CN114181885A - 咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法 - Google Patents

咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，包括培育大鼠、分离CD90阳性细胞、培育睾丸间质干细胞(SLC)、检测咪达唑仑对增殖和分化的影响、扩增SLCs并检测细胞活力、DAPI染色并计数、流式细胞仪分析细胞、睾酮(T)和孕酮(P4)分析、通过QPCR及WB实验进行mRNA及蛋白表达检测、通过SNK检验确定显著性差异并绘制图表。其步骤简单，可以有效验证咪达唑仑药物对睾丸间质干细胞的增殖和分化的影响。

Description

咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法
技术领域
本发明涉及生物化学试验技术领域。
背景技术
咪达唑仑是一种具有多种功能的神经药物，具有镇静、催眠、减轻焦虑、顺行性遗忘、脑介导的肌肉放松和抗惊厥活性的功能。由于该药物经常在儿童和青少年中长期使用，因此还需要研究该药物其他生理系统可能的影响。近几十年来，男性不育率一直在上升，但其背后的原因仍不清楚。最近的一项研究发现，在过去50年中，男性的平均精子数量平均每年下降1.4%，在1973年至2011年间总体下降了52.4%。而睾丸间质细胞（LCs）是雄性哺乳动物（包括男性人类）睾酮（T）的主要来源。雄性激素对维持雄性生殖（包括精子生成）和雄性正常生理功能至关重要。LCs缺陷会导致低血清T水平，除生殖功能外，还可能影响男性的一般生理情况，症状包括身体成分变化、疲劳增加、性功能障碍、情绪低落、认知功能下降和免疫反应降低。因此，发展和维持一个合理水平的功能性间质细胞群对人体是至关重要的。众所周知，睾丸间质细胞的功能及其发育对各种外部影响非常敏感，包括营养、环境污染物和药物。由于咪达唑仑的长期重复使用，目前已有研究发现该药物对神经发育的潜在负面影响进行了评估，发现，青春期使用咪达唑仑可能会影响大脑发育。除了神经系统，青春期也是其他身体器官发育的重要时期，包括生殖系统，并且生殖系统在这一时期特别容易受到外部因素的影响，有研究表明，咪达唑仑可急性影响成人睾丸间质细胞（ALCs）的睾酮分泌。但是目前在青春期反复使用该药物对睾丸间质细胞的发育的潜在长期影响尚不清楚；
随着研究的开展，与人类一样相似的大鼠体内的ALC也是在青春期由睾丸间质干间质细胞（SLC）发育而来的。在成年大鼠中，单剂量的乙烷二甲基磺酸盐（EDS）可完全消除ALC，并在此后的2个月内从SLC重新生成新一代ALC。通过研究发现，这种再生过程所涉及的干细胞与青春期的干细胞完全相同。通过进一步研究发现，EDS后参与ALC再生的SLC特异性表达CD90，可作为分离SLC的表面标记物。通过标记物纯化的SLC在体外可与促黄体生成素（LH）、沙漠刺猬因子（DHH）激动剂（SAG）分化为ALC。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞（LCs）发育影响的试验方法，其步骤简单，可以有效验证咪达唑仑药物对睾丸间质细胞的增殖和分化的影响。
为实现上述目的，本发明提供了一种咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，包括以下步骤，
步骤一，选用2-4个月成年雄性SD大鼠作为实验对象，将EDS溶解于DMSO:PBS=1:3的混合物中，对SD大鼠进行腹腔注射给药，剂量为80mg/kg。经EDS处理四天后，处死SD大鼠；
步骤二，迅速取出大鼠睾丸并将其置于冰冷的汉克斯平衡盐溶液中，去除睾丸包膜后，松解睾丸组织，将实质组织置于含1mg/ml胶原酶IV的DMEM/F12培养基中，水浴摇床34℃，振荡90次/分，消化组织30分钟。上述消化后组织室温沉淀1分钟后，用70μm孔径的尼龙网过滤上清液。通过磁珠分选法（MACS）对CD90+细胞进行正向分选，将获得的细胞颗粒悬浮在BD-IMagTM（BI）缓冲液中，调整细胞密度为2 x 107细胞/ml，用藻红蛋白（PE）结合的CD90抗体（1:500）对细胞表面抗原进行标记，4℃避光孵育40分钟。而后用BI缓冲液洗涤细胞两次，并用抗PE的磁珠（1:100）在4℃避光条件下标记细胞30分钟。将磁珠标记的细胞转移到收集管中，将所述收集管置于BD IMagTM细胞分离磁铁支架上，避光分选8分钟后，将含阴性组分的上清液丢弃，用BI缓冲液重悬粘附在收集管内壁的阳性组分，重复上述分选步骤2次，各4分钟。最后，用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并收集管内壁的阳性组分，并通过流式细胞术（FCM）测定CD90+细胞的百分比；
