CN1201693A

CN1201693A - 抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白产品及其应用和活性检测法

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Publication number: CN1201693A
Application number: CN98107254A
Authority: CN
Inventors: 杨荣鉴; 钟青萍; 熊勇华; 杨宁生; 陈红兵
Original assignee: ZHONGDE UNION INST
Current assignee: ZHONGDE UNION INST
Priority date: 1998-04-01
Filing date: 1998-04-01
Publication date: 1998-12-16
Anticipated expiration: 2018-04-01
Also published as: CN1290580C

Abstract

本发明涉及含有抗A组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白,并具有其抗体活性的产品、保健品、药物;本发明的有效成分经精制,纯度高,活性高,是配制保健品和药物的理想用品,它们被应用于防治因A组轮状病毒感染引起的婴幼儿腹泻病,特异性强,治愈率高,效果优于常规药。同时还提供一种高效的活性检测方法。

Description

抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白产品及其应用和活性检测法

本发明涉及生物领域的免疫球蛋白产品，尤其是一种关于鸡蛋卵黄免疫球蛋白(IgY)产品，该产品具有较高的抗轮状病毒活性，而且本发明涉及含有该产品或由它们组成的保健品和药物以及应用它们防治因A组轮状病毒感染引起的婴幼儿腹泻病。

轮状病毒遍及全球，是小儿腹泻病的重要病因，世界每年大约有90万人死于该病。经调查表明：我国每年五岁以下小儿腹泻病患达2.5亿人次，其中相当大的比例因A组轮状病毒感染引起。对于该病多年来除采用口服或静脉注射补液纠正脱水之外还无特异性疗法。在预防方面，轮状病毒疫苗的使用还处在实验阶段，而且由于婴幼儿免疫系统发育还不完全，特异的抗轮状病毒免疫反应在消化系统发挥作用还存有障碍。

当前，已有少数学者利用免疫球蛋白制剂(IgG)治疗和预防轮状病毒感染取得了显著疗效。当用抗原免疫产卵母鸡后，鸡可产生相应的抗体转移和积累于卵黄中，此抗体即为卵黄免疫球蛋白(IgY)。用A组轮状病毒抗原免疫鸡，10天后收集所产卵，并通过一定步骤可得到相应的抗A组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白(抗—ARV IgY)。与IgG相比，IgY产量大，均一性好，IgY不会激活哺乳动物的补体系统，鸡属于鸟类，与哺乳动物间种系发生距离大，IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清反应，因而IgY用于免疫检测试验比用动物制备抗体更经济、方便。IgY的纯度在诊断、防治疾病方面有着较高的要求。

抗—ARV IgY的分离提纯，主要困难是如何有效去除卵黄中所含高浓度的脂类，讫今已公开了不少分离、提纯抗—ARV IgY的方法，其主要过程是去除脂类，分离纯化，浓缩终产物。如用氯仿、丙三醇、丙酮等有机溶剂去除磷脂蛋白复合物，再借盐析、超速离心等方法提取抗—ARV IgY。这些方法因提取物中残留有机溶剂及其它一些化学物质对人、动物和环境会造成不利影响，而且操作过程复杂，产率与纯度低，故而限制了其应用。

抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白用于牛、鼠等动物，实验表明预防和治疗动物腹泻都有良好效果，但牛轮状病毒与人轮状病毒有一定的区别，而且只有动物实验，没有人体临床实验结果，目前还未见将抗—ARV IgY产品制成保健品和药品用于人体。

本发明的目的在于克服上述缺点，提供一种含有抗A组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白(抗—ARV IgY)，并具有其抗体活性的产品、保健品和药物，且应用它们防治因A组轮状病毒感染引起的婴幼儿腹泻病，同时还提供抗—ARV IgY的ELIAS阻断检验方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

以A组轮状病毒抗原皮下注射免疫产蛋母鸡10天后收集其所产卵黄，通过已知的提取抗—ARV IgY粗品的方法得到粗品，再经下述步骤纯化：

a.将粗提抗—ARV IgY过DEAE-Sephadex A50凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥再溶解；

b.过Sephadex G200凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥得到抗—ARV IgY纯品。

