CN119138589A - 一种丝素蛋白基水凝胶的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝素蛋白基水凝胶的制备方法与应用，其中，所述丝素蛋白基水凝胶的制备方法包括以下步骤：步骤1，以蚕茧为原料提取丝素蛋白溶液；步骤2，将丝素蛋白溶液中加入预设量的交联剂并搅拌反应，然后加入过量的多巴胺、氨基甘露糖混合溶液，得到丝素蛋白基水凝胶，其中，加入的多巴胺与氨基甘露糖的摩尔比为1:(0.5～2)，以及采用微流控芯片将益生菌置入丝素蛋白基水凝胶中，得到益生菌微胶囊。本发明旨在实现益生菌微胶囊用于治疗肠道炎症的微囊不仅能治疗肠炎，还要求能包封益生菌免受胃酸和胃肠道消化酶的损害，同时不影响益生菌自身的生长繁殖。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种丝素蛋白基水凝胶的制备方法与应用。
背景技术
目前，炎症性肠病(IBD)是一种由遗传、环境和其他因素共同引起的肠道炎症，且IBD的确切病因尚未确定，以及组织损伤和病原体感染是引起肠道炎症反应的主要原因，进而肠道菌群是IBD的主要环境诱因之一。采用的传统直接口服给药方法治疗肠炎需要持续给药，且容易导致副作用，其中，传统的口服益生菌治疗肠炎，由于需经过胃酸和胃肠道的消化酶等外界不利环境的影响，到达肠道炎症部位时的益生菌大量死亡，使得治疗效果大大减弱；进而，采用固定化方法可以保护益生菌免受胃肠道不适和环境压力的影响，现有专利CN118020941A的发明专利公开了一种益生菌-水凝胶口服递送系统及其制备方法，该益生菌-水凝胶口服递送系统可在一定程度上实现治疗效果，但减少了益生菌与作用部位的粘附和生长，进而治疗效果受到影响。因此，亟需选择一种既可包封益生菌免受胃酸和胃肠道消化酶的损害，同时不影响益生菌自身的生长繁殖的药物，还可保障肠道炎症的治疗效果的目的。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种丝素蛋白基水凝胶的制备方法与应用，旨在解决现有的益生菌-水凝胶口服递送系统无法保障治疗效果的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供一种丝素蛋白基水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，以蚕茧为原料提取丝素蛋白，并配置成相应的丝素蛋白溶液；
步骤2，将丝素蛋白溶液中加入预设量的交联剂并搅拌反应，然后加入过量的多巴胺、氨基甘露糖混合溶液，得到丝素蛋白基水凝胶，其中，加入的多巴胺与氨基甘露糖的摩尔比为1:(0.5～2)。
可选地，在步骤2中，所述多巴胺与氨基甘露糖总摩尔量大于丝素蛋白摩尔量10倍且小于20倍。
可选地，所所述步骤1具体包括以下步骤：
步骤11，将蚕茧加入至碳酸钠溶液中煮沸30min，然后用去离子水多次洗涤残留的丝胶蛋白，最后进行烘干或过夜风干，得到干燥的脱胶丝纤维；
步骤12，将脱胶丝纤维浸入9.3mol/L的溴化锂溶液并置入50-60℃烘箱中4h，以使纤维溶解，得到粘性丝溶液；
步骤13，将粘性丝溶液进行多次透析操作，最后离心处理得到纯化的丝素蛋白溶液。
可选地，在步骤2中，所述交联剂包括N-羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺EDC溶液。
可选地，所述NHS和EDC的摩尔比为2:1。
可选地，所述多巴胺与氨基甘露糖的摩尔比为1:2。
此外，为了实现上述目的，本发明还提供一种益生菌微胶囊的制备方法，所述方法包括以下步骤：