步骤三，用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基重悬纯化的睾丸间质干细胞（SLCs），将细胞接种于24孔板中，3小时后，细胞贴壁时，将培养基更换为扩增培养基（EM），细胞在35℃，5% CO2条件下扩增培养一周后，进行CD90荧光染色或进行睾丸相关基因的定量聚合酶链反应分析（QPCR）；细胞扩增后汇合率达90%时，将EM更换为分化诱导培养基（DIM）并培养3周。
步骤四，为检测咪达唑仑对SLC增殖的影响，用含不同浓度梯度（0-30μm）咪达唑仑的EM培养SLCs 48小时，培养的后24小时添加EdU标记细胞。为检验咪达唑仑对SLCs分化的影响，用含不同浓度梯度（0-30μm）咪达唑仑的DIM培养SLCs 21天，培养结束后，固定细胞并对其进行CYP11A1荧光染色，或收集细胞进行QPCR和蛋白免疫印迹分析（WB）；
步骤五，将通过MACS获得的SLCs接种于96孔板中，扩增培养，至细胞密度达80%时，用0-30μm浓度梯度的咪达唑仑处理细胞24小时；在咪达唑仑处理的最后3小时，向96孔板的各孔中加入20ul的Cell Tite 96试剂，并将细胞在37℃下孵育3h，使用酶标仪在490nm处读取吸光度，检测细胞活力；
步骤六，对于步骤四体外扩增培养48h、EdU标记的SLCs，在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟，然后用0.5%Trion X-100破膜处理10分钟，经PBS洗涤后，根据试剂说明书，用Click-it regents处理细胞，以显示细胞分裂时核的EdU掺入，然后对细胞核进行DAPI染色。对于步骤四体外分化培养的细胞，将对照组（0μM）、咪达唑仑低剂量组（5μM）和咪达唑仑高剂量组（30μM）的细胞分别进行CYP11A1荧光染色。将细胞固定、破膜、非特异性抗原封闭后，添加CYP11A1一抗（1:100）在4℃黑暗环境中孵育过夜，经PBS洗涤后，在室温下用荧光二抗（1:1000）避光染色细胞1小时，然后用DAPI染色细胞核；在荧光显微镜下计数EdU+与DAPI+细胞的比值。
步骤七，对新鲜分选的细胞或体外扩增一周的细胞均进行CD90+细胞百分比分析。扩增培养1周后的细胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤两次，然后将细胞悬浮在PBS中，并用PE结合的CD90抗体避光染色45分钟，经PBS洗涤3次后，用AttuneTM NxT流式细胞仪分析细胞。
步骤八，根据以前文献报道的方案，使用Acquity超高效液相色谱（UPLC）装置和XEVO TQD三重四极质谱仪对培养基中的睾酮（T）和孕酮（P4）进行分析，用甲醇将T原液或P4原液中稀释为不同浓度梯度的T或P4工作液，用不含T或P4的培养基梯度稀释相应的工作液，制备标准样品和质控样品；内标（IS）工作溶液由T-d3原液制成；每100ul细胞培养基样品中添加10ul IS工作溶液和200ul，震荡混匀后，将混合物在12000g下离心15分钟，将上清液取样后装入机器，对于T和P4，分析内和分析间的变异度≤±15%。
步骤九，使用RNeasy®试剂盒提取总RNA，并合成cDNA进行QPCR，再分析睾丸细胞标记基因的mRNA水平；将核糖体蛋白S16（Rps16）的mRNA水平作为内参，靶基因的Ct值用Rps16的Ct值进行标准化；
步骤十，进行WB实验，用RIPA裂解液裂解细胞并提取总蛋白，用增强型BCA蛋白分析试剂盒测量蛋白质浓度，将30μg样品蛋白质通过10%SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上，孵育相应抗体进行蛋白表达检测，使用Image Lab 3.0量化每个靶蛋白的灰度值，以α-Tubulin蛋白的灰度值为内参进行标准化；
步骤十一，数据表示为平均数±标准误，采用单因素方差分析方法进行多组比较，并使用Prism软件统计，通过SNK检验确定各组之间的显著性差异并绘制图表；P<0.05、0.01、0.001或0.0001时，表示存在显著性差异。
作为本发明的进一步设置，所述步骤一中，采用二氧化碳窒息的方式处死SD大鼠。
作为本发明的进一步设置，所述步骤二中还包括，温育8分钟后，将阴性组分的上清液丢弃，将粘附在收集管内壁的阳性组分用BI缓冲液重新悬浮，重复分选和丢弃阴性组分上清液动作至少两次。
作为本发明的进一步设置，所述步骤四中还包括，在检测咪达唑仑对SLC增殖的影响以及检验咪达唑仑对SLC分化的影响时，每3或4天更换一次培养基，并在分化期间收集培养基进行T和P4测定。
作为本发明的进一步设置，所述步骤六中采用Click-it®EdU Alexa Fluor试剂盒增殖SLCs。
作为本发明的进一步设置，所述步骤九中分析睾丸细胞标记的mRNA基因，包括Lhcgr、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1、Insl3、Gli1、Cd90、Pdgfr-a、Ptprc、Adgre1、Acta2、Smc1b、Ddx4、Vwf和Sox9。
