CN1190425A - 新型结冰控制分子及其应用 - Google Patents

Abstract

将冰表面上氢键键合位点的一种分布模式作为一个模板,被用于设计、选择和制造合成冰界面掺杂剂。冰界面掺杂剂是一种分子,当其与冰晶体表面结合时,能抑制其它水分子进入冰晶体。因此冰界面掺杂剂能抑制冰晶生长,重结晶和升华。冰界面掺杂剂也可抑制非均一成核剂,因此能延迟或阻止冰的成核。本发明提供了典型的掺杂剂结构,它可获得近乎完美的冰键合效果,并适用于广泛的特殊冰键合用途。轨道转向提供了在界面掺杂剂中与冰键合的原子的孤对轨道转向,从而形成一种最佳角度对准冰上的辅助键合位点。

Description

新型结冰控制分子及其应用

本申请是根据美国专利申请号为Nos.08/413/370，30/03/1995提交的和申请号为08/485,185，07/06/1996提交的整个文本作为参照的PCT申请。

发明背景

冰的形成对有生命系统和食物产品有破坏性，对于必须对付生活环境中冰雪的人类来说，又是一种讨厌的东西和危害。本发明所属领域提供一种制备特殊化学试剂的方法，该试剂称为冰界面掺杂剂(IID)，它能有效地减少冰的形成，使即使形成的冰对有生命系统和食物无害，并因此减少对处在该环境下的人和机器造成的麻烦和危害。

参照图1，冰结晶的形状为六角形片状10。由a轴12和b轴14(它在结晶学上与a轴是等同的)形成并与c轴垂直的一个平面是一六角形截面，称为底面18。此六角体的六个面称为棱柱侧面20。结晶学上，底面18称为0001面，棱柱侧面根据方向不同称为l100面或l120面。

图2表明同样形成这种宏观结构的晶体单元也是六角体形状。在图2中，按照惯例，只表示氧原子。氢原子排列在将每一氧原子与其最近四个氧原子连接的直线上。

图2A表示如上所见的底面0001面。在每一六角形中，三个顶点向上(即向前)突出，其间的三个顶点向下(即向后)突出。向上的顶点隔开4.5埃±.02埃，相互之间角度为60°。它们的第四根键垂直突出纸面指向观者。晶格中间隔的氧原子双层21隔开的距离为7.36埃，换言之，每一由氧界定的六角形和与其紧密相邻的同样六角形隔开距离为7.36埃。图2B表示cl100和d1120棱柱侧面(晶面)的示图。

有一些天然存在的分子可改变冰和水的性质。一些鱼类产生的抗冻糖蛋白(AFGP)和抗冻蛋白或抗冻多肽(AFPs)被认为能优先吸附到冰的棱柱侧面20上，因此能阻止垂直于棱柱侧面的冰晶生长，即沿底面18和沿a轴12和b轴14方向伸展的冰晶生长。

这类鱼的这一功能足以使它能在体温比鱼的体液热力学凝固点低1℃时生存。由于这类鱼组织和体液内存在的AFGP能阻止冰的生长(即使是在过冷条件下)，因此这类鱼能与冰晶接触，并对其吸收，不致受到冰生长透过鱼过冷组织产生的侵害，这些被吸收的冰晶本可为冰生长提供成核位点。昆虫的抗冻或“热滞后”蛋白(THPs)更有效，其在低于热力学凝固点2℃或更大的过冷度条件下仍能起作用。

在极带鱼和一些陆生昆虫体内发现的天然“抗冻”或“热滞后”蛋白被认为因与晶格匹配而吸附到冰上(Davies和Hew，FASEB J.，4；2460-2468，1990)或通过沿某些轴的偶极相互作用而吸附在冰上(Yang，Sax，Chakrabartty和Hew，自然(Nature)，333：232-237，1988)。

在某些生物体内发现的抗冻糖蛋白(AFGP)和抗冻蛋白或抗冻多肽(AFPs)为新型人造IID的概念提供了天然的“原理证据”。然而，天然冰界面掺杂蛋白的活性对于大多实际应用来说尚嫌不足。而且，底面生长抑制的一个缺点是，当过冷度足以克服冰晶生长抑制时，生长通常主要是发生在垂直于底面18的c轴16方向上。这导致纺锤形或针形的冰晶形成(图1B)，显然由于机械原因，其对生命细胞造成的危害比普通的冰大。

在商业上可以实际应用的天然IID的数量和种类非常有限。而且，它们必须有相当高的的相对分子质量(通常至少约5,000道尔顿)才能有效。这使它们非常昂贵，而且它们通常需要与其它难以获得的蛋白质发生复杂的相互作用，并需要部分碳水化合物才能充分有效。

而且，将天然鱼的AFGP加入到防冻剂浓溶液中(30-40％v/v DMSO)，其对在-20℃至-40℃以下冰晶生长速度的影响很小(Fahyz，G.M.在生物冰成核及其应用(Biological Ice Nucleation and its Applitions)，18章，pp.315-336，1995)，因此对要冷藏器官玻璃化用途是否有效还有疑问。

天然抗冻蛋白的另一问题，是关于其作用的确切机理的理解一直尚不清楚，阻碍了更为有效的重组变异体的发展。最近，Warren和其同事们报道了这一方面的一些进展(美国专利No.5,118,792)。

Caple等人(Cryo-Letters，4：51-58，1983)制备了一些明显是偶然遇到的合成聚合物，表明其中一些可阻止水经碘化银晶体作用的成核过程。他们认为这些聚合物吸附到碘化银或冰晶核上，但他们没有提出具体的相互作用，这些聚合物不是根据冰或碘化银的结构制备的。而且，他们除指出这些聚合物上疏水基团与亲水基团之比为2∶1时能对成核起最大抑制作用外，他们就关于在系统化的理论或实验基础上进行冰键合聚合物的合成方法，或怎样使这种聚合物的冰键合效果最大方面均未提出指导性的一般原理。他们还指出，他们的聚合物在高浓度时可使他们的溶液形成晶核，但没有指出他们的聚合物可降低冰晶生长速度，也没有指出学术性以外的实际用途。Caple等人(Cryo-Letters，4：51-58，1983)也报道了从天然原料中发现组成未明，未经表征和未经纯化的一些成核抑制物质，但仍没有指出其应用。

设计某种人造化学试剂以控制冰的物理性质的思想首先由Fahy在由McGrath和Diller编辑的低温生物工艺(Low Temperature Biotechnolody)，1988年，ASME，113-146页中提出。这一意见的提出只是一句话，“深入探访AFP作用的机理…使得有可能设计一些分子，它们能以辅助方式抑制冰晶生长，例如沿着不同的结晶平面”。然而，该文没有提出制备这些分子的方法。

Kuo-Chen Chou(“抗冻蛋白的能量优化结构及其结合机理(Energy-optimized structure of antifreeze protein and its binding mechanism)”，分子生物学(J.Mol.Biol.)，223：509-519，1992)提到一种特别设计冰晶生长抑制剂的意向。然而，它只局限在现有抗冻分子的小改进上，并没有设想到本发明从头制备合成IID的根本不同的方案。

基于上面这些回顾，根据本发明设计一些能阻止冰晶生长(具体是在c轴方向上)的分子是有利的。当它与一种阻碍底面方向上的生长的物质结合使用使得所有的生长平面而非单单一个生长平面受到抑制，就会避免现有冷冻细胞技术仅用底面生长抑制剂的极大缺点。而且，由于c轴方向上的生长(后称“C生长”)是在吸附在棱柱侧面上的物质(即防碍a轴方向生长即“A生长”的物质)存在条件下过冷时的限制性因素，混合使用C生长抑制剂与A生长抑制剂时达到的过冷度与单用A生长抑制剂实现的过冷度相比会有相当大的提高。