在a、b两步骤中采取下述措施有利于提纯：将粗提抗—ARV IgY过DEAE-Sephadex A50凝胶色谱柱后，以0.01M的内含0.01M-0.14M线性NaCl浓度的PH为6.8的PB磷酸缓冲液洗脱，流速为20毫升/小时，收集具有抗体活性的蛋白峰，收集液于蒸馏水中透析除盐，冷冻干燥后用PB缓冲液溶解。

中间产物过Sephadex G200凝胶色谱柱后以0.01M，PH7.0的PBS缓冲液洗脱，流速为11～13毫升/小时，收集具有抗体活性的蛋白峰于蒸馏水中透析除盐，冷冻干燥后即得纯品。

抗—ARV IgY是防治A组轮状病毒引起的腹泻病的有效成份，其纯度越高对防治越有利。而有效含量在10％以上都有一定的效果，常用的有30％～50％，而85％～98％用于配药是最好的。

只有具有抗体活性的抗—ARV IgY产品才有效果，其活性与免疫用的抗原种类和数量有关，建立检验抗—ARV IgY活性的方法对其应用有重要意义，本发明采用的ELIAS阻断试验方法，灵敏度高，能快速测定活性，且能半定量测定含量，样品用量少，而以往的各种活性检测灵敏度差，准确性差，样品消耗大。抗—ARV IgY的有效应用因此受到阻碍。

用于人体的保健品和药物必须经过严格的毒理实验和临床实验，仅有防治疾病的动物实验是不够的。抗—ARV IgY有效成份配以常用的辅料，例如食用单糖或多糖，以及其他风味剂可作成保健品，增强婴幼儿预防A组轮状病毒侵害的能力；也可以配以食用单糖或多糖以及其他常用的药用辅料，作为防治A组轮状病毒引起的腹泻病的药物。

本发明所提供的抗—ARV IgY产品经离子交换层析及凝胶过滤层析，纯度大于99.9％，是配制保健品和药物的理想原材料，因抗—ARV IgY特异性强，纯度高的抗—ARV IgY可用于多种试验中，如双向免疫扩散试验、单向免疫扩散试验，免疫电泳，火箭电泳，放射性同位素免疫试验。因其不会固定哺乳动物补体，不固定金黄色葡萄球菌A蛋白、不固定哺乳动物Fc受体，也不与类风湿因子发生特异性反应，高纯度的抗—ARV IgY在诊断婴幼儿轮状病毒腹泻病时效果远胜于其他免疫球蛋白。本明所提供的含抗—ARV IgY的保健品、药物经大量临床实验表明对婴幼儿轮状病毒感染具有被动免疫保护作用，治疗效果明显优于其他常规用药。经安全性试验表明安全无毒。本发明在提纯制备临床实验和安全性试验方面作了大量工作为抗—ARV IgY从实验室研究阶段走向保健品、药物的产业化提供了依据。

下面结合实施例详细说明本发明：

实施例1：选健康产卵良种母鸡隔离饲养一周后，将ARVIgY抗原悬浮液加入乳化剂充分乳化，鸡皮下多点注射，两周后再免疫注射一次。10天后产生免疫应答，所产蛋的卵黄中含有有效的抗—ARV IgY成份。收集所产卵黄，通过已知的提取抗—ARV IgY粗品的方法得到粗品，粗品纯度为15％～55％，再经下述步骤纯化：

b.过Sephadex G200凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥得到抗—ARV IgY纯品，纯度为99.2％。

实施例2：按实施例1的方法制备的纯品，在a步骤中，将粗提抗—ARV IgY过DEAE-Sephadex A50凝胶色谱柱后，以0.01M的内含0.01M-0.14M线性NaCl浓度的PH为6.8的PB磷酸缓冲液洗脱，流速为20毫升/小时，收集具有抗体活性的蛋白峰，收集液于蒸馏水中透析除盐，冷冻干燥后用PB缓冲液溶解。

实施例3：按实施例1的方法制备的纯品，在b步骤中，中间产物过Sephadex G200凝胶色谱柱后以0.01M，PH7.0的PBS缓冲液洗脱，流速为11～13毫升/小时，收集具有抗体活性的蛋白峰于蒸馏水中透析除盐，冷冻干燥后即得纯品。

