CN120888552B - 一种人工非编码rna分子、dna分子和生物材料及其在提高根瘤菌碳氮代谢能力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人工非编码RNA分子、DNA分子和生物材料及其在提高根瘤菌碳氮代谢能力中的应用，属于基因工程技术领域，所述人工非编码RNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，转录所述人工非编码RNA分子的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；本发明还提供了重组载体和具有高效碳氮代谢能力的重组根瘤菌；本发明提供的人工非编码RNA分子及利用该RNA分子构建的重组表达载体能够显著提高根瘤菌苹果酸的利用能力，进而增强根瘤菌的共生固氮能力，与豆科作物共生，能够显著提高豆科作物的产量和品质。

Description

一种人工非编码RNA分子、DNA分子和生物材料及其在提高根 瘤菌碳氮代谢能力中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种人工非编码RNA分子、DNA分子和生物材料及其在提高根瘤菌碳氮代谢能力中的应用。

背景技术

在全球农业生产体系中，氮素作为植物生长发育不可或缺的核心营养元素，其供应能力直接决定农作物的产量与品质。豆科植物-根瘤菌构成的共生固氮体系是目前已知自然界中固氮效能最高的生物系统，其固氮量在全球生物固氮总量中具有较大的占比，在农业生产中展现出不可替代的应用价值。在这一共生体系中，根瘤菌能够侵入豆科植物根系并形成特殊的共生器官——根瘤，通过自身含有的固氮酶系统将空气中的惰性氮气转化为植物可直接吸收利用的氨态氮，为宿主植物提供稳定的氮素来源；与此同时，根瘤菌则依赖宿主豆科植物根系通过主动分泌作用释放的特定有机物质（如蔗糖、有机酸等）作为碳源，满足自身生长繁殖、能量代谢及固氮酶系统高效运转所需的碳骨架与能量供应，二者形成互利共生的紧密关系。

然而，在实际农业生态系统中，土壤根际环境是一个由细菌、真菌、放线菌等多种微生物构成的复杂微生态系统，微生物多样性极高且种间竞争激烈。这种复杂的根际微环境会对豆科植物根系分泌物的产生与释放过程产生显著干扰：一方面，根际其他微生物会与根瘤菌形成竞争关系，争夺植物光合作用产生的有机碳源，导致根系向根瘤菌定向分泌的碳源物质总量减少，造成碳源供应不足；另一方面，部分根际微生物还会通过代谢活动改变根系分泌物的化学组成与比例，破坏根瘤菌对特定碳源的识别与利用偏好，导致根瘤菌对现有碳源的利用率大幅降低。上述问题直接导致根瘤菌在根际环境中的定殖能力、繁殖效率及固氮活性受到严重制约，进而影响整个共生固氮体系的固氮效能，成为限制该体系在农业生产中规模化高效应用的核心瓶颈。因此，如何通过科学手段提高根瘤菌对宿主根系碳源的识别能力、吸收效率及代谢利用水平，突破根际微环境带来的碳源限制，成为进一步提升豆科植物——根瘤菌共生固氮能力、推动生物固氮技术产业化应用的关键突破口，也是当前农业微生物学与植物营养学领域的重要研究方向。

随着分子生物学与微生物遗传学研究的不断深入，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）作为一类不编码蛋白质但具有重要调控功能的RNA分子，在原核生物环境适应性调控中的作用逐渐被揭示。研究表明，ncRNA能够通过碱基互补配对的方式与靶标基因的mRNA分子直接相互作用，在转录后水平上调控靶标基因的表达：既可以通过结合mRNA的核糖体结合位点抑制翻译过程，也可以通过稳定mRNA的二级结构促进其翻译效率，从而精准调控微生物的碳代谢、氮代谢、群体感应及环境胁迫响应等关键生理过程。在豆科植物-根瘤菌共生体系中，ncRNA同样扮演着重要角色，其不仅能够调控根瘤菌自身碳代谢相关基因（如碳源转运蛋白基因、糖代谢酶基因等）的表达，还能参与根瘤菌与宿主植物之间的信号交流过程，影响根瘤的形成与发育。