采用微流控芯片将益生菌置入丝素蛋白基水凝胶中，得到益生菌微胶囊，其中，丝素蛋白基水凝胶为采用上述任一项所述的丝素蛋白基水凝胶的制备方法制得，以及控制微流控芯片上的流动相流速为12μL/min，固定相流速为1μL/min。
可选地，所述益生菌微囊平均直径为98.258um。
此外，为了实现上述目的，本发明还提供一种上述所述方法制备得到的益生菌微胶囊。
此外，为了实现上述目的，本发明还提供上述所述的益生菌微胶囊在食品领域、药物制备、保健品制备领域的应用。
有益效果：
(1)本发明的丝素蛋白基水凝胶的制备方法，通过以蚕茧为原料提取丝素蛋白溶液；并将丝素蛋白溶液中加入预设量的交联剂并搅拌反应，然后加入过量的多巴胺、氨基甘露糖混合溶液，得到丝素蛋白基水凝胶。该丝素蛋白基水凝胶具有较长主链且支链具有多种官能团，进而兼具了丝素蛋白、多巴胺Dopa、氨基甘露糖Mannose-NH2功能，可便于后续负载功能益生菌应用。
(2)采用微流控芯片将益生菌置入丝素蛋白基水凝胶中，得到益生菌微胶囊，制得的微囊均一化程度高。以及微囊包裹活菌，免受胃酸和胃肠道消化酶侵蚀，实现目的蛋白缓慢且持续释放，此外，多巴胺修饰的丝素蛋白水凝胶增强细菌定殖时间，以及甘露糖可靶向巨噬细胞甘露糖受体；益生菌微胶囊具有抑炎，清除活性氧，增强修复能力(丝素蛋白抑炎，多巴胺和甘露糖清除活性氧)。利用丝素蛋白、多巴胺和甘露糖通过“一锅法”合成的新型材料增强了多巴胺本身的粘附性，还兼具了靶向肠道的功能，能用来包埋益生菌增强益生菌的抗逆性和定殖肠道的能力，提高了益生菌的抗炎能力。
(3)本发明中的制备方法简单方便，且成本低，丝素蛋白基水凝胶微囊SS具有较强的抗炎功能，并在体外和结肠炎模型中均得到印证；该丝素蛋白基水凝胶微囊SS以及由SS包埋益生菌形成的益生菌微胶囊还在食品领域、药物制备、保健品制备领域的应用。
附图说明
图1是本发明实施例方案涉及的一种丝素蛋白基水凝胶的制备方法的合成原理示意图；
图2为S0、S1、S2、S3纯材料微囊在不同浓度下的ABTS抗炎性能的实物对照图；图3为S0、S1、S2、S3纯材料微囊的ABTS清除效率的柱状图；
图4为S0、S1、S2、S3包菌微囊在不同浓度下的ABTS抗炎性能的实物对照图；图5为S0、S1、S2、S3包菌微囊的ABTS清除效率的柱状图；
图6为S0、S1、S2、S3纯材料微囊在不同浓度下的PTIO抗炎性能的实物对照图；图7为S0、S1、S2、S3纯材料微囊的PTIO清除效率的柱状图；
图8为S0、S1、S2、S3包菌微囊在不同浓度下的PTIO抗炎性能的实物对照图；图9为S0、S1、S2、S3包菌微囊的PTIO清除效率的柱状图；
图10为S0、S1、S2、S3纯材料微囊在不同浓度下的DPPH抗炎性能的实物对照图；图11为S0、S1、S2、S3纯材料微囊的DPPH清除效率的柱状图；
图12为S0、S1、S2、S3纯材料微囊在不同浓度下的羟基自由基清除效果的实物对照图；图13为S0、S1、S2、S3纯材料微囊的羟基自由基清除效率的柱状图；
图14为S0、S1、S2、S3包菌微囊在不同浓度下的羟基自由基清除效果的实物对照图；图15为S0、S1、S2、S3包菌微囊的羟基自由基清除效率的柱状图；
图16为S0、S1、S2、S3包菌微囊的抑制脂质过氧化能力的柱状图；
图17为S0、S1、S2、S3包菌微囊在不同浓度下的清除超氧阴离子效果的实物对照图；
图18为S0、S1、S2、S3包菌微囊的清除超氧阴离子效率的柱状图；
图19为S0、S1、S2、S3包菌微囊在不同浓度下的类酶活性的实物对照图，
图20为S0、S1、S2、S3包菌微囊的类酶活性效率的柱状图；
图21为S0、S1、S2、S3包菌微囊的过氧化氢清除效率的柱状图；
图22为本发明益生菌微囊的微观图；
