CN1213742C - 炎症的药物控制 - Google Patents

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Abstract

通过控制血红素加氧酶(HO)的水平和/或活性实现对炎症的控制。血红素加氧酶诱导剂是抗炎性的(图14)，被用于治疗炎症，例如慢性炎症。血红素加氧酶抑制剂可以促进炎症，被用于治疗免疫抑制病症。可选的或补充的血红素加氧酶的活性控制是通过控制一氧化氮的水平实现的，提高水平会促进炎性反应。

Description

炎症的药物控制
本发明涉及对炎性反应的控制，抑制或减轻炎症的药物，促进、诱导或加重炎症的药物和通过抑制或促进炎症治疗疾病的方法。具体地说，本发明涉及对体内血红素加氧酶(heme-oxygenase)的活性或数量进行控制，或对活性或数量同时进行控制。
除其它应用之外，本发明可以具体应用于下述情况：在表现为炎性反应或被炎性反应恶化的疾病(例如在如风湿性关节炎的慢性炎症的治疗中)的治疗中，在患有例如哮喘的过敏反应的患者中，在患有ROS(反应性氧族)具有致病作用的疾病患者中，例如重灌注损伤和动脉硬化、以及在患有由药物治疗或病理导致的免疫抑制状态的患者中，例如爱滋病。
慢性炎症给许多国家的资源加上了沉重的社会和经济负担，但是安全和有效的疗法的数目却是有限的。目前，主要的研究力量集中于那些负责启始和保持病理过程的介质上。相反，几乎没有注意力集中在负责消除炎性反应的内源因子上。
主要的抗炎药剂是糖皮质激素和非甾类抗炎药(NSAID)。它们都受到充分编目的缺点的影响，实际上，在英国报道的药物不良反应中的近四分之一是由NSAID造成的。NSAID的副作用通常是影响胃肠道，并且也影响肝脏、肾脏、脾脏、血液和骨髓。NSAID在一些慢性炎症的治疗中并非有效。
糖皮质激素是有力的抗炎剂，它既抑制炎症的急性期，也抑制炎症的慢性期。但是，它们也带来了危险，即它们也抑制了免疫应答，并且能在许多方面降低基本细胞修复过程。一般地，它们必须通过注射给药，而口服施用无效。
因此存在对其它抗炎药物的持续需要，它们可以口服给药，并且它们对慢性炎症有效。
相反地，已知存在许多的疾病，它们对炎性反应有显著的抑制作用。一个例子是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)，被HIV感染会典型地导致这样的免疫抑制，以至患者死于单独的、偶发的感染，通常是对健康人很少致命的细菌或病毒感染。在这种病例中，炎症的刺激或诱导可能有助于防止非HIV感染死亡。但是，没有为这种前炎症(pro-inflammatory)目的的适宜的已知药物。
血红素(铁-原卟啉-IX)作为血红素蛋白(例如血红蛋白和细胞色素)的辅基，在细胞代谢中起着重要的作用。它的分解代谢是一个两步的过程。第一步是限速反应，是由微粒体酶——血红素加氧酶催化的胆绿素和一氧化碳的生成。第二步是由胞质酶——胆绿素还原酶催化的从胆绿素生成胆红素的反应。
血红素加氧酶发现于肝脏、肾脏、脾脏和皮肤，并且也被限制在特定的细胞类型中，值得注意的是成纤维细胞和巨噬细胞。该酶至少以两种异构形式(isoform)存在，一个是组成酶，另一个是诱导酶。血红素、重金属离子(例如锡、金、铂和汞)和过渡金属离子(例如铁、钴、铬和镍)都可以诱导血红素加氧酶。而且，血红素加氧酶是以广义的针对刺激，如热激(heat shock，由此得到另一个名称：热激蛋白32；hsp32)和氧化应激，以及细胞因子，如白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子和IL-6的应激反应的一部分被诱导的。由于能保护易受伤害的细胞酶免于失活，应激反应看来是有益的。
在传统中药中，动物胆汁被用于治疗支气管炎、哮喘和其它过敏反应已有几世纪之久了。最近人们发现胆绿素和胆红素能够清除反应性氧族(ROS)，它可能具有一些前炎性反应的作用，包括蛋白酶抑制剂的失活、透明质酸解聚成血管原性片段，以及改变蛋白以引发内源性抗原。
Abraham等，《国际生物化学杂志》，20(6)；543-558页(1998)提供了血红素加氧酶及其在哺乳动物生理活动中的作用的综述，包括其由内源的和外源的因子引起的活性。讨论了该酶与NADPH-细胞色素P-450还原酶的相互作用，也讨论了重金属离子在诱导血红素加氧酶活性中起到的作用。金属卟啉被描述成抑制剂。在参考文献的第845页，作者写道：“总的说来，当细胞处于应激或疾病状态时，血红素加氧酶的活性增加。实际上，该酶可以看作标示异常情况发生的红灯。”Sacerdoti等，《科学》243：388-390页(1-20-89)断言过敏反应与肾细胞色素P450的水平有关，并且该酶可通过诱导血红素加氧酶的生成而耗尽。这可以通过用Co2+处理来解决。
McCarty(《化学文摘》，100：1864024(1984)旨在说明硒在降低白三烯方面的作用，白三烯被认为是过敏和炎症的主要介质。实际上，McCarty描述了口服施用饮食辅药的方法。
