过氧化氢产生或释放的组合物及化学治疗剂的给药步骤。

21.包含疫苗佐剂或疫苗的T细胞活化组合物和抑制细胞间活性氧代谢物的产生或释放的组合物在制备用于激活有此需要的病人的T细胞的药物中的应用。

22.权利要求21的应用，其中疫苗佐剂选自卡介苗、百日咳毒素、霍乱菌毒素、大肠杆菌热敏性毒素、分枝杆菌71-kDa细胞壁结合蛋白、微乳剂MF59、聚(丙交酯-并-乙交酯)微颗粒和免疫刺激复合体。

23.权利要求21的应用，其中疫苗选自流感疫苗、人免疫缺陷性病毒疫苗、肠炎沙门氏菌疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、支气管炎博德特氏菌疫苗、肺结核疫苗、同种异型肿瘤疫苗和自身肿瘤疫苗。

24.权利要求21的应用，其中所述药物还包含选自IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ的细胞因子。

25.权利要求21的应用，其中所述药物还包含选自醋酸黄酮及4-醋酸呫吨酮。

26.权利要求21的应用，其中所述药物包含日剂量在1000至600,000U/kg的T细胞活化组合物。

27.权利要求21的应用，其中抑制细胞间活性氧代谢物产生或释放的组合物选自组胺、5-羟色胺、地马普替、可乐定、苯甲唑林、双咪硫胍、4-甲基组胺、氨乙吡唑及组胺同系物。

28.权利要求21的应用，其中所述药物包含0.05至50mg剂量的细胞间活性氧代谢物产生或释放的抑制剂。

29.权利要求21的应用，其中所述药物包含细胞间活性氧代谢物产生或释放的抑制剂，剂量为1至500μg/kg病人体重。

30.权利要求21的应用，其中所述药物包含T细胞活化组合物和细胞间活性氧代谢物产生或释放的抑制剂，并且在相隔1小时内服用。

31.权利要求21的应用，其中所述药物包含T细胞活化组合物和细胞间活性氧代谢物产生或释放的抑制剂，并且在相隔24小时内服用。

32.权利要求21的应用，其中所述药物还包括细胞间活性氧代谢物清除剂。

33.权利要求32的应用，其中清除剂选自过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶及抗坏血酸过氧化酶。

34.权利要求32的应用，其中所述药物包含剂量从约0.05至50mg/天的清除剂。

35.权利要求32的应用，其中将所述药物分别配制成T细胞活化组合物及细胞间活性氧代谢物抑制或清除组合物。

36.权利要求21的应用，其中所述药物还包含化学治疗剂。

37.权利要求36的应用，其中化学治疗剂包含选自环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、雌氮芥、异环磷酰胺、松龙苯芥、马利兰、帖太帕、卡氮芥、罗氮芥、甲氮蝶呤、硫唑嘌呤、硫嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、长春碱酰胺、鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙、更生霉素、阿霉素、克鲁诺霉素、艾比鲁霉素、博来霉素、尼托霉素、顺氯氨铂、卡伯帕丁、甲基苄肼、阿莫克林、米托先特隆、三苯氧胺、尼鲁特米德及氨基乙哌啶酮的抗癌剂。

38.权利要求36的应用，其中化学治疗剂包含选自碘苷、三氯胸苷、阿糖腺苷、无环鸟苷、溴乙烯去氧尿苷、三唑核苷、膦酰基三钠、金刚烷胺、金刚乙胺、(S)-9-(2′，3′-二氢丙基)-腺嘌呤，4′，6′-二氯黄酮、AZT、3′(-叠氮-3′-脱氧胸苷)、苷昔韦洛、地达新诺、扎西他宾、双脱氧腺苷、尼弗拉平，HIV蛋白水解酶抑制剂及其他病毒蛋白水解酶抑制剂的抗病毒剂。

39.权利要求21的应用，其中同时进行T细胞活化组合物，抑制细胞间过氧化氢产生或释放的组合物及化学治疗剂的给药步骤。

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