基于上述研究基础，合成生物学作为一门融合了分子生物学、工程学与信息学的新兴学科，其核心的模块化设计理念为解决根瘤菌碳代谢调控问题提供了全新思路。该理念主张将生物体内复杂的生理功能拆解为具有特定功能的 “模块”，通过人工设计、改造与组装这些功能模块，实现对生物体生理过程的精准调控与定向改造。因此，利用合成生物学模块化设计理念，针对根瘤菌碳代谢调控网络的关键节点，人工设计并构建能够特异性调控碳代谢相关基因表达的人工非编码 RNA 功能模块，不仅能够突破天然 ncRNA 调控效率低、特异性差的局限，更能实现对根瘤菌碳源吸收、转运与代谢过程的精准调控，从而显著提升根瘤菌在复杂根际环境中对宿主根系碳源的利用能力，为高效共生固氮菌底盘菌株的创建提供核心技术支撑。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人工非编码RNA分子、DNA分子和生物材料及其在提高根瘤菌碳氮代谢能力中的应用。本发明提供的人工非编码RNA分子能够显著提高根瘤菌对苹果酸的利用能力，进而增强根瘤菌的共生固氮能力。

本发明提供了一种人工非编码RNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种DNA分子，所述DNA分子转录获得所述的人工非编码RNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种基因表达盒AbcR1，包括响应共生固氮信号的启动子和所述的DNA分子；所述基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种重组载体，包括初始载体和所述的基因表达盒AbcR1。

优选的，所述基因表达盒AbcR1插入到所述初始载体的多克隆位点。

本发明提供了所述的人工非编码RNA分子、所述的DNA分子、所述的基因表达盒AbcR1、所述的重组载体在提高根瘤菌碳氮代谢利用方面的应用。

本发明提供了一种具有高效碳氮代谢能力的重组根瘤菌，在宿主根瘤菌中，转入所述的重组载体。

优选的，所述宿主根瘤菌为费氏中华根瘤菌。

本发明提供了所述的重组根瘤菌在提高豆科作物产量和品质中的应用。

本发明提供了所述的重组根瘤菌在土壤改良中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种人工非编码RNA分子，所述人工非编码RNA分子是根据费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）中碳代谢调节的关键酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pckA mRNA比对得到的序列保守区域，用人工化学合成的方法合成一个具有“简并性”互补配对区的人工非编码RNA分子；本发明提供的人工非编码RNA分子及利用该RNA分子构建的重组表达载体能够显著提高根瘤菌苹果酸的利用能力，进而增强根瘤菌的共生固氮能力。本发明提供的人工非编码RNA分子和/或DNA分子能够应用于根瘤菌中人工高效碳氮偶联途径的构建。

进一步的，共生信号诱导表达的基因表达盒AbcR1能够显著提高根瘤菌的碳源利用能力，尤其是根瘤菌共生时的主要碳源苹果酸。本发明提供的重组根瘤菌与豆科作物共生时的促生效果、结瘤数量和固氮酶活性均显著提高，分别是底盘菌的1.12倍、1.32倍和1.23倍，可见本发明提供的重组根瘤菌能够显著提高豆科作物的产量和品质。

附图说明

图1为本发明提供的重组表达载体构建示意图；

图2为本发明提供的重组表达载体的PCR验证结果；

图3为本发明底盘菌和本发明提供的重组根瘤菌S. fredii（pAbcR1）对苹果酸等碳源利用能力测定；

图4为本发明提供的人工非编码RNA与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pckA mRNA结合能力测定，其中(a) AbcR1与pckA mRNA分子结合；(b)为 AbcR1与pckA mRNA突变6个碱基的pckA-m1 mRNA分子结合；(c)为 AbcR1与pckA mRNA突变9个碱基的pckA-m2 mRNA分子结合。

具体实施方式

本发明提供了一种人工非编码RNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

agcygayacyygyyyggyggcyycyccycccagygccaccgcaggagaygyyccccycyggaggyycyaayaayyyygaccacyaccaggggcccacayyyccygcggyccgcyyyyyyy。

上述人工非编码RNA分子是本发明根据费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）中碳代谢调节的关键酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pckA mRNA比对得到的序列保守区域，用人工化学合成的方法合成一个具有“简并性”互补配对区的人工非编码RNA分子。