图23为本发明益生菌微囊的粒径分布图；
图24为MYECN菌种与益生菌微囊MYE@SS进行正常生长曲线图；
图25为MYECN菌种与益生菌微囊MYE@SS中进行在模拟胃液中消化1.5h后的生长曲线；
图26为MYECN菌种与益生菌微囊MYE@SS中进行在模拟肠液中消化相应时间后的生长曲线；
图27为Control组、DSS组、SS组对应的体重变化曲线；
图28为Control组、DSS组、SS组对应的结肠长度图片与柱状图；
图29为Control组、DSS组、SS组对应的脾脏重量变化分布图；
图30为Control组、DSS组、SS组对应的血常规各细胞指标的柱状图；
图31为Control组、DSS组、SS组在1至16天的小鼠粪便变化图；
图32-35为不同组治疗后的试验小鼠在呼吸代谢24小时内(黑夜和白天)的呼吸交换率、二氧化碳呼出量、氧气吸收量和能量消耗量变化图；
图36为不同组治疗后的试验小鼠的呼吸代谢各项指标黑夜和白天总量变化图；
图37为不同组治疗后的试验小鼠的心肝脾肺肾组织的H&E染色图；
图38为不同组治疗后的试验小鼠的小鼠结肠组织H&E染色图；
图39为不同组治疗后的小鼠结肠组织病理学评分图；
图40为不同组治疗后的的小鼠疾病活动指数评分结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种丝素蛋白基水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，以蚕茧为原料提取丝素蛋白，并配置成相应的丝素蛋白溶液。具体地，丝素蛋白溶液提取的具体包括以下内容：
步骤11，将蚕茧加入至碳酸钠溶液中煮沸30min，然后用去离子水多次洗涤残留的丝胶蛋白，最后进行烘干或过夜风干，得到干燥的脱胶丝纤维，其中，10g蚕茧加入3L碳酸钠溶液，且3L碳酸钠溶液中含有6.36g～13g的无水碳酸钠，以及在50-60℃烘箱中烘干。
步骤12，将脱胶丝纤维浸入9.3mol/L的溴化锂溶液并置入50-60℃烘箱中4h，以使纤维溶解，得到粘性丝溶液；
步骤13，将粘性丝溶液进行多次透析操作，优选地，用去离子水透析3天，去离子水在开始的6小时每3小时更换一次，在接下来的34小时内每6小时更换依稀，然后将溶液以9000rpm离心20分钟，以去除杂质，得到纯化的丝素蛋白Silkfibroin,SF，并在丝素蛋白SF中加入相应量的抗生素在4℃保存备用。
进一步地，将丝素蛋白SF配置成相应质量分数的丝素蛋白溶液，优选地，丝素蛋白溶液的质量分数为4％。
步骤2，将丝素蛋白溶液中加入预设量的交联剂并搅拌反应，然后加入过量的多巴胺Dopa、氨基甘露糖Mannose-NH2混合溶液，得到丝素蛋白基水凝胶，其中，加入的多巴胺与氨基甘露糖的摩尔比为1:(0.5～2)，以及交联剂包括N-羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺EDC溶液，且NHS和EDC的摩尔比为2:1，以及所述多巴胺与氨基甘露糖总摩尔量为丝素蛋白摩尔量10倍以上，优选地，多巴胺与氨基甘露糖的摩尔比比例：多巴胺：氨基甘露糖＝1:1，或者多巴胺：氨基甘露糖＝1:2，或者多巴胺：氨基甘露糖＝2:1。
进而该步骤中具体反应原理如下述所示：
