CN119959552B - 一种基于arih1质谱鉴定crl复合物的protac研发方法 - Google Patents
一种基于arih1质谱鉴定crl复合物的protac研发方法Info
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Abstract
本发明公开了一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，涉及生物技术领域；包括如下步骤：S1：构建PBTE‑C357SARIH1过表达的H9细胞系；S2：诱导H9干细胞系由ESC向中胚层、内胚层分化；S3：过表达ARIH1免疫沉淀实验；S31：将H9细胞分别接种于12个15cm细胞皿中，各加入20mL RPMI培养基，并同时加入Doxycycline诱导FLAG‑ARIH1过表达，过表达后准备收样。本发明基于ARIH1作为CO‑E3连接酶与发生拟素化激活的CRL形成稳定复合物的特性，利用TMT‑IP/MS技术精准鉴定处于激活状态的CRL底物受体。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法。
背景技术
Cullin-RING泛素连接酶(CRL)家族是泛素-蛋白酶体系统中最大的E3泛素连接酶家族，通过识别特定的底物受体(Substrate Receptor)来调控蛋白质的降解。CRL家族在多种生物学过程中发挥关键作用，包括细胞周期调控、信号传导和癌症发生发展。然而，由于CRL家族成员众多且功能复杂，鉴定其激活状态的底物受体一直是研究难点。
TMT-IP/MS(Tandem Mass Tag免疫沉淀质谱)是一种结合了TMT多肽标记技术和免疫沉淀质谱联用技术的先进方法，广泛应用于蛋白质相互作用研究，尤其在PROTAC(蛋白质降解靶向嵌合体)开发中具有重要应用。TMT(Tandem Mass Tag)技术是由美国ThermoScientific公司研发的一种多肽体外标记技术。该技术通过特异性标记多肽的氨基基团，利用同位素标签在质谱分析中实现多肽的定量分析。TMT技术具有高灵敏度、高通量和高准确性的特点，能够同时对多个样本进行定量分析，适合复杂蛋白质组学研究。IP/MS(免疫沉淀-质谱联用技术)是一种基于免疫沉淀和质谱分析的蛋白质相互作用研究方法。其原理是利用特异性抗体捕获目标蛋白及其相互作用蛋白，通过免疫沉淀富集后，再利用质谱分析鉴定这些蛋白质。TMT-IP/MS结合了TMT的定量能力和IP/MS的蛋白质相互作用分析能力。通过TMT标记技术对免疫沉淀后的多肽进行定量分析，能够更准确地鉴定和定量蛋白质相互作用。TMT-IP/MS技术凭借其高特异性、高灵敏度和定量分析能力，在PROTAC开发中具有重要的应用价值，能够为靶向蛋白质降解研究提供有力支持。
在已有的研究中，孙蕾和陈振国团队通过冷冻电镜技术揭示了CRL3复合物在其催化循环过程中多个状态下的动态组装和分子机制。他们研究了CRL3KBTBD2复合物的自组装、底物招募、活化、去活化以及底物受体交换等过程，并解析了其在不同状态下的结构。此外，许超教授课题组研究了CRL2FEM1B复合物的组装模式及其识别底物的分子机制。这些研究为理解CRL家族的功能提供了重要基础，但主要集中在结构解析和机制研究方面，并且只集中于CRL的某一底物上，尚未涉及利用TMT-IP/MS技术进行系统性鉴定激活状态的多种底物受体。
相比传统的小分子，PROTAC分子更难开发，瓶颈主要聚焦在成药、合成工艺、评价手段等方面。PROTAC在新药研发方面的发展瓶颈包括以下几点：
①分子量较大带来的成药性问题：传统的小分子药物，基本上都符合成药性原则——Lipinski“类药五规则”，但PROTAC分子往往分子量较大，目前报道的PROTAC的分子量大都在700道尔顿以上，因此相比于传统小分子抑制剂，PROTAC分子的水溶性和细胞渗透性均有限。药代动力学性质差是影响其成药性的一个主要障碍。