本发明提供了一种DNA分子，所述DNA分子转录获得所述的人工非编码RNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

agctgatacttgtttggtggcttctcctcccagtgccaccgcaggagatgttcccctctggaggttctaataattttgaccactaccaggggcccacatttcctgcggtccgcttttttt。

本发明提供了一种基因表达盒AbcR1，包括响应共生固氮信号的启动子和所述的DNA分子；所述基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：

cctgcctgcttggaatcggcatcgccatgctccccgactacatcgtcggccgggatcccggtctgatccagctgccgatcagtgccgacatcccctctttcgatacctatttctgctatccggacgaaatgaagaacgccgcgaagctgaaggtcttccgcgactatattgttgccaaggcgcgcaactggaatttttgacgcccgtcgcgattgcccgattaatgggcaattgccagttccgccgttacctcattgtttttcttgaagctttttcgccatggcgaaacgcccgggcaacgcgattctattgtgcgatgcaaaaatatgcaggaatgcgcagacggcatggctggcatgcatattaaatgattgcccctcgcccaaaaaaacagcataccaaatccagctgatacttgtttggtggcttctcctcccagtgccaccgcaggagatgttcccctctggaggttctaataattttgaccactaccaggggcccacatttcctgcggtccgcttttttt。

本发明提供的人工非编码RNA分子的表达受到共生固氮信号诱导型启动子元件的控制，本发明通过人工合成的方法合成了上述人工非编码RNA的DNA分子序列与启动子序列，获得了该非编码RNA分子的基因表达盒AbcR1。基因表达盒AbcR1通过与根瘤菌盘菌的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pckA mRNA的碱基互补配对，引起受抑制的二级结构解链，从而导致磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的高效表达。本发明所述DNA分子在共生固氮信号诱导型启动子的控制下参与微生物中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因的转录后调控。

本发明提供了一种重组载体，包括初始载体和所述的基因表达盒AbcR1。

在本发明中，所述基因表达盒AbcR1优选的插入到所述初始载体的多克隆位点，进一步优选的插入到Bam HI酶切位点和Hind III酶切点位之间。本发明对所述重组载体的制备方法以及具体的操作参数没有特殊限定，采用本领域常规的酶切连接操作即可。在本发明中，所述初始载体优选为pBBR1MCS-2。

本发明还提供了所述的人工非编码RNA分子、所述的DNA分子、所述的基因表达盒AbcR1、所述的重组载体在提高根瘤菌碳氮代谢利用方面的应用。

本发明提供了一种具有高效碳氮代谢能力的重组根瘤菌，在宿主根瘤菌中，转入所述的重组载体。

在本发明中，所述宿主根瘤菌优选为费氏中华根瘤菌，更优选为费氏中华根瘤菌CCBAU45436。本发明转入所述重组载体的方法优选的采用三亲结合的方法。

本发明提供了所述的重组根瘤菌在提高豆科作物产量和品质中的应用。

本发明提供了所述的重组根瘤菌在土壤改良中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的人工非编码RNA分子重组表达载体的构建

本发明根据费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）中碳代谢调节的关键酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pckA mRNA比对得到的序列保守区域，用人工化学合成的方法合成一个具有“简并性”互补配对区的人工非编码RNA分子abcR1，其核酸序列如SEQ IDNO：1所示。

转录获得所述的人工非编码RNA分子的DNA分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

人工非编码RNA分子的表达受到共生固氮信号诱导型启动子元件的控制，通过人工合成的方法合成了上述人工非编码RNA的DNA分子序列与启动子序列，获得了该非编码RNA分子的基因表达盒AbcR1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

然后分别将人工非编码RNA的基因表达盒AbcR1和表达载体pBBR1MCS-2进行BamHI和Hind III双酶切，利用无缝克隆技术将基因表达盒AbcR1插入到pBBR1MCS-2的多克隆位点处，最后经PCR测序验证，获得了表达功能模块AbcR1的大肠杆菌菌株重组菌株DH5a3(pAbcR1)。重组表达载体pAbcR1的构建如图1所示，图中基因转录方向用箭头表示，插入位点为Bam HI和Hind Ш，重组表达载体的PCR验证结果如图2所示，本发明的重组表达载体可以扩增出条带大小为526 bp的上述DNA片段。