美国专利5102670号涉及通过向患者肿胀的眼睛施用血红素加氧酶诱导物来增加血红素加氧酶的生成，以减少存在于眼中的12(R)hydroxyeicostetraenoic acid(12(R)-HETE)以及同样存在于眼中的12(R)Dihydroxyeicosatrienoic acid(12(R)-DIHETE)，从而缓解眼球肿胀。该专利提供的缓解角膜结膜的肿胀的方案依赖于减少主要发现于眼中的花生四烯酸的代谢产物12(R)HETE和12(R)DIHETE。具体地说，它解释了治疗效果主要在于保持血-眼房水屏障，一种只在眼中存在的屏障。因此，该专利所述只涉及眼，其它方面的应用很少。
在几乎相同的时期，纽约Drummond的Rockefeller大学的Messrs.George S.Drummond和Hallah Kappas与其他人员一起参与了涉及血红素加氧酶的研究。研究的结果至少部分地收录于美国专利4657902、4699903、4684637、5010073和5223494号。
美国专利4657902号旨在说明新的化合物—锡中卟啉(tinmesoporphyrin)—和包含它的组合物的应用，该应用是抑制血红素在哺乳动物中的代谢，从而控制哺乳动物的色氨酸的代谢率，并将该代谢率提高到使哺乳动物排出血红素的水平。
该专利在其公开内容第1栏第22-36行指出：
“在哺乳动物和其它脊椎动物中，血红素被血红素加氧酶氧化降解，形成开链四吡咯胆绿素。在哺乳动物中，胆绿素被胆绿素还原酶还原成胆红素。在肝脏中，胆红素在被排出前被肝葡糖苷酰转移酶系统转化成单和双葡糖苷酰结合体。
胆红素是有毒化合物，但通常其毒性不会表现出来，因为胆红素迅速结合到血浆蛋白上，运送到肝脏，结合并被排出。但是在幼体内，血清中存在有害健康的高浓度胆红素，它可能产生神经毒性。棘手的神经综合症例如“核黄疸症”是最严重的胆红素毒性的表现。”
因此，发明人在第3栏第43-48行指出：
“现在已经发现化合物锡中卟啉(SnMP)可以被用于治疗需要这种治疗的哺乳动物，包括人，以降低血红素代谢率，从而提高血红素的分泌率并控制色氨酸在肝脏中的代谢率。”
美国专利4699903号旨在说明一种通过施用锡二碘次卟啉来提高需要提高血红素的处理水平的哺乳动物的血红素分泌率的方法。
美国专利4684637号公开了通过施用锡或铬原卟啉IX以在哺乳动物体内降低代谢率从而降低血红素代谢率的方法。
美国专利5010073号涉及以脾脏为靶的脂质体金属卟啉制剂，它抑制脾脏中血红素加氧酶的活性。
美国专利5223494旨在描述一种通过施用中卟啉来抑制血红素加氧酶在肠道中的活性的方法，用于降低需要该预防措施的哺乳动物对食品中铁的吸收。
后面部分的专利涉及对所选体内组织中的血红素加氧酶的抑制，它是通过为特定的目的，以那些体内组织(例如，脾脏或肠道)为靶而实现的。
热激蛋白(HSP)或应激蛋白在生物圈中属于最高度保守和最丰富的一类蛋白。虽然蛋白的许多异构形式是在正常的生理条件下表达的，并且在细胞中起重要作用，但是它们大都被威胁细胞完整性的因素所调节。这些因素包括热激和冷激、氧基、重金属、缺氧、感染、酒精、离子载体和硫醇反应性药剂。这提高了HSP在细胞中的浓度，而导致细胞可以暂时抵抗其他致命损伤，并且对一些生物介质不进行应答。
HSP在病理状况下的作用吸引了许多注意力。由于其广泛的种间氨基酸同源性，对HSP的免疫应答可能是高度交叉反应性的，甚至是自体反应性的。对HSP的免疫应答已经在大鼠辅助关节炎(adjuvant arthritis)中、在鼠降植烷关节炎中、在非肥胖型糖尿病鼠的糖尿病中、在风湿性关节炎中、在全身性红斑狼疮中、在动脉硬化症中和在肿瘤监视(tumoursurveillance)中被发现。因此，HSP可能在病理状况下具有自相矛盾的作用，在细胞和组织处于应激环境时具有细胞保护作用，但是在一些自身免疫疾病中引起有害的免疫应答。
由L-精氨酸和分子氧在一氧化氮合成酶(NOS EC 1.14.13.39)的同功酶的催化下生成的一氧化氮(NO)，参与了许多生理和病理过程。这种分子的反应性和其与金属蛋白络合的能力是其许多生物反应的基础。例如，包含血红素的可溶性鸟苷酸环化酶(EC 4.6.1.2.)在血管平滑肌中被NO激活，导致血管调节(vasoregulation)，然而在宿主防御中，铁硫酶的抑制造成病原入侵中的代谢紊乱。
炎症涉及不同介质的顺序释放，这些介质包括作用于血管的介质、化学诱引剂、细胞因子、前列腺素、自由基和蛋白水解酶。在风湿性关节炎，一种慢性炎症中，HSP在患者的滑液衬中被调节。但是，它们在炎症中的作用有待彻底阐明。
本发明的目的是提供改进的(或至少可选的)用来控制炎症的方法，具体地说，是提供治疗慢性炎症或炎性反应的刺激的方法，例如治疗免疫抑制病症。
我们现在已经发现，通过控制体内血红素加氧酶的剂量或活性，或其剂量和活性，(1)获得了一般化的抗炎效果或反应，其中血红素加氧酶被诱导，或者(2)获得了一般性的炎性反应，其中血红素加氧酶被阻遏(或抑制)。
根据本发明的一个方面，通过施用一种化合物来治疗炎性反应，该物质诱导血红素加氧酶，或刺激或提高血红素加氧酶的活性。该治疗可以是全身的或定向的，例如定向到发现于人体单核细胞和巨噬细胞中的可诱导的血红素加氧酶。该治疗诱导血红素加氧酶的生成和/或刺激其活性；特殊的医疗应用包括慢性炎症的治疗，例如风湿性关节炎，过敏反应的治疗，例如哮喘，以及损伤、动脉硬化症和栓塞的治疗。