作为本发明的进一步设置，所述步骤十中，通过LHCGR、STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、INSL3、AKT、CREB、pCREB、SCARB1和α-Tubulin蛋白抗原进行抗体检测。
这样设置的有益效果是，通该实验方法，可以判断验证咪达唑仑对SLC分化有剂量依赖性作用。在0.1-5μM的低浓度下，该药物可轻度增加SLC分化，也就是促进T细胞的产生，而在15-30μM的高浓度下，该药物可抑制LC发展，也就是减少T产生。同时通过试验认为较低水平的T增加是由于SCARB1和CYP17A1的上调，而较高水平的T减少是由于多种类固醇生成蛋白的变化，而类固醇生成蛋白的不均匀变化，特别是CYP17A1的减少，也影响T与孕酮P4的比率，这可能对男性生殖产生额外影响，并且可以通过该方法确认类固醇生成蛋白的丢失是由AKT-CREB信号通路失活导致。
附图说明
图1A为本发明实施例通过表面标记CD90分离睾丸间质干细胞过程中未染色睾丸细胞悬浮液的标识图；
图1B为本发明实施例通过表面标记CD90分离睾丸间质干细胞过程中睾丸细胞悬液MACS分离前用CD90PE抗体进行染色的标识图；
图1C为本发明实施例通过表面标记CD90分离睾丸间质干细胞过程中睾丸细胞悬液在MACS后用CD90PE抗体染色的标识图；
图1D为本发明实施例通过表面标记CD90分离睾丸间质干细胞过程中CD90+阳性细胞在体外培养7天后的标识图；
图2A为本发明实施例中MACS前的睾丸混合细胞对不同的睾丸内细胞标记基因的表达水平图；
图2B为本发明实施例中MACS后的CD90+阳性细胞对不同的睾丸内细胞标记基因的表达水平图；
图2C为本发明实施例中MACS后的CD90-阴性细胞对不同的睾丸内细胞标记基因的表达水平图；
图2D为本发明实施例中CD90+细胞在扩增培养基中培养7天后对不同的睾丸内细胞标记基因的表达水平数图；
图2E为本发明实施例中不同的睾丸内细胞标记基因在Positive/Raw下的表达水平图；
图2F为本发明实施例中不同的睾丸内细胞标记基因在Expand/Positive下的表达水平图；
图3A为本发明实施例中将SLC与咪达唑仑培育24小时，最后3小时将四氮唑化合物（MTS reagent）添加到培养基中，通过活细胞形成的福尔马赞产物（colored formazanproduct）在490nm处的吸光度标识图；
图3B为本发明实施例中SLC在不同浓度的咪达唑仑（0μM；1μM；5μM；30μM）中培育48小时，然后EdU标记24小时，EdU标记细胞的数量占细胞总数的百分比示意图；
图4A为本发明实施例在0、5或30μM咪达唑仑存在下，SLC在21天内被诱导分化为产生睾酮的间质干细胞过程中，每3-4天收集的培养基中睾酮浓度的示意图；
图4B为本发明实施例SLC在含不同浓度的咪达唑仑的培养基中分化21天后，各组培养基内睾酮浓度变化在第21天时的示意图；
图4C为本发明实施例SLC分化第21天，不同浓度咪达唑仑处理组培养基内孕酮浓度的示意图；
图4D为本发明实施例培养基中睾酮和孕酮的百分比统计图；
图4E为本发明实施例培养基中睾酮和孕酮的总和计数图；
图5A为本发明实施例在不同浓度咪达唑仑的作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以Rps16作为内部对照，通过QPCR检测类固醇生成基因Lhcgr的表达示意图；
图5B为本发明实施例在不同浓度咪达唑仑的作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以Rps16作为内部对照，通过QPCR检测类固醇生成基因Star的表达示意图；
图5C为本发明实施例在不同浓度咪达唑仑的作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以Rps16作为内部对照，通过QPCR检测类固醇生成基因Cyp11a1的表达示意图；
图5D为本发明实施例在不同浓度咪达唑仑的作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以Rps16作为内部对照，通过QPCR检测类固醇生成基因Cyp17a1的表达示意图；
图5E为本发明实施例在不同浓度咪达唑仑的作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以Rps16作为内部对照，通过QPCR检测类固醇生成基因Hsd3b1的表达示意图；
图5F为本发明实施例在不同浓度咪达唑仑的作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以Rps16作为内部对照，通过QPCR检测类固醇生成基因Insl3的表达示意图；
图6A为本发明实施例不同类固醇生成蛋白在0、5或30μM咪达唑仑作用下表达示意图；
图6B为本发明实施例类固醇生成蛋白SCARB1在0、5或30μM咪达唑仑作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过westernblots检测类固醇生成蛋白的表达统计图；
