CN1195772A - 梳式斑点免疫检测法 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示一种人类免疫缺陷病毒HIV1+2型抗体检测法——梳式斑点免疫法,采用人工合成多肽抗原(含HIV－1型gp41和HIV－2型gp36)吸附于梳状反应齿上,经与标本中存在的抗HIV抗体反应后,抗原－抗体复合物与金标A蛋白作用,抗体阳性的标本在梳齿与标本的接触端显示粉红色斑点,而阴性标本无任何颜色,本发明的测出法具有快速、简便、灵敏和特异性的优点,结果易于观察,并可永久保存。
Description
本发明涉及人类免疫缺陷病毒HIV1+2型抗体检测法，具体是一种梳式斑点免疫检测法。
国际上检出艾滋病的方法有多种如：间接ELISA测定法、直接FIA测定法、免疫印迹法测定法、Biochrom测定法、IAF Biochem测定法、Pharmacia测定法等[AIDS.1990 Apr；4(4)：355-60]。其中以合成多肽作为艾滋病的诊断试剂，因其肽是通过纯化学法合成，不引入任何污染抗原，具有高特异性和高敏感性等优点，是很有发展前途的一种诊断试剂[国外医学：预防1989，12(5)，193-195]。95年美国Schwartz-DH等叙述各种商用HIV抗体诊断试剂盒对测试的血清样品，其HIV感染的检出是100％的灵敏，Murex Single应用诊断系统和UntiedBiomedical公司的HIV-1/2酶免疫测定(ELA)试剂盒检出HIV-1gp41的抗体的专一性达98～100％[Clin-Diagn-Lab-Immunol.1995 May；2(3)：268-71]。94年西班牙Fernandez-Rodriguez-E等叙述使用快速诊断免疫酶测定(测试包为HIV1/HIV-2)，在唾液里检出HIV抗体，此法对静脉药物泛用的人群意义尤为重大。文献叙述了从70名艾滋病患者的血清和唾液里，均能用此法同时和预期测量抗-HIV抗体[Rev-Clin-Esp.1994 Jul；194(7)：523-5]。
国内：中国发明专利CN 1052310是美国病毒技术公司在90年10月在中国申请的专利，文中叙述特异性肽片段HIVp17被用作检测和治疗艾滋病的诊断剂和疫苗。
本发明的目的是提供一种梳式斑点免疫检测法，用于检测血清、血浆或全血的HIV1+2抗体。
本发明的上述目的是通过以下方式实现的：一种梳式斑点免疫检测法，包括将含HIV-1gp41和HIV-2gp36的人工合成多肽抗原色被于梳齿上，经与标本中存在的HIV反应形成抗原——抗体复合物，再与金标A蛋白作用，抗体阳性者梳齿尖即呈现红色斑点，阴性者无色。
本发明的优点是明显的，本方法通过特殊的合成肽，减少了非特异性反应；采用金标代替酶标，大大缩短检测所需的时间；使用梳条代替酶标板，无需任何设备，结果易于判断并可永久存档，而且灵敏度高达100％，特异性为99.9％；时间短，在20分钟可获得检测结果，所以适于临床、基层血站和落后边缘地区推广使用；另外，它适于长期存放，置于37℃可达二周，22℃三个月，4℃一年灵敏度，特异性不受影响。
本发明方法中采用的HIV-1gp41和HIV-2gp36合成抗原的纯度＞95％，溶解度≥1mg/ml，在浓度＜2μg/ml时有强的抗原性，HIV-1gp41和HIV-2gp36其序列分别为：gp41：Arg-Ile-leu-Ala-val-Glu-Arg-Tyr-leu-lys-Asp-Gla-Gln-lev-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-lys-lev-ile-Cys-NH2
gp36：AGln-Asp-Gln-Ala-Arg-leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Ary-Gln-Val-Cys-NH2。
A蛋白是一分子量42KD的多肽，是金黄色葡萄球菌S.aureus的正常膜组份。抗体分子有两个A蛋白的结合位点，位于重链的第二和第三恒定区。但是由于来源于不同动物的抗体以及不同的抗体型和亚型之间，其FC片断不同，因此A蛋白与不同抗体的亲合能力也不相同。A蛋白与来源于人、免、鼠的抗体具有很强的亲合力。