②可用的E3泛素连接酶数量有限：作为PROTAC组成部分之一，E3泛素连接酶起着至关重要的作用。虽然研究已发现600多种E3连接酶能在人体细胞中发挥作用，但大部分E3连接酶组织分布具有局限性，即使是目前应用较多的E3连接酶CEBN、MDM2、XIAP仍有小部分组织尚未覆盖，如MDM2连接酶，存在于99％测试样本中，而CRBN只在76％的测试样本中表达。因此组织分布广泛的E3连接酶及具有良好成药属性配体的开发尚有很大拓展空间。600多种E3连接酶中，仅有12种E3连接酶被应用于PROTACs中，其中两种进入临床试验阶段，另外10种处于临床前探索阶段目前以靶向CRBN E3泛素连接酶为主。
③当高浓度的PROTACs在丰富的E3连接酶和靶标存在下倾向于形成二元复合物而不是三元复合物时，不可避免地会出现Hook效应，这给合理设计体内剂量带来了困难。
CRL(Cullin RING ubiquitin ligase)家族，是最大的E3泛素连接酶超家族，包含200多个家族成员，调控细胞内约20％蛋白的泛素化降解。作为最重要的E3超家族，CRL的生化活性有一套精准的调控系统：CRL是模块化的复合体酶，其Cullin蛋白作为支架可以组装上百种不同的底物受体，从而对特异底物蛋白进行泛素化修饰。CRL的底物蛋白有包括Cyclin D、HIF1α、AKT、Nrf2、PCNA、PD-1、PD-L1等在内的关键蛋白，因而对细胞周期、信号转导、DNA损伤修复、免疫检查点等生物学过程有重要的调控作用。多种CRL家族成员的表达或活性异常参与了肿瘤等疾病的发生过程，是重要的治疗靶点；另外，例如CRL4CRBN、CRL2VHL也是被广泛应用于PROTAC技术的E3泛素连接酶，基于CRL4CRBN的ARV-110成功获批上市表明CRL在该新兴的新药研发领域具有巨大的潜力和空间。尽管CRL具有重要的生物学功能，在多种疾病中扮演关键的调控作用，但是相较于催化磷酸化修饰的激酶，针对CRL泛素连接酶的小分子药物开发远远落后。其中主要的原因之一就是关于CRL家族的调控机制和功能的研究相对欠缺。
根据ARIH1可作为CO-E3与发生拟素化激活的CRL(Cullin-RING泛素连接酶)形成稳定复合物，本发明主要基于此特点针对ARIH1进行TMT-IP/MS(Tandem Mass Tag免疫沉淀质谱)鉴定处于激活状态的CRL底物受体(Substrate Receptor)，筛选鉴定具有关键生物学功能的CRL家族成员。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，包括如下步骤：
S1：构建PBTE-C357S ARIH1过表达的H9细胞系；
S2：诱导H9干细胞系由ESC向中胚层、内胚层分化；
S3：过表达ARIH1免疫沉淀实验；
S31：将H9细胞分别接种于12个15cm细胞皿中，加入20mL RPMI培养基，并同时加入Doxycycline诱导FLAG-ARIH1过表达，过表达后准备收样，在收样当日在对照组加入MLN处理；
S32：使用使用含有蛋白酶抑制剂的MCLB buffer裂解细胞，在裂解开始前，将蛋白酶抑制剂补充至裂解缓冲液，并将含有蛋白酶抑制剂的裂解液放在冰上，每个皿加入裂解液，刮取细胞并收集到管中，在摇床下旋转处理，然后使用低温离心机离心；
S33：将两个管的上清液合并为一个样品，并使用滤器过滤，然后过滤到含有FLAGBeads的管中，并在摇床上旋转处理；
S34：将样品与FLAG Beads混合液转移到管中，用MCLB buffer洗涤，使用3×FLAG肽洗脱，将洗脱液合并至一个EP管内；
S35：对样品加入TCEP，还原1小时，之后使用碘乙酰胺对样品进行烷基化；使用TCA/乙腈沉淀，然后在buffer中重悬，往重悬液中加入LysC，室温过夜；
S36：次日加入胰蛋白酶，消化6小时，再加入乙腈ACN混合，室温反应；加入TMT，再次进行室温反应；
S37：对分化至中胚层、内胚层的细胞采用相同的方式进行处理，之后从每个样品中取2μL，合并到100μL 5％FA/5％ACN中，进行Stage tip处理，干燥后进行质谱分析。
优选的：所述S1中，构建PBTE-C357SARIH1过表达的H9细胞系具体如下：
