CN1186439C

CN1186439C - 一种酶解微反应器的制备、应用及再生方法

Info

Publication number: CN1186439C
Application number: CNB011368608A
Authority: CN
Inventors: 雷政登; 郭忠; 邹汉法; 张清春; 孔亮
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2001-10-30
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2005-01-26
Anticipated expiration: 2021-10-30
Also published as: CN1415734A

Abstract

一种酶解微反应器的制备、应用及再生方法，以石英或玻璃毛细管为载体，采用羧甲基化氨衍生物作为螯合试剂，γ-缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷为偶联剂，将胰蛋白酶溶液通过硅烷化的毛细管加载酶，制得毛细管金属螯合型酶解微反应器。该反应器可应用于肽谱分析，并且可以再生。

Description

一种酶解微反应器的制备、应用及再生方法

技术领域

本发明涉及一种金属螯合酶反应器的制备以及用于蛋白质鉴定中的应用和该酶解微反应器的再生方法，具体地是指毛细管为载体的金属螯合型酶解微反应器的制备及在蛋白质的肽谱分析中的应用和该酶解微反应器的再生。

背景技术

蛋白质的鉴定和结构分析一直以来都是生物化学研究的重要课题，蛋白质的肽谱分析是蛋白质结构鉴定的一个强有力的手段。传统的肽谱分析方法主要是用游离的专一性内切酶或化学试剂水解目标蛋白，再利用反相液相色谱(RP-HPLC)(Chloupek R.C.，Hancock W.S.，Snyder L.R.；J.Chromatogr.；1992，594：65)、毛细管(CE)(Monning C.A.，Kennedy R.T；Anal.Chem.；1994，66，280R)对水解产物分离分析。这种分析方法时间长，游离的蛋白水解酶比较容易自水解，从而降低了分析结果的可靠性和准确性，并且蛋白水解酶和目标蛋白的用量比较大，分析成本比较高。质谱(MS)新检测手段(Nelson R.W.，Krone J.R.，BieberA.L.，etal；Anal.Chem.；1995，67：1153、姜泓海，邹汉法，汪海林等；中国科学(B)；2000，30：385)的引入解决了传统方法分析长的问题，但对蛋白酶自水解却无能为力。而用固定化酶来代替游离酶作肽谱分析具有许多优点：(1)酶的稳定性增加，可以重复使用；(2)易于将固定化酶和底物、产物分离，肽谱中不出现水解酶的自水解峰；(3)可用于构造酶反应器，反复分批反应和装柱连续反应，有利于实现管道化和自动化；(4)酶的使用效率增加，成本显著降低。目前的基体辅助激光解吸电离时间飞行质谱(MALDT-TOF-MS)的检测灵敏度和精确度可达到很高的水平，而且分析时间短。因此利用固定化酶解蛋白再结合MS检测其水解片段有利于微量蛋白的快速肽谱分析。

通常固定化酶采用的方法是用共价键结合法，即让酶通过共价键与载体结合起来，这种方法的优点是酶和载体的结合比较牢固，酶不易脱落。缺点是合成反应条件比较剧烈，酶活力难免有所损失，另外，制备酶解反应器的过程是相当烦琐的。这种酶解反应器的固化酶一旦失活，将无法再生而使得整个酶解反应器报废。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毛细管金属螯合型酶解微反应器的制备方法，该方法制备的酶解反应器体积小。

本发明的又一目的在于提供一种毛细管金属螯合型酶解微反应器在蛋白质鉴定中的应用，其蛋白质样品的使用量可以达到pmol甚至fmol级，降低了分析成本。

本发明的另一目的在于提供一种毛细管金属螯合型酶解微反应器的再生方法，使该酶解微反应器可以反复使用。

为实现上述目的，本发明提供的一种毛细管金属螯合型酶解微反应器的制备方法，其反应如下：

具体制备过程为：

1)采用羧甲基化氨衍生物如羧甲基化氨衍生物为亚氨基二乙酸、三羧甲基乙二胺、硝脑三乙酸或羧甲基化的天冬氨酸作为螯合试剂，其用量为2.0-10.0g/100ml，γ-缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷为偶联剂，其用量为0.6-3.0ml/100ml，先将螯合剂配制成pH＝11的水溶液，再加入偶联剂，加热搅拌下反应4-8小时，配制生成带螯合基团的硅烷化试剂；

