CN119220590A - 紫花苜蓿MsPYL9基因及其在调控植物耐旱性能中的应用 - Google Patents
紫花苜蓿MsPYL9基因及其在调控植物耐旱性能中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN119220590A CN119220590A CN202411653960.8A CN202411653960A CN119220590A CN 119220590 A CN119220590 A CN 119220590A CN 202411653960 A CN202411653960 A CN 202411653960A CN 119220590 A CN119220590 A CN 119220590A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- gene
- mspyl
- mspyl9
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 91
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 89
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 50
- 241000219823 Medicago Species 0.000 title claims abstract description 44
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 title abstract description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims description 11
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 6
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 claims 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 31
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 13
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 30
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 24
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 10
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 8
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 8
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 8
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 3
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 3
- 229940038649 clavulanate potassium Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- ABVRVIZBZKUTMK-JSYANWSFSA-M potassium clavulanate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 ABVRVIZBZKUTMK-JSYANWSFSA-M 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N ticarcillin Chemical compound C=1([C@@H](C(O)=O)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)C=CSC=1 OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N 0.000 description 3
- 229960004075 ticarcillin disodium Drugs 0.000 description 3
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 241000220485 Fabaceae Species 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 1
- 101150021031 PYL9 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000012233 TRIzol extraction Methods 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003501 hydroponics Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002366 mineral element Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了紫花苜蓿MsPYL9基因及其在调控植物耐旱性能中的应用，涉及分子生物学领域。MsPYL9蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％同一性，将其应用于转基因植物的构建，可以在不改变植物的基本生理结构和营养价值的前提下，优化植物品种，提升植物对干旱胁迫的耐受能力，这使得植物能够在干旱条件下趋近于正常生长。MsPYL9蛋白或MsPYL9基因对培育抗旱植物具有重要意义，可有效提高生产力，节约水资源。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及紫花苜蓿MsPYL9基因及其在调控植物耐旱性能中的应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是豆科苜蓿属的一种多年生草本植物，起源于西亚地区，由于其适应性强且生长快速，现在已经广泛引种和栽培于欧洲、亚洲和北美洲的温带地区，被称为“牧草之王”。紫花苜蓿具有丰富的营养价值，且营养全面，在农业生产中占有重要地位。
紫花苜蓿以粗蛋白质含量高而著称，粗蛋白约占干物质的15％～20％，远高于其它饲料作物。粗蛋白中氨基酸种类齐全、比例均衡、转化效价较高，含有20种以上人和动物全部必需的氨基酸，以及一些稀有氨基酸。紫花苜蓿还富含碳水化合物、维生素、矿物质元素等，这些营养物质在动物的生长发育中发挥着重要的作用，包括提供重要的能量营养素，促进动物的消化，改善动物产品品质，提高动物的免疫机能等。
分布于北方地区的紫花苜蓿受限于北方地区的降水量较少，土壤盐渍化，以及冬季寒冷漫长等特性，紫花苜蓿种植面积和产量受到严重威胁。紫花苜蓿对干旱条件有一定的适应能力，但长期或严重的干旱胁迫会对紫花苜蓿产生重要影响。通过分子育种手段，筛选和培育出更加耐旱的紫花苜蓿品种，可以增加牧草生产的稳定性和可持续性。耐旱紫花苜蓿的培育还可以减少对水资源的需求，有助于节约水资源，特别是在干旱地区或水资源稀缺的地方，可以更有效地利用有限的水资源进行农牧业生产。目前紫花苜蓿抗逆新品种的选育仍不足以达到紫花苜蓿的生产需求。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供紫花苜蓿MsPYL9基因及其在调控植物耐旱性能中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了生物材料在提高植物抗逆性或制备提高植物抗逆性的产品中的应用，所述生物材料包括以下任意一种：(1)MsPYL9蛋白，氨基酸序列与SEQID NO:1所示序列具有至少80％同一性；(2)编码所述MsPYL9蛋白的分离的核酸分子；(3)含所述分离的核酸分子的载体；(4)含所述载体的重组细胞或重组菌。
第二方面，本发明实施例提供了一种提高植物抗逆性的方法，其包括：提高目标植物中MsPYL9基因的表达水平；所述MsPYL9基因编码的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％同一性。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例筛选获得了MsPYL9基因，其可以在不改变植物的基本生理结构和营养价值的前提下，优化植物品种，提升植物对干旱胁迫的耐受能力，这使得植物能够在干旱条件下趋近于正常生长。MsPYL9基因对培育抗旱植物具有重要意义，可有效提高生产力，节约水资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中MsPYL9与拟南芥、小麦和蒺藜苜蓿中PYL基因编码的氨基酸序列的系统发育分析结果图；
图2为实施例2中MsPYL9基因受胁迫诱导时的Real-time PCR表达模式图；其中，A为甘露醇终浓度为400mM条件下地上部分和地下部分MsPYL9基因在各时间点的表达情况；B为植物激素脱落酸终浓度为80μM条件下地上部分和地下部分MsPYL9基因在各时间点的表达情况；
图3为实施例3中MsPYL9在烟草叶片中的亚细胞定位结果图；
图4为实施例4中分子检测在转基因拟南芥中的目的基因的结果图；其中，A为电泳图，plasmid为阳性对照，blank为水对照，wild-type为野生型植物对照，1-19为T3代纯合株系；B为qRT-PCR的结果图；WT为野生型，OE1～OE19为T3代过表达纯合株系；
图5为实施例4中野生型和过表达株系在MS培养基、含有400mM和500mM甘露醇的MS培养基中的萌发情况对比；A为种子萌发表型，B为萌发率统计；
图6为实施例4中T3代纯合株系OE3、OE11、OE12和野生型株系WT分别在失水处理期间和复水三天后的生长情况对比结果；
图7为实施例5中紫花苜蓿OE和野生型之间的离体叶片失水率对比情况；其中，A为叶片失水表型，B为叶片失水率统计；
图8为实施例5中过表达和野生型紫花苜蓿的土壤干旱表型的对比结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一方面，本发明实施例提供了生物材料在提高植物抗逆性或制备提高植物抗逆性的产品中的应用，所述生物材料包括以下任意一种：
(1)MsPYL9蛋白，氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％同一性；