功能模块AbcR1表达载体转入费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium frediiCCBAU45436）中是通过三亲结合方式转入。首先将过夜培养的底盘菌株CCBAU 45436、表达助质粒pRK2013的大肠杆菌DH5a3(pRK2013)以及表达人工非编码RNA的重组大肠杆菌DH5a3(pAbcR1) 6000 rpm 离心5 min，弃上清收集菌体；然后用生理盐水清洗两次后以1 mL生理盐水将3株菌体细胞重悬于一个Ep管中，6000 rpm 离心5 min，弃上清，用 60 μL生理盐水再次重悬混合菌体后点在无抗TY固体培养基； 30 ℃正置培养2 d，挑取菌斑重悬于1 mL生理盐水中，梯度稀释涂布于相应的双抗平板上培养2 d，最后通过菌落PCR和测序验证获得重组根瘤菌S. fredii（pAbcR1）。

实施例2

本实施例用于测定本发明提供的重组根瘤菌的碳源利用能力：

利用Biolog GN3 96孔鉴定板检测重组根瘤菌碳源利用能力，具体步骤如下：

将费氏中华根瘤菌CCBAU45436 （以下简称底盘菌S. fredii）和重组根瘤菌S. fredii（pAbcR1）在YMA平板上活化两代，使菌株保持活力；用1 mL移液器刮下新鲜菌体，于接种液中重悬混匀，然后用浊度计将比色管中的浊度调至95%±2%；再将菌悬液倒入储液槽，利用8道移液器吸取菌悬液100 μL加入Biolog GN3 96孔鉴定板中，每组三个重复；最后将微孔鉴定板直接放入Omnilog读数仪箱中孵育，设置Omnilog系统程序，30 ℃培养48 h，扫描鉴定板分析底物代谢情况。

结果如图3所示，与底盘菌S. fredii相比，重组根瘤菌S. fredii（pAbcR1）对10种碳源的利用能力显著提高，其中包括根瘤菌共生时的主要碳源苹果酸，是底盘菌的1.22倍。

本实施例证实了，共生信号诱导表达的人工非编码RNA功能模块AbcR1能够显著提高底盘菌的碳源利用能力，尤其是根瘤菌共生时的主要碳源苹果酸。

实施例3

本实施例用于测定提供的重组根瘤菌与冀豆17的共生固氮能力：

利用蛭石盆栽实验分析重组根瘤菌对冀豆17的促生能力、结瘤能力和固氮能力，具体步骤如下：

挑选大小均匀、种皮完整且光滑的冀豆17种子放入锥形瓶中，在超净台中进行消毒：无水乙醇清洗1 min；倒出无水乙醇，用无菌水冲洗一次；用1:5稀释的次氯酸钠溶液清洗2 min；倒出溶液用无菌水冲洗一次；用含有霉菌抑制剂（PPM）的无菌水将种子冲洗5次；无菌水冲洗两次；再用无菌镊子将种子分散地平铺在含0.6%水琼脂的大平皿上；最后将平皿放入黑色塑料袋中28 ℃避光萌发2-3 d。

在种子萌发期间，将水罐、装蛭石的上层杯和吸水绳等耗材灭菌；蛭石用低氮植物营养液搅拌均匀（1 kg蛭石用1.5 L的低氮植物营养液，可分装为25盆），然后121 ℃灭菌90min。

大豆发芽后，在大平皿上选择发芽均匀、生长状况良好且均一的种子进行移苗。将种子根部朝下埋入分装好蛭石的上层杯中，下层水罐也装满水，放在人工气候室进行培养（湿度60%，光照16 h，黑暗8 h；温度：白昼26℃，黑夜22℃）。

幼苗生长期间，将底盘菌S. fredii和重组根瘤菌S. fredii（pAbcR1）接种于YMA液体培养基中，30 ℃培养两天；待幼苗长出第一片真叶时，将培养好的菌液离心，弃上清，再将菌体用0.85%生理盐水重悬清洗两次，6000 rpm离心10 min，弃上清，最后用PBS液体重悬，将菌液OD₆₀₀调整到0.2，接种1 ml菌液至大豆根部，培养3周，每周定期补水，每组设8个平行。