A蛋白与抗体FC片断的结合是通过疏水作用完成的，因此不会改变该抗体与抗原的结合活性。通过与酶、荧光素、胶体金等的结合，A蛋白可以用来对抗体进行定位或定量。
本发明使用的A蛋白，每mg可结合10-11mg人IgG。并具有如下的质量指标：
外观：肉眼观察为冰冻干燥粉未。
光吸收：在275nm光吸收，当10mg/mL浓度的A蛋白溶液A275≥1.32，样品光吸度(275nm)不低于此标准品的88％。
光谱特性：在250-350nm的光扫描图谱，其最大光吸收在275nm，最小光吸收在250nm，在267nm存在一个峰，在320nm的光吸收应小于0.04。
纯度：用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定为银染色单一条带(42KD)。
以下将结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例：梳式斑点免疫检测法
一、试剂和包被梳的制备：
(1)点梳液的配制
配方：
HIV-1gp41(购自美国BCI公司)0.1mg
HIV-2-gp36(购自美国BCI公司)0.15mg
Na2CO3(AR)0.6g
NaHCO3(AR)0.29g
用重蒸馏水稀释至100ml的溶液PH＝9.6，采用8μl/孔点于18齿塑料梳尖上，于4℃过夜。
(2)封闭液的配制
配方：
NaCl(AR)1.7g 0.2MNa2HPO47.7ml
0.2M NaH2PO42.3ml蔗糖(AR)10g
BSA(购自美国Sigma公司)0.2g
用重蒸馏水稀释成200ml的溶液pH＝7.4，采用10μl/孔封闭上述(1)梳点，于37℃二小时，干燥真空包装后备用。
(3)显示剂的配制
配方：
1％氯化金60ml
1％柠檬酸钠240ml
加重蒸馏水至5000ml后，加热煮沸15分钟，冷却至30℃，再加入：
A蛋白(购自美国BCI公司)9mg
5％BSA(购自美国Sigma公司)1g
于12000转/分离心60分钟，弃上清液，沉淀中加入：
乙二醇(AR)20ml
NaN3(购自美国Sigma公司)1g
用0.01M PBS(AR)稀释至2000ml(λ＝525nm 0D＝0.35)。
(4)样品稀释液配制
配方：
0.2M Na2HPO428ml
0.2M NaH2PO472ml
NaCl(AR)17g
NaN3(购自美国Sigma公司)0.48
BSA(购自美国Sigma公司)0.2g
Tween-20(购自美国Sigma公司)1ml
用重蒸馏水稀释至2000ml
(5)抗HIV1+2阳性对照配制
配方：
HIV1+2阳性血清(购自美国BCI公司)80ml
NaN3(购自美国Sigma公司)0.1g
将其混匀后使用。
(6)抗HIV1+2阴性对照配制
配方：
HIV1+2阴性血清(购自美国BCI公司)80ml
NaN3(购自美Sigma公司)0.1g
将其混匀后使用。
(7)洗涤液配制
配方：
NaCl(AR)170g
NaN3(购自美国Sigma公司)4g
0.2Mna2HPO4770ml
0.2MNaH2PO4230ml
Tween-20 20ml加重蒸馏水至20000ml pH＝7.4。
二、检测方法：
(1)标记待检样品和检测梳的编号、位置和日期。
(2)在微孔反应板的每一标孔内加上述样品稀释液1滴，再分别加入待检样品或上述抗HIV1+2阳性和阴性的对照品1滴(50μl，充分混匀。
(3)将检测流插入相应的标本行中，室温孵育10分钟。
(4)在微孔反应板的第二排孔内，每孔加入上述显示剂3滴。
(5)在洗涤槽中加入由20ml加80ml重蒸馏水的上述洗涤液。
(6)将孵育完毕的梳子取出，把齿尖放在吸水纸上吸去多余液体。
(7)将梳齿插入稀释好的洗涤液中，来回摆动10次，然后将齿尖放在吸水纸上吸去多余液体。
(8)将梳齿插入上述显示剂中，室温孵育10分钟，重复(6)～(8)，将检测梳标记面向上放在吸水纸上晾干。
(9)在强光或日光下与眼平齐、垂直观察结果，梳尖具有粉红色圆点均为阳性(即使是很浅的粉红色圆点，没有颜色为阴性。
(10)将梳子装入档案夹内存档备查。