(2)编码所述MsPYL9蛋白的分离的核酸分子；
(3)含所述分离的核酸分子的载体；
(4)含所述载体的重组细胞或重组菌。
在一些实施例中，所述抗逆性包括抗旱性。“抗旱性”指抗失水逆境的能力。可选地，失水逆境可以为与甘露醇终浓度为400-500mM的模拟逆境相同或等同的自然逆境。
在一些实施例中，所述核酸分子可以为MsPYL9蛋白的编码基因或其CDS区域。
在一些实施例中，所述提高植物抗逆性包括培育抗逆性增强的植物。
在一些实施例中，所述载体包括克隆载体和表达载体。可用植物表达载体构建含有所述编码所述MsPYL9蛋白的分离的核酸分子的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1300、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。
在一些实施例中，所述重组菌可以为细菌或真菌。所述细菌可以为农杆菌和大肠杆菌；所述真菌可以为酵母。在一些实施例中，所述重组细胞包括转基因细胞系。
在一些实施例中，所述植物包括：紫花苜蓿和拟南芥中的任意一种或多种。
在一些实施例中，所述MsPYL9蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示，该序列源于紫花苜蓿(Medicago sativa L.)，由190个氨基酸组成。
在一些实施例中，所述编码MsPYL9蛋白的核酸分子为MsPYL9基因或其CDS区域。
在一些实施例中，所述分离的核酸分子的核苷酸序列与如SEQ ID NO:2所示序列具有至少80％同一性。
在一些实施例中，所述分离的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施例中，所述具有至少80％同一性具体可以为具有80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、100％中的任意一种或任意两种之间范围的同一性。可选地，可通过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而成为同一性非100％的氨基酸序列。
另一方面，本发明实施例还提供了一种提高植物抗逆性的方法，其包括：提高目标植物中MsPYL9基因的表达水平。
所述MsPYL9基因编码的蛋白为MsPYL9蛋白，需要说明的是，所述的MsPYL9蛋白、植物和抗逆性同前述任意实施例所述，不在赘述。
在一些实施例中，所述表达水平包括蛋白表达水平和/或基因表达水平。
在一些实施例中，所述提高目标植物中MsPYL9基因的表达水平的步骤包括：将编码MsPYL9蛋白的核酸分子插入目标植物的基因组中。对将外源基因插入目标植物的基因组的方法无具体限制，可基于本领域的常规技术知识进行获取和实施。
在一些实施例中，将编码MsPYL9蛋白的核酸分子插入目标植物的基因组中后，获得转基因植物种子；所述方法还包括：将所述转基因植物种子进行人工培育或使所述转基因植物种子自然生长。
在一些实施例中，所述编码MsPYL9蛋白的核酸分子的核苷酸序列与如SEQ ID NO:2所示序列具有至少80％同一性。所述具有至少80％同一性具体可以为具有80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、100％中的任意一种或任意两种之间范围的同一性。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1：克隆和测序MsPYL9基因
植物材料：紫花苜蓿中苜1号。
在正常条件下将健康饱满的种子在铺好双层滤纸的培养皿中萌发5d，当幼苗子叶展开后，移至配好的pH＝5.8的MS营养液。培养7d后，在MS营养液中添加NaCl至终浓度为150mM，处理24h，快速取样，在液氮速冻，在-80℃保存备用。
用Trizol提取法提取样品的RNA，然后用cDNA第一链合成试剂盒反转录成cDNA。
PCR的检测体系的总体积为50μL，体系为5×Phusion HF Buffer 10μl、cDNA1μL、2.5mM dNTP 4μL、Phusion DNAPolymerase 0.5μl、ddH2O 32.5μL、引物MsPYL9-F(5’-3’)：GCGGATCCATGAACAACGGTTGTGAACAA(SEQ ID No:3)1μL和引物MsPYL9-R(5’-3’)：GCGAGCTCTTATGGGTTGATATTGATAGG(SEQ ID No:4)1μL。反应程序为：第一轮：98℃预变性30s；第二轮：98℃变性10s，54℃退火30s，72℃延伸10s，第二轮循环35次；第三轮：72℃延伸5min；4℃终止，反应完成。
用1.5％琼脂糖中电泳检测结果，目的片段的长度为589bp，回收该基因的DNA片段，与表达载体pBI121共同进行双酶切，酶切位点选择BamH I和Sac I，通过凝胶电泳确认酶切结果，随后使用EasyPure胶回收试剂盒(EG101，北京全式金生物技术股份有限公司)进行产物回收，最后，利用T4 DNA连接酶(M0202，New England Biolabs北京有限公司)，将酶切后的目的片段与表达载体连接起来，转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞，均匀涂布在含卡那霉素(Kan)的LB抗性平板上，37℃培养箱中过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑，挑入含有Kan抗性的液体培养基中，在37℃摇床中200rpm过夜培养。