关于天然抗冻蛋白的一个问题一直是对其精确反应机理的理解存在混乱。最近，Sicheri和Yang(自然(Nature)，375：427-431，1995)描述了一种清楚的关于AFPs怎样与冰晶格实行匹配的模型。他们指出，在八种所检测的AFPs中，每个AFP分子中与冰键合的原子数为3至10个，平均每一AFP的冰接触点数为分子中每4.8个氨基酸中有一个至每15个氨基酸有一个(大约每422-1340道尔顿的AFP质量有一个冰键)。与冰键合的氨基酸发现为苏氨酸(thr)，天冬氨酸(asp)，天冬酰胺(asn)和赖氨酸(lys)。每个键合的氨基酸形成一个键，键是通过苏氨酸的羟基氧，赖氨酸和天冬酰胺的氨基氮及天冬氨酸的羧基氧(O-或羰基氧)形成。对于冬季比目鱼的AFP，详细的分析表明，晶格匹配与AFP键合基团的平面布局和匹配基团运动自由度的结构限制有关。键的连接发生在2021平面的边缘(Biophys.J.，63：1695-1662，1992；Faraday Discuss.，95：299-306，1993；J.Am.Chem.Soc.，116：417-418，1994.)。更详细的分析表明，天冬酰胺和天冬氨酸的氧和氮与冰的氧之间的晶格匹配是不完善的。一个原因是冰内与这些位点相连的氧是位于每一键合原子的一侧，而非直接在其底部。另一原因是天冬酰氨和天冬氨酸氢键合基团的三角平面(sp2)配位与冰内氧的四面体(sp3)配位列不同。他们推断：“与以前由其它作者(Biophys.J.，59：409-418，1991；Biophys.J.，63：1659-1662，1992；Biophys.J.，64：252-259，1993)认为的相比，起基础作用的是氢键相互作用可能更确切一些”。

发明概要

本发明提供冰界面掺杂剂的制备方法，用此方法制备的冰界面掺杂剂以及其应用方法。一种方法是需要决定冰成核体上的氢键键合位点间的距离，以及需要制备一种合成分子，其在其自身氢键键合位点和冰成核体上已知位点之间有一辅助键长。这些分子与冰键合能力的提高可通过在设计方法中考虑一种新的“轨道转向”概念来实现。轨道转向指将孤对电子轨道调整至最佳方向以有利于与冰的氢键键合。通过将键合原子共价连接到其它至少两个非氢的原子上，形成一部分相对刚性IID结构，使IID的键合原子锁闭在固定的不旋转状态可以部分地达到此目的。本发明的合成分子可以设计成既有高度活性又能适用于实际应用。第二种方法是要找出实际上是直接作用于冰的抗体的IID。这在就是要动物中培养实际的抗冰抗体，或用体外细胞培养的标准“捷径”方法，或用化学和体外自然选择的结合方法寻找辅助蛋白或核酸IID。

根据本发明制备的IID的效果超过了天然试剂的效果。假如说天然的IID只限制于使用蛋白质，而蛋白质在化学组成上和结构上的多样性是有限的，其发展可能性也是有限的，那么本发明提供的合成IID在性能上会大大超过现存的天然抗冻大分子，只要遵循本发明提供的恰当步骤。而且，本发明提供了新而最佳蛋白质结构的制备方法，其抑制冰晶的形成与现有天然抗冻蛋白或糖蛋白无关。

本发明制备的掺杂剂分子能吸附到冰的每一表面晶面上。制备的掺杂剂分子还可起协同作用，在其分子边缘为其它掺杂剂提供键合位点。本发明提供分子的制备方法，该分子可有效地吸附到冰的晶格上或其它冰的成核表面上以防止冰晶在这些冰成核表面上生长。

本发明也提供了抑制冰在各种物体中或其上的生长，这些物体例如有飞机机翼、鞋类、道路、食品、植物、窗户、电缆、移植组织包括血管组织及其它冰生长控制是有益的物体。

体现本发明的一种方法包括一种冰界面掺杂剂的制备方法，它是先要决定在一个能成核出冰晶的物体上许多个冰晶模板氢键键合位点之间的距离，并合成一种掺杂剂分子，它具有多个掺杂剂氢键键合位点，这些位点之间相隔距离能与所述冰成核体氢键键合位点相结合。

实施方案还包括用至少一个聚合物与至少一个所述冰成核体氢键键合位点相结合来确定所述距离，且所述至少一个聚合物可以是一个多聚核苷酸，所述多聚核苷酸可放大。

另一实施方按的特点是根据本发明制备冰界面掺杂剂的方法包括从生物来源断裂获得的DNA片段中制得至少一种聚合物，该方法还包括在溶液中将DNA片段粘附在冰上，从溶液中分离出冰和粘附的片段，将粘附的片段再从冰上取下并将片段放大等步骤。

附图简述

图1A表示冰晶的大分子棱柱结构，其包括底面和棱柱侧面的表面原子排列。

图1B表示有a轴和b轴抑制剂存在时的冰针状结构。

图2表示冰晶底面0001的晶格结构(图2A)和棱柱侧面的晶格结构(图2B)。

图3描述了用枝状或环状结构使晶格匹配最大化以减少或预防冰晶成核趋势的技术。

图4表示一种有氢键键合位点能用来键合到冰成核体的适用掺杂分子。

图5是冰晶格结构与掺杂分子相结合的三个视图。5a表示沿冰晶的棱柱轴的俯视图；5b是转过来的视图，可清楚地表示冰和掺杂分子之间的氢键键合；5c表示掺杂剂和与掺杂剂键合的冰晶格结构中的水分子。

图6表示当羟基氧的取向是在冰内氧原子的正上方时，羟基的孤对电子与冰内键合位点之间的关系。

图7表示一种人造IID(IB2)的转向轨道，这些轨道的排列使得它们能形成与冰底面的氢原子完全匹配。

图8表示一个部分转向的人造IID(IB3)例子，其中一个氧原子转向而另一个处于可旋转进入正确轨道的允许状态。

图9表示一转向与非转向IID混合的例子，其使用的原理与IB3相同，只是用了不同的物理方式。

图10表示最小冰晶表面的原子详细情况，该冰晶看起来宏观上呈板状六角冰晶形状。

最佳实施方案描述

这里描述的原理使设计的IID可与任何所需的结晶平面键合，或甚至与冰晶结构内固有的非结晶结构键合。这里描述的具体分子原型被具体设计为能键合到底面上以阻止C生长。

尽管根据具体应用，这里关于制备不同IID类的描述在细节上有些不同，但下列基本标准在不同程度上适用于所有种类的IID。

这里定义的冰界面指能成核冰晶生长的表面部分。一个冰晶体具有好几个这样的表面，在整个说明书中用作一种典型的冰界面。非均匀成核剂也被认为具有能为本发明的分子所锁闭的冰界面。

使用适当的计算化学软件包可使符合下列标准任何一条或其若干条的IID制备非常容易。合适的软件包包括“HyperChem”(加利弗尼亚州旧金山的AutoDesk制造)和“ECEPP/2”(见Chou，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，223：509-517，1992)，和“Insight II，Discover，and Analysis”(新泽西州Parsippany的Biosim Technologies，Incorporated制造)，或作为这些软件包基础的直接程序，如“MM2”(Dr.Norman Allinger，Georgia大学)。也可使用许多严格性较差但仍有用的程序。所有的这些程序参照结合在本发明中。

物理分子模型也可用来表示计算分子模型。物理分子模型使人迅速了解可达到所需目的的原子排列方式，通过它们很容易看到用计算模型并不总能看到的孤对电子状态。这很重要，因为例如，是氧和氮的孤对电子与冰晶晶格的氢原子相键合的。

