CN1191274C - 识别对虾白斑杆状病毒单链抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种识别对虾白斑杆状病毒单链抗体的制备方法，经分离纯化病毒，将单链抗体基因克隆到噬菌体表达载体，融合蛋白的形式单链抗体片段由重链和轻链可变区域组成，用一可弯曲小肽连接成氨基酸单链，其DNA通过PCR技术对mRNA进行反转录和扩增，克隆到噬菌体表达载体，噬菌体抗体从重组噬菌体抗体cDNA文库淘选，选择专一识别对虾白斑杆状病毒的抗体，适用于对虾病毒病的早期检测，通过适合载体，可用于对虾白斑杆状病毒病的防治。
Description
本发明涉及水产养殖生物病毒抗体，更具体涉及对虾病毒单链抗体的制备方法。
1993年以来，我国虾病爆发性流行，引起养殖的对虾大面积死亡，经济损失惨重。研究表明，其主要是由一种新的没有包涵体的C型杆状病毒—对虾白斑杆状病毒所致。该病毒可以感染我国所有人工养殖的对虾种类，感染性强，发病快，死亡率高，给对虾养殖业带来极大的危害；据报道，其它国家和地区也有类似情况。目前，对对虾病毒病尚无有效的治疗方法，避免与病毒病源接触被认为是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速诊断。目前的诊断方法主要有核酸探针技术和酶联免疫吸附技术。核酸探针技术对技术条件要求高，广大虾农掌握此技术难度很大，难以推广；酶联免疫吸附技术虽可在养虾场应用，但由于此法所需的多克隆抗体和单克隆抗体制备麻烦、费用高，限制了该技术的应用和发展。
本发明的目的是提供一种可批量生产、操作简单、使用方便、成本较低的能识别对虾白斑杆状病毒单链抗体的制备方法。
噬菌体抗体展示是利用基因工程技术模拟自然免疫选择系统来制备抗体，本发明采用噬菌体抗体展示技术，制备能识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体。本发明包括如下步骤：首先从感病斑节对虾的血淋巴液中分离纯化白斑杆状病毒，将抗体片段的基因克隆到丝状噬菌体N-末端第三蛋白基因区域，表达的融合蛋白在噬菌体尾尖表面展示。具有抗原结合活力的抗体片段若由重链和轻链的可变区域组成，由一可弯曲的小肽连接成为氨基酸单链的形式，称为单链抗体。单链抗体片段的获得是通过PCR技术对免疫过或未免疫的小白鼠脾脏mRNA进行反转录和扩增，克隆到噬菌体表达载体上。具有抗原结合活力的噬菌体抗体可直接利用抗原亲和性从重组噬菌体抗体文库中淘选，通过调节琥珀中止密码的活性，可选择性地获得与噬菌体融合的抗体或可溶性抗体。其具体制备方法为：
1、采用蔗糖密度梯度超速离心法，用电镜检测，从感病斑节对虾的血淋巴液中分离纯化白斑杆状病毒。
2、用蛋白量为20～150μg纯化的完整对虾白斑杆状病毒粒子注射小鼠，用Titremax佐剂或福氏佐剂或氢氧化铝等常用佐剂，经17～26天进行二次或三次免疫，再经3～5天用酶联免疫印迹法和酶联免疫吸附法测定抗体效价，取抗体效价最高的小鼠脾脏，从中提取mRNA。
3、将此mRNA反转录为cDNA，再用对应于重链和轻链抗体可变部位DNA的引物通过PCR技术将抗体的重链和轻链的可变片段的DNA扩增。
4、用一编码可弯曲小肽的DNA小片段将重链和轻链DNA片段连接起来组成单链抗体DNA，再用对应诊断单链抗体DNA的引物用PCR技术将整个片段扩增。
5、将单链抗体DNA片段两端的限制性内切酶位点(SfiI和NotI)酶切，再与具同样酶切位点的噬菌体表达载体连接，电转移至大肠杆菌中，可获得较高效价的噬菌体抗体cDNA文库。