菌液检测合适后送西安擎科生物科技股份有限公司进行测序。测序结果表明，菌落具有SEQ ID No:2中的核苷酸序列，将其命名为MsPYL9基因，将该基因编码的蛋白命名为MsPYL9蛋白，蛋白序列如SEQ ID No:1所示。MsPYL9与拟南芥、小麦和蒺藜苜蓿中PYL基因编码的氨基酸序列的系统发育分析结果图见图1。
实施例2:实时荧光定量PCR分析MsPYL9基因的表达特性
紫花苜蓿种子萌发和水培同实施例1。用12d的紫花苜蓿幼苗进行胁迫处理：
干旱处理：在MS水培营养液中添加甘露醇至终浓度为400mM，处理时间分别为0，1，3，6，12和24h。快速取样，样品在液氮速冻，在-80℃保存备用。
植物激素脱落酸处理：在MS水培营养液中添加植物激素脱落酸至终浓度为80μM，处理时间分别为0，1，3，6，12和24h。快速取样，样品在液氮速冻，在-80℃保存备用。
样品RNA提取和反转录cDNA方法同实施例1。将cDNA稀释成50ng/μL。用qRTMsPYL9-F(5’-3’)：GACACAGTACATAAGAAGACATCAC(SEQ ID No:5)和qRTMsPYL9-R(5’-3’)：CTAGAGACCAAACAAGATG AACTG(SEQ ID No:6)对样品进行扩增检测目的基因，以MsACTIN-F(5’-3’)：GACAATGGAACTGGAATGG和MsACTIN-R(5’-3’)：CAATACCGT GCTCAATGG作为内参。
qRT-PCR检测体系的总体积为10μL，体系为2×SYBR qPCR Mix 5μL、cDNA1μL、引物qRTMsPYL9-F 0.2μL、引物qRTMsPYL9-R 0.2μL、RNase-Free ddH2O 3.6μL。反应程序为：第一轮：94℃预变性3min；第二轮：94℃变性10s，60℃退火30s，第二轮循环40次，反应完成。
仪器为Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪，作图软件为Origin 2022。计算相对表达量的方法为2-△△Ct法。△△Ct＝(Ct目的基因-Ct内参基因)Time x-(Ct目的基因-Ct内参基因)Time 0；Timex表示逆境处理时间，即x代表1，3，6，12或24h。Time 0表示没有经过逆境处理。
实验结果如图2所示。
上述结果显示：MsPYL9基因在紫花苜蓿无论地上部分还是地下部分中均受到甘露醇和植物激素脱落酸诱导。表明MsPYL9在逆境条件下基因水平受到影响，但在地上和地下受到影响程度不同。
实施例3：MsPYL9蛋白亚细胞定位分析
1.材料准备
本实例中的植物材料为本氏烟草。在正常条件下将健康饱满的种子在离心管中用蒸馏水浸泡2h，在穴盘中每穴中分散点播2-3粒种子，6-7周后烟草可接受侵染。
2.亚细胞载体的构建
根据MsPYL9基因的序列设计引物MsPYL9-GFP-F和MsPYL9-GFP-R，引物5’端分别引入Xho I和Spe I酶切位点：MsPYL9-GFP-F(5’-3’)：CCCTCGAGATGAACAACGGTTGTGAACAA(SEQID No:7)、MsPYL9-GFP-R(5’-3’)：GGACTAGTCCTGGGTTGATATTGATAGGATC(SEQ ID No:8)。
以实施例1中的紫花苜蓿的cDNA为模板，使用MsPYL9-GFP-F和MsPYL9-GFP-R进行PCR扩增。PCR扩增体系的总体积为50μL，其中包括5×Phusion HF Buffer 10μl、cDNA1μL、2.5mM dNTP 4μL、Phusion DNA Polymerase 0.5μl、ddH2O 32.5μL、引物MsPYL9-GFP-F 1μL和引物MsPYL9-GFP-R 1μL。反应程序为：第一轮：98℃预变性30s；第二轮：98℃变性10s，54℃退火30s，72℃延伸10s，第二轮循环35次；第三轮：72℃延伸5min；4℃终止，反应完成。
用1.5％琼脂糖中电泳检测结果，目的片段的长度为588bp。回收纯化PCR扩增产物：用限制性内切酶Xho I和Spe I酶切，回收酶切后的PCR产物，酶切产物的大小为577bp；同样，用限制性内切酶Xho I和Spe I对pBI121-GFP表达载体酶切，酶切产物的大小为14kb。
将目的基因的酶切产物和pBI121-GFP表达载体的酶切产物用DNA连接酶(Takara，货号：6022)连接。热激连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞，在37℃培养箱中过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑测序。选取MsPYL9测序序列与其CDS序列完全一致的阳性克隆菌落提质粒，并转入到农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBI121-Pro35S:MsPYL9:GFP，将菌液与50％甘油按1:1的体积比例均匀混合，液氮速冻，-80℃保存备用。
从-80℃取重组农杆菌EHA105/pBI121-Pro35S:MsPYL9:GFP置于冰上，挑取部分冻住的菌块与3mL LB液体中，抗性为利福平(Rif)和Kan，在28℃和200rpm的摇床中摇24h。
取50μL菌液加入到100mL LB液体中，抗性为Rif和Kan，在28℃和200rpm的摇床中摇16-20h，摇到OD600＝0.5-1。