可见，上述反应生成了的丝素蛋白基水凝胶作为一种新的物质具有较长主链且支链具有多种官能团，还兼具了丝素蛋白、多巴胺、氨基甘露糖功能，可便于后续负载功能益生菌应用，以及具体的合成原理简图如图1所示。并且以多巴胺与氨基甘露糖总摩尔量等于丝素蛋白摩尔量10倍为例，确定多巴胺与氨基甘露糖的最佳比例。第一种对照组是不加多巴胺、氨基甘露糖，仅采用丝素蛋白与交联剂反应，记为S0；第二种是将丝素蛋白与交联剂反应，并加入多巴胺：氨基甘露糖的摩尔比为1:1继续反应，记为S1:第三种是将丝素蛋白与交联剂反应，并加入多巴胺：氨基甘露糖的摩尔比为1:2继续反应，记为S2；第四种是将丝素蛋白与交联剂反应，并加入多巴胺：氨基甘露糖的摩尔比为2:1，继续反应，记为S3。并将S0、S1、S2、S3四种丝素蛋白基水凝胶微囊都分别测定清除活性氧和活性氮及清除羟基自由基能力，并得出下述抗炎指标测定结果。
其中抗炎指标测定包括ABTS抗炎性能测定、PTIO抗炎性能测定、DPPH抗炎性能测定，图2所示为S0、S1、S2、S3纯材料微囊在不同浓度下的ABTS抗炎性能的实物对照图，图3为S0、S1、S2、S3纯材料微囊的ABTS清除效率的柱状图，从图中可以看出，S1、S2、S3的清除效率明显高于S0。
以及图4所示为S0、S1、S2、S3包菌微囊在不同浓度下的ABTS抗炎性能的实物对照图，图5为S0、S1、S2、S3包菌微囊的ABTS清除效率的柱状图，从图中可以看出，S1、S2、S3的清除效率均高于S0，且S3的清除效率最佳。
以及图6所示为S0、S1、S2、S3纯材料微囊在不同浓度下的PTIO抗炎性能的实物对照图，图7为S0、S1、S2、S3纯材料微囊的PTIO清除效率的柱状图，从图中可以看出，S1、S2、S3的清除效率均高于S0。
以及图8所示为S0、S1、S2、S3包菌微囊在不同浓度下的PTIO抗炎性能的实物对照图，图9为S0、S1、S2、S3包菌微囊的PTIO清除效率的柱状图，从图中可以看出，S1、S2、S3的清除效率均高于S0。
以及图10所示为S0、S1、S2、S3纯材料微囊在不同浓度下的DPPH抗炎性能的实物对照图，图11为S0、S1、S2、S3纯材料微囊的DPPH清除效率的柱状图，从图中可以看出，S1、S2、S3的清除效率明显高于S0。
以及测定S0、S1、S2、S3在纯材料微囊或包菌微囊对羟基自由基清除能力，其中，图12为S0、S1、S2、S3纯材料微囊在不同浓度下的羟基自由基清除效果的实物对照图，图13为S0、S1、S2、S3纯材料微囊的羟基自由基清除效率的柱状图，从图中可以看出，在浓度为0.5mg/mL时，S0大于S1、S2、S3，且在浓度增大至1mg/mL、2mg/mL时，S2的清除效率高于S0、S1、S3。同时，图14所示为S0、S1、S2、S3包菌微囊在不同浓度下的羟基自由基清除效果的实物对照图，图15为S0、S1、S2、S3包菌微囊的羟基自由基清除效率的柱状图，从图中可以看出，S2均大于S0、S1、S3的清除效率。
以及测定S0、S1、S2、S3包菌微囊对抑制脂质过氧化能力、清除超氧阴离子能力，类酶活性。其中，图16为S0、S1、S2、S3包菌微囊的抑制脂质过氧化能力的柱状图，从图中可以看出，S2均大于S0、S1、S3的清除效率。以及图17为S0、S1、S2、S3包菌微囊在不同浓度下的清除超氧阴离子效果的实物对照图，图18为S0、S1、S2、S3包菌微囊的清除超氧阴离子效率的柱状图，从图中可以看出，S1、S2、S3的清除效率明显高于S0。以及图19为S0、S1、S2、S3包菌微囊在不同浓度下的类酶活性的实物对照图，图20为S0、S1、S2、S3包菌微囊的类酶活性效率的柱状图，从图中可以看出，针对SOD类酶活性，S1、S2、S3的含量明显高于S0，针对CAT类酶活性，S0、S2、S3的含量明显高于S1，针对POD类酶活性S2的含量明显高于S0、S1、S3。图21中S0、S1、S2、S3包菌微囊的过氧化氢清除率的柱状图，从图中可以看出，S3均小于S0、S1、S2的清除效率。
根据上述获取的抗炎指标测度结果，利用熵权-TOPSIS综合评价方法，确定具有综合抗炎效果的用量比，如表1所示为根据不同比例活微囊的综合评价的数学建模创建。