6、用吸附在朔料管壁上的对虾白斑杆状病毒对上述噬菌体抗体文库进行1～4次淘选，用酶联免疫吸附法筛选可得到抗原结合专一性的阳性克隆，该阳性克隆分泌的单链抗体可专一性识别对虾白斑杆状病毒。
本发明的优点与效果：
本发明不仅避免了在制备多克隆抗体过程中由个体引起的效价及专一性的差异，也避免了在制备单克隆抗体过程中繁杂的杂交瘤技术，操作简易、费用较低，筛选范围广，可批量制备抗体，一旦获得所需的抗体，就可获得该抗体的基因，为抗体的进一步应用提供了多种可能性。同时本发明制备的单链抗体分子量只有天然抗体分子量的五分之一，容易穿透细胞间隙，到达靶位。实验证明，单链抗体更容易中和病毒，其抗原亲和性也高于天然抗体。使用本发明已筛选到180多个具抗原结合专一性的阳性克隆，从中选取效价高，特异性强的单链抗体可直接用于诊断对虾白斑杆状病毒，适合对虾病毒病的早期检测，其中可中和对虾白斑杆状病毒的单链抗体基因可转入适合的载体，用于对虾白斑杆状病毒病的防治。
实施例：
1)采用蔗糖密度梯度超速离心法，用电镜检测，从感病斑节海南岛对虾的血淋巴液中分离纯化白斑杆状病毒。
2)用蛋白量为100μg纯化的完整的对虾白斑杆状病毒粒子注射到小鼠的腹膜间(57xDBA hybrids)，佐剂为Titremax，21天后进行第二次免疫。4天后用酶联免疫印迹法(Dot Blot)和酶联免疫吸附法(ELISA)测定抗体效价。取抗体效价最高的小鼠脾脏，用Invitrogen Fast公司生产的TrackTM2.0试剂盒从中提取mRNA。
3)将此mRNA反转录为cDNA，再用对应于重链和轻链抗体可变部位DNA的引物通过PCR技术将抗体的重链和轻链的可变片段的DNA扩增。
4)用一编码可弯曲小肽的DNA小片段将重链和轻链DNA片段连接起来(scFv)组成单链抗体DNA，再用对应于整段单链抗体DNA的引物用PCR技术将单链抗体DNA片段扩增。
5)将单链抗体DNA片段两端的限制性内切酶位点(SfiI和NotI)酶切，再与具同样酶切位点的噬菌体表达载体Pcantab 5E(从Pharmacia公司购买)连接，电转移至E.coli NM522中。如此所获噬菌体抗体cDNA文库的效价为2.1×107。
6)用吸附在朔料管壁上的对虾白斑杆状病毒对上述噬菌体抗体文库进行三轮淘选，用ELISA筛选到180个具抗原结合专一性的阳性克隆。
Claims (1)
1、一种识别对虾白斑杆状病毒单链抗体的制备方法，其特征是，该方法包括如下步骤：
(1)采用蔗糖密度梯度超速离心法，用电镜检测，从感病斑节对虾的血淋巴液中分离纯化白斑杆状病毒；
(2)用蛋白量为20～150μg纯化的完整对虾白斑杆状病毒粒子注射小鼠，用Titremax佐剂或福氏佐剂或氢氧化铝等常用佐剂，经17～26天进行二次或三次免疫，再经3～5天用酶联免疫印迹法和酶联免疫吸附法测定抗体效价，取抗体效价最高的小鼠脾脏，从中提取mRNA；
(3)将此mRNA反转录为cDNA，再用对应于重链和轻链抗体可变部位DNA的引物通过PCR技术将抗体的重链和轻链的可变片段的DNA扩增；
(4)用一编码可弯曲小肽的DNA小片段将重链和轻链DNA片段连接起来组成单链抗体DNA，再用对应诊断单链抗体DNA的引物用PCR技术将整个片段扩增；
(5)将单链抗体DNA片段两端的限制性内切酶位点酶切，再与具同样酶切位点的噬菌体表达载体连接，电转移至大肠杆菌中，可获得较高效价的噬菌体抗体cDNA文库；
(6)用吸附在朔料管壁上的对虾白斑杆状病毒对上述噬菌体抗体文库进行1～4次淘选，用酶联免疫吸附法筛选可得到抗原结合专一性的阳性克隆，该阳性克隆分泌的单链抗体可专一性识别对虾白斑杆状病毒。
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