取部分菌液离心，转速4500g，离心时间15min，倒掉LB液体，使用MS重悬液重悬和稀释至OD600＝0.4-0.6，在28℃和120rpm复苏2-3h，即可注射烟草叶片。
注射法转化烟草叶片：注射前一天给烟草浇充足的水，在光下培养2-3h，使烟草处于健康饱满的状态。用1mL注射器将菌体从烟草叶背面无叶脉出注射进入叶片，叶片不要有太多注射孔。注射完后，黑暗处理24h，再在光照下生长24-48h即可切片观察。使用仪器为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
观察方法：取注射孔附近健康的一小片叶片置于载玻片上，先在荧光显微镜下观察，若表达则用共聚焦显微镜拍照，以转质膜Marker(PM，RFP)的烟草作为正对照。
结果如图3所示，从左到右分别为MsPYL9的GFP荧光图像、质膜Marker的荧光图像、明场图像和重合图像。
上述结果显示：MsPYL9基因定位于细胞质和细胞膜上。
实施例4：MsPYL9在提高拟南芥抗逆性中的应用
需说明的是：拟南芥作为模式植物，利用其对MsPYL9基因进行功能分析和验证，其结论可以认为等同于紫花苜蓿中MsPYL9调控植物响应干旱的分子机理。
实验操作包括如下步骤：
一、MsPYL9过表达拟南芥的制备
1.重组载体的构建
(1)MsPYL9基因的克隆
根据MsPYL9基因的序列设计引物MsPYL9-F和MsPYL9-R，引物5’端分别引入BamH I和Sac I酶切位点：MsPYL9-F(5’-3’)：GCGGATCCATGAACAACGGTTGTGAACAA(SEQ ID No:3)、MsPYL9-R(5’-3’)：GCGAGCTCTTATGGGTTGATATTGATAGG(SEQ ID No:4)。
以实施例1中的紫花苜蓿的cDNA为模板，使用MsPYL9-F和MsPYL9-R进行PCR扩增。PCR扩增体系的总体积为50μL，其中包括5×Phusion HF Buffer 10μl、cDNA 1μL、2.5mMdNTP 4μL、Phusion DNA Polymerase 0.5μl、ddH2O 32.5μL、引物MsPYL9-F 1μL和引物MsPYL9-R 1μL。扩增条件为：第一轮：98℃预变性30s；第二轮：98℃变性10s，54℃退火30s，72℃延伸10s，第二轮循环35次；第三轮：72℃延伸5min；4℃终止，反应完成。
(2)MsPYL9基因与表达载体的酶切
用1.5％琼脂糖中电泳检测结果，目的基因的长度为589bp，回收该基因的DNA片段，与表达载体pBI121共同进行双酶切，酶切位点选择BamH I和Sac I，通过凝胶电泳确认酶切结果，随后使用EasyPure胶回收试剂盒(EG101，北京全式金生物技术股份有限公司)进行产物回收。
(3)MsPYL9基因与表达载体的连接
利用T4 DNA连接酶(M0202，New England Biolabs北京有限公司)，将酶切后的目的片段与表达载体连接起来，转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞，均匀涂布在含Kan的LB抗性平板涂上，37℃培养箱中过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑，挑入含有Kan抗性的液体培养基中，在37℃摇床中200rpm过夜培养。菌液检测合适后送西安擎科生物科技股份有限公司进行测序。获得与MsPYL9基因CDS序列完全一致的阳性克隆菌落提质粒。
(4)重组农杆菌获得
用重组的pBI121-Pro35S:MsPYL9载体转入到农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBI121-Pro35S:MsPYL9，将菌液与50％甘油按1:1的体积比混合，液氮速冻，-80℃保存备用。
2.MsPYL9过表达拟南芥获得
从-80℃取出重组农杆菌置于冰上，挑取部分冻住的菌块于3mL LB液体中，抗性为Rif和Kan，28℃200rpm摇24h。
取2mL菌液加入到200mL LB液体中，抗性为Rif和Kan，28℃、200rpm摇20-24h，直至OD600＝1.2-2.0。
取部分菌液离心，转速4500g，离心时间15min，倒掉LB液体，使用5％蔗糖重悬和稀释至OD600＝0.8的花浸泡侵染液。
将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)花序(前两天可以剪掉果荚，提高转染效率)浸泡入侵染液中，侵染3-5s；浸泡完毕后，取出花盆，黑暗处理24h，于温室中继续培养。一周后侵染第2次。
收获T1代种子，筛选阳性植株用Kan(50mg/mL)筛选，传代，直至获得T3代纯合株系。其中T2代表示T1代自交产生的种子及种子生长所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及种子生长所长成的植株。
以T3代再生植株的整个植株的DNA作为模板，用目的基因引物35S-F(5’-3’)：CTATCCTTCGCAAGACCCTT(SEQ ID No:9)和MsPYL9-R(5’-3’)：GCGAGCTCTTATGGGTTGATATTGATAGG(SEQ ID No:4)，以及Kan引物NPTII-F(5’-3’)：CAATCCACATCGGCCAGAT(SEQ ID No:10)和NPTII-R(5’-3’)：AGCTGCCTGTTCCAAAGG(SEQ IDNo:11)进行PCR扩增。目的基因和Kan基因的PCR检测体系和扩增条件一致。PCR检测体系为：PCR的总体积为20μL，其中包括2×F8 PCR MasterMix 10μL，上游引物1μL、下游引物1μL、ddH2O 6μL和DNA模板(50ng/μL)2μL；扩增条件为：(1)94℃预变性4min；(2)94℃变性30s；(3)52℃退火30s；(4)72℃延伸10s；(5)2-4步骤循环35次；(6)72℃延伸5min。