S11：在转染前一天，将H9细胞接种于6孔板中，加入2mL不含抗生素的培养基，确保细胞在转染时的汇合度达到70％-90％；
S12：准备质粒DNA和转染试剂，计算所需PBTE-C357SARIH1和hypbase质粒的量，按照3:1的比例混合；
S13：在无菌离心管中加入100μL无血清的Opti-MEM培养基，再加入2μg质粒DNA，混匀，在另一个无菌离心管中加入100μL无血清的Opti-MEM培养基，再加入5μLLipofectamine 2000，混匀后室温静置5分钟，将DNA稀释液加入到Lipofectamine 2000稀释液中，混匀，室温静置20分钟，形成DNA-Lipofectamine 2000复合物，将制备好的DNA-Lipofectamine 2000复合物缓慢加入到每个孔的细胞培养基中，晃动培养板，使复合物均匀分布；
S14：将培养板放入培养箱中继续培养，在转染后，更换为含血清的完全培养基，继续培养；
S15：转染，等待设定时间后进行换液，更换为含血清的完全培养基，并加入潮霉素B进行筛选，待对照细胞死亡80％以上，撤去实验组的抗生素，并更换为含血清的完全培养基，等待状态恢复正常；
S16：待稳转细胞可进行正常传代后，分孔进行WB检测ARIH1的表达。
优选的：所述S14中，具体为：将培养板放入37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，在转染6小时后，更换为含血清的完全培养基，继续培养48小时。
优选的：所述S15中，具体为：转染48h后进行换液，更换为含血清的完全培养基，并加入潮霉素B 100μg/ml进行筛选，待对照细胞死亡80％以上，撤去实验组的抗生素，并更换为含血清的完全培养基，等待状态恢复正常。
优选的：所述S2中，诱导H9干细胞系由ESC向中胚层、内胚层分化具体如下：
S21：当过表达ARIH1的细胞生长至满时，将其铺板；
S22：第二天，更换培养液，使用Advanced RPMI 1640培养基，每毫升加入以下试剂：
Glutamax(100×)：10μL；
CHIR99021(5μM)：1μL；
200ng/mL Activin A：0.2μL；
从此时开始，同时加入多西环素，0.5mg/ml；诱导FLAG-ARIH1过表达；
S23：第三天，使用S22相同的培养基换液；
S24：第四天，此时细胞已分化至中胚层，配置后续诱导培养基并进行换液；
S25：第五天，细胞分化至内胚层干细胞。
优选的：所述S21中，对于6孔板，每孔铺1×105个细胞，铺板后，加入Y27632，1000:1稀释，以抑制细胞凋亡。
优选的：所述S24中，使用Advanced RPMI 1640培养基，每毫升加入以下试剂：
Glutamax(100×)：10μL；
100ng/mL Activin A：1μL。
优选的：所述S31中，将H9细胞以2.7×107个细胞的密度分别接种于12个15cm细胞皿中，分为实验组6个和对照组6个；
加入Doxycycline的浓度为0.5mg/ml；诱导FLAG-ARIH1过表达，过表达48h后准备收样，在收样当日在对照组15cm皿加入MLN，1μM处理6h；
所述S32中，每个皿加入1.6mL裂解液，刮取细胞并收集到管中，在4℃摇床下旋转10分钟，然后使用4℃低温离心机1200rpm，离心15分钟。
优选的：所述S33中，将两个管的上清液合并为一个样品，并使用0.45μm滤器过滤，然后过滤到含有60μL FLAG Beads的管中，并在4℃摇床上旋转3小时；
所述S34中，将样品与FLAG Beads混合液转移到管中，用MCLB buffer洗涤3次，每次15分钟；接下来使用3×FLAG肽洗脱，每次200μL，共2次，将洗脱液合并至一个EP管内。
优选的：所述S35中，对样品加入终浓度为10mM的TCEP，在37℃下还原1小时，之后使用终浓度为15mM的碘乙酰胺对样品进行烷基化；使用TCA/乙腈沉淀，然后在50μL 0.2MEPPS pH 8.0buffer中重悬，往重悬液中加入1μL LysC，室温过夜；