下面的条件确定了用于设计和制备各种IID分子的标准：

a.协调分子质量、分子流动性、与冰分子键合之间矛盾的原理。水分子质量只有18道尔顿，因此与目的在于抑制水吸附到已有冰晶上的合成结构相比，水有高度的流动性。为使IID与水能最大限度地竞争达到正推进的冰界面，IID的分子质量应保持最小。在快速冷却时特别应这样。而且，合成人造分子的费用通常随分子质量的增大而增大。因此，本发明合成的IID质量应在4500道尔顿或以下，最好在1000-3000道尔顿或以下。如这里指出的，设计成的IID分子质量可低达100-500道尔顿。

由于同样原因，一种给定IID分子的效果与IID分子能覆盖的冰成核界面例如冰晶的面积有关，也与IID分子在冰界面上形成键的数目有关，这两个因素均随分子质量的降低而降低。这些因素大概可部分用来解释为什么有效的天然AFP有数千道尔顿质量。而且，合成IID的分子流动性很大，除使连接到冰界面上的速度高以外，还会使它从冰界面上离开下来的速度也高。

使IID分子的质量低不利于在一些应用(如生物应用)，虽对另一些应用(如工业应用)并非不利的另一个因素是低质量分子每单位质量的渗透效应更高。

为了消除较低分子重量的负面效应，IID应满足下列标准。

1.合成IID的冰键合与IID质量之比应比天然IID高。根据Chou(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，223：509-517，1992)的看法，37个氨基酸的比目鱼抗冻蛋白每第11个氨基酸与冰形成一个键。这一结果为每个分子共有四个与冰结合的键，或每819道尔顿有一个与冰键合的键。合成IID的键对质量之比应大约为每50至500道尔顿1个键。键合位点应线性分布，即实际上是一维的，以减小成核趋势。或者，由于同样原因，分子的冰键合部分的宽度或面积应受到局限。在大片连续区域的晶格匹配会促进成核现象(Gavish等，科学(Science)，250：973-975，1990)，但这一趋势可通过将匹配位点散开和/或排列成行来减少或消除。

2.合成IID形成的键至少应和天然IID形成的键一样牢固，在可避免成核趋势时最好更牢固一些，例如通过构建一种实际上为线性的分子。最好使用带电荷的基团如质子化的胺或离子化的氧(如在羧酸和其它酸基团中)，这是既为了使强氢键接合到特定冰晶格位点上，也是为了使水的局部结构破坏形成非冰形态，从而进一步阻止晶体生长。也可用羰基，亚砜基，硫酸根和磷酸根中的双键氧。

决定键强度上限的因素有，在使用需考虑毒性时键合基团的化学毒性、IID中强键合基团的空间结构与冰的空间限制的相容性、IID在这些与冰强键合位点之间的不利的吸附或排斥作用，以及特别强的与冰键合位点作为成核位点的趋势。然而在一些实施方案中，非常强的冰键合位点的成核趋势并非不利，如果试剂在形成冰核的同时，也会吸附到冰表面上阻止进一步生长的话。

3.一种不用有毒化学基团形成强键合的好方法是根据分子识别原理，该原理例如表现为用酶-底物或激素-受体之间的亲和力来识别。这通常涉及要被识别分子的结构和识别分子之间的三维空间配合。因此，IID的操作参比质量最好是与具体识别冰晶表面特别结构的特定识别一致的最小质量。总质量可以是这一操作参比质量的一倍或几倍。

样品结构1和2表示了弱(低操作参比质量以及因而低的键数目，加上最小的三维空间特征)冰识别分子，其操作参比质量大约为100道尔顿(结构1和2分别为116和104道尔顿)。由于每一结构有两个冰键，其质量与键数之比各自为58和52道尔顿/键，而比目鱼抗冻蛋白的数值为819。

在结构1中，氧原子之间相隔4.5埃，在结构2中，相隔的距离精确为7.36埃，这两种情况都与冰晶格间距非常精确地配合。

4.含低原子序原子，如硼和氮的分子，适于使分子质量最小和使流动性最大，从而使冰键数与IID质量之比最大。

b1.协同性和自结合性。重复聚合物中固有的对冰键合的协同性，其很大的优点是冰与大量单体之间相互作用的加和性，可使每个分子的键数目达到最大。一个重要的原理是将IID设计成在较大结构中起单元的作用，这就可使分子在获得这种协同键合主要优点的同时获得合成的经济性及与较低分子质量相应的高流动性。这种单元的两个例子是a)作为独立自结合分子的单元和b)在单一聚合物分子中形成单体的单元。

对于分散的分子单元，当单元取向适当能冰发生协同作用时，单元边缘之间会发生面对面的键合，如氢键键合。这就使这些单元作为一个群体迅速自结合形成覆盖冰的一层表面，条件是能有向前推进的冰前沿作为冰模板对这种自结合过程起促进作用。每一单元有足够的流动性使具有与向前推进的冰前沿有最佳取向的单元以适当方式在冰前沿上取向。这就减缓了冰前沿的生长，并补充其它单体通过面对面的键合形成一层覆盖冰的膜(“诱导配合”过程)。横向结合(平行)的杆或条带与非连接结构相比可与冰晶整个表面形成更牢固的键。

一个有用的分子自结合类型的例子是由Ghardiri等人提供的(“以循环肽结构为基础的自结合有机纳米试管”(Self-assembling organic nanotubes based ona cyclic peptide architecture)，自然(Nature)，366：324-327，1993，在这里完全参考结合之)。Ghardiri等人指出一种平面循环多肽，在这种循环多肽自身平面的上方和平面下方都形成氢键，结果生成自结合的长分子管道。然后这些管道又面对面相连形成三维结构的排列。Ghardiri等人的工作中除对循环多肽外，未涉及其它目标分子的识别。IID不宜形成厚的三维结构，其应形成大体上是二维的或杯状的或阶梯状的结构(使IID和冰之间的键数与被吸附的IID质量之比最大)。然而，实际上与该工作中类似的二维结构加上下面指出的改进，对IID的制备就是很适合的。

适宜采用这种办法的条件为：a)用来覆盖冰表面的IID数量没有限制(因为这种几何关系会使得若覆盖在冰表面上太快，会过快地减少IID供应，因此使其它冰表面不受晶体生长的抑制)，和/或b)IID应充分隔开，以避免IID引起的成核剂活力使水分子组织生成扩展的平面冰状结构，或c)成核作用不是个问题。

b2.规则(周期性)聚合物的合成。第二种模件化方法是在一给定分子内的模件化。当IID必须相当大时，如果它们可以设计成常用的较小的单体的聚合产物，那么制备它们就更经济。例如，糖原是葡萄糖缩合形成的聚合产物。一种改性的葡萄糖分子可缩合成一有任意分子质量的IID。天然的或经改性的核酸和天然或经改性的氨基酸也可用相当低的费用聚合成大小不受限制的IID。

IID应设计成可阻止在其冰键合面的自结合，最好也能阻止其在背离冰前沿的一面的自结合。在前一面上的自结合会堵塞分子上具有功能即对冰生长起抑制作用的位点，而在分子非冰键合一面的缔合会使太多分子取向离开冰表面。人为设计的空间位阻和极性基团的仔细排列可防止不必要的自缔合。