2)以内径25-100μm的石英或玻璃毛细管为载体，用浓硝酸冲洗15-45分钟，氢氟酸或氟化氢铵溶液蚀刻8-16小时；

3)将硅烷化试剂循环通过蚀刻的毛细管进行反应，反应时间为1.5-4小时；

4)用硫酸铜溶液对硅烷化的毛细管加载Cu2+，加载时间为1-3小时；

5)将胰蛋白酶溶液通过硅烷化的毛细管加载酶，加载时间为1-3小时，用pH＝8的磷酸盐缓冲溶液将未螯合的胰蛋白酶冲洗干净，制得毛细管金属螯合型酶解微反应器。

本发明提供的一种毛细管金属螯合型酶解微反应器用于肽谱分析，其具体方法为：

1)将制备好的毛细管金属螯合型酶解微反应器吸入样品溶液，两端密封，50℃保温10-30分钟；

2)将含有基体的有机溶液点在样品耙上，干燥后在耙上形成一层薄膜，所用基体可以是α-氰基-4-羟基肉桂酸或2，5-二羟基苯甲酸，有机溶液可以是丙酮或乙醇；

3)将毛细管金属螯合型酶解微反应器中的水解产物直接吹出点在基体膜层上，干燥；

4)再点加含有基体的三氟乙酸/乙腈溶液，干燥后送入质谱仪进行分析。

本发明提供的一种毛细管金属螯合型酶解微反应器的再生方法，其步骤为：

1)用EDTA溶液和水冲洗毛细管；

2)用硫酸铜溶液对硅烷化的毛细管加载Cu2+，加载时间为1-3小时；

3)将胰蛋白酶溶液通过硅烷化的毛细管加载酶，加载时间为1-3小时；

4)用pH＝8的磷酸盐缓冲溶液将未螯合的胰蛋白酶冲洗干净，即完成毛细管金属螯合型酶解微反应器的再生。

为进一步了解本发明的技术特征，列举实施例并结合附图对本发明作具体描述。

附图说明

图1为毛细管金属螯合酶反应器用于5pmol马心细胞色素C的肽谱分析质谱图；

图2为毛细管金属螯合酶反应器用于20fmol马心细胞色素C的肽谱分析质谱图：

图3为毛细管金属螯合酶反应器用于5pmol牛血清蛋白的肽谱分析质谱图；

图4为再生后的毛细管金属螯合酶反应器用于5pmol马心细胞色素C的肽谱分析质谱图。

具体实施方式

实施例1、制备毛细管金属螯合型酶解微反应器：(1)以亚氨基二乙酸(Iminodiacetic acid，IDA)为螯合剂，取1g溶解在50ml的蒸馏水中，用NaOH调节pH＝11制成反应液；以γ-缩水甘油醚基丙三甲氧基硅烷(γ-Glycidoxypropyltrimethoxysilane，GLYMO)为偶联剂，移取1.5mL，搅拌下缓慢分批滴加入反应液中，加热搅拌反应6小时，将反应得到的产物转移到烧杯中待用。

(2)以内径25μm的熔融石英毛细管为载体，用浓硝酸冲洗30分钟，再用氟化氢铵溶液对毛细管蚀刻12小时，之后分别用水、浓盐酸、水冲洗干净。

(3)将第(1)步反应生成的GLYMO-IDA-SILANE循环通过蚀刻好的毛细管，反应时间3小时，反应完后用水将残余的硅烷化试剂冲洗掉，用甲醇灌满整个毛细管，两端封口保存。

(4)将第(3)步硅烷化好的毛细管用水冲洗干净后，用EDTA溶液冲洗，去除毛细管中的残余的金属离子，然后用水冲净，用CuSO4溶液加载Cu²⁺，加载时间2小时，然后再用水将剩余的Cu2+去掉；用注射器将新配制的胰蛋白酶溶液通过毛细管加载酶，时间2小时，用pH＝8的磷酸盐缓冲溶液将未螯合的胰蛋白酶冲洗干净，制得毛细管金属螯合型酶解反微应器。

实施例2、(1)以三羧甲基乙二胺(tris(carboxymethyl)ethylenediamine，TED)为螯合剂，用量为3g，γ-缩水甘油醚基丙三甲氧基硅烷1ml，加热搅拌反应时间4小时，其余同实施例1。

(2)以内径100μm的玻璃毛细管为载体，浓硝酸冲洗15分钟，再用氢氟酸对毛细管蚀刻8小时。其余条件同实施例1。

(3)反应时间在1.5小时。其余条件同实施例1。

(4)用CuSO4溶液加载Cu²⁺，加载时间1小时，将新配制的胰蛋白酶溶液通过毛细管加载酶，时间1小时。其余条件同实施例1。

实施例3、(1)以硝脑三乙酸(nitrolotriacetic acid，NTA)为螯合剂，用量5g，γ-缩水甘油醚基丙三甲氧基硅烷1.5ml，加热搅拌反应时间8小时，其余同实施例1。