表1-不同比例活微囊的综合评价的数学建模创建数据表
根据表1中的数学建模数据表，得到表2中的熵权-TOPSIS数学建模后对益生菌活微囊综合评价结果。
表2-综合评价结果
| 项 | 正理想解距离D | 负理想解距离D- | 相对接近度C | 排序结果 |
| MYE@S0 | 6.259 | 4.375 | 0.411 | 4 |
| MYE@S1 | 4.685 | 5.147 | 0.523 | 2 |
| MYE@S2 | 2.671 | 7.408 | 0.735 | 1 |
| MYE@S3 | 6.956 | 4.964 | 0.416 | 3 |
即最终得到所述多巴胺与氨基甘露糖的摩尔比为1:2的使用效果最佳，将丝素蛋白基水凝胶材料S2命名为SS。
其中，所述益生菌微胶囊的制备步骤为：采用微流控芯片将益生菌置入不同丝素蛋白基水凝胶中，得到益生菌微胶囊，其中丝素蛋白基水凝胶为采用上述所述的丝素蛋白基水凝胶的制备方法制得。具体地，将100μl菌液预先在100mlLB中过夜培养，并将菌液离心5000rpm5min备用，且用1mlPBS+40％蔗糖重悬，控制菌液：材料＝1:10加入后枪头吹打混匀作为DP，以及油+大豆磷脂酰胆碱(1％w/w)作为CP。利用微流控技术DP：1μl/min，CP：12μl/min。成品离心后依次置于4℃保存45min、-20℃保存1h，并在-80℃过夜，-80℃冻干14-15h。益生菌微囊具体的微观结构如图22所示，从图中可以看出，益生菌微胶囊粒径大小基本相差不大，微囊形态较均一化，以及进一步测定益生菌微胶囊粒径分布，如图23所示，其中分布在98μm左右的占比较大，且计算得出最终生成的益生菌微囊的平均直径为98.258μm。
以本实验室构建的MY ECN为菌种例，则SS包封工程益生菌后命名为MYE@SS。测定丝素蛋白基水凝胶SS包埋益生菌后对益生菌的保护作用。
验证1，分别将MYECN菌种与益生菌微囊MYE@SS进行正常生长，并记录0-15h中的OD600值，具体结果如图24所示，其中MY ECN菌种与MYE@SS中细菌正常生长的基本处于同步状态，即MYECN益生菌被丝素蛋白基水凝胶包封后，益生菌的生长曲线没有显著变化，说明丝素蛋白基水凝胶的包封不影响益生菌的正常生长。
验证2，分别将MY ECN菌种与益生菌微囊MY E@SS中进行在模拟胃液中消化1.5h后的生长曲线，并记录0-15h中的OD600值，具体结果如图25所示，其中MYECN菌种的OD600值波动不大，在模拟胃液中，益生菌几乎没有生长，而用丝素蛋白基水凝胶SS包封后的益生菌能正常生长。进而胃液处理后的益生菌微囊MYE@SS基本不受影响。说明丝素蛋白基水凝胶SS能帮助益生菌抵抗外界不利环境，如胃液的消化作用。
验证3，分别将MYECN菌种在模拟肠液液中消化2h、4h后进行正常生长，以及将益生菌微囊MYE@SS中在模拟肠液液中消化4h后进行正常生长，并相应记录0-15h中的OD600值，得到如图25所示的生长曲线，益生菌在模拟肠液中消化4h，能显著影响益生菌的正常生长，而丝素蛋白基水凝胶SS包埋的益生菌能在模拟肠液中消化4h后仍正常生长。说明丝素蛋白基水凝胶SS能保护益生菌免受肠液长时间消化的影响。
进一步地，通过对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用来验证丝素蛋白基水凝胶微囊的效果。
实验动物
7-8周龄C57BL6/j小鼠，雄性，24只，均购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002，统一在所在地实验动物中心饲养，温度为23℃±2℃，湿度为55％±5％，12h昼夜循环照明，分笼饲养，自由饮食饮水。所有动物实验均符合所在地实验动物伦理审查委员会的要求。