天然存在的分子，如含有大量亲水基团的单糖、多糖和阿拉伯木聚糖，已被发现会产生较弱的热滞后现象。与天然IID起相同作用的已知AFGP是由与多肽链(通常是几个Ala-Al-Thr的重复序列)相连的二糖组成的。同样，可制成或合成出合成IID，它例如是与碳聚合物骨架相连的糖或多糖，如在聚乙烯醇(PVA)中发现的情况。在这一例中，可先生成具有糖侧链的单体单元，然后进行聚合，或可用糖单元与预制的聚合物骨架反应来实现合成。功能性单元之间的最优距离可通过控制每一单体单元内具有糖侧链的缩合位点的碳原子数目来确定。例如，C-C-OH，C-C-C-OH或C-C-C-C-OH的重复会将侧链各自隔开1，2或3个碳原子。为获得有用的活性，并不需要占有所有的糖受体位点。当然，这一方法可用任何具有冰键合活性的替代物，而不一定是糖。事实上，侧链基团，如羟基可不作衍生。例如，聚合物

        CH₃(CHOH(CH₂)₃CHOH(CH₂)₃CHOH(CH₂)₃)_nCH₃或聚合物

        CH₃(CHOHCH₂CH₂CHOHCH₂CH₂)_nCH₃

其中n是1至1000，较佳为3至500，最好为4至300，它们都应易合成并有活性。

另一类可用于形成聚合IID的分子是含有巯基的化合物。在这一例中，可以合成出分子量相当低的，具有与冰晶晶格匹配的单体，其一个或多个巯基基团处在合适的位置上。巯基通过氧化作用反应形成二硫键，较低分子量通过这种键单体互相连接形成更高分子量的IID。每一单体上的巯基基团的排列位置应避免产生会防碍单体在聚合反应后与冰表面键合的空间位阻。避免空间位阻的办法，例如是将巯基基团置于分子平面之上或平行于分子平面，从而促使IID上有关的亲水基团与冰相互作用。两种硫醇类物(含巯基的化合物)的氧化作用可形成这种二硫键，该氧化作用是在温和的氧化条件下进行。这样，聚合的速度及因此获得的IID的分子量的分布在一定程度上可以控制，而且，用同种的单体，但改变单功能团与多官能团巯基化合物之比可生成不同分子量的IID。

由相对不活泼的单体生成活泼的聚合物IID的聚合过程也可在IID的功能位点上完成。这一原地聚合作用可使使用者能将分子量相当低的单体传递到需要IID活性的区域，例如，通过在聚合作用发生前从喷雾罐中喷出的方法。根据单体的不同本性，可用若干种化学方法实现原地聚合。这些方法的例子包括自由基引发、阴离子和阳离子聚合作用及催化作用。如果单体物质含有反应性基团如巯基基团，则用例如上述的温和氧化条件进行聚合作用，这种温和氧化条件包括例如在喷射后将单体暴露在氧气下。实施例中描述了一种模件聚合物，其显示在图4和5中。

c.分子形状。至少有一些天然AFP是线性聚合物，至少有一种在晶体内或晶体上呈线性棒状(Yang.，自然(Nature)，333：232-237，1988；Chou，分子生物学杂志(J.Mol Biol.)，223：509-517，1992.)。然而，就减少为获得指定与冰键合的氢键数所需的原子数目来说，这种线性排列与枝状结构相比是不可取的，因为在这种情况下，有些潜在的键合位点不能起作用。

如图3所示，一种以最小的质量实现与冰的前顶点即上顶点(图中未表示其它顶点)牢固键合的更优选方法是，例如，通过其横向键合(而并不仅仅是沿一维轴线的键)，即，设计生成的结构31中可键合最近的键合位点，而不仅仅是键合那些恰好位于一特定直线上的键合位点。这可以通过采用分子枝状结构(例如具有灵活伸展的周期性的“手臂”的棒，如结构2或“Y”或“X”形状的分子)、圆形(环状)结构、或这些结构形式的结合和变体来实现。

IID最好具有一定的空间位阻特征(“凸起”或“支脚”)以避免或限制在冰键合的一面或背离冰的一面(疏水面)产生自结合现象。这些特征可包括甲基基团，乙基基团，冠醚突出物等。通常支脚是疏水性或有弱的亲水性。

d.亲水亲油性。天然的IID起作用时看来是其将冰键合基团(如极性即亲水基团)置于分子的一面而非冰键合基团(如非极性即疏水基团)在另一面，有效地在一面吸附冰而在另一面排斥水。这一特征对于合成IID通常也是需要的，但应注意上述的IID冰键合和非冰键合表面各自的极性与极性之间，疏水性与疏水性之间的相互作用。

e.晶格匹配。晶格匹配是IID与冰键合的基础。晶格匹配可涉及用氢键直接结合到冰的特定位点上或沿冰表面上电合成矢量进行的键合(Yang等，自然(Nature)，333：232-237，1988)。通常的冰晶格结构是已知的。而且，这一结构实际上是不随温度而变的，温度从0℃降至-196℃时，4.52埃间距只降低0.04埃，7.36埃间距只降低0.05埃。因此，作为一级近似，晶格匹配提供了可用来匹配冰内的重复间的距清楚的设计信息以重复合成IID中的间距。冰还有其它一些晶格匹配间距。这些间距包括沿0112轴排列的16.7±.5埃的分子间距，沿2021冰平面排列的6.3±.4的分子间距。与该较长间距有关的键合位点实际上形成一等腰三角形，其两条边大约为16.7埃，其间角大约为48±2°。大约6.3埃的键长实际上是以线性的排列方式在重复着。

在有和没有IID条件下冰晶的生长机理会产生一些复杂情况。如果观察一个平的冰晶表面，在该面上氧原子和氢原子的确切位置作为一级近似是确定的，可寻求对在这些位置的匹配。然而，在一生长的结晶内，在本是平的结晶面上发现有新增加的水分子，由于空间和几何原因，这种情况将对IID吸附可能有干扰。结晶面上冰的加入将使结晶面产生一些不平整现象，对此必须加以考虑，所以通常冰结晶面被认为是分子水平上“粗糙”。设计IID时最好通过先“识别”冰结晶面上的阶梯或凸起，然后针对性地键合到这些阶梯或凸起位点上，或者是通过其自身是阶梯或凹陷的形状来适应这种情况。识别阶梯或凸起的IID上的氢键键合位点将与冰晶的两层或多层冰分子键合。下面描述实现这一目标的方法。

当存在的IID19在C轴16方向上诱导纺锤形冰晶22的生长(见图1B)时，这种“C生长”可通过加入能与冰的底面18(它面对沿与棱柱侧面20垂直的C轴16方向)键合的IID来解决。此外，这种冰针的侧面不一定是很象通常的棱柱和基面结构，所以可设计出与这种针状表面相匹配的IID来阻止或有助于阻止这种类型表面的形成。因此，这种针状表面结构的分析对IID设计使其与这种异常表面匹配也是有利的。

f.刚性。设计成的合成IID在结构上最好为刚性。当生成相当大(5个或6个或更多单体)的聚合物时这一要求特别重要，因为单体之间自由的或有限制的旋转会迅速生成一些构象不同的聚合物形态，其中大多不能与冰表面良好地键合。IID有刚性则其结构可很好地固定，这对于与严格明确的辅助表面(如冰晶的辅助表面)进行结构匹配具有设计和物理功能方面的优点。

g.轨道转向。确定IID结构的一个更精密的方法是轨道转向的概念。轨道转向是指将一些键设计成在IID分子内强迫孤对电子轨道进入确定的位置。将AFP内的氧原子或氮原子与冰内的氧原子进行匹配的通常范例忽略了以下因素：a)实际上被键合的可能是冰中的氢原子而非氧原子，b)冰内的氢原子和氧原子孤对电子相互间呈104.5°。