实施例4：将含有抗—ARV IgY有效成份的制品加其他辅料配制成抗—ARV IgY含量不少于10％的产品。

实施例5：将含有抗—ARV IgY有效成份的制品加其他辅料配制成抗—ARV IgY含量不少于30％的产品。

实施例6：将含有抗—ARV IgY有效成份的制品加其他辅料配制成抗—ARV IgY含量在30％～50％和85％～98％的产品。

实施例7：将实施例1-6中任何一项所述的产品制成保健品和药物，并用于预防和治疗A组轮状病毒引起的婴幼儿腹泻病。

实施例8：在实施例4-7中任何一项所述的产品中所加辅料含单一或混配的食用单糖或多糖。

实施例9：将含有抗—ARV IgY有效成份的制品加下述单一或混配的辅料配成保健品或药物：糊精，香菇多糖，蔗糖，黄芪多糖，麦芽糖，葡萄糖，猴菇多糖，果葡糖浆，淀粉，麦芽粉。

实施例10：取麦芽糊精3份，香菇多糖3份进行灭菌，在无菌室内将其与纯度为20％的抗—ARV IgY粗品4份混合均匀，送入自动灌装机灌制胶囊，所得胶囊进行抛光，铝塑包装。制成产品的规格：每版12粒胶囊，每粒含内容物200毫克，作为治疗用药，服用方法每日口服3次，一次1～3粒。

实施例11：取蔗糖2份，黄芪多糖4份，纯度为50％的抗—ARV IgY制品，按实施例10方法制成每粒含内容物100毫克的胶囊，服用方法每日2～3次，一次1粒。

实施例12：采用麦芽糊精5份，麦芽糖2份，猴菇多糖1～2份，纯度40％的粗提抗—ARV IgY1～8份制成药物。

实施例13：采集抗—ARV IgY免疫蛋70个，分离得到1000毫升蛋黄，加水稀释至8000毫升，离心得到清液7000毫升，采用中空纤维超滤提取，最后浓缩至700毫升待用，其中含有粗提抗—ARV IgY18克。将麦芽糊精50克，麦芽糖20克，蔗糖12克加水100毫升溶解，100℃灭菌30分钟，冷却。将处理过的辅料与70毫升超滤液混合均匀，冷冻干燥，无菌粉碎包装成袋，每小袋内含0.5克。用作治疗A组轮状病毒引起的婴幼儿腹泻病。

实施例14：取实施例1-3中任何一项提供的抗—ARV IgY纯品2份，麦芽糖4份，淀粉2份按实施例10的方法制成内容物100毫克的胶囊。

实施例15：取纯度为30％的抗—ARV IgY粗品1份，葡萄糖3份，灵芝多糖1份，蒸馏水25份，配成保健液。

实施例16：取抗—ARV IgY免疫蛋100个，得到蛋黄液1400毫升，加3倍水稀释并加入3.5％ PEG6000混匀，离心得到上清液3500毫升，再加PEG6000至终浓度12％，静置4小时，离心收集沉淀。用蒸馏水400毫升溶解60克葡萄糖，20克灵芝多糖，以100毫升蒸馏水溶解IgY沉淀。混合上述两种溶液，通过细菌过滤器除菌，灌封至10毫升包装瓶中，得到总蛋白0.4克/100毫升，抗—ARV IgY0.12克/10毫升的保健液。用于预防抗A组轮状病毒引起的婴幼儿腹泻病。服用方法每天2-3次，每次一瓶。

实施例17：取健康小鼠20只，并设对照组，给药前禁食16小时，以0.15克/毫升的抗—ARV IgY溶液按0.8毫升/20克体重容积灌胃给药，并分别在6小时，24小时后再给同样剂量的抗—ARV IgY溶液，观察动物反应7天。小鼠经灌胃抗—ARV IgY6.0克/公斤(相当于人临床用药的1800倍)，其饮食、活动、皮毛、大小便等均未有异常，无一鼠死亡。与对照组相比，经灌胃高剂量抗—ARV IgY的小鼠，其饮食、体重比仅仅略微稍有增加，差异不显著。以上结果表明抗—ARV IgY制品安全无毒。