所述S36中，加入1μL胰蛋白酶，37℃消化6小时，再加入15μL乙腈ACN混合，室温反应10分钟；加入4μL TMT，室温反应1.5小时。
本发明的有益效果为：
1.本发明基于ARIH1作为CO-E3连接酶与发生拟素化激活的CRL形成稳定复合物的特性，利用TMT-IP/MS技术精准鉴定处于激活状态的CRL底物受体。
2.本发明的技术可应用于不同细胞系，包括多种肿瘤细胞系，有助于系统性地研究CRL家族在癌症发生发展中的动态组装；通过鉴定具有关键生物学功能的CRL家族成员，为新型PROTAC的研发提供具有靶标意义的CRL家族成员。
3.本发明的技术能够快速鉴定关键的CRL底物受体，为PROTAC的设计提供明确的靶点，从而缩短从靶点发现到药物设计的周期；通过精准筛选和鉴定，减少了在无效靶点上的投入，降低了研发成本。
4.本发明的技术适用于多种细胞系，包括不同的肿瘤细胞系，能够系统性地研究CRL家族在不同癌症中的动态组装和功能调控；这为开发针对特定肿瘤类型的个性化PROTAC提供了可能；通过在不同肿瘤细胞系中的应用，可以发现具有肿瘤特异性的CRL底物受体，从而开发出更精准的肿瘤治疗药物。
5.传统小分子药物难以靶向“不可成药”的蛋白质，如转录因子和支架蛋白等；本发明通过TMT-IP/MS技术鉴定的CRL底物受体，为开发针对这些“不可成药”靶点的PROTAC提供了可能；每个PROTAC分子可以降解多个靶蛋白分子，具有催化降解功能，因此只需低剂量即可发挥显著药效，且药效持久。
附图说明
图1为本发明提出的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法的技术思路图；
图2为本发明在人胚干细胞中ARIH1过表达与MLN4924处理对底物受体活性影响的火山图分析结果图；
图3为本发明在人中胚层细胞中ARIH1过表达与MLN4924处理对底物受体活性影响的火山图分析结果图；
图4为本发明在人内胚层细胞中ARIH1过表达与MLN4924处理对底物受体活性影响的火山图分析结果图；
图5为本发明不同细胞类型中多个底物受体的活性状态示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1：
一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，包括如下实验步骤：
S1：构建PBTE-C357S ARIH1过表达的H9细胞系：
S11：在转染前一天，将H9细胞以适当的密度(每孔约0.5-2×105个细胞)接种于6孔板中，加入2mL不含抗生素的培养基，确保细胞在转染时的汇合度达到70％-90％，以获得最佳转染效率；
S12：准备质粒DNA和转染试剂，计算所需PBTE-C357S ARIH1和hypbase质粒的量，按照3:1的比例混合；
S13：在无菌离心管中加入100μL无血清的Opti-MEM培养基(Gibco)，再加入2μg质粒DNA(PBTE-C357S ARIH1和hypbase质粒按比例混合)，轻轻混匀，在另一个无菌离心管中加入100μL无血清的Opti-MEM培养基，再加入5μL Lipofectamine 2000(ThermoScientific)，轻轻混匀后室温静置5分钟，将DNA稀释液加入到Lipofectamine 2000稀释液中，轻轻混匀，室温静置20分钟，形成DNA-Lipofectamine 2000复合物，将制备好的DNA-Lipofectamine 2000复合物缓慢加入到每个孔的细胞培养基中，轻轻晃动培养板，使复合物均匀分布；
S14：将培养板放入37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，在转染6小时后，更换为含血清的完全培养基，继续培养48小时；
S15：转染48h后进行换液，更换为含血清的完全培养基，并加入潮霉素BHygromycin B(sangon，100μg/ml)进行筛选，待对照细胞死亡80％以上，撤去实验组的抗生素，并更换为含血清的完全培养基，等待状态恢复正常；