图6表示一个分子内的氧原子位置与冰晶格位点的氧原子进行匹配的一个可能的效果，这通常在文献中被认为是冰键合的理想方法。所示的这个例子是使用表示底面作为IID的键合表面。氧原子位置62和64是可重叠的，但是由于冰62内的轨道不能恰当地对准结合分子64内的轨道以实现氢键键合，所以键合是较弱的。“轨道转向”提供一个确切的轨道取向，其比仅以局部电子密度的增加设计成“非轨道转向”IID分子对于与冰晶格的键合更有效果。

天然AFP中也发现同样问题。对于合适的氢键结合轨道对准得并不恰当。尽管如此，天然的AFP仍是有效的，但其效果不如设计成能实现轨道精确对准的人工IID。

实现轨道转向的一个较佳方法是将键合原子插入环状结构，其方法与将氧插入葡萄糖环状结构骨架锁闭形态的方法类似。环中结合原子的插入迫使孤对电子轨道进入特定的位置，这些特定的可预知的位置可互相平行排列并隔开适当的距离，从而与冰内合适的原子键合。

除了氧原子，其它有孤对电子轨道的元素如氮和氟，也可与氧一样被使用，但形成稍微不同的结构。例如，氮可作为分隔两个环的顶点，与氧不同，其一对孤对电子伸出在石墨表面平面上方。

键的手性很重要。如果用交替的左右对映异构体，孤对电子轨道电子就不会有很好取向。

h.表面特性和可接收空白区域。如图1B所示，天然IID19只覆盖了冰晶表面的一小部分，却仍有效。这是由于生长抑制不仅与水分子接近冰表面然后在冰表面上的吸附进行的空间位阻有关。而且，它也与已吸附水分子没有水平键合位置来提供稳定化力以阻止吸附的水分子自动返回周围溶液中有关，换句话说，与冰的表面能有关(Kelvin效应；见Mazur，Ann.N.Y.Acad.of Sci.，125：659-676，1965)。IID的吸附间接增加了IID吸附位点之间的表面能，因此产生了冰滞留效应，如图1B所示，这个冰滞留效应在冰表面上的作用范围以IID吸附位点为中心达到好几个分子直径。

当液体介质的过冷度增加，这个效应就减少，同时结晶过程推动力增加，能克服较高的冰晶生长表面能垒。因此，IID必须设计成能覆盖足够的表面以适应过冷度，这对具体的特定用途很重要。因此IID用于保护桔树的合适的空白区域比适用于食物冷冻的空白区域大，适用于食物冷冻的空白区域又比适于生物冷藏的空白区域大。

Kelvin方程描述了由于为在一空隙内生长而迫使冰形成高度弯曲形状(高能量)而引起的凝固点下降。这一方程也可用于因限制天然AFP/AFGP之间(Wilson，Cryo-Letters，14：31-36，1993)和合成IID分子之间的冰表面积引起的凝固点下降。因此，例如在设计一环状IID时，这一方程的关系确定了IID环的直径，该IID环在一给定的整体溶液过冷度下可防止冰晶生长。如需极度过冷度(如在器官玻璃化中)，若冰核不完全被覆盖，就不能完全抑制晶体生长，但如果晶体生长非常缓慢，则不必完全抑制晶体生长。考虑到上述因素，环直径越小，晶体生长越慢，直至直径变得足够小以诱导冰成核活性。

i.IID的中间模板的合成。冰成核剂(INA)与THP的功能相反。它是诱导冰晶成核而非抑制冰晶生长。THP和INA均必须与冰结构有对应关系。虽然THP与冰键合，但它们并不类似于冰。由于INA是创造冰的，所以被认为与冰更类似，是结构上(如在碘化银，云母或胆固醇晶体中)或有与冰表面能相同的表面能，如单细胞菌属丁香毛杆菌素(Syringae)成核位点的情况即是如此。Parody-Morreale等人(自然(Nature)，333：782-783，1988)证明鱼抗冻糖蛋白是通过细菌冰成核物质抑制成核的，这说明抗冻分子键合到成核剂上是由于成核剂与冰结构类似。

制备与在生物中存在的特定结构结合的分子的一个现有方法是将这种结构注入动物体中。动物体中就会对外来物质产生抗体，该抗体的结构与外来物质的结构密切互补。然而，仅仅将冰注入动物是不可能形成冰的抗体的。但若认识到下面两点再来合成抗体IID，该障碍是可克服的，这两点是(a)与细菌冰成核剂或另一已知的冰成核物质键合的抗体也可与冰键合，(b)与冰键合的抗体起的作用与IID一样可抑制冰晶生长，而且比天然AFP的效果更好。

按这种思路制备IID的方法是先选择一合适的成核剂，然后培养出该成核剂的抗体(如用已知的免疫技术方法)，最后从中筛选有抑制冰晶生长和/或与冰键合活性的抗体。

典型成核剂包括(但并不局限于)P.syringae成核剂片段(该片段可使成核位点暴露在抗体作用下)先合成的IID，与蛋白质或其它辅助剂相连的IID(使其更具免疫性)，THP/AFP，交联的改进的C₃₀H₆₁OH链烷醇链(其头部或尾部基团之间间距为4.5埃(Gavish等，科学(Science)，250：973-975，1990))，交联的α氨基辛酸、l-甲硫氨酸、d，l-酪氨酸、或d，l-丙氨酸和类似的种类(Gavish等，科学(Science)，256：815-818，1992)及先前形成的抗冰抗体片段。

冰晶生长抑制和冰键合活性筛选可根据常规实验进行。

冰晶生长抑制的常规测定方法是已知的(例如，见Knight，DeVrise，和Oolman，Nature，308：295-296，1984)。抗体与冰键合的测定方法是对抗体先作标记(放射性标记，荧光标记，酶法标记，抗原标记或其它标记)，然后测定在恒定的冰热力学凝固点温度下当冰水混合物中加入低浓度的抗体后，标记物从液相到固相的分配。另一种测定键合活性的方法是冰晶生长习性的测定(Knight等，自然(Nature)，308：295-296，1984)。这种测定方法通常是用与Clifton技术物理(Hartford，NY)纳升渗压计连接的显微镜观察冰晶生长和熔化(例如见Chakrabratty，Yang和Hew，生物化学(J.Biol.Chem.)，264(19)；11313-11316，1989)。这种测定方法技术也可以同样方式用于测定合成或分离获得的IID活性。纳升渗压计可用于测试IID对在每一分量结晶方向上冰晶生长的影响(即对结晶生长习性的影响)(例如见Chakrabratty和Hew，生物化学(J.Biochem).，202；1057-1063，1919)。用纳升渗亚计进行的测定方法是要对IID溶液中冰晶在接近熔点时进行观察。晶体开始熔化的温度与冰晶开始生长的温度之差是IID的特性，称为热滞后。

j.用重组化学方法合成IID。重组化学领域是用转录系统来生成许多种DNA，RNA或蛋白质的变异体，然后从中按所需活性进行筛选(Alper，科学(Science)，264：1399-1401；Kenan，Tsai，和Keene，T.I.B.S.，19：57-64，1994)。与需人造冰代用品的间接抗体方法不同，这一极为有用的方法是直接的。