在本发明的一个实施方案中，一种药物组合物包含与药用载体结合的，可诱导、刺激或提高血红素加氧酶的活性的化合物。该组合物以注射用溶液、口服可接受组合物或局部用组合物的形式存在。
一种适宜的注射用溶液包括灭菌的含盐溶液，优选地包含接近生理浓度的盐。
对于口服施用，该组合物可以是固体形式，例如药片、药丸或可悬于水中或溶于水中的粉末。这样的固体组合物的制备对于本领域的技术人员是已知的。在口服组合物中补充增味剂是一种选择，以使该组合物更加可口，或至少使口腔减少一点难受。适宜的增味剂包括甜味剂、香味剂和可以掩盖或减少药物活性组分中任何不愉快或不希望的味道的药剂。
对于局部用组合物，优选的载体是非水载体，它适于将该组合物在使用后保持在一定位置。适宜的载体包括乳膏、凝胶、蜡、油或乳液。
本发明由此提供了另一种抗炎药物。它可以根据所选的具体化合物口服给药，并且最初的试验显示了有用的抗炎活性。据信，血红素加氧酶的产物在炎症的发展过程中具有多种作用，而被大多数NSAID、环氧酶靶向的该酶的产物具有较少的作用，所以本发明的组合物显示了比NSAID可能更强的药物活性。
本发明的另一个实施方案是一种抗炎组合物，它包含血红素加氧酶诱导剂或刺激剂和药用载体。
本发明的另一个实施方案是一种化合物在生产治疗炎症的药剂方面的应用，该化合物诱导、刺激或提高血红素加氧酶的活性。
适合于诱导血红素加氧酶的药剂包括的A型前列腺素；A型前列腺素的类似物、衍生物、复合物和结合物，它们是前列腺素A受体的激动剂；前列腺素A受体的激动剂；维生素B12；氯高铁血红素；保留了血红素加氧酶抑制活性的上述物质的片段、亚单位、结合物、类似物、衍生物和复合物。适宜的剂量是每公斤例如人的体重从0.1至30μmol。举例来说，在使用氯高铁血红素(FePP)时，适宜的剂量是从约0.06mg氯高铁血红素至约24mg氯高铁血红素每公斤体重。
用于诱导或激活血红素加氧酶的可选的药剂是抑制或降低一氧化氮合成的药剂。我们已经发现了一氧化氮(NO)的水平和血红素加氧酶的活性之间基本上是反比关系，降低NO水平导致HO活性的提高，并且是抗炎性的。因此，本发明第一方面的另一个实施方案是一种药物组合物，它包含作为活性组分的降低NO水平的物质，例如一氧化氮合成酶抑制剂(NOS)。
根据本发明的另一实施方案，提供了一种在患者体内诱导(提高)血红素加氧酶水平的方法，该方法包括施用有效剂量的血红素加氧酶诱导剂以降低患者的炎性反应。
在本发明的具体实施方案中，炎症是通过诱导或刺激单核细胞中的血红素加氧酶(例如在单核细胞和巨噬细胞中发现的可诱导的血红素加氧酶)来治疗的。这在治疗慢性炎症时是有好处的，这些炎症是由在炎症部位的大量的上述细胞治疗和表征的。
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种在人体内控制炎性反应的方法，该方法包括通过施用有效剂量的血红素加氧酶诱导剂降低炎性反应。
优选地，诱导剂在任何适当方式的适当的药用载体(例如，无菌水、盐水(无菌))中施用。一种pH值介于pH7和pH8之间的具有缓冲能力的、等渗的水溶液是适宜的。冰冻干燥制剂也是适宜的。冰冻干燥制剂可以用无菌水恢复。
在本发明优选的实施方案中，治疗了特殊的慢性炎症。可以根据本发明的第一方面进行治疗的包含慢性炎症在内的疾病包括：慢性炎性关节疾病—例如风湿性关节炎，慢性炎性肠道疾病—例如节段性回肠炎，呼吸系统炎性疾病—例如哮喘，脑的慢性炎症—例如多发性硬化，以及软组织炎症—例如腱鞘炎。
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种在人体内一般性地降低炎性反应(治疗炎症)的方法，该方法包括监测HSP32异构形式的血红素加氧酶的出现(表达)，如果低于正常水平，施用有效剂量的血红素加氧酶诱导剂以提高血红素加氧酶的表达，从而缓解炎性反应(炎症)。该诱导剂优选地以单核细胞和巨噬细胞为靶。
药剂的量可以在一段时间内施用。但是，迄今为止所使用的化合物的作用在每次单剂量给药后24小时出现峰值，在给药48小时后消失。
制剂可以是单位剂型(对单一剂量)，或者可以包装成多剂型组合物，可以从中取出并使用适宜的剂量。例如，小瓶中的溶液可以提供多剂型组合物，从中可以取出并施用一定量的药剂。本发明第一方面的组合物和应用可选地可以用(1)NSAID和(2)NOS(一氧化氮合成酶)抑制剂中的一个或两个来补充。
根据本发明的第二方面，提供了一种通过抑制或阻遏血红素加氧酶来刺激炎性反应的方法。在第二方面的实施方案中，用于刺激或加强炎症的药物组合物包含血红素加氧酶抑制剂和药用载体。
术语“刺激炎症”和“加强炎症”是指炎症的至少一种特有特征被刺激或加强；术语“抑制炎症”、“缓解炎症”和所有这些术语的变体也是这样。
在使用本发明第二方面的组合物进行免疫抑制治疗(例如治疗爱滋病)时，施用血红素加氧酶抑制剂以刺激单核细胞和/或巨噬细胞的活性。这两类细胞对于抵抗细菌和病毒感染是很重要的，所以提高它们的活性提供了新的例如对爱滋病的治疗方法。