S16：待稳转细胞可进行正常传代后，分孔进行WB检测ARIH1的表达(通过FLAG标签抗体进行检测)，与对照相比，实验组出现明显过表达条带(～70kDa)，则说明稳转细胞系构建成功。
S2：诱导H9干细胞系由ESC(Embryonic Stem Cells)向中胚层(Mesendoderm)、内胚层(Endoderm)分化：
S21：当过表达ARIH1的细胞生长至满时，将其铺板。对于6孔板，每孔铺1×105个细胞，铺板后，加入Y27632(MCE，1000:1稀释)以抑制细胞凋亡；
S22：第二天，更换培养液(配置如下：使用Advanced RPMI 1640培养基，每毫升加入以下试剂：Glutamax(100×)10μL，CHIR99021(5μM)1μL，200ng/mL Activin A 0.2μL)，从此时开始，加入Doxycycline(多西环素，0.5mg/ml)诱导FLAG-ARIH1过表达；
S23：第三天，仍然使用上述配置的培养基换液；
S24：第四天，此时细胞已分化至中胚层(Mesendoderm)，配置后续诱导培养基并进行换液(使用Advanced RPMI 1640培养基，每毫升加入以下试剂：Glutamax(100×)10μL，100ng/mL Activin A 1μL)；
S25：第五天细胞已成功分化至内胚层(Endoderm)干细胞。可进行后续实验。
S3：过表达ARIH1免疫沉淀(Co-IP)实验：
S31：将H9细胞以适当的密度(2.7×107个细胞)分别接种于12个15cm细胞皿中(分为实验组6个和对照组6个)，加入20mL RPMI培养基(Gibco)，并同时加入Doxycycline(多西环素，0.5mg/ml)诱导FLAG-ARIH1过表达，过表达48h后准备收样，在收样当日在对照组15cm皿加入MLN(1μM)(MLN：是拟素化抑制剂，可使CRL不激活)处理6h；
S32：使用含有蛋白酶抑制剂的MCLB buffer(Modified Cell Lysis Buffer：Tris0.5g，NaCl 0.5g，SDS 0.1g，Triton-X-1001mL，去离子水至10mL，用HCl调整pH值至7.4)裂解细胞，在裂解开始前，将蛋白酶抑制剂(MCE)补充至裂解缓冲液，并将含有蛋白酶抑制剂的裂解液放在冰上，每个皿加入1.6mL裂解液，刮取细胞并收集到2mL管中，在4℃摇床下旋转10分钟，然后使用4℃低温离心机12000rpm，离心15分钟；
S33：将两个管的上清液合并为一个样品，并使用0.45μm滤器过滤，然后过滤到含有60μL FLAGBeads(预先使用PBST洗涤液洗涤过)的5mL管中，并在4℃摇床上旋转3小时；
S34：将样品与FLAG Beads混合液转移到15mL管中，用MCLB buffer洗涤3次，每次15分钟。接下来使用3×FLAG肽(Cytiva)洗脱，每次200μL，共2次，将洗脱液合并至一个1.5ml EP管内；
S35：对样品加入终浓度为10mM的TCEP，在37℃下还原1小时，之后使用终浓度为15mM的碘乙酰胺对样品进行烷基化；使用TCA/乙腈沉淀，然后在50μL 0.2M EPPS pH8.0buffer中重悬，往重悬液中加入1μL LysC(Wako Chemicals)，室温过夜；
S36：次日加入1μL胰蛋白酶(Gibco)，37℃消化6小时，再加入15μL乙腈ACN混合，室温反应10分钟。加入4μL TMT(Thermo Scientific)，室温反应1.5小时；
S37：对分化至中胚层(Mesoderm)、内胚层(Endoderm)的细胞也进行以上操作，之后从每个样品中取2μL，合并到100μL 5％FA/5％ACN中，进行Stage tip处理，干燥后进行质谱分析。
如图2-4所示，展示了在不同细胞类型中，ARIH1(C357S)过表达与MLN4924处理对底物受体活性影响的火山图分析结果。图中包括三种细胞类型：hESC(人胚干细胞)、hMes(人中胚层细胞)和hEndo(人内胚层细胞)。每个图中，横轴表示底物受体的log2倍数变化(log2 fold change)，纵轴表示-log10 p值(-log10 p-value)，用于衡量统计显著性。可看到在加MLN做阴性对照情况下，不加MLN的实验组处于激活状态组装到ARIH1上形成复合物的底物受体数量在不同时期的细胞各有不同程度的增加。