实施例18：将含抗—ARV IgY有效成份的保健品或药物用于200例小儿轮状病毒肠炎病人被动免疫保护治理。轮状病毒性肠炎流行期间住院患儿，年龄在2岁以下，病程在七天之内，临床诊断为秋季腹泻并经大便ELISA检测为轮状病毒抗原阳性者(阴性者别除)，随机分成抗—ARV IgY治疗组和常规药物治疗组。

治疗方法和剂量：抗—ARV IgY治疗组仅服用抗—ARV IgY每次一粒，一日三次。常规药物治疗组为对照组。用药不做统一规定，由接诊医生按各自用药习惯选择应用1至数种药物。如干挠素、思密达、丽球肠乐、培菲康、消化散、病毒唑、丁胺卡地霉素、头孢哌酮等。两组均进行补液治疗，纠正脱水、电解质紊乱，调整酸碱平衡。有营养不良者给予支持疗法。

观察方法：A列入观察的患儿均收集新鲜大便做常规化验和轮状病毒ELISA检测确认，必要时检测血电解质、血气分析。详细间问病史及体格检查，填写临床观察表。

疗效评判标准：A大便次数≤2次/日中恢复到正常次数，大便性状恢复正常，临床症状完全消失为治愈。(据此分为～1天、～2天、～3天、～4天治愈)。计算治愈天数至第4天。无效：经过四天(96小时)治疗后，腹泻次数虽有减少仍＞2次/日或性状无明显好转，甚至病情加重而更换药物者均属无效。

两组临床资料分布：收集资料完整者抗—IRV IgY治疗组共162例，常规药物治疗组160例。治疗组中男性115例(70.99％)，女性47例(29.01％)；对照组男性125例(78.13％)，女性35例(21.87％)。年龄1岁以内者治疗组123例(75.92％)，最小者37天；对照组129例(80.63％)，最小者40天。两组住院时发病天数见表1，临床表现见表2。大便镜检有白细胞者治疗组45例(27.78％)，对照组48例(30％)。两组临床表现除“呕吐”项外(此项治疗组有102例为62.96％，对照组有77例为48.13％。治疗组明显重于对照组，P＜0.01，差异有统计学意义)，其它表现及性别、年龄、病程、大便镜检诸条件大致相似(经统计学处理P值均＞0.05，差异无统计学意义)具有可比性。

结果：

本研究中抗—ARV IgY治疗组总治愈率143例(88.27％)，对照组96例(60.0％)。经统计学处理X2＝33.08，P＜0.01(见表3)。平均止泻天数治疗组2.86±1.34(X±S)天，对照组4.31±1.62(X±S)天。经统计学处理μ＝8.77，P＜0.01。两组差异有非常显著意义。

实施例19：ELIAS阻断试验：所有待测样品蛋白含量定为3mg/ml；取病毒100μl滴入快速A组轮状病毒抗原酶标诊断试剂盒(广东珠江生物高科技中心产)中心反应孔(包被有抗A组HRV IgG)，37℃温浴30分钟，以蒸馏水冲洗反应孔10次以上后，每孔加满洗液[PH7.2.0.01MPBS(含0.5％吐温)]，室温放置3分钟后倾去拍干，每孔加入一号试剂(酶联抗A组IRV IgG)100μl，于37℃静置30分钟，用蒸馏水冲洗10次以上，再以洗液洗2次：每孔先后加入2号、3号试剂(联苯胺，过氧化氢)各50μl，于室温静置3-5分钟，显色(蓝色)后立即加入8NH₂SO₄30-50μl/孔，终止反应，显黄色，用DG3022型酶联免疫检测仪测吸光值OD₄₅₀nm。本试验结果以样品阻断(阳性，不显或微显蓝色)孔与对照(阴性)孔的测定结果来计算阻断率，在于50％为阳性结果。计算公式如下：

实施例20：将实施例1-6中任何一项所述的产品加入奶制品、咖啡、蜂蜜和各种其它饮料中。

表1 两组入院时发病天数(例数)比较组别～1天～2天～3天～4天～5天～6天～7天合计抗-IRV IgY 21 35 48 25 27 4 2 162治疗组常规药物 31 41 42 24 13 2 7 160治疗组