适合于抑制血红素加氧酶(例如，单核细胞和巨噬细胞中的可诱导的血红素加氧酶)的药剂典型地为FePP的类似物(注意，它诱导血红素加氧酶)，其中铁离子被其它的金属离子所置换，或PP被置换。举例如下：
SnPP SnMP SnDPP  CrPP CrMP CrDPP
ZnPP ZnMP ZnDPP  MnPP MnMP  MnDPP
其中：
Sn＝锡，Cr＝铬，Zn＝锌，Mn＝锰，PP＝原卟啉，MP＝中卟啉，DPP＝二碘次卟啉
这些药剂的适当剂量范围是从每公斤如人的体重0.1至50μmole。举例来说，当使用锡原卟啉(SnPP)时，SnPP的适当剂量范围是从0.07mg/kg至46mg/kg人体重。
前列腺素A受体的拮抗剂是另一种适合于降低血红素加氧酶活性的药剂。
用于降低HO活性的可选的药剂是提高NO水平的药剂。因此，本发明第二方面的另一个实施方案是一种药物组合物，其包含作为活性成分的可以提高患者NO水平的物质。可选地，该物质是一氧化氮合成酶(NOS)的底物或该酶的激活剂。一种已知的NOS的底物是L-精氨酸，并且一种已知的NO受体是硝基氢氰酸钠。
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种降低体内血红素加氧酶水平的方法，该方法包括施用有效剂量的血红素加氧酶抑制剂以降低炎性反应，该抑制剂以例如单核细胞和巨噬细胞中的可诱导的血红素加氧酶为靶。
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种在人体内控制炎性反应的方法，该方法包括通过施用有效剂量的血红素加氧酶抑制剂来激活炎性反应，该抑制剂以例如单核细胞和巨噬细胞中的可诱导的血红素加氧酶为靶。
该抑制剂可以以任何适当的方式在适当的药用载体(例如，无菌水、盐水(无菌))中施用。一种pH值介于pH7和pH8之间的具有缓冲能力的、等渗的水溶液是适宜的。冰冻干燥制剂也是适宜的。冰冻干燥制剂可以用无菌水恢复并施用。
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种提高炎性反应的方法(例如用于治疗患有爱滋病的患者)，该方法包括监测血红素加氧酶的HSP32异构形式的存在(表达)，如果高于正常水平，则施用有效剂量的血红素加氧酶抑制剂，从而提高炎性反应。
药剂的量可以在一段时间内施用。但是，迄今为止所使用的化合物的作用在每次单剂量给药后24小时出现峰值，在给药48小时后消失。
本发明进一步的实施方案是血红素加氧酶抑制剂在制造一种药物时的应用，该药物用于治疗免疫抑制疾病。另一个是血红素加氧酶抑制剂在制造一种药物时的应用，该药物用于提高单核细胞和巨噬细胞的活性。
免疫抑制还可能由其它疗法的副作用造成，例如由于为抑制移植器官排斥而设计的药物的使用造成的移植后免疫抑制。在这些情况下，排斥大部分是由T细胞应答介导的，所以免疫抑制是为了除去有害的T细胞活性。但是，也会见到同时失去单核细胞和巨噬细胞的活性(通常是由于数量减少)。于是，本发明第二方面的另一种应用是选择性地刺激单核细胞和巨噬细胞。“选择性”是指这些细胞的活性和/或数量的增加在很大比例上比T细胞的活性和/或数量的任何增加要高。
下面参考附图，用一些具体的实施方案来说明本发明：
图1表明在将角叉菜胶注射到鼠胸膜腔后，急性炎症第2、6和24小时的发展情况(空方块——细胞渗出物，实心方块——总细胞，每个时间点n＝6)；
图2表明在急性炎症过程中，以nmol胆红素/60’/mg蛋白对时间(小时)测量的HO活性(每个时间点n＝6)；
图3是用Western杂交分析显示的HSP缺失的照片，峰值出现在第24小时；
图4显示在将角叉菜胶注射到鼠胸膜腔后，急性炎症以小时计的发展情况(口分泌体积，■总炎症细胞，n＝10)；
图5表明炎症细胞血红素加氧酶(HO)活性在角叉菜胶胸膜炎期间对时间(小时)的变化，活性以pmole胆红素/mg蛋白/小时表示，n＝9(结果表达为均值±s.e.均值，■外周血液单核细胞(PBMNs)，口炎症细胞时间过程)；
图6和7显示了血红素加氧酶异构体的Western杂交分析：图6)炎症细胞团HO-1泳道的分析，炎症细胞于第2、6、12、24和48小时采集，脾脏匀浆(SP)、PBL(BL)，图7)炎症细胞团HO-2道的分析，炎症细胞于第2、 6、12、24和48小时采集，脾脏匀浆(SP)、PBL(BL)；
图8-10显示炎症细胞血红素加氧酶1涂片的免疫定位，它证实了单核细胞中血红素加氧酶-1蛋白的提高了的阳性染色；图8)正常兔血清(对照)，图9)6小时炎症细胞涂片，图10)48小时炎症细胞涂片；
图11-16显示了血红素加氧酶(HO)调节剂对炎症的效果和HO的活性：锡原卟啉二氯化物(SnPP)对急性炎症在第24小时的效果(图11-渗出物体积，图12-细胞数)、铁原卟啉IX二氯化物(FePP)对急性炎症在第24小时的效果(图13-渗出物体积，图14-细胞数)、在24小时的炎症细胞中施用SnPP(图15)和FePP(图16)对HO活性的效果，治疗后炎症细胞与上述原卟啉一起收集并用图5的方法测定HO的活性，n＝6。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