图6C为本发明实施例类固醇生成蛋白LBCGR在0、5或30μM咪达唑仑作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过westernblots检测类固醇生成蛋白的表达统计图；
图6D为本发明实施例类固醇生成蛋白CYP11A1在0、5或30μM咪达唑仑作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过westernblots检测类固醇生成蛋白的表达统计图；
图6E为本发明实施例类固醇生成蛋白HSD3B1在0、5或30μM咪达唑仑作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过westernblots检测类固醇生成蛋白的表达统计图；
图6F为本发明实施例类固醇生成蛋白CYP17A1在0、5或30μM咪达唑仑作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过westernblots检测类固醇生成蛋白的表达统计图；
图6G为本发明实施例类固醇生成蛋白STAR在0、5或30μM咪达唑仑作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过westernblots检测类固醇生成蛋白的表达统计图；
图6H为本发明实施例类固醇生成蛋白INSL3在0、5或30μM咪达唑仑作用下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过westernblots检测类固醇生成蛋白的表达统计图；
图7A为本发明实施例中咪唑安定对AKT-CREB信号分子和胆固醇导入蛋白SCRB1的影响示意图；
图7B为本发明实施例中在0、5或30μM咪唑安定存在下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过Western blot分析AKT的表达示意图；
图7C为本发明实施例中在0、5或30μM咪唑安定存在下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过Western blot分析CREB的表达示意图；
图7D为本发明实施例中在0、5或30μM咪唑安定存在下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过Western blot分析PCREB/CREB的表达示意图；
图7E为本发明实施例中在0、5或30μM咪唑安定存在下诱导干间质细胞经21天分化为间质细胞，以α-Tubulin蛋白为内对照，通过Western blot分析PCREB的表达示意图。
具体实施方式
本发明咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法的实施例：包括以下步骤，
步骤一，选用2-4个月成年雄性SD大鼠作为实验对象，将EDS溶解于DMSO:PBS=1:3的混合物中，对SD大鼠进行腹腔注射给药，剂量为80mg/kg，经EDS处理四天后，处死SD大鼠；
步骤二，迅速取出SD大鼠睾丸并将其置于冰冷的汉克斯平衡盐溶液中，去除睾丸包膜后，将实质组织置于含1mg/ml胶原酶IV的DMEM/F12培养基中，34℃水浴摇床，振荡90次/分，消化组织30分钟；消化后的组织室温沉淀1分钟后，用70μm孔径的尼龙网过滤上清液；通过磁珠分选法（MACS）对CD90+细胞进行正向分选，将获得的细胞颗粒悬浮在BD-IMagTM（BI）缓冲液中，调整细胞密度为2 x 107细胞/ml，用藻红蛋白（PE）结合的CD90抗体对细胞表面抗原进行标记，4℃避光孵育40分钟，而后用BI缓冲液洗涤细胞两次，并用抗PE的磁珠在4℃避光条件下标记细胞30分钟；将磁珠标记的细胞转移到收集管中，将所述收集管置于BD IMagTM细胞分离磁铁支架上，避光分选8分钟后，将含阴性组分的上清液丢弃，用BI缓冲液重悬粘附在收集管内壁的阳性组分；用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并收集管内壁的阳性组分，并通过流式细胞术（FCM）测定CD90+细胞的百分比；
步骤三，用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基重悬纯化的睾丸间质干细胞（SLCs），将细胞接种于24孔板中，3小时后，细胞贴壁时，将培养基更换为扩增培养基（EM），细胞在35℃，5% CO2条件下扩增培养一周后，进行CD90荧光染色或进行睾丸相关基因的定量聚合酶链反应分析（QPCR）；细胞扩增后汇合率达90%时，将EM更换为分化诱导培养基（DIM）并培养3周；