X²＝10.33 P＞0.05

表2 两组入院时临床症状(例数)比较

大便次数体温呕吐脱水组别

＜10次/日≥10次/日正常发热有无无轻--中重抗-IRV IgY 83 79 46 116 102 60 2 158 2治疗组常规药物 93 67 33 127 77 83 8 150 2对照组两组比较X²值 X²＝1.54 X²＝2.62 X²＝7.18 X²＝3.80

P＞0.05 P＞0.05 P＜0.01 P＞0.05

表3 两组效果比较

～1天～2天～3天～4天无效总治愈率组别

例数％例数％例数％例数％例数％例数％抗-IRV IgY 24 14.81 45 28.40 49 30.25 24 14.81 19 11.73 143 88.27治疗组常规药物 1 0.63 13 8.13 49 30.63 33 20.63 64 40.0 96 60.0对照组

X²＝33.08 P＜0.01

Claims

1、合有抗体活性的抗A组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白(抗—ARV IgY)的产品，其制备方法采用含A组轮状病毒的抗原皮下注射免疫鸡10天后收集其所产卵的卵黄，通过已知的提取抗—ARV IgY粗品的方法得到粗品、再经下述步骤纯化：

2、根据权利要求1所述的含抗—ARV IgY的产品，其特征在于：将粗提抗—ARV IgY过DEAE-Sephadex A50凝胶色谱柱后，以0.01M的内含0.01M-0.14M线性NaCl浓度的PH为6.8的PB磷酸缓冲液洗脱，流速为20毫升/小时，收集具有抗体活性的蛋白峰，收集液于蒸馏水中透析除盐，冷冻干燥后用PB缓冲液溶解。

3、根据权利要求1或2所述的含有抗—ARV IgY的产品，其特征在于：中间产物过SephadexG200凝胶色谱柱后以0.01M，PH7.0的PBS缓冲液洗脱，流速为11～13毫升/小时，收集具有抗体活性的蛋白峰于蒸馏水中透析除盐，冷冻干燥后即得纯品。

4、含有抗—ARV IgY的产品，其特征在于抗—ARV IgY含量不少于10％。

5、含有抗—ARV IgY的产品，其特征在于抗—ARV IgY含量在30％～50％。

6、含有抗—ARV IgY的产品，其特征在于抗—ARV IgY含量在85％～98％。

7、一种检验抗—ARV IgY成份活性的方法：

ELIAS阻断试验：所有待测样品蛋白含量定为3mg/ml；取病毒100μl滴入快速A组轮状病毒抗原酶标诊断试剂盒(广东珠江生物高科技中心产)中心反应孔(包被有抗A组HRV IgG)，37℃温浴30分钟，以蒸馏水冲洗反应孔10次以上后，每孔加满洗液[PH7.2，0.01 MPBS(含0.5％吐温)]，室温放置3分钟后倾去拍干，每孔加入一号试剂(酶联抗A组IRV IgG)100μl，于37℃静置30分钟，用蒸馏水冲洗10次以上，再以洗液洗2次：每孔先后加入2号、3号试剂(联苯胺，过氧化氢)各50μl，于室温静置3-5分钟，显色(蓝色)后立即加入8NH₂SO₄30-50μl/孔，终止反应，显黄色，用DG3022型酶联免疫检测仪测吸光值OD₄₅₀nm。本试验结果以样品阻断(阳性，不显或微显蓝色)孔与对照(阴性)孔的测定结果来计算阻断率，在于50％为阳性结果。计算公式如下：

8、根据权利要求1-6任何一项所述产品，配以辅料，用作口服保健品。

9、根据权利要1-6任何一项所述产品，配以辅料，用作药物。

10、根据权利要1-6任何一项所述产品，用于防治因轮状病毒感染而致的婴幼儿腹泻。

11、根据权利要求8所述的产品，其所配的辅料含有食用单糖或多糖。

12、根据权利要求9所述的产品，其所配的辅料含有食用单糖或多糖。

13、将权利要求1-6任何一项所述产品，加入奶制品、咖啡、蜂蜜和各种其它饮料中。