图17和18显示了NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对鼠脑和脾血红素加氧酶活性的效果，图17-脑匀浆，图18-脾匀浆(0.1、0.5、1、5或10mM的L-NAME与反应混合物一起温育。结果表示为没有接受化合物的对照(con)组的活性的百分比，n＝8，***P＜0.001)；
图19和20显示了L-精氨酸对鼠脑和脾血红素加氧酶活性的效果，图19-脑匀浆，图20-脾匀浆。0.1、0.5、1、5或10mM的L-精氨酸与反应混合物一起温育。结果表达为没有接受化合物的对照(con)组的活性的百分比，n＝8，*P＜0.05，***P＜0.001)；
图21和22显示了D-精氨酸对鼠脑和脾血红素加氧酶活性的效果，图21-脑匀浆，图22-脾匀浆。0.1、0.5、1、5或10mM的D-精氨酸与反应混合物一起温育，结果表达为没有接受化合物的对照(con)组的活性的百分比，n＝8)；并且
图23和24显示了硝基氢氰酸钠对鼠脑和脾血红素加氧酶活性的效果，图23-脑匀浆，图24-脾匀浆。0.001、0.01、0.1、1或10mM的硝基氢氰酸钠与反应混合物一起温育。结果表达为没有接受化合物的对照(con)组的活性的百分比，n＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。
实施例1
在以下的实施例中，我们检测了血红素加氧酶在急性和慢性炎症中的表达和可能的参与。血红素加氧酶-1的高度可诱导的异构体最近被分类为HSP(HSP32)。这是血红蛋白的辅基的分解代谢中的限速酶。该反应的主要产物，胆红素，是有力的自由基清除者，并可能代表一种内源机制，该机制可以使细胞保护自己免受自由基的损害。一氧化碳(CO)也是由该反应产生的。由于与一氧化氮——炎症的主要介质的结构相似性，以及两种分子都有结合血红蛋白的能力，CO在炎症中的作用是一个复杂的问题，我们找到了一个答案。
在本实施方案中，使用了急性炎症的鼠角叉菜胶胸膜炎模型以决定HSP32在炎症细胞中的表达和活性。炎症的标记、细胞渗出物和细胞个数在2、6和12小时持续增长，峰值在24小时，消失于48小时。炎症在早期的时间点由多形核白细胞(PMN)支配，随着炎性反应的发展，单核细胞的数量增加。单核细胞的增加与Western杂交分析确定的HSP32蛋白水平的提高有关，强标记带出现在24和48小时。免疫组织化学法确定HSP32蛋白出现于单核细胞中。血红素加氧酶(HO)活性也在第2、6和24小时检测，只有后边的时间点显示了活性。然后检测用氯高铁血红素(一种HSP32表达的诱导剂)调节HO活性的效果和锡原卟啉-IX(血红素的合成类似物，它抑制HO的活性)。6小时时与对照相比，诱导剂或抑制剂对炎症没有明显的效果。但是，在24小时时，抑制剂使细胞的渗出物明显地提高了135％(p＜.001 Mann-Whitney)，而诱导剂分别使细胞渗出物和细胞个数降低了83％(p＜.001)和50％(p＜.001)。因此这些化合物的效果相当于HSP32在这个急性炎症的模型中的暂时表达。
材料和方法
动物和药品
200±20克的雄性的Wistar鼠(Tuck&Sons Ltd.，Essex，英国)被用于炎症。动物或者通过静脉注射施用15mg/kg的铁原卟啉IX氯化物(FePP)-炎症前18小时，或者通过皮下注射施用两倍剂量的40μ摩尔/kg的锡原卟啉二氯化物(SnPP)-炎症前18小时和炎症诱导时(卟啉获自卟啉产品公司，Logan，犹他州)。药物在0.1N的NaOH中制备，并与盐水1∶1混合，然后将它们调节到pH7.4，药物载体。总注射体积为0.2毫升。对照组动物只接受载体。
胸膜炎的诱导
在鼠体内诱导角叉菜胶胸膜炎，并按照上述Tomlinson等的方法制备细胞团。
HO活性
细胞团中的HO活性在后线粒体上清液中用定量胆红素的生成来测量(Jollie DR等，生物化学和生物物理进展，1985年，第240卷，51-59页)，胆绿素还原酶用鼠肝细胞液取代(3mg/ml)。蛋白以BSA为标准，用Bradford法估测。
Western杂交分析
向细胞团中加入含有1％Triton X100的蛋白酶抑制剂缓冲液并用载胶缓冲液(Tris，50mM，SDS，10％；甘油，10％；2-巯基乙醇，10％溴酚蓝，2mg/ml)以1∶1的比例煮沸(10分钟)并在10,000g离心10分钟使之裂解。上清液的蛋白浓度用上述方法测定，每个样品的总蛋白等价物(20μg)用Laemmli缓冲液系统将分配到10％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺微胶(Hoefer；Staffordshire，英国)上，并转移到聚乙烯吡咯烷酮二氟化物膜(Millipore，Hertfordshire，英国)上。非特异性的IgG用5％的干乳蛋白阻断，并与多克隆抗体和HSP32 1∶1000的稀释液(Stressgen公司，维多利亚，加拿大)温育。蛋白带用扩增的碱性磷酸酶药剂盒(Sigma公司，Poole，英国)检测，并用硝基蓝四唑(NBT)-5-溴-4-氯-3-碘磷酸(BCIP)显影。Rainbow标记和预染色的蓝色蛋白标记被用于测定蛋白的分子量。