步骤四，检测咪达唑仑对SLC增殖的影响，用含浓度梯度为0-30μm咪达唑仑的EM培养SLCs 48小时，培养的后24小时添加EdU标记细胞；在检验咪达唑仑对SLCs分化的影响时，用含浓度梯度为0-30μm咪达唑仑的DIM培养SLCs 21天，培养结束后，固定细胞并对其进行CYP11A1荧光染色，或收集细胞进行QPCR和蛋白免疫印迹分析（WB）；
步骤五，将通过MACS获得的SLCs接种于96孔板中，扩增培养，至细胞密度达80%时，用0-30μm浓度梯度的咪达唑仑处理细胞24小时；在咪达唑仑处理的最后3小时，向96孔板的各孔中加入20ul的Cell Tite 96试剂，并将细胞在37℃下孵育3h，使用酶标仪在490nm处读取吸光度，检测细胞活力；
步骤六，对于步骤四中体外扩增培养48h、EdU标记的SLCs，在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟，然后用0.5%Trion X-100破膜处理10分钟，经PBS洗涤后，用Click-it regents处理细胞，然后对细胞核进行DAPI染色，对于步骤四体外分化培养的细胞，将对照组、5μM咪达唑仑低剂量组和30μM咪达唑仑高剂量组的细胞分别进行CYP11A1荧光染色；将细胞固定、破膜、非特异性抗原封闭后，添加CYP11A1一抗在4℃黑暗环境中孵育过夜，经PBS洗涤后，在室温下用荧光二抗避光染色细胞1小时，然后用DAPI染色细胞核；在荧光显微镜下计数EdU+与DAPI+细胞的比值；
步骤七，对新鲜分选的细胞或体外扩增一周的细胞均进行CD90+细胞百分比分析，扩增培养1周后的细胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤两次，然后将细胞悬浮在PBS中，并用PE结合的CD90抗体避光染色45分钟，经PBS洗涤3次后，用AttuneTM NxT流式细胞仪分析细胞；
步骤八，使用Acquity超高效液相色谱（UPLC）装置和XEVO TQD三重四极质谱仪对培养基中的睾酮（T）和孕酮（P4）进行分析，用甲醇将T原液或P4原液中稀释为不同浓度梯度的T或P4工作液，用不含T或P4的培养基梯度稀释相应的工作液，制备标准样品和质控样品；内标（IS）工作溶液由T-d3原液制成；每100ul细胞培养基样品中添加10ul IS工作溶液，并与200ul乙腈混合，震荡混匀后，将混合物在12000g下离心15分钟，将上清液取样后装入机器，对于T和P4，分析内和分析间的变异度≤±15%；
步骤九，使用RNeasy®试剂盒提取总RNA，并合成cDNA进行QPCR，再分析睾丸细胞标记基因的mRNA水平；将核糖体蛋白S16（Rps16）的mRNA水平作为内参，靶基因的Ct值用Rps16的Ct值进行标准化；
步骤十，进行WB实验，用RIPA裂解液裂解细胞并提取总蛋白，用增强型BCA蛋白分析试剂盒测量蛋白质浓度，将30μg样品蛋白质通过10%SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上，孵育相应抗体进行蛋白表达检测，使用Image Lab 3.0量化每个靶蛋白的灰度值，以α-Tubulin蛋白的灰度值为内参进行标准化；
步骤十一，数据表示为平均数±标准误，采用单因素方差分析方法进行多组比较，并使用Prism软件统计，通过SNK检验确定各组之间的显著性差异并绘制图表；P<0.05、0.01、0.001或0.0001时，表示存在显著性差异。
在该方法中，所述步骤一中，采用二氧化碳窒息的方式处死SD大鼠。
在该方法中，所述步骤二中还包括，分选8分钟后，将阴性组分的上清液丢弃，将粘附在收集管内壁的阳性组分用BI缓冲液重新悬浮，重复分选和丢弃阴性组分上清液动作至少三次。
在该方法中，所述步骤四中还包括，在检测咪达唑仑对SLC增殖的影响以及检验咪达唑仑对SLC分化的影响时，每3或4天更换一次培养基，并在分化期间收集培养基进行T和P4测定。
在该方法中，所述步骤六中采用Click-it®EdU Alexa Fluor试剂盒增殖SLCs。
在该方法中，所述步骤九中分析睾丸细胞标记的mRNA基因，包括Lhcgr、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1、Insl3、Gli1、Cd90、Pdgfr-a、Ptprc、Adgre1、Acta2、Smc1b、Ddx4、Vwf和Sox9。
在该方法中，所述步骤十中，通过LHCGR、STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、INSL3、AKT、CREB、pCREB、SCARB1和α-Tubulin蛋白进行抗体检测。
其中，本实施例中，DMEM/F12培养基、地塞米松、FBS、ITS均从Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯购买。β-巯基乙醇、FGF2、N2和B27补充剂来自Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德；鸡胚提取物来自生物制品公司，马萨诸塞州塞勒姆；EGF来自Peprotech，新泽西州洛基山；LIF来自密理博，马萨诸塞州伯灵顿；Oncostatin-M和PDGFBB来自ProSpec，新泽西州东布伦瑞克；SAG购自EMD生物科学公司，威斯康星州密尔沃基；抗R-藻红蛋白（PE）磁性粒子与BD-IMag™缓冲液（10倍）来自BD biosciences，新泽西州富兰克林湖；咪达唑仑来自江苏恩华制药有限公司，中国徐州；人类LH来自MyBiosource，加利福尼亚州圣地亚哥。