结果如图4中的A所示。该图结果显示：T3代纯合株系在658bp扩增出单一条带，且扩增抗性基因Kan均有条带。
随机选择株系提取T3代再生植株的整个植株的RNA，并反转录成cDNA作为模板，用目的基因部分片段引物对qRTMsPYL9-F和qRTMsPYL9-R，以及内参基因对AtACTIN-F(5’-3’)TGTGCCAATCTACGAGGGTTT和AtACTIN-R(5’-3’)TTTCCCGCTCTGCTGTTGT进行qRT-PCR扩增。
qRT-PCR体系包括2×SG Fast qPCR Master Mix 10μL，引物qRTMsPYL9-F 0.5μL，引物qRTMsPYL9-R 0.5μL，DNF buffer 2μL，ddH2O5μL和cDNA 2μL，总体积为20μL。qRT-PCR扩增条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s；(3)60℃退火1min；(4)步骤(2)至(3)循环40次。
结果如图4中的B中所示。结果显示，MsPYL9在野生型株系(Col-0)中不表达，而在过表达纯合株系中有不同程度的表达提高。从纯合株系中挑选3个高表达株系进行后续的生理分析。
二、转基因植物的抗逆性评价
1.转基因植物的抗失水能力性评价
(1)干旱胁迫对萌发率的影响
将T3代MsPYL9过表达拟南芥的3个代表性纯合株系OE3、OE11、OE12和野生型Col-0各50粒种子经消毒处理后，用10μL枪头均匀分点在MS培养基和含有400mM和500mM甘露醇的MS培养基上，封口膜密封，4℃低温处理3d后，移入22℃，16h光照/8h黑暗，60％相对湿度的培养箱中培养7d，每天统计萌发率，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
结果如图5所示：该图为野生型和过表达株系在MS培养基、含有400mM和500mM甘露醇的MS培养基中的萌发情况对比。结果显示：在MS平板上，野生型和过表达株系萌发率和萌发速率基本一致；而在400mM和500mM甘露醇平板上，MsPYL9过表达拟南芥株系的萌发率和萌发速率都明显大于野生型。
(2)土壤失水对转基因植株抗性的影响
植物材料为T3代过表达MsPYL9拟南芥的3个代表性纯合株系OE3、OE11、OE12和野生型Col-0。将每个株系的种子消毒处理后，选取健康饱满的种子，用10μL枪头均匀点在培养基上，用封口膜密封，春化3d后，移入温度22℃、16h光照/8h黑暗、相对湿度60％的培养箱中培养14d，将幼苗移小方盆中，每盆6株苗，每盆土壤重量一致并吸水至饱和然后断水，进行失水处理35d，然后复水，期间持续观察植物表型并拍照。
图6为T3代纯合株系OE3、OE11、OE12和野生型株系WT分别在失水处理期间和复水三天后的生长情况对比结果。其结果显示：随着失水程度的加重，野生型明显比过表达株系生长情况要弱；复水后，野生型的存活率比过表达株系要低。故，本申请提供的方法能够增强拟南芥的抗旱能力，也即可延伸至该方法同样能够增强紫花苜蓿的抗旱能力。
实施例5：MsPYL9在提高紫花苜蓿抗逆性中的应用
一、MsPYL9过表达紫花苜蓿的制备
1.重组载体的构建
与MsPYL9过表达拟南芥的制备中的重组载体为同一个。
2.MsPYL9过表达紫花苜蓿的获得
从-80℃取出重组农杆菌置于冰上，重组农杆菌为EHA105/pBI121-Pro35S:MsPYL9。挑取部分冻住的菌块于3mL LB液体中，抗性为Rif和Kan，28℃、200rpm摇24h。
取0.5mL菌液加入到200mL LB液体中，抗性为Rif和Kan，28℃、200rpm摇15h，直至OD600＝0.6-0.8。
取部分菌液离心，转速4500g，离心时间15min，倒掉LB液体，使用SM4液体重悬和稀释至OD600＝0.2-0.4的侵染液。将紫花苜蓿叶片进行清洗和消毒，浸泡入侵染液中，抽真空10min，超声波清洗3-5min，再次抽真空10min。
侵染完毕后，将叶片晾至表面无明显水分，置于SM4固体培养基中黑暗培养2-3天，转入含有头孢霉素(Cef，200mg/mL)、替卡西林二钠/克拉维酸钾(Tim，200mg/mL)和卡那霉素(Kan，50mg/mL)的SM4选择培养基上，每隔14天继代一次，选择培养4-6周。
抗性愈伤组织移至含有头孢霉素(Cef，200mg/mL)、替卡西林二钠/克拉维酸钾(Tim，200mg/mL)和卡那霉素(Kan，50mg/mL)的MSBK培养基上，每隔14天继代一次，培养大约4周，以出现明显的抗性芽为标准。
长出分化芽的胚性愈伤移至含有头孢霉素(Cef，200mg/mL)、替卡西林二钠/克拉维酸钾(Tim，200mg/mL)和卡那霉素(Kan，50mg/mL)的SH9培养基上，每隔3-4周继代一次，培养8-12周，以分化芽长出正常三叶，且部分生根为标准。生根苗移至MS0培养基中，培养6-8周，长出健壮的根后即可移栽。
对再生植株进行阳性筛选和表达量鉴定，具体方法与拟南芥植株筛选鉴定方法相同。选择表达量较高的阳性植株进行后续实验。
二、转基因紫花苜蓿的离体叶片失水率评价