统计
结果用均值±s.e.均值表达。统计分析由Mann-Whitney U-检测决定，认为＜0.05的P值有显著性。
图1显示了在胸膜腔炎症过程中渗出物体积和细胞个数的发展；它们都在注射角叉菜胶后24小时最大。渗出物细胞团中HO活性的显著提高，图2，和图3(照片)，与炎性反应中的峰值相一致。然后研究HO抑制剂SnPP和诱导剂FePP对角叉菜胶炎症的作用(表1)。6小时时的渗出物体积和细胞个数并未被预处理的HO抑制剂或诱导剂所改变。但是，炎症开始后24小时，与载体对照组相比SnPP使渗出物体积增加了128％(P＜0.001)，然而与载体对照组相比，FePP使渗出物体积减小了73％，细胞个数减少了50％(都是P＜0.001)。
然后检测血红素加氧酶抑制剂锡原卟啉二氯化物(SnPP)和诱导剂铁原卟啉IX氯化物(FePP)对急性炎症的作用。实验动物或者于炎症诱导前18和0小时接受双剂量的40μmoles/kg SnPP皮下注射，或者于炎症前18小时接受单剂量的15mg/kg FePP静脉注射。实验动物与通过适当途径只接受载体的对照动物比较。***P＜0.001
这些结果第一次用一个急性炎症模型证明了在炎症细胞中HSP32表达和HO活性的诱导。上文描述的HO活性的提高与胸膜腔中巨噬细胞的数量的增加有关。在这个模型中，免疫组织化学证明了炎症巨噬细胞对HSP32的强阳性免疫反应性，但不包括周围单核细胞(未提供数据)。对HO活性的预刺激或抑制的作用分别在24小时显著缓解或加剧炎症。这说明HO调节剂主要是在第24小时对巨噬细胞起作用，在第6小时炎症部位多形核白细胞占优势时没有明显作用。通过本发明实现的HO活性的提高代表了一种新型的用于治疗慢性炎症疾病的疗法，相反，活性的降低对于那些具有有害炎性反应的患者有益。
实施例2
方法
药物施用
动物在-18小时时和炎症诱导时接受双剂量的3、10或30μmoles/kgSnPP(HO抑制剂)或载体对照。动物在炎症诱导前18小时接受单剂量的3、10或30μmoles/kg FePP(HO诱导剂)或载体对照，n＝9。
胸膜炎的诱导
200+20克的雄性Wistar鼠用氟烷麻醉，将150μl的溶于0.9％NaCl的1％角叉菜胶溶液注射到胸膜腔。在注射刺激剂后2、6、12、24和48小时通过用1毫升包含3.15％的柠檬酸三钠、苯甲磺酰氟1mM(Sigma化学公司，Poole，英国)、胃蛋白酶抑制剂A(Sigma)和溶于10mMpH7.3磷酸缓冲液(PBS)中的0.2mM leupeptin的蛋白酶抑制剂缓冲液灌洗胸腔来收集渗出物。弃去任何被血液污染的渗出物。使用DN型Coulter计数器数细胞(Coulter电子公司，Luton，英国)。每个样品在800g离心10分钟，所得细胞团用下述方法制备。
免疫组织化学
外周血液和渗出物细胞样品涂覆于聚-L-赖氨酸涂敷的涂片上，风干。在免疫标记或组织染色前涂片用4％的溶于0.1M磷酸缓冲液的多聚甲醛固定1小时。内源的过氧化物酶用甲醇中0.3％的H2O2耗尽，试样用PBS中的0.1％Triton X100洗涤。非特异性的IgG用PBS中的0.1％基本无球蛋白的BSA中的1∶50 NGS封闭。试样用多克隆抗-HO-1抗体(1∶200)或多克隆抗-HO-2抗体(1∶1000)在4℃温育过夜，用生物素标记的山羊抗-兔第二抗体洗涤并再温育30分钟。在与Vectastain ABC山葵-过氧化物酶(Vector实验室，Peterborough，英国)温育30分钟后，在适当的时间(5-10分钟)加入溶于0.05M的pH7.6的Tris缓冲液的底物0.05％二氨基联苯胺四氯化物(Sigma)。得到阳性免疫反应性标记棕色物。初级抗血清用NGS替代作为阴性对照。用常规的组织染色、苏木精和红色染料确认形态观察结果。
统计
将(n个)实验结果用均值±s.e.均值表示。统计分析由Student氏非对称t检测决定，认为＜0.05的P值有显著性。
血红素加氧酶检测
用上述Sierra ES等，《分析生物化学》1992年第200卷27-30页的方法测定HO活性。细胞在蛋白酶抑制剂缓冲液中超声破碎10秒钟。用上述方法检测血红素加氧酶。反应混合物(15μl)包括11.2μM[14C]血红素比活(54Ci/mol)，1mM NADPH，2mM葡萄糖-6-磷酸，0.1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，3mg/ml肝细胞浆蛋白和50-100μg样本蛋白。反应用加入血红素启动，在37℃温育30分钟，通过加入过量的冷血红素和胆红素并加冰停止反应。将2μl反应混合物两次点到硅胶薄层色谱板上。色谱用氯仿∶醋酸的20∶1的稀释液显影。切下相当于血红素和胆红素的斑点并置于10ml的闪烁液中以备计数。用Bradford法测定蛋白(Bradford MM等，《分析生物化学》1976年第72卷248-254页)，使用BSA作为标准蛋白。活性表示为pmole胆红素/mg蛋白/小时，n＝9。结果表示为均值±s.e.均值。
结果