采用本方法检测血清、血浆或全血的HIV1+2抗体的灵敏度高达100％，特异性为99.9％，操作简单，无需反复洗涤，操作时间短，仅需20分钟，而其它诸如ELA法则需二小时左右，操作过程不需要特殊设备，结果易于判别，且可留档备查，以便于与日后结果比较更具客观性。
上述实施例仅为了说明的目的，本发明的保护范围将在权利要求书中体现。
Claims (2)
1.一种梳式斑点免疫检测法，其特征包括将含HIV-1gp41和HIV-2gp36人工合成多肽抗原包被于梳齿上，梳齿与标本中存在的HIV反应，再与金标A蛋白作用，以梳齿显示或不显示粉红色点进行判别，有粉红色圆点为阳性，没有颜色者为阴性。
2.如权利要求1所述的检测法，其特征包括
(1)标记待检样品和检测梳；
(2)在微孔反应板的每一标孔内加样品稀释液1滴，再分别加入待检样品或抗HIV1+2阳性和阴性的对照品1滴后充分混匀；
(3)将检测梳插入相应的标本中，室温孵育10分钟；
(4)在微孔反应板的第二插孔内，每孔加入显示剂3滴；
(5)在洗涤槽中加入由20ml加80ml重蒸馏水的洗涤液。
(6)将孵育完毕的梳子取出，把齿尖放在吸水纸上吸去多余液体。
(7)将梳齿插入稀释好的洗涤液中，来回摆动10次，然后将齿尖放在吸水纸上吸去多余液体。
(8)将梳齿插入显示剂中，室温孵育10分钟，重复(6)～(8)，将检测梳标记面向上放在吸水纸上晾干。
(9)在强光或日光下与眼平齐、垂直观察结果，梳尖具有粉红色圆点均为阳性(即使是很浅的粉红色圆点)，没有颜色为阴性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN97106358A CN1195772A (zh) | 1997-04-04 | 1997-04-04 | 梳式斑点免疫检测法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN97106358A CN1195772A (zh) | 1997-04-04 | 1997-04-04 | 梳式斑点免疫检测法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1195772A true CN1195772A (zh) | 1998-10-14 |
Family
ID=5168605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN97106358A Pending CN1195772A (zh) | 1997-04-04 | 1997-04-04 | 梳式斑点免疫检测法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1195772A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102608312A (zh) * | 2012-02-28 | 2012-07-25 | 李洪 | 一种应用于微量明胶颗粒凝集hiv-1近期感染检测法的血清或血浆样品稀释液 |
| CN111879934A (zh) * | 2020-08-12 | 2020-11-03 | 上海市动物疫病预防控制中心(上海市兽药饲料检测所、上海市畜牧技术推广中心) | 一种犬癌胚抗原免疫梳、犬癌胚抗原检测试剂盒 |
-
1997
- 1997-04-04 CN CN97106358A patent/CN1195772A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102608312A (zh) * | 2012-02-28 | 2012-07-25 | 李洪 | 一种应用于微量明胶颗粒凝集hiv-1近期感染检测法的血清或血浆样品稀释液 |
| CN111879934A (zh) * | 2020-08-12 | 2020-11-03 | 上海市动物疫病预防控制中心(上海市兽药饲料检测所、上海市畜牧技术推广中心) | 一种犬癌胚抗原免疫梳、犬癌胚抗原检测试剂盒 |
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