通过上述试验方法，由于大鼠睾丸中的SLC特异性表达表面标记物为CD90，方法采用了基于MACS+细胞扩增程序的SLC纯化方案，在CD90PE抗体染色之前，如图1A所示，或之后如图1B-图1D所示，通过流式细胞术分析EDS处理的大鼠睾丸间质，经胶原酶消化制备的细胞悬浮液，并用磁珠系统（BD-ImagTM）阳性选择CD90PE染色细胞3次，如图1B，选择富集的CD90+细胞从最初的4.9%纯度到约83%，如图1C所示，并且在体外扩增7天后，CD90+细胞的纯度几乎达到100%，如图1D所示。
本方法为了进一步鉴定CD90+细胞的纯度，方法从细胞中分离出总RNA，并针对每个主要睾丸内细胞的标记基因进行qPCR，如图2所示，这些细胞和相应的标记物包括：SLC（间质干细胞1、Cd90、Pdgfr-a）、免疫细胞（Ptprc）、巨噬细胞（Adgre1）、平滑肌细胞（Acta2）、生殖细胞（Smc1b、Ddx4）、血管内皮细胞（Vwf）和支持细胞（Sox9），分选前和分选后阴性细胞悬浮液中的主要细胞类型为生殖细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞。MACS术后富集的阳性细胞，所有3种SLC特异性标记物（Gli1、Cd90、Pdgfr-a）均高水平表达（图2C），进一步的在体外扩增7天后，所有3个SLC基因的高表达均保持不变，而其他细胞的标记物显著降低（图2D）。计算每种细胞类型的富集因子（比率）（图2E，2F）。可以看到，MACS步骤正富集SLC达15倍左右（图2E），而体外扩增步骤则负富集了除SLC外的所有其他细胞类型（图2F）。这些结果与流式细胞术发现的CD90+细胞增加相一致。
进一步的本方法为了探索咪达唑仑对SLC活性的潜在毒性作用，我们将细胞与四氮唑化合物（MTSreagen）培育24小时，四氮唑化合物可被活细胞转化为福尔马赞产物（colored formazam product）。在整个咪达唑仑浓度范围内，形成的福尔马赞产物的浓度没有变化，从而可以排除对细胞的一般毒性作用，如图3A所示。为了检测咪达唑仑对SLC增殖的影响，CD90+细胞在扩增期间与不同浓度的咪达唑仑培养48小时，并在最后24小时加入EdU，方法证明，咪达唑仑对细胞增殖有轻度抑制作用，有约20%的抑制率，通过该方法发现咪达唑仑的抑制作用可在1μM时出现，但是随着浓度的增加，抑制作用不会进一步降低，直至30μM。
本方法为了检测咪达唑仑对SLC分化的影响，体外诱导细胞经过3周分化为ALC，在没有咪唑安定的情况下，最初不具有类固醇生成活性的SLC在7天内变成具有睾酮合成能力的细胞，如图4A所示。随后，该细胞产生睾酮的能力不断增加。低浓度（5μM）咪达唑仑组在第21天时，睾酮的生成有轻微但显著的增加。而高浓度（30μM）咪达唑仑组在分化的21天中，睾酮的生成几乎完全被抑制。在21天的分化过程中，用一系列浓度梯度的咪达唑仑培育细胞，并在第21天测定各处理组培养基内睾酮水平。如图4B所示，证实了SLC对咪达唑仑的双相反应。该方法有效证实低浓度（1-5μM）咪达唑仑可促进睾酮产生，高浓度（15-30μM）咪达唑仑会抑制睾酮产生。
在类固醇生成过程中，睾酮合成酶（CYP7A）将孕酮（P4）转化为睾酮（T），本方法测定了培养基中的孕酮（P4）水平，见图4C。方法发现在随着咪达唑仑处理浓度的升高，咪达唑仑上调了孕酮（P4）浓度，而下调了睾酮（T）较孕酮（P4）的比例，如图4D，且睾酮（T）和孕酮（P4）的总量会随着咪唑安定浓度的增加而减少，如图4E，这表明总类固醇的合成水平在咪唑安定浓度升高时被抑制。
进一步的，本方法为了阐明咪唑安定对类固醇生成途径的特异性作用，通过QPCR和Western blot分析关键类固醇生成酶的mRNA和蛋白质水平。通过试验发现随着咪达唑仑浓度的增加，Lhcgr和Cyp17a1基因先上调后下调，如图5所示，而其他4个基因未受到显著影响。Lhcgr和Cyp17a1的这些双相反应与睾酮（T）变化在各组中完全一致。如（图6）所示，通过Western印迹试验进一步揭示，LHCGR在低浓度的咪达唑仑组中依赖性上调没有出现，而SCARB1和CYP17A1在低水平（5μM）的咪达唑仑处理后显著上调，其次，除HSD3B1外，所有蛋白质中均在高水平的咪达唑仑作用下下调。从而证实，咪达唑仑对类固醇生成途径的影响没有影响所有的基因和蛋白质，证明这种影响在某些蛋白的合成过程中可能发生在转录和翻译环节。