最后对大豆的地上株高、根瘤数、根瘤鲜重和固氮酶活性等共生指标进行检测。

结果如表1所示，与底盘菌相比，重组根瘤菌与冀豆17共生时的促生效果、结瘤数量和固氮酶活性均显著提高，分别是底盘菌株的1.12倍、1.32倍和1.23倍。

表1 底盘菌和重组根瘤菌接种大豆的共生固氮表型分析

本实施例证实了，共生信号诱导表达的人工非编码RNA功能模块AbcR1能够显著提高底盘菌的共生固氮能力。

实施例4

本实施例通过微量热涌动实验鉴定本发明提供的人工非编码RNA基因表达盒与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pckA mRNA的结合能力，具体步骤如下：

由上海生工生物工程股份有限公司合成本实验所需的长度为30 bp的5’FAM荧光标记的pckA mRNA序列作为探针；并通过体外转录的方法获得序列全长为120 bp的人工非编码RNA序列作为配体；

使用的配体AbcR1浓度为6 μM，标记探针mRNA的浓度为200 nM；然后将配体AbcR1二分之一浓度梯度稀释，取10 μL与相同体积的靶标混合均匀，将混合样品分别加入到16个标准处理的毛细管中，静置5 min；

利用购自Nano Temper Technologies GmbH的NT.115型仪器对人工非编码RNA基因表达盒AbcR1与pckA mRNA之间的结合能力进行分析并计算出解离常数Kd。

Kd=[A]×[L]/[AL]，

其中[A]是自由荧光分子的浓度，[L]是自由配体的浓度，[AL]是A和L复合物的浓度。

结果如图4所示，人工非编码RNA基因表达盒AbcR1与pckA mRNA之间的微量热泳动拟合曲线均为典型的“S”型曲线，二者结合的K_d值为53.52±81.65 nM。将pckA mRNA突变6个碱基后，AbcR1与PckAm-m1 mRNA存在结合，其Kd值为233.75±116.84 nM，结合能力为pckA mRNA未突变时的22.90%，再继续突变3个碱基后，AbcR1与pckA mRNA不再结合。说明人工非编码RNA功能模块AbcR1与pckA mRNA之间有很好的结合趋势。

本实施例证明了人工非编码RNA功能模块AbcR1能够通过碱基互补配对的方式与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pckA mRNA相互作用，进而从转录后水平调控宿主底盘菌的碳源利用能力。

由上述实施例可知，本发明提供的人工非编码RNA分子能够显著提高根瘤菌对苹果酸的利用能力，增强根瘤菌的共生固氮能力，提高豆科作物的产量和品质，对于推动生物固氮技术的创新发展具有重要的理论意义，更对降低农业生产对化学氮肥的依赖、实现农业绿色可持续发展具有重要的现实价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种人工非编码RNA分子，其特征在于，所述人工非编码RNA分子由SEQ ID NO.2所示的DNA分子转录获得。

2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子转录获得权利要求1所述的人工非编码RNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种基因表达盒AbcR1，其特征在于，包括响应共生固氮信号的启动子和权利要求2所述的DNA分子；所述基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种重组载体，其特征在于，包括初始载体和权利要求3所述的基因表达盒AbcR1。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述基因表达盒AbcR1插入到所述初始载体的多克隆位点。

6.权利要求1所述的人工非编码RNA分子、权利要求2所述的DNA分子、权利要求3所述的基因表达盒AbcR1、权利要求4或5所述的重组载体在提高费氏中华根瘤菌碳代谢利用方面的应用。

7.一种具有高效碳代谢能力的重组根瘤菌，其特征在于，在宿主根瘤菌中，转入权利要求4或5所述的重组载体，所述宿主根瘤菌为费氏中华根瘤菌。

8.权利要求7所述的重组根瘤菌在提高豆科作物产量和品质中的应用，其特征在于，将所述重组根瘤菌接种大豆后，能够提高大豆的地上株高、根瘤数量、根瘤鲜重和固氮酶活。