从长势一致的紫花苜蓿上采集五到六片大小相似、幼嫩程度相似的三叶，立即称重，然后将其放在实验室工作台上，每1h称重，共8h。每个株系至少设置3个生物学重复。根据叶片的初始重量计算相对失水量，叶片Time x失水率＝(叶片Time 0重量-叶片Time x重量)/叶片初始重量×100％，Time x表示离体时间1-8h，并将每片叶片的Time 0失水率设为0。
图7为紫花苜蓿过表达(OE)和野生型(WT)之间的离体叶片失水率对比情况。结果显示：叶片离体放置8h后，OE株系比WT保留的水分更多，说明过表达MsPYL9基因改变了紫花苜蓿叶片表皮渗透性，使紫花苜蓿在逆境下的保水能力增强。
三、转基因紫花苜蓿的土壤干旱表型评价
评估转基因紫花苜蓿发育后期成苗阶段的耐旱性。将草炭土和蛭石(体积比3:1)混合均匀，装入大小一致的育苗盆中并称重，确保每盆的土壤基质重量一致，挑选生长一致2月龄过表达和野生型扦插苗，移至单独的育苗盆中，每个株系6盆重复，正常生长5天后，将土壤吸至饱和水并开始干旱处理，干旱过程中拍照记录表型；待植株叶片严重萎蔫时重新浇水，并在复水7天后统计植株存活率。
结果如图8所示，在干旱处理前，OE株系和WT植株生长状态无明显差异；干旱处理28天时，WT植株大部分叶片发黄干枯死亡，而OE植株的叶片仅有少量枯黄。在复水5天后，过表达株系叶子恢复生长，而WT植株叶子仍然枯黄甚至死亡。
承上，本申请提供了一种具有干旱耐受性功能的MsPYL9蛋白，首先通过qRT-PCR实验确定了MsPYL9基因的表达受到干旱胁迫的诱导，然后将MsPYL9基因在拟南芥中过表达后发现，过表达拟南芥比野生型拟南芥具有更强的抗旱性；在紫花苜蓿中进行离体叶片失水率分析，发现在干旱条件下过表达紫花苜蓿比野生型植物的叶片保留的水分更多；在紫花苜蓿中进行土壤干旱表型评价，发现在干旱条件下过表达紫花苜蓿比野生型植物长势更好，且复水后能够恢复良好状态。故，MsPYL9基因抗旱研究为紫花苜蓿抗旱分子设计育种提供了新的基因资源，对培育和获得具有抗旱植物及其功能增强新品种具有参考及借鉴意义。
综上所述，本申请从豆科植物紫花苜蓿中克隆得到的编码基因，在干旱和植物激素脱落酸的诱导下表达增加，编码的蛋白定位到细胞质和细胞膜上；编码基因转入植物后可以提高目的植物抗干旱能力。编码后得到的具有抗旱能力的蛋白质有利于培育抗逆性更强的植物品种或者改造其它植物的抗逆性。
本申请提供的抗逆性基因和具有抗旱能力的蛋白质对研究相关的抗旱相关调控基因提供思路和方法，对培育和获得具有抗旱性的植物(如拟南芥、烟草或豆科植物)具有重要的参考及借鉴意义，本申请中提到的PYL9基因在玉米(Zea mays)、水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticum aestivum)等物种中均可提高植物的抗逆性。本申请有利于培育具有或增强干旱耐受性的紫花苜蓿、扩大紫花苜蓿生产种植规模，加快畜牧产业发展。
涉及的序列信息如下。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.生物材料在提高植物抗逆性或制备提高植物抗逆性的产品中的应用，其特征在于，所述生物材料包括以下任意一种：
(1)MsPYL9蛋白，氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％同一性；
(2)编码所述MsPYL9蛋白的分离的核酸分子；
(3)含所述分离的核酸分子的载体；
(4)含所述载体的重组细胞或重组菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗逆性包括抗旱性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括：拟南芥、烟草和豆科植物中的任意一种或多种；
可选地，所述豆科植物包括紫花苜蓿。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分离的核酸分子的核苷酸序列与如SEQ ID NO:2所示序列具有至少80％同一性。
5.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，其包括：提高目标植物中MsPYL9基因的表达水平；
所述MsPYL9基因编码的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％同一性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗逆性包括抗旱性。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物包括：拟南芥、烟草和豆科植物中的任意一种或多种；
可选地，所述豆科植物包括紫花苜蓿。
8.根据权利要求5～7任一项所述的方法，其特征在于，所述表达水平包括蛋白表达水平和/或基因表达水平。
9.根据权利要求5～7任一项所述的方法，其特征在于，所述提高目标植物中MsPYL9蛋白的蛋白活性和/或表达水平的步骤包括：将编码MsPYL9蛋白的核酸分子插入目标植物的基因组中；