将角叉菜胶注射到鼠胸膜腔内导致急性胸膜炎的产生，以炎症细胞数和渗出物体积测定，炎症在24小时达到最高峰(图4)。在第48小时，炎症损害事实上已被消除，细胞数和渗出物体积分别降低到炎症高峰时的25％和11％。早期炎症的特征在于多形核细胞(PMN)汇集到胸膜腔，并且在第24和48小时单核细胞(MN)的比例增加[表2]。随着炎症的发展，HO活性显著增加，记录到的最高活性是在炎症消除中(图4)，当MN主导炎症损害时。Western杂交分析证明了HO-1蛋白水平的显著提高(未提供数据)。在炎症细胞切片中，HO-1免疫反应性特异性地定位在单核细胞上，而PMN几乎没有显示染色。随着炎症的发展，阳性染色的细胞数增加(图8-10)。用HO-2的多克隆抗体发现了定位于单核细胞的相似的免疫反应性染色结果。
这些结果说明了炎症细胞中HO表达和活性的提高。为了查明提高的HO活性不仅与组织保护有关，而且参与了急性炎症的缓解，我们使用了一种HO抑制剂，锡原卟啉(SnPP)，在角叉菜胶注射前18小时和注射时皮下给药，以及一种HO诱导剂，铁原卟啉IX氯化物(FePP)，在炎症诱导前18小时皮下给药(Maines MD等，FASEB J.，1988年第2卷2557-2568页)。
注射角叉菜胶6小时后——炎症的PMNs期，与载体控制组对比，SnPP和FePP处理对炎症损害都没有作用(未提供数据)。但是，注射角叉菜胶24小时后，当MNs占优势时，接受SnPP(HO抑制剂)的动物在炎症渗出物上表现出 剂量依赖性增加，与对照组相比，施用了3μmoles/kg SnPP的动物渗出物增加了70％(图11)。我们注意到最高剂量的SnPP(30μmoles/kg)进一步增加了渗出物的体积，但是导致了炎症细胞数的降低(图12)，可能的解释是后者是毒性作用。相反，接受FePP——HO诱导剂的动物在炎症细胞数和渗出物体积方面都表现出 剂 量依赖性抑制(图13和图14)，施用的所有剂量都显著缓解炎症，与载体对照组相比，FePP的最低剂量(3μmoles/kg)使炎症细胞数和渗出物体积分别降低了90％和55％。在这个模型中，所实现的抑制程度优于最适剂量的传统抗炎药或类固醇。对炎症细胞团HO活性的分析证明了施用SnPP后HO活性的降低和施用FePP后HO活性的提高(图15和16)。这些发现支持HO活性对缓解急性炎症致关重要的观点。这些数据还说明，SnPP和FePP的主要作用方式是通过调节HO的活性，而不是其它的机制，因为实验现象表现了剂量依赖性，并且卟啉的相反作用只有在HO表达时才被发现。
最后，本实施例的发现暗示了急性炎症缓解过程中HO的直接参与。HO在MNs——一种与慢性炎症紧密相关的细胞类型中的存在，支持了这样一个观点：该酶是作为慢性炎性反应的调节剂，并且因此，它是本发明的不同方面的疗法的目标。
实施例3
方法
雄性Wister鼠(160±20g，Tuck公司，英国)的脑和脾在蛋白酶抑制剂缓冲液中用玻璃匀浆器匀浆：苯甲磺酰氟1mM、胃蛋白酶抑制剂A1.5mM和leupeptin 0.2mM溶于10mM pH7.3磷酸盐缓冲液。用Bradford法测定蛋白量，牛血清清蛋白用作标准蛋白。
一氧化氮合成酶的活性用瓜氨酸法测定，数据用pmol瓜氨酸/mg蛋白/30分钟计算(Vane J.R.等，(1993)《美国国家科学院院刊》第91卷2046-2050页)。
血红素加氧酶的活性用上述方法测定(Sierra E.E.等，(1992)《分析生物化学》第200卷27-30页)。
总之，15μl的反应混合物包括11.2μM[14C]血红素(比活54Ci/mol)、1mM NADPH、2mM葡萄糖-6-磷酸、0.1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、3mg/ml肝细胞浆蛋白、100-50μg的样本蛋白和相关浓度的检测药物；L-精氨酸、D-精氨酸、NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)或硝基氢氰酸钠。包含检测药物的反应混合物可以在加入血红素启动反应前于37℃平衡30分钟。反应在30分钟后通过加入过量的冷血红素和胆红素并置于冰浴中终止。将2μl反应混合物两次点到硅胶薄层色谱板上。所有的样品双向层析。色谱用氯仿∶醋酸的20∶1的稀释液显影。切下相当于血红素和胆红素的斑点并置于10ml的闪烁液以备计数。数据以pmole胆红素/mg蛋白/小时计算。
原始数据的统计分析使用Student氏非对称t检验。结果表示为均值±s.e.均值，认为P＜0.05具有显著性。
结果
用我们的检测系统确定鼠脑匀浆含有HO和NOS活性。相反，鼠脾匀浆含有双倍HO活性，而缺少NOS活性(表3)。NOS抑制剂L-NAME的加入导致脑HO活性的 剂量依赖性提高，5mM L-NAME显著提高活性80％(图17)。相反地，脑匀浆中NOS底物L-精氨酸的加入导致HO活性的 剂量依赖性降低(图19)。使用的最高浓度的L-精氨酸10mM使HO活性降低75％。对映异构体L-精氨酸和D-精氨酸没有作为底物被NOS使用，因此对脑HO活性没有显著作用(图21)。