溃疡性结肠炎小鼠模型的建立
7-8周龄雄性C57BL6/j小鼠，随机8只小鼠一组，共3组，具体为Control组、DSS组、SS组。溃疡性结肠炎模型的建立参考现有技术。适应7天后，Control组正常饮水，其余组自由饮用3％DSS(36-50kDa)一周。第一次灌胃前3天向各组小鼠饮用水中加入浓度为10g/L的阿拉伯糖，直至采样。14天后各制剂组隔天灌胃给药，共4次。
Control组和DSS组隔日灌胃200μL的PBS(pH7.4)，SS组隔日灌胃100μL的SS微胶囊(1×1010cfu/mL)，实验期间每天监测小鼠的体重。
小鼠生化指标记录以及样本采集：在实验过程中，每日记录小鼠的体重数据。在实验结束后，记录每只小鼠的结肠长度并拍照。
病理学分析：用生理盐水清洗结肠样本两次，浸入1mL含有4％多聚甲醛的组织固定溶液中，组织包埋于石蜡，10μm的石蜡切片用于H&E染色观察，并对HE染色结果进行分析和评价。HE染色评分标准：组织学总分以E+I表示，总分为16分，具体组织学评分标准如表3所示。
表3-DSS结肠炎组织学分级方案
炎症因子检测：将结肠样本匀浆，按照ELISA试剂盒说明书的要求，测定TNF-α、IL-1β、IL-10的含量。
统计分析：除非另有说明，所有实验结果至少重复三次，所有数据均通过GraphPadPrism 8.0分析。所有定量数据均以mean±SEM表示。显著性评估采用未配对学生t检验和单因素及双因素方差分析(ANOVA)，将p<0.05认为具有显著性差异。
实验结果：
1.病理指标：体重
如图27所述，DSS处理后，DSS组与SS组体重降低程度基本一致，说明小鼠溃疡性结肠炎模型构建成功。从第7天开始治疗后，丝素蛋白基水凝胶微囊SS能降低DSS处理后的体重减轻程度，在第10天开始出现体重增长。而DSS组体重仍然无明显上升，说明丝素蛋白基水凝胶微囊SS能治疗溃疡性结肠炎引起的体重降低。
2.病理指标：结肠长度和脾脏重量。
如图28所示为DSS处理并治疗后各组小鼠结肠长度，基于结肠的长度能反映炎症的严重程度，结肠炎越严重结肠长度越短。图中可看出丝素蛋白基水凝胶微囊SS治疗后，结肠的长度接近正常组(PBS组)。说明丝素蛋白基水凝胶微囊SS能改善结肠炎的结肠缩短的症状。
以及图29所示为DSS处理并治疗后各组小鼠脾脏重量，小鼠脾脏的重量一定程度上能反映炎症的严重程度，结肠炎越严重，脾脏越重。图中可以看出经治疗后，DSS组与正常组(PBS组)具有显著性差异，SS组与正常组无显著性差异。说明SS能显著降低DSS引起的小鼠溃疡性结肠炎的严重程度。
3.血常规
用抗凝管采血后测定血常规各细胞的指标，结果如图30所示，图中可以看出SS组的血常规各指标接近正常组(PBS组)。Gran％(粒细胞比例)、Mon％(单核细胞比例)、Lym％(淋巴细胞比例)及血小板的数目增加都意味着炎症的发生，以及SS组治疗后的血常规的指标结果更接近正常组。
4.隐血实验
准备一般为0.5-1g/L邻联甲苯胺的浓度。(需要1％邻联甲苯胺的试剂，用冰乙酸和无水乙醇混合液配置)，将不同实验组的小鼠粪便用200μL生理盐水混合均匀。将混合好的粪便样本离心10分钟，取上清液。取100μL上清液放在新的EP管内，加入100μL邻联甲苯胺试剂，混合均匀。加入10μl过氧化氢，观察颜色变化。如果出现蓝色染色，则说明粪便中存在潜血。颜色越深，说明粪便中潜血更严重。