通过westernblots分析，蛋白质含量的降低可能源于所有细胞蛋白表达水平表达较低且均匀，或者是由于细胞群间蛋白表达水平的不均匀减少导致的。本实例为了证实Western blot的结果并更详细地评估各细胞的变化，将细胞中的CYP11A1和CYP17A1蛋白进行免疫荧光染色，结果表明，在低剂量组（5μM）中，CYP11A1没有显著变化，而在高剂量组30μM中，检测到的阳性细胞显著减少。对于CYP17A1，与对照细胞相比，低剂量组（5μM）的染色数量明显强于高剂量组（30μM）。这与图6中的Western blot和图3中睾酮的产生的结果完全一致，表明SCARB1和CYP17A1是在低浓度下产生较高睾酮的原因，而多种酶的组合变化是在高浓度下产生较低T细胞的原因。
由于PI3K/AKT信号通路在类固醇生成过程中的细胞的发育、分化和凋亡中起着重要作用。为了检测该信号通路是否受咪达唑仑治疗的影响，通过Western blot分析该通路中两个关键成分AKT和CREB的蛋白表达水平和/或其磷酸化，通过上述操作发现，高剂量的咪达唑仑可明显降低两种蛋白的总水平和CREB的磷酸化形式。而在低剂量下，两种蛋白质中的任何一种较于对照组均未检测到差异，这表明该信号通路可能是高剂量咪达唑仑暴露导致睾酮产生减少的部分原因，但与低剂量咪达唑仑处理后细胞睾酮合成增加无关。
通过上述方法发现，如果在ALC发展过程中给予较长时间的咪达唑仑暴露，会影响睾丸间质细胞的增殖和分化。其作用呈剂量依赖性。在低剂量（1-5μM）下，该药物可轻度增加ALC类固醇生成功能的发育，而在高剂量（15-30μM）下，该药物可抑制睾丸间质细胞的发育。较低水平的睾酮生成增加可能是由于CYP17A1的上调，而高剂量组睾酮生成减少可能是由于多种类固醇生成蛋白的变化。然而，类固醇生成途径蛋白的这些变化可能是由于AKT-CREB信号途径的变化介导。由于类固醇生成途径的不均匀变化，孕酮（P4）在睾酮（T）产生减少的浓度下积累。两种重要类固醇激素（T/P4）之间的比率变化也可能影响男性生殖系统的发育。由于所测试的咪达唑仑浓度接近于人类患者的血液水平，因此咪达唑仑在临床上的运用存在引起这些影响发生的风险。本方法也有效验证了咪唑安定对睾丸间质干细胞发育的作用机理。
以上实例，只是本发明优选地具体实例的一种，本领域技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，其特征在于：
步骤一，选用2-4个月成年雄性SD大鼠作为实验对象，将EDS溶解于DMSO:PBS＝1:3的混合物中，对SD大鼠进行腹腔注射给药，剂量为80mg/kg，经EDS处理四天后，处死SD大鼠；
步骤二，迅速取出SD大鼠睾丸并将其置于冰冷的汉克斯平衡盐溶液中，去除睾丸包膜后，分离曲精管，将实质组织置于含1mg/ml胶原酶IV的DMEM/F12培养基中，34℃水浴摇床，振荡90次/分，消化组织30分钟；消化后的组织室温沉淀1分钟后，用70μm孔径的尼龙网过滤上清液；通过磁珠分选法(MACS)对CD90+细胞进行正向分选，将获得的细胞颗粒悬浮在BD-IMagTM(BI)缓冲液中，调整细胞密度为2 x 107细胞/ml，用藻红蛋白(PE)结合的CD90抗体对细胞表面抗原进行标记，4℃避光孵育40分钟，而后用BI缓冲液洗涤细胞两次，并用抗PE的磁珠在4℃避光条件下标记细胞30分钟；将磁珠标记的细胞转移到收集管中，将所述收集管置于BD IMagTM细胞分离磁铁支架上，避光分选8分钟后，将含阴性组分的上清液丢弃，用BI缓冲液重悬粘附在收集管内壁的阳性组分；用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬并收集管内壁的阳性组分，并通过流式细胞术(FCM)测定CD90+细胞的百分比；
步骤三，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基重悬纯化的睾丸间质干细胞(SLCs)，将细胞接种于24孔板中，3小时后，细胞贴壁时，将培养基更换为扩增培养基(EM)，细胞在35℃，5％CO2条件下扩增培养一周后，进行CD90荧光染色或进行睾丸相关基因的定量聚合酶链反应分析(QPCR)；细胞扩增后汇合率达90％时，将EM更换为分化诱导培养基(DIM)并培养3周；
步骤四，在检测咪达唑仑对SLC增殖的影响，用含浓度梯度为0-30μm咪达唑仑的EM培养SLCs 48小时，培养的后24小时添加EdU标记细胞；在检验咪达唑仑对SLCs分化的影响时，用含浓度梯度为0-30μm咪达唑仑的DIM培养SLCs 21天，培养结束后，固定细胞并对其进行CYP11A1荧光染色，或收集细胞进行QPCR和蛋白免疫印迹分析(WB)；
步骤五，将通过MACS获得的SLCs接种于96孔板中，扩增培养，至细胞密度达80％时，用0-30μm浓度梯度的咪达唑仑处理细胞24小时；在咪达唑仑处理的最后3小时，向96孔板的各孔中加入20ul的Cell Tite 96试剂，并将细胞在37℃下孵育3h，使用酶标仪在490nm处读取吸光度，检测细胞活力；