(2)以内径50μm的石英毛细管为载体，浓硝酸冲洗45分钟，再用氢氟酸对毛细管蚀刻16小时。其余条件同实施例1。

(3)反应时间在4小时。其余条件同实施例1。

(4)用CuSO4溶液加载Cu2+，加载时间3小时，将新配制的胰蛋白酶溶液通过毛细管加载酶，时间3小时。其余条件同实施例1。

实施例4、用实施例1制备的毛细管金属螯合型酶解微反应器进行蛋白质的肽分析，其方法如下：用0.01M NH₄HCO₃缓冲溶液配制1μM马心细胞色素C溶液，将此溶液加热20分钟去活，室温冷却。截取10cm的制备好的毛细管酶解微反应器，然后缓慢吸入样品溶液，将两端密封住，50℃保温15分钟。取0.5μlα-氰基-4-羟肉桂酸(CHCA)的丙酮水溶液点在清洗干净的样品耙上，冷风加速吹干，使基体首先在耙上形成一层均匀的薄膜，然后将毛细管酶解微反应器中的水解产物直接吹出点在基体膜层上，迅速吹干，点加CHCA的三氟乙酸(TFA)/乙腈溶液0.5μl，待其干燥后，用0.1％TFA溶液清洗1-3次，氮气吹干。送入质谱仪进行分析。所得质谱图见图1。

实施例5、用0.01M NH₄HCO₃缓冲溶液配制20nM马心细胞色素C溶液，此溶液加热30分钟，取1.5μl 2，5-二羟基苯甲酸的乙醇水溶液点在清洗干净的样品耙上，其余操作以及条件与实施例4相同。所得质谱图见图2。

实施例6、用0.01M NH₄HCO₃缓冲溶液配制1μM牛血清白蛋白溶液，取1.0μlα-氰基-4-羟肉桂酸(CHCA)的乙醇水溶液点在清洗干净的样品耙上，，其余操作以及条件与实施例4相同。所得质谱图见图3。

实施例7、毛细管金属螯合型酶解微反应器的再生：

用EDTA溶液冲洗毛细管，将毛细管酶解微反应器中的Cu²⁺和胰蛋白酶冲洗掉，然后用水冲洗净，按照实施例1中第(4)步所述的方法重新加载酶。再生后的毛细管金属螯合型酶解微反应器按照实施例4所述的分析方法检测马心细胞色素C的肽谱图见图4。

Claims

1、一种酶解微反应器的制备方法，其反应如下：

其具体步骤为：

1)采用羧甲基化氨衍生物作为螯合试剂，γ-缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷为偶联剂，先将螯合剂配制成pH＝11的水溶液，再加入偶联剂，加热搅拌反应4-8小时，配制生成带螯合基团的硅烷化试剂；

2)以石英或玻璃毛细管为载体，用浓硝酸冲洗后，氢氟酸或氟化氢铵溶液蚀刻；

3)将硅烷化试剂循环通过蚀刻的毛细管进行反应；

4)用硫酸铜溶液对硅烷化的毛细管加载Cu²⁺；

5)将胰蛋白酶溶液通过硅烷化的毛细管加载酶，用pH＝8的磷酸盐缓冲溶液将未螯合的胰蛋白酶冲洗干净，制得毛细管金属螯合型酶解微反应器。

2、如权利要求1所述的酶解微反应器的制备方法，其特征在于，步骤1)所述羧甲基化氨衍生物为亚氨基二乙酸、三羧甲基乙二胺、硝脑三乙酸或羧甲基化的天冬氨酸；加热搅拌时间为4-8小时。

3、如权利要求1所述的酶解微反应器的制备方法，其特征在于，步骤2)所述毛细管的为内径25-100μm，浓硝酸冲洗时间为15-45分钟，蚀刻时间为8-16小时。

4、如权利要求1所述的酶解微反应器的制备方法，其特征在于，步骤3)所述硅化烷反应时间为1.5-4小时。

5、如权利要求1所述的酶解微反应器的制备方法，其特征在于，步骤4)所述加载Cu²⁺时间为1-3小时。

6、如权利要求1所述的酶解微反应器的制备方法，其特征在于，步骤5)所述加载酶时间为1-3小时。

7、如权利要求1所述的制备方法制备出的酶解微反应器在肽谱分析中的一种应用，其具体方法为：

2)将含有基体的有机溶液点在样品耙上，干燥后在耙上形成一层薄膜，所述基体为α-氰基-4-羟基肉桂酸或2，5-二羟基苯甲酸；

8、如权利要求7所述的酶解微反应器的应用，其特征在于，所述有机溶液为丙酮或乙醇。

9、如权利要求1所述的制备方法制备出来的酶解微反应器的一种再生方法，其步骤为：

1)用EDTA溶液和水冲洗毛细管；

2)用硫酸铜溶液对硅烷化的毛细管加载Cu²⁺，加载时间为1-3小时；

4)用pH＝8的磷酸盐缓冲溶液将未螯合的胰蛋白酶冲洗干净。