脾HO活性与脑活性不同，并不被加入L-NAME、L-精氨酸或D-精氨酸所改变(图18、20和22)。但是，NO供体硝基氢氰酸钠的加入导致脾和脑匀浆中HO活性的剂量依赖性降低(图23和24)。加入10mM的硝基氢氰酸钠使脑和匀浆中HO的活性分别降低75％和80％。
这些结果表明由NOS产生的NO抑制HO活性。认识到在正常生理条件下存在于脑中的NOS和HO的异构体是酶的构成形式是非常重要的，这些酶分别是cNOS和HO-2(Bredt D.S.等，(1990)《美国国家科学院院刊》第87卷682-685页，以及Verma A.，等(1993)《科学》第259卷381-384页)；而在正常生理条件下脾脏只含有HO的可诱导形式(Maines M.D.(1988)《FASEB杂志》第2卷2557-2568页)。
NO抑制剂和供体对HO活性的作用已经在鼠脑和鼠脾匀浆中被检验，在脑中NOS和HO的内源活性都很高，而在脾中HO活性更高，但NOS的活性比在脑中低。
我们发现一氧化氮的底物——L-精氨酸(0.1-10mM)而非D-精氨酸在鼠脑匀浆中降低血红素加氧酶的活性，并且精氨酸类似物L-NAME(0.1-10mM)在相同组织中提高其活性。在脾匀浆中，一氧化氮的内源活性低于脑中的，这些化合物没有作用。一氧化氮供体硝基氢氰酸钠(0.001mM-10mM)在脑和脾中都降低血红素加氧酶的活性。
本发明人相信在NOS被诱导的情况下，NO对HO活性的调节作用将被放大。另外，还说明NO对重要炎症介质——前列腺素的生成的调节是通过它与含有血红素的酶——环氧化酶的相互作用完成的。我们已经证明了HO在炎症模型中的抗炎作用。我们建议NOS和HO在炎性反应中具有互惠的调节作用，该作用是本发明不同方面的基础。
表1
治疗组   渗出物体积(毫升)   细胞总数106
6小时
皮下注射的载体(n＝27)     1.26±0.01     72±7
皮下注射的SnPP(n＝26)     1.59±0.12     67±6
静脉注射的载体(n＝23)     1.29±0.15     69±8
iv.v注射的FePP(n＝26)     0.99±0.11     50±8
24小时
皮下注射的载体(n＝29)     0.79±0.12     63±6
皮下注射的SnPP(n＝24)     1.80±0.21     58±6
静脉注射的载体(n＝22)     1.37±0.16     90±6
iv.v注射的FePP(n＝25)     0.37±0.07     45±6
表2
    时间 细胞类型 细胞总数的百分比   ％+ve forHO-1#   ％+ve forHO-2#
    2小时   PMNs     86     0     0
  MNs     14     25     45
    6小时   PMNs     ＞99     0     0
  MNs     ＜1     N.D.     N.D.
    12小时   PMNs     ＞99     0     0
  MNs     ＜1     N.D.     N.D.
    24小时   PMNs     62     0     0
  MNs     38     36     41
    48小时   PMNs     30     0     0
  MNs     70     89     46
炎症细胞切片的免疫细胞化学分析
*：多形核细胞(PMNs)和单核细胞(MNs)在炎症细胞切片中的相对百分比。#：存在的PMNs和MNs的百分比，它们是对血红素加氧酶异构体呈阳性的。N.D.：存在的细胞不足于进行分析。
表3
    脑n＝8     脾n＝5
血红素加氧酶活性pmol胆红素/mg蛋白/30′     40±4     85±5
一氧化氮合成酶活性pmol胆红素/mg蛋白/30′     358±78     2.38±1
在鼠脑和脾匀浆中血红素加氧酶和一氧化氮合成酶的活性。均值±s.e.均值。
因此，根据本发明，对炎症的控制在本发明的实施例中是通过(1)控制HO，或(2)控制一氧化氮的水平或与控制HO结合实现的。
由于可以对本发明的实施方案进行许多修改而不背离本发明的范围，因此这意味这里包含的所有的材料应被理解为对本发明的说明，而不是限制。

Claims (6)

1.一种在哺乳动物中提高血红素加氧酶的活性或数量的化合物在制备治疗慢性炎症的药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中提高血红素加氧酶的活性的化合物用于制备全身治疗慢性炎症的药物。
3.权利要求1的应用，其中所述化合物诱导血红素加氧酶。
4.权利要求3的应用，其中所述化合物诱导血红素加氧酶-1。
5.权利要求1-4任一项的应用，其中所述提高血红素加氧酶活性的化合物用于制备治疗下述疾病的药物：风湿性关节炎、慢性肠炎、多发性硬化、哮喘、气管炎、腱炎和脑部慢性炎症。
6.权利要求1-4任一项的应用，其中的化合物是氯高铁血红素。
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