如果所需的活性是对冰键合，用于对冰键合的最好的产物(蛋白质或甚至核酸，或这两者的非天然变异体(Fahy，Clin.Chem.，39：2011-2016，1993))可对重组方法制备的产物按其吸附到冰某一有关结晶面的行为进行筛选来确。例如，可用细分散的冰作为一种手段，其方法是在键合后重复分离出冰的部分(例如，将冰从溶液中取出或滤出)，将好的冰键合剂从最初的候选物混合物中初步挑选出来，然后使冰融化，或可放大融化物中的释出物质，然后检测释出物质中含有的那些新候选物质的含量。作为重组合成的例子，例如蛋白质的合成，生长的蛋白质分子与一些键相连，这些键也与标记分子相连，标记分子使蛋白质序列在蛋白质活性确定后能容易地被测出。这就需要趁蛋白质还连接在颗粒上时就测出冰键合活性。然而，只要键合足够强，且用于从测试溶液中回收冰的冰滤套上的开孔足够大时，整个颗粒应会粘在冰上并可如上所述被回收。如果不同的颗粒太多以致难以分离出单一颗粒用于分析，可用更严格的选择标准将候选物的数目减少到可处理范围。为此，例如，可将回收的冰送入纯水中，并在不同的g力下离心。由于颗粒密度比水大，冰的密度比水小，离心就可将键合较弱的颗粒分离出来。仍粘附的颗粒可用标准技术一个个解码，例如将PCR技术用于核酸编码序列以得出冰键合蛋白的基本结构。然后这些蛋白可不限量的生产，例如先合成相应DNA序列，转染，然后在一合适的微生物系或细胞系内表达蛋白。如果需要，可用水以外的物质，如油、或蔗糖或“Ficoll”溶液或其它密度可调的溶液进行离心。

重组化学方法的操作通常是，先严格地生成有给定聚合物长度的给定聚合物所有可能的变体，然后从这一大群变体中选出有活性的变体，一个可能的缺点是用这种方法筛选的聚合物长度受限制。一个类似的方法是用由天然来源构建的各种库。基因组DNA可用限制性酶切法或超声溶解法以形成无数“短”的DNA序列，然后DNA序列可有选择或随机地放大，例如用聚合酶链反应(PCR)，发酵或组织培养来生产有不同分子量的大量变体。选择性放大是在放大时用特定启动物来实现，随机放大需要用PCR(随机顺序启动物)随机启动。或者，如上所述，合成生成的核酸库可用冰筛选来分离冰键合物质。结构进一步不同的变体可在这类DNA库内产生，其方法是使低聚物变性，实际上生成一单链DNA，其具有的潜在的与冰表面键合(亲水)位点的数目比相应双链DNA多。然后每一冰键合物质的浓度可用放大技术增加。虽然这些方法中可能要用到大量的计算机模拟技术或实验工作，但这种模拟技术和实验工作被本技术领域普通技术人员认为是常规的。

                          实施例

一种普通IID。如上所指出的，有37个氨基酸的比目鱼抗冻蛋白形成低达每11个氨基酸只有一个氢键，或AFP大约每819道尔顿只有一个键。图4表示一种合成IID(IB1)(结构4)，其设计成每75道尔顿IID有一个键。这种IID是采用HyperChem构建并确定其尺寸的，HyperChem为一化学计算软件包，该典型软件根据这里描述的原理使新型IID的制备更容易。在这一结构中，黑色圆圈代表碳原子，深灰色圆圈代表冰的氧原子，浅灰色圆圈代表IB1的氧原子与相连的氢原子，无色圆圈代表氢原子。

键合位点用氧原子41-43和45-47表示。结构3包括三个单体环101，102和103，它们的作用是作为图中重复一次的上模。这段带子宽度两端上所氧原子的精确间距为4.50埃(氧原子41至42和45至46距离)，沿带子一个边缘上的氧原子最近间距为4.55埃，它与冰的氧原子间4.52埃的间距之间的相差可忽略。而且，氧原子41和45，氧原子42和46之间的间距为7.54埃，这与冰的氧原子7.36埃的间距相接进。这段带子宽度上间距(41至42和45至46)和用DeVrise观察得到的糖分子内的间距不一致，沿带子边缘的间距与先前设想的结构也不同。将轴向间距如氧41至43和41至45的间距和横向间距如氧41和42的间距组合起来以便与冰三角位点分布匹配也同样代表了一种以前未知的结构和特征。

这一设计说明了：IID的内部模式化特征(环101-103)、IID的平面(含义为潜在环状的)特征、极性基团的位置完全在亲水亲油分子一侧、使用至少适中的刚性结构来保证键合位点的位置确定、IID质量和局部区域的最小化、获得比天然IID多得多的单位质量的冰键合数目。横向极性基团插入使面对面的氢键键合形成协同性的排列也是很明显的。

在图5中，冰晶0001底平面18的最上层的氧原子表示为完整的圆圈。有阴影的圆圈代表已键合的冰晶格位点。在图5中，51代表经旋转以面对底部平面产生氢键键合的结构3。为便于识别，IID的一些氧原子(41，43，45)用图4中表示的相同数字表示。该图显示所有可用的位点30实际上均与IID键合。

这一冰晶晶格用化学计算软件包Hyperchem制成，所有原子间距和角度尽可能接近地采用了发表的实验数据。为与冰晶格氧原子和氢原子区别，结构3的羟基基团51为深灰色。图5B和5C表示经旋转的结构351，其面对底部平面产生氢键键合。为便于识别，IID的一些氧原子41，43，45用图4中表示的相同数字表示。图5A表示沿冰晶C轴的俯视图，图5B表示相同的经旋转的冰-IID复合物以清楚地表示冰与IID之间的氢键键合(氢键用点划线表示)。图5C表示结构351和在其正下方的冰晶格水分子从侧面看的情况。该图显示实际上所有可用位点30都被IID所键合。

由图5可明显看出，在石墨“分子钉板”骨架上人为设定的羟基间距与冰内向前突出的氧原子之间4.5埃和7.4埃的间距吻合得很好。六个氧原子41-43和45-47(用大的深黑圆圈50表示)均位于冰晶格内用浅灰圆圈表示的前突氧原子的正上方，结构3的键数/道尔顿数之比是Chou确定的一种抗冻蛋白内的该比值的十倍。事实上，IID结构3与其途径上每一顶点30键合的能力表示其在结构上可代表一种近乎理想的能为未经改性的底面设计的IID图案。

结构3例举本发明一类优选的掺杂剂，其能抑制冰晶在c轴16方向上的生长。当其与一种能抑制底面18方向上生长的物质联合使用时，所有的生长平面而不仅仅一个生长平面受抑制，这就避免了仅使用底面生长抑制剂来冷冻细胞时产生的致命缺点。而且，由于C轴16方向上的生长(“C生长”)是在吸附到棱柱侧面20是的物质(抑制a轴方向上生长，即“A生长”的物质)存在条件下过冷时的限制因素，A生长抑制剂与C生长抑制剂混用应比单用A生长抑制剂获得的过冷度大很多。

AFP加C轴选择性IID也可通过防止冰晶在冷却时生长形成相当大体积，并通过防止冰晶在加热时合并来减少结冰的危害，这里防止的过程称为晶体长大、重结晶、或Ostwald摧熟。冰晶的过度生长被认为是结冰对有机组织和器官脆弱的胞外结构造成伤害并导致这些组织和器官在冰融化后死亡的主要原因。因此，本发明提供了对冰晶在冷却和加热时其大小和稳定性最好的控制，并提供了一种用相当简单的技术就可实现复杂系统冷冻保藏的透明化的另一种方法。

结构3还有一优点，利用石墨骨架四面体排列能与冰晶格的四面体排列相配合的事实，该结构可精细调节成任何需要的冰晶形态。与图3所示结构相同，碳六角体可以任何所需的方式从图3所示的“带状”结构3产生并进入周围平面，这与图3显示图案相似。(图6揭示，IID3的几何结构应使它有效地具有树枝状特征，因为结构3很象图3的“I”形状。)而且，碳六角体也可用垂直与母平面的类似空间结构类似从母平面朝上方或下方来构筑。