通过观察1至16天的不同实验组的小鼠粪便变化，具体如图31所示，从图中可知造模组(DSS组)比正常组(PBS组)颜色明显深，说明造模成功。治疗组(SS组)相比其他造模组颜色具有明显变迁，且随着观察时间延长，便血的颜色在逐步变浅，可见，丝素蛋白基水凝胶微囊SS能明显改善结肠炎引起的粪便隐血症状。
5.呼吸代谢测定
基于肠道疾病影响宿主的能量代谢，且有研究证明，炎症性肠病(IBD)患者患有体重减轻、营养不良和其他几种影响其生活质量的代谢改变，即急性炎症小鼠的体重、呼吸交换比(RER)、食物摄入量和体脂含量均下降，患有炎症的小鼠会改变其代谢，可作为对严重结肠炎症的反应或适应的测量指标。进而通过最大氧耗量和二氧化碳产生量可以反映疾病的轻重程度。进而，通过测定不同组治疗后的试验小鼠在呼吸代谢24小时内(黑夜和白天)的呼吸交换率、能量消耗量、氧气吸收量和二氧化碳呼出量变化，具体测定结果如图32-35所示，其中图32为在呼吸代谢24小时内(黑夜和白天)的呼吸交换率变化，图33为在呼吸代谢24小时内(黑夜和白天)的二氧化碳呼出量，图34为在呼吸代谢24小时内(黑夜和白天)的氧气吸收量，图35为在呼吸代谢24小时内(黑夜和白天)的能量消耗量变化，，从图中可以看出，丝素蛋白基水凝胶微囊SS组的各项呼吸代谢指标更接近正常组(PBS组)，说明丝素蛋白基水凝胶微囊SS具有显著恢复患有结肠炎小鼠呼吸代谢的能力。
进一步地，通过测定不同组治疗后的试验小鼠的呼吸代谢各项指标黑夜和白天总量变化，如图36所示，其中，图36b为白天、黑夜的呼吸交换率，图36a为黑夜和白天呼吸交换率总量，图36d为白天、黑夜的氧气吸收量，图36c为黑夜和白天总量氧气吸收量，图36f为白天、黑夜的二氧化碳呼出量，图36e为黑夜和白天总量二氧化碳呼出量，图36h为白天、黑夜的能量消耗量，图36a为黑夜和白天总量能量消耗量，从图中可以看出丝素蛋白基水凝胶微囊SS组无论是白天还是黑夜的呼吸代谢各项指标均更接近正常组(PBS组)。进而说明丝素蛋白基水凝胶微囊SS具有显著恢复患有结肠炎小鼠呼吸代谢的能力。
6.体内生物相容性实验
正常组和所有的饮水中添加DSS的造模组，取心肝脾肺肾组织的H&E染色，如图37所示，其中显示所有组的心肝脾肺肾组织及细胞结构均正常。以及获取小鼠结肠组织H&E染色图，如图38所示，采用H&E染色法来观察结肠组织切片的具体形态，其中与正常组(PBS组)相比，DSS组小鼠结肠呈现明显的炎症反应，表现为大量的中性粒细胞浸润、隐窝溶解消失、结肠黏膜和杯状细胞基本全部被破坏，结肠组织病理学评分显著升高。SS组在一定程度上恢复了结肠结构完整性。
以及对不同组小鼠结肠组织进行组织学评价，即根据表3中的评估标准，得到图39所述的小鼠组织病理学评分，其中，DSS组平均评分为8，以及SS处理小鼠的结肠组织表现出显著的治疗效果，组织病理学评分降低，指状隐窝结构规则，上皮完整，炎症细胞浸润减少，与健康结肠相似，即SS处理显著降低了UC小鼠的结肠组织病理学评分。综上所述，SS可以有效缓解结肠炎症水平，改善溃疡性结肠炎小鼠结肠组织损伤。说明丝素蛋白基水凝胶微囊SS不会引起其他组织病变，具有良好的生物相容性。
7.小鼠疾病活动指数(DAI评分)
测定不同组的小鼠疾病活动指数，即测定体重下降百分比、粪便性状和粪便隐血程度，其中具体的标准与评分如表4所示。
表4疾病活动指数(DAI)参数及其相关评分
| 分数 | 体重下降百分比(％) | 粪便性状 | 粪便隐血程度 |
| 0 | 不变 | 正常 | 正常 |
| 1 | 1-5 | 轻微松散 | 隐血阳性 |
| 2 | 5-10 | 不成型 | 血迹明显 |
| 3 | 10-15 | 糊状 | 肉眼可见的血便 |
| 4 | >15 |
进而根据上述表4的评分标准，得到如图40所示的评分结果，与PBS和SS治疗的结肠炎小鼠相比，SS治疗小鼠的DAI评分在第15天明显降低，进而显示SS治疗对小鼠具有治疗效果。