如图5所示，该热图展示了不同细胞类型中多个底物受体(Substrate Receptors)的活性状态。图中包括三种细胞类型：胚胎干细胞(ESC)、中胚层(Mes)和内胚层(Endo)。深色方块表示该底物受体在特定细胞类型中未检测到(ND)或不活跃(Inactive)，而浅色方块表示该底物受体在特定细胞类型中活跃(Active)，有助于理解不同细胞类型中CRL复合物底物受体的动态变化和功能差异。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：构建PBTE-C357S ARIH1过表达的H9细胞系；
S2：诱导H9干细胞系由ESC向中胚层和内胚层分化；
S3：过表达ARIH1免疫沉淀实验；
S31：将H9细胞分别接种于12个15cm细胞皿中，加入20 mL RPMI培养基，并同时加入Doxycycline诱导FLAG-ARIH1过表达，过表达后准备收样，在收样当日在对照组加入MLN处理；
S32：使用含有蛋白酶抑制剂的MCLB buffer裂解细胞，在裂解开始前，将蛋白酶抑制剂补充至裂解缓冲液，并将含有蛋白酶抑制剂的裂解液放在冰上，每个皿加入裂解液，刮取细胞并收集到管中，在摇床下旋转处理，然后使用低温离心机离心；
S33：将两个管的上清液合并为一个样品，并使用滤器过滤，然后过滤到含有FLAGBeads的管中，并在摇床上旋转处理；
S34：将样品与FLAG Beads混合液转移到管中，用MCLB buffer洗涤，使用3×FLAG肽洗脱，将洗脱液合并至一个EP管内；
S35：对样品加入TCEP，还原1小时，之后使用碘乙酰胺对样品进行烷基化；使用TCA/乙腈沉淀，然后在buffer中重悬，往重悬液中加入LysC，室温过夜；
S36：次日加入胰蛋白酶，消化6小时，再加入乙腈ACN混合，室温反应；加入TMT，再次进行室温反应；
S37：对分化至中胚层和内胚层的细胞采用相同的方式进行处理，之后从每个样品中取2µL，合并到100µL 5% FA/5% ACN中，进行Stage tip处理，干燥后进行质谱分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，其特征在于，所述S1中，构建PBTE-C357SARIH1过表达的H9细胞系具体如下：
S11：在转染前一天，将H9细胞接种于6孔板中，加入2mL不含抗生素的培养基，确保细胞在转染时的汇合度达到70%-90%；
S12：准备质粒DNA和转染试剂，计算所需PBTE-C357SARIH1和hypbase质粒的量，按照3:1的比例混合；
S13：在无菌离心管中加入100µL无血清的Opti-MEM培养基，再加入2µg质粒DNA，混匀，在另一个无菌离心管中加入100µL无血清的Opti-MEM培养基，再加入5µL Lipofectamine2000，混匀后室温静置5分钟，将DNA稀释液加入到Lipofectamine 2000稀释液中，混匀，室温静置20分钟，形成DNA-Lipofectamine 2000复合物，将制备好的DNA-Lipofectamine2000复合物缓慢加入到每个孔的细胞培养基中，晃动培养板，使复合物均匀分布；
S14：将培养板放入培养箱中继续培养，在转染后，更换为含血清的完全培养基，继续培养；
S15：转染，等待设定时间后进行换液，更换为含血清的完全培养基，并加入潮霉素B进行筛选，待对照细胞死亡80%以上，撤去实验组的抗生素，并更换为含血清的完全培养基，等待状态恢复正常；
S16：待稳转细胞可进行正常传代后，分孔进行WB检测ARIH1的表达。
3.根据权利要求2所述的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，其特征在于，所述S14中，具体为：将培养板放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养，在转染6小时后，更换为含血清的完全培养基，继续培养48小时。
4.根据权利要求3所述的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，其特征在于，所述S15中，具体为：转染48h后进行换液，更换为含血清的完全培养基，并加入潮霉素B 100μg/ml进行筛选，待对照细胞死亡80%以上，撤去实验组的抗生素，并更换为含血清的完全培养基，等待状态恢复正常。
5.根据权利要求4所述的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，其特征在于，所述S2中，诱导H9干细胞系由ESC向中胚层和内胚层分化具体如下：
S21：当过表达ARIH1的细胞生长至满时，将其铺板；
S22：第二天，更换培养液，使用Advanced RPMI 1640培养基，每毫升加入以下试剂：
100×Glutamax：10µL；
5µM CHIR99021：1µL；
200 ng/mL Activin A：0.2µL；
从此时开始，同时加入多西环素，0.5mg/ml；诱导FLAG-ARIH1过表达；
S23：第三天，使用S22相同的培养基换液；
S24：第四天，此时细胞已分化至中胚层，配置后续诱导培养基并进行换液；
S25：第五天，细胞分化至内胚层干细胞。
6.根据权利要求5所述的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，其特征在于，所述S21中，对于6孔板，每孔铺1×105个细胞，铺板后，加入Y27632，1000:1稀释，以抑制细胞凋亡。
7.根据权利要求5所述的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，其特征在于，所述S24中，使用Advanced RPMI 1640培养基，每毫升加入以下试剂：
100×Glutamax：10µL；
100 ng/mL Activin A：1µL。
8.根据权利要求1所述的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，其特征在于，所述S31中，将H9细胞以2.7×107个细胞的密度分别接种于12个15cm细胞皿中，分为实验组6个和对照组6个；
加入Doxycycline的浓度为0.5mg/ml；诱导FLAG-ARIH1过表达，过表达48h后准备收样，在收样当日在对照组15cm皿加入MLN，1μM处理6h；
所述S32中，每个皿加入1.6 mL裂解液，刮取细胞并收集到管中，在4℃摇床下旋转10分钟，然后使用4℃低温离心机1200rpm，离心15分钟。
9.根据权利要求1所述的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，其特征在于，所述S33中，将两个管的上清液合并为一个样品，并使用0.45 µm滤器过滤，然后过滤到含有60µL FLAG Beads的管中，并在4℃摇床上旋转3小时；
所述S34中，将样品与FLAG Beads混合液转移到管中，用MCLB buffer洗涤3次，每次15分钟；接下来使用3×FLAG肽洗脱，每次200µL，共2次，将洗脱液合并至一个EP管内。
10.根据权利要求1所述的一种基于ARIH1质谱鉴定CRL复合物的PROTAC研发方法，其特征在于，所述S35中，对样品加入终浓度为10mM的TCEP，在37℃下还原1小时，之后使用终浓度为15mM的碘乙酰胺对样品进行烷基化；使用TCA/乙腈沉淀，然后在50µL 0.2 M EPPS pH8.0 buffer中重悬，往重悬液中加入1µL LysC，室温过夜；
所述S36中，加入1µL胰蛋白酶，37℃消化6小时，再加入15µL 乙腈ACN混合，室温反应10分钟；加入4µL TMT，室温反应1.5小时。
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