很明显，在结构如结构3和冰之间生成一个伸展的匹配模式的可能至今尚未人们认识。DeVrise指出在重复的Ala-Ala-Thr结构上有N-乙酰半乳糖胺残基的抗冻糖蛋白的糖OH-OH之间距离为4.5埃(DeVries，Comp.生物化学(Biochem.)，73A：627-640，1982)，但这种糖的间距是由不同的，更有限制性的几何结构决定的，由这种几何结构不能设想获得人造IID，如IID3。

轨道转向IID。图7表示有三个氧原子的一个分子，这些氧原子的结合方式使每个氧原子的孤对电子取向到一定的位置。这种结构的一种变体显示在图8和9中，其中至少一个氧原子被“锁闭”，而剩余的一个或多个氧原子的位置可使它们的轨道或结合的氢旋转入与被锁闭氧原子的轨道或结合的氢呈平行的取向。

这一方法是将这种“锁闭”原子与能绕一个单键自由旋转的一些原子结合起来，但它们的旋转轨道能取大约与“转向”轨道平行并与其适当隔开的位置，从而实现与冰内原子的键合。

图6代表一轨道转向的IID的原形，其能实现与一个冰的氧六角体的三个顶点键合(当所有这些顶点的末端为氢原子时)的目的。氧原子74，75和77的孤对电子71，72和73朝IID正下方突出，并准确对准冰的氢原子，形成三个强氢键。两个轨道71和72的位置不能自由运动，因此始终正确地对准以实现冰的键合。这一结构在本申请中称为“轨道转向”，或更简单地称为“转向”。第三氧原子77虽然是可自由转动的，但其被限制在一位置使其轨道在转动时对准被锁闭的氧原子的“转向”轨道。该分子的键密度为每95道尔顿一个键，与Sicheri和Yang报道的每422道尔顿一个键的最优键密度(见上面)相比更好。锁闭的氧原子74和75的间距为4.87埃，每一锁闭氧原子与自由转动的氧原子77间距为4.58埃。

这一实施例选择的特定原形也可说明构建具有良好分子刚性以防止分子弯曲，因而其冰键合基团的取向从键合取向改变到非键合取向(如在一简单六角体内会发生的例如从“椅”型取向变成“船”型取向或是相反)的IID的原理。图6(IB2)表示的分子内构建的结构控制程度比通常简单合成所希望的高，但其生动地说明了结构控制的原理。刚性和功能性之间的协调则按对IID的需求，合成的费用和实用性来进行。

图8表示了相当简单的分子80(IB3)，它将一个锁闭氧原子82的较为简单的结构控制与另一个氧原子84的可允许转动的对准结合起来。含有三个五元环85-87共用一对桥接碳原子88的这种结构还可简化，其方法是减去形成第三个无氧的环86的三个碳原子89，这有助于形成IB3的手性。如图所示的，键密度为每84道尔顿有一个键，减去三个碳原子后为每63道尔顿有一个键。氧原子之间的距离为4.55埃。此外，IB3分子可被束缚起来即或以合适间距和角度互相牢固地连接，从而将几个IB3单体的键加和起来得出更大的总键合稳定性。

图9表示图8(IB4)描述的概念的第二个实施方案。这里也是一个转向的轨道91可对准自由转动的轨道92以形成很局部的晶格匹配。氧93和94之间相隔4.41埃。键密度为每77道尔顿有一个键。IB4单体可按需连接，如对IB3那样对几个单体的键进行加和。

图10表示最简单的水分子聚集体，它保持着在溶液中进行肉眼可见的冰生长时人们熟悉有类似的六角平板结构。水分子以随机取向嵌入晶格100。因此，在底面101上，从每一氧六角体的三个最上方顶点向上伸展的垂直键可能是三个孤对电子云，三个氢原子，两个空轨道和一个氢原子，或两个氢原子和一个空轨道。从六角体到六角体，垂直键的分布可随机地不同。特定的IID只能键合可用的可能底面键合位点中的一部分，但这是合乎需要的，考虑到冰表面的完全覆盖并非必需，而且若将冰表面完全覆盖，需要的IID比适于加在溶液中的更多。

这里给出的实施例仅仅是以碳、氢和氧为基础，且有一个条件，即除单键外没有其它键。很明显，这些限制是不必要的，只是用于简化和减小生物毒性。

应用。具体IID的选择与手边的具体用途有关，IID可设想有多种用途。

通过防止Ostwald催熟，例如，IID可防止冷冻食物如冷冻蔬菜在家用冰箱中牢牢地粘在一起。有了IID，通过减少冰的表面能(升华速度)，冰箱内牛排和其它产品的表面干燥变硬现象可减慢。为了这种用途，在物品冷冻前，可在其面上简单地涂上无毒IID。

通过防止冰淇淋的类似产品中的小冰颗粒聚结，就会带来一些好处，例如这类产品的储藏期可延长好几个月，且在家用冰箱温度下，冰淇淋本身无需采用FreezeFlo处理所需的高糖浓度，其比常规生产的冰淇淋更软。为此，最好在产品包装前，使产品与有效量的无毒IID混合。

通过防止农作物如柑橘作物内可成核过冷水中产生籽晶，成千上万公顷农作物(例如整个弗罗里达州的桔树)就可年年防冻，其比用Frostban(一种细菌，在其膜上缺少成核位点)更可靠有效。为达到这一目的，最好(但不是必须)将无毒IID用例如喷雾法涂在作物上。

通过减缓冷冻保藏试剂的可玻璃化溶液中冰的生长，极少量存在的冰晶就会维持足够小，从而使其对玻璃化的用于临床移植或灌输的器官，体液和其它体组织无毒。为达到这一目的，最好(但非必须)将可移植或可灌输的IID加入组织中，例如采用加入冷冻保藏溶液内的方法。

对于用冷冻而不用玻璃化保藏，制成的IID可不直接与成核剂相互作用，因此在冷冻过程中，成核剂是用来催化大量冰晶形成，而IID同时阻止这些冰晶生长成有破坏性的尺寸。这将改变冰的物理特性，使复杂的系统可在冷冻时存活或抵抗冷冻。

IID也可特定制成与成核物质相互作用，从而直接使其钝化以增加过冷度。这将在许多关键的用途中防止结冰。

IID也可用于稳定已形成的冰晶。例如，它们可用于造雪工业，以稳定已形成的雪花，获得长期持久的“粉末”以提高滑雪者的兴趣。在这一用途中，IID可在刚生成时喷洒在雪花上。这将阻止雪花的重结晶(聚结作用)。

IID还有一些重要的用途，其可防止或除去如汽车，飞机，火箭助推器及类似设备上的结冰，及除去路面或航海路线上的结冰。例如，它们可掺入轮胎和鞋的物质和/或表面上，这样汽车，人和其它物体不会打滑，而实际上会粘在冰上，从而减少了由于冰打滑而引起的事故或伤害。IID可覆盖在飞机机翼上或汽车挡风玻璃上的薄冰层上形成一滑腻的表面，其不会与其余的冰键合，因此可使其余堆积上去的冰雪很容易被扫除，或自行掉落而非必须凿去或融化除去。

在这些不同的用途中，对IID的非冰键合表面在生产中加以改进，使其易被生产中的底物吸收，或使其具有溶解度和结构适配性或有有限制的毒性。非冰键合表面的改进与底物材料有关，这对该技术领域人员是很显而易见的。对于眼前用途，冰键合表面的改进是为了直接加长或减少冰键合强度。

尽管本发明联系这里的具体实施例进行了描述，但很明显，许多变化和改进对本发明技术领域人员是显而易见的。因此，本发明这里列出的最佳实施例只用于叙述，并无限制目的。在不脱离本发明的下面权利要求所确定的精神和范围内可作各种变化。

Claims (46)