综合上述，测定丝素蛋白基水凝胶SS治疗小鼠溃疡性结肠炎能力，发现丝素蛋白基水凝胶SS能显著缩短溃疡性结肠炎病程，降低炎症程度，且对其他组织器官不会造成损害，具有较好的生物相容性。并且，丝素蛋白基水凝胶除了具有强大的体外和体内抗炎能力外，丝素蛋白基水凝胶还能用于包埋益生菌，保护益生菌免受胃肠道不利环境的影响。进而本发明中制得益生菌微胶囊可用于制备治疗溃疡性结肠炎药物。
此外，为了实现上述目的，本发明还提供上述所述的益生菌微胶囊在食品领域、药物制备、保健品制备领域的应用。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
Claims (10)
1.一种丝素蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，以蚕茧为原料提取丝素蛋白，并配置成相应的丝素蛋白溶液；
步骤2，将丝素蛋白溶液中加入预设量的交联剂并搅拌反应，然后加入过量的多巴胺、氨基甘露糖混合溶液，得到丝素蛋白基水凝胶，其中，加入的多巴胺与氨基甘露糖的摩尔比为1:(0.5～2)。
2.如权利要求1所述的丝素蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤2中，所述多巴胺与氨基甘露糖总摩尔量为丝素蛋白摩尔量10倍以上。
3.如权利要求1所述的丝素蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，所所述步骤1具体包括以下步骤：
步骤11，将蚕茧加入至碳酸钠溶液中煮沸30min，然后用去离子水多次洗涤残留的丝胶蛋白，最后进行烘干或过夜风干，得到干燥的脱胶丝纤维；
步骤12，将脱胶丝纤维浸入9.3mol/L的溴化锂溶液并置入50-60℃烘箱中4h，以使纤维溶解，得到粘性丝溶液；
步骤13，将粘性丝溶液进行多次透析操作，然后离心处理得到纯化的丝素蛋白溶液。
4.如权利要求1所述的丝素蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤2中，所述交联剂包括N-羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺EDC溶液。
5.如权利要求4所述的丝素蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述NHS和EDC的摩尔比为2:1。
6.如权利要求1所述的丝素蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述多巴胺与氨基甘露糖的摩尔比为1:2。
7.一种益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
采用微流控芯片将益生菌置入丝素蛋白基水凝胶中，得到益生菌微胶囊，其中丝素蛋白基水凝胶为采用权利要求1至6中任一项所述的丝素蛋白基水凝胶的制备方法制得，以及控制微流控芯片上的流动相流速为12μl/min，固定相流速为1μl/min。
8.根据权利要求7中所述的益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述益生菌微囊平均直径为98.258μm。
9.一种根据权利要求7或8中所述方法制备得到的益生菌微胶囊。
10.权利要求9中所述的益生菌微胶囊在食品领域、药物制备、保健品制备领域的应用。
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