步骤六，对于步骤四中体外扩增培养48h、EdU标记的SLCs，在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟，然后用0.5％Trion X-100破膜处理10分钟，经PBS洗涤后，用Click-it regents处理细胞，然后对细胞核进行DAPI染色，对于步骤四体外分化培养的细胞，将对照组、5μM咪达唑仑低剂量组和30μM咪达唑仑高剂量组的细胞分别进行CYP11A1荧光染色；将细胞固定、破膜、非特异性抗原封闭后，添加CYP11A1一抗在4℃黑暗环境中孵育过夜，经PBS洗涤后，在室温下用荧光二抗避光染色细胞1小时，然后用DAPI染色细胞核；在荧光显微镜下计数EdU+与DAPI+细胞的比值；
步骤七，对新鲜分选的细胞或体外扩增一周的细胞均进行CD90+细胞百分比分析，扩增培养1周后的细胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤两次，然后将细胞悬浮在PBS中，并用PE结合的CD90抗体避光染色45分钟，经PBS洗涤3次后，用AttuneTM NxT流式细胞仪分析细胞；
步骤八，使用Acquity超高效液相色谱(UPLC)装置和XEVO TQD三重四极质谱仪对培养基中的睾酮(T)和孕酮(P4)进行分析，用甲醇将T原液或P4原液中稀释为不同浓度梯度的T或P4工作液，用不含T或P4的培养基梯度稀释相应的工作液，制备标准样品和质控样品；内标(IS)工作溶液由T-d3原液制成；每100ul细胞培养基样品中添加10ul IS工作溶液，并与200ul乙腈混合，震荡混匀后，将混合物在12000g下离心15分钟，将上清液取样后装入机器，对于T和P4，分析内和分析间的变异度≤±15％；
步骤九，使用
Figure FDA0003297996040000031
试剂盒提取总RNA，并合成cDNA进行QPCR，再分析睾丸细胞标记基因的mRNA水平；将核糖体蛋白S16(Rps16)的mRNA水平作为内参，靶基因的Ct值用Rps16的Ct值进行标准化；
步骤十，进行WB实验，用RIPA裂解液裂解细胞并提取总蛋白，用增强型BCA蛋白分析试剂盒测量蛋白质浓度，将30μg样品蛋白质通过10％SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上，孵育相应抗体进行蛋白表达检测，使用Image Lab 3.0量化每个靶蛋白的灰度值，以α-Tubulin蛋白的灰度值为内参进行标准化；
步骤十一，数据表示为平均数±标准误，采用单因素方差分析方法进行多组比较，并使用Prism软件统计，通过SNK检验确定各组之间的显著性差异并绘制图表；P<0.05、0.01、0.001或0.0001时，表示存在显著性差异。
2.根据权利要求1所述的咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，其特征在于：所述步骤一中，采用二氧化碳窒息的方式处死SD大鼠。
3.根据权利要求1所述的咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，其特征在于：所述步骤二中还包括，温育8分钟后，将阴性组分的上清液丢弃，将粘附在收集管内壁的阳性组分用BI缓冲液重新悬浮，重复分选和丢弃阴性组分上清液动作至少三次。
4.根据权利要求1所述的咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，其特征在于：所述步骤四中还包括，在检测咪达唑仑对SLC增殖的影响以及检验咪达唑仑对SLC分化的影响时，每3或4天更换一次培养基，并在分化期间收集培养基进行T和P4测定。
5.根据权利要求1所述的咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，其特征在于：所述步骤六中采用
Figure FDA0003297996040000032
EdU Alexa Fluor试剂盒增殖SLCs。
6.根据权利要求1所述的咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，其特征在于：所述步骤九中分析睾丸细胞标记的mRNA基因，包括Lhcgr、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1、Insl3、Gli1、Cd90、Pdgfr-a、Ptprc、Adgre1、Acta2、Smc1b、Ddx4、Vwf和Sox9。
7.根据权利要求1所述的咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，其特征在于：所述步骤十中，通过LHCGR、STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、INSL3、AKT、CREB、pCREB、SCARB1和α-Tubulin蛋白进行抗体检测。
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