1.一种制备冰界面掺杂剂的方法，包括：

(a)在一可为冰晶成核的物体上，决定多个冰晶模板氢键键合位点间的至少一个距离；和

(b)合成一种掺杂剂分子，该分子有多个相距这样的距离使其能与所述冰成核体氢键键合位点相对应的掺杂剂氢键键合位点。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个冰晶模板氢键键合位点包括至少三个冰晶模板氢键键合位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(a)还包括决定至少三个所述冰晶模板氢键键合位点的相互位置，且步骤(b)包括合成所述掺杂剂分子，该分子有所述掺杂剂氢键键合位点，所述掺杂剂氢键键合位点可与所述至少三个冰晶模板氢键键合位点相对应。

4.根据权利要求3所述的方法，还包括：

(c)将所述掺杂剂分子在所述掺杂剂分子的边缘共同键合起来。

5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(c)包括使所述掺杂剂分子共价结合或通过氢键键合。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括合成所述掺杂剂分子，该分子上有含所述掺杂剂氢键键合位点的与冰成核体键合的一面和不含所述掺杂剂氢键键合位点的非冰成核体键合的一面。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述非冰成核体键合面不与另一所述掺杂剂分子的非冰成核体键合面相连。

8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括：

选择一稳定的分子，其氢键分布模式与在冰成核体的至少一个表面上存在的氢键分布模式抗原性地相似；

用所述稳定分子对一种动物进行免疫处理生产抗冰成核的抗体；和

收集所述抗体。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述冰成核体是冰的晶体。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述掺杂剂分子中至少有一个氢键键合位点，其固定地位于所述掺杂剂分子上，当所述掺杂剂分子与所述成核体结合时，其将一个孤对电子轨道或一个氢原子指向一个冰晶体模板氢键键合位点。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述掺杂剂分子中至少有两个掺杂剂氢键键合位点，其在空间的固定取向是将孤对电子或氢原子指向至少两个冰晶体模板氢键键合位点。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述掺杂剂分子还包括第二个掺杂剂氢键键合位点，所述第二位点有一个可旋转的孤对电子轨道或形成氢键的原子，所述第二位点可转动使该轨道或形成氢键的原子指向第二个冰晶模板氢键键合位点。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述掺杂剂分子还包括第二个和第三个掺杂剂氢键键合位点，所述第二和第三位点均有一孤对电子轨道或形成氢键的原子，它们与所述固定孤对电子轨道旋转相连，以使所述第二位点转动至指向第二冰晶模板氢键键合位点。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述掺杂剂分子中有至少三个掺杂剂氢键键合位点，其在空间的固定取向是将孤对电子轨道或形成氢键的氢原子指向至少三个冰晶模板氢键键合位点。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述掺杂剂分子中还有第三个掺杂剂氢键键合位点，其有旋转的孤对电子轨道或氢键形成原子，使得所述第三掺杂剂位点能旋转将该轨道或氢键形成原子指向第三冰晶模板氢键键合位点。

16.根据权利要求10所述的方法，还包括使所述掺杂剂分子与所述掺杂剂分子的边缘键合在一起。

17.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少三个所述冰晶模板键合位点是一种复合物，其从(i)三个氧原子，(ii)两个氧原子和一个氢原子，(iii)一个氧原子和两个氢原子及(iv)三个氢原子中选出。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个间距从4.5±0.4埃，6.3±0.4埃，7.3±0.5埃和16.7±0.5埃中选出。

19.根据权利要求3所述的方法，其中所述掺杂剂氢键键合位点包括三个构成三角形的位点，限定该三角形的尺寸选自(i)三边每一边长4.5±.4埃，(ii)三边，每一边长7.3±.5埃，和(iii)两条边每边长为16.7±.5埃，其间夹角为48±2°。

20.一种合成的冰界面掺杂剂分子，

所述分子的分子质量为4500道尔顿或小于4500道尔顿，包括：

一非冰成核体键合面；

一冰成核体键合面，其与非冰成核体键合面相对；

冰成核体键合面上至少有两个氢键键合位点，所述氢键键合位点可在一给定温度下与冰成核体的至少一个表面进行氢键键合；

其中该分子在氢键合到至少一个表面上时能抑制在所述温度下冰在所述表面的生长。

21.根据权利要求20所述的分子，其中所述分子质量约为1000道尔顿或更少。

22.根据权利要求20所述的分子，其中所述分子是一种具有线性、枝状或环状结构的聚合物。

23.根据权利要求20所述的分子，其中所述非冰成核体键合面不与另一所述分子的非冰成核体键合面显著相连接。

24.根据权利要求20所述的分子，其中所述冰成核体键合面不与另一所述分子的冰成核体键合面相连接。

25.根据权利要求20所述的分子，其中所述分子中还有与另一所述分子的边缘相连接的边缘，相连接时不会使每个所述分子在所述温度下丧失抑制冰在所述表面生长的活性。

26.根据权利要求20所述的分子，其中所述至少两个氢键键合位点的第一氢键键合位点有一个孤对电子轨道，其在所述掺杂剂分子与冰成核体键合时直接指向冰成核体氢键键合位点。

27.根据权利要求20所述的分子，其中所述氢键键合位点包括至少两个氢键键合位点，其孤对电子轨道是化学固定的，致使在所述掺杂剂分子与冰成核体结合时指向两个对应的冰成核体氢键键合位点。

28.根据权利要求26所述的分子，其中第二个所述氢键键合位点包括一个可旋转的第二孤对电子轨道或氢键形成原子，所述第二氢键键合位点旋转至一位置使所述第二孤对电子轨道或氢键形成原子在所述分子与所述冰成核体结合时指向一个相应的冰成核体氢键键合位点。

29.一种根据权利要求1所述方法制备的合成冰界面掺杂剂分子。

30.一种防止或减慢冰晶生长的方法，将可防止或减慢冰晶生长有效量的权利要求20所述的多种分子施加到一物体上。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述物体从食物产品、有生命的植物、交通工具表面、道路表面、鞋类、通道、光线通过器和公共事业管线中选出，该物体含有生长有待防止的冰晶。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述生长有待防止的冰晶是一种人造雪晶体。

33.根据权利要求30所述的方法，其中所述物体是一种有待冷冻保藏的器官，体液或其它体内组织。

34.根据权利要求30所述的方法，是将多种不同的所述分子施加到所述物体上。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述不同的分子是键合到冰晶的不同表面或特征部位上。

36.根据权利要求35所述的方法，其中一个所述表面是冰的针状面。

37.根据权利要求30所述的方法，还包括对所述物体施加多个成核体。

38.一种根据权利要求1所述的方法制备的合成冰界面掺杂剂分子，至少一个所述掺杂剂键合位点涉及与所述掺杂剂分子的一个氧原子结合的一个氢键。

39.一种根据权利要求1所述的方法制备的合成冰界面掺杂剂分子，至少一个所述掺杂剂键合位点涉及与一个氮原子或与所述氮原子相连的一个氢原子相键合的氢键。

40.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括选择多种有一些键长的分子，所述键长合起来提供了所述多个的可参与氢键键合的至少两个之间距离。

41.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个距离通过将至少一个聚合物键合到至少一个所述冰成核体氢键键合位点来决定的。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述至少一个聚合物包括由糖，氨基酸和核酸中选出的至少一个物质，该物质是从作为与冰键合部分。

43.根据权利要求43所述的方法，其中放大过程包括用所述多核苷酸或所述多核苷酸的一种互补物作为规定聚合物顺序的模板。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述与所述冰成核体氢键键合位点键合的至少一个聚合物是用所述冰成核体作为模板进行聚合的。

45.根据权利要求41所述的方法，还包括：

决定所述至少一个聚合物的顺序；和

合成所述至少一个聚合物。

46.根据权利要求41所述的方法，其中所述至少一个聚合物是一种多肽，所述方法还包括：

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