可选地，所述方法还包括：将编码MsPYL9蛋白的核酸分子插入目标植物的基因组中后获得的转基因植物种子进行人工培育或使所述转基因植物种子自然生长。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述编码MsPYL9蛋白的核酸分子的核苷酸序列与如SEQ ID NO:2所示序列具有至少80％同一性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202411653960.8A CN119220590A (zh) | 2024-11-19 | 2024-11-19 | 紫花苜蓿MsPYL9基因及其在调控植物耐旱性能中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202411653960.8A CN119220590A (zh) | 2024-11-19 | 2024-11-19 | 紫花苜蓿MsPYL9基因及其在调控植物耐旱性能中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN119220590A true CN119220590A (zh) | 2024-12-31 |
Family
ID=94047925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202411653960.8A Pending CN119220590A (zh) | 2024-11-19 | 2024-11-19 | 紫花苜蓿MsPYL9基因及其在调控植物耐旱性能中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN119220590A (zh) |
-
2024
- 2024-11-19 CN CN202411653960.8A patent/CN119220590A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108660140B (zh) | SlSL4基因在调控番茄果实成熟中的应用 | |
| CN107435047A (zh) | 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用 | |
| CN113388017A (zh) | 一种耐旱蛋白及其编码基因在培育耐旱植物中的应用 | |
| US20240263188A1 (en) | Application of bfne gene in tomato plant architecture improvement and biological yield increase | |
| CN113512558B (zh) | 一种改良番茄对青枯病抗性的方法 | |
| CN116004656A (zh) | 香蕉成熟相关基因MabHLH130及其应用 | |
| CN115896045A (zh) | 杜梨E3泛素连接酶基因PbrATL18在植物抗干旱和炭疽病遗传改良中的应用 | |
| CN102220297A (zh) | 一种抗逆相关蛋白TaSnRK2.3及其编码基因与应用 | |
| CN116514941A (zh) | MsRGP1蛋白、其编码基因及其在提高植物抗旱性和耐盐性中的应用 | |
| CN118726410B (zh) | 促进植物耐旱和早花的蔓花生wrky40转录因子及其应用 | |
| CN116004657A (zh) | 粉蕉成熟相关基因MbGRF1及其应用 | |
| CN110684088B (zh) | 蛋白ZmbZIPa3及其编码基因在调控植物生长发育与耐逆性中的应用 | |
| CN113403325B (zh) | 茶树孤儿基因CsOG3及其在提高茶树耐寒性上的应用 | |
| CN108715852B (zh) | 一种番茄果实成熟基因Sl0658及其应用 | |
| CN108864264A (zh) | 玉米OXS2a基因、其编码蛋白及应用 | |
| CN115896128B (zh) | 一种烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF6.13、编码基因及其应用 | |
| CN110607309A (zh) | 一种可增强植物抗旱作用的蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN113832170B (zh) | 玉米ZmHSMT3基因及其在降低水稻籽粒镉积累中的应用 | |
| Okeyo-Ikawa et al. | In planta seed transformation of Kenyan cowpeas (Vigna unguiculata) with P5CS gene via Agrobacterium tumefaciens. | |
| CN113234720B (zh) | 小麦长链非编码RNAlncR156及其在调控小麦响应干旱胁迫中的应用 | |
| CN105037517B (zh) | 拟南芥抗性基因cimt1、其编码蛋白及应用 | |
| CN119220590A (zh) | 紫花苜蓿MsPYL9基因及其在调控植物耐旱性能中的应用 | |
| CN119264233A (zh) | 紫花苜蓿MsRCAR1基因及其在植物耐干旱中的应用 | |
| CN115896124B (zh) | 紫花苜蓿MsFER1编码基因及其蛋白与应用 | |
| CN116463363B (zh) | 玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆及在盐胁迫中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |