CN118580373A - 一种TGF-β和TIGIT双特异性融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明公开一种TGF‑β和TIGIT双特异性融合蛋白及其用途，更具体地，本发明公开了一种包括TGF‑β受体部分和抗TIGIT部分的融合蛋白，本发明的融合蛋白可用于治疗肿瘤。

Description

一种TGF-β和TIGIT双特异性融合蛋白及其用途

本申请请求2023年3月1日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为202310195000.0，发明名称为“一种TGF-β和TIGIT双特异性融合蛋白及其用途”的中国专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入本申请。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及靶向TGF-β的融合蛋白及其应用。

背景技术

这里的陈述仅是提供与本披露有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。

免疫抑制性受体(IRs)在调节慢性病毒感染和癌症的固有和适应性免疫中发挥着重要的作用。在慢性抗原刺激下，T细胞功能失调或衰竭并上调许多IRs，包括程序性细胞死亡受体1(PD-1)和带有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。同时，肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APCs)在肿瘤微环境(TME)中表达IR配体，这导致肿瘤细胞可以逃避免疫监视。。

TIGIT(也称为WUCAM、Vstm3、VSIG9)是脊髓灰质炎病毒受体(PVR)/黏连蛋白家黏连蛋白家族(隶属于免疫球蛋白超家族)的成员，在淋巴细胞中表达，特别是在效应和调节性CD4+T细胞，滤泡辅助CD4+T细胞，效应CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞中高表达。TIGIT与DCs或肿瘤细胞上表达的CD155结合，诱导CD155磷酸化并触发信号级联反应，促进免疫耐受性DCs形成，抑制固有免疫和适应性免疫；还可以直接抑制CD8+T细胞效应，或TIGIT⁺Treg可以抑制CD8+T细胞，防止癌细胞清除。

TIGIT有几种抑制淋巴细胞活化的不同作用机制：首先，它是一种与共刺激受体CD226作用完全相反的抑制性受体，当TIGIT存在于淋巴细胞表面时，与CD226相比，它对其共同配体CD155的亲和力高于CD226，因此，TIGIT将会竞争性的优先与CD155结合，从而阻断CD226的共刺激效应；其次，TIGIT可以通过抑制CD226同源二聚体的形成，阻断CD226信号；此外，TIGIT的胞质尾部含有一种基于酪氨酸的免疫受体抑制基序(ITIM)，可能导致信号抑制，有研究表明这是TIGIT导致T细胞抑制的主要机制。

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β，TGF-β)属于调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，具有三种形式，包括TGF-β1/2/3。这一家族除TGF-β外，还有活化素(activins)、抑制素(inhibins)、缪勒氏管抑制质(Mullerian inhibitor substance,MIS)和骨形成蛋白(bone morpho-genetic proteins,BMPs)。TGF-β最初因为这种细胞因子能使正常的成纤维细胞转化成为非贴壁依赖性生长的细胞而得名，在细胞的生长、分化和免疫功能中都发挥重要的调节作用。TGF-β通过结合TGF-β受体(TGF-βI型受体(TGF-βRI，人TGF-βRI的GenBank登录号：L11695)和TGF-βII型受体(TGFβRII，人TGFβRII的GenBank登录号：M85079))来介导TGF-β信号传导。

机体多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β。在体外，非活性状态的TGF-β又称为latency associated peptide(LAP)，通过酸裂解可被活化。在体内，酸性环境可存在于骨折附近和正在愈合的伤口。蛋白本身的裂解作用可使TGF-β复合体变为活化TGF-β。TGF-β可以抑制丝裂原、同种异体抗原刺激的T细胞增殖或IL-2依赖的T细胞生长，也可以抑制IFN-γ诱导黑素瘤细胞MHCⅡ类抗原表达，并且，TGF-β还可以抑制PBMC中IFN-γ和TNF-α的产生，促进IL-6的表达。机体多数免疫细胞，包括B细胞、T细胞和树突状细胞，以及巨噬细胞，都分泌TGF-β，而TGF-β又通过其他细胞因子负调控免疫细胞的增殖、分化和激活。因此，TGF-β是一种有效的免疫抑制剂，TGF-β信号的紊乱会导致机体自身免疫、炎症和癌症出现。

肿瘤微环境中TGF-β增加与免疫逃逸相关，几种常见的癌症类型均表现出富含TGF-β的TME。TGF-β由癌细胞和TME中存在的其他几种细胞类型(包括Treg)产生。成纤维细胞，巨噬细胞和血小板也是肿瘤中重要的TGF-β生产者。TGF-β水平升高会阻止幼稚T细胞向Th1效应子表型分化，促进其向Treg亚型的转化，并抑制树突状细胞的抗原呈递功能。

发明内容

发明人通过大量实验研究，构建了一种融合蛋白，其包括结合TGF-β的TGF-β受体部分和结合TIGIT抗原的抗TIGIT抗体部分。在一些实施方案中，所述TGF-β受体部分直接或通过连接子连接抗TIGIT抗体重链或轻链的C端或N端；在一些实施方案中，所述TGF-β受体部分的C端与抗TIGIT抗体重链或轻链的N端连接。

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，所述TGF-β受体为TGFβRII多肽；在一些实施方案中，所述TGF-β受体为TGFβRII突变体片段，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端片段、柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段，其中，所述C-末端片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端的至多122个氨基酸(例如112、113、114、115、116、117、118、119、120、121或122个TGFβRII胞外结构域的C-末端的氨基酸残基)；所述柔性片段的N端与所述TGFβRII胞外结构域的N-末端片段的C端相连，所述柔性片段的C端与所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段的N端相连。

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端的112-122个氨基酸(例如112、113、114、115、116、117、118、119、120、121或122个TGFβRII胞外结构域的C-末端的氨基酸残基)，或在一些实施方案中，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端的112～117个氨基酸(例如112、113、114、115、116或117个TGFβRII胞外结构域的C-末端的氨基酸残基)；在一些实施方案中，所述TGFβRII胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为TGFβRII胞外结构域的N-端截短多肽；在一些实施方案中，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为TGFβRII胞外结构域的N-端截短连续14-23个(例如14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个)氨基酸残基的多肽，优选截短连续16-23个氨基酸残基的多肽；在一些实施方案中，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或SEQ IDNO：43所示多肽。

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的N末端的0～6个氨基酸；在一些实施方案中，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的N末端的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸；在一些实施方案中，所述TGFβRII胞外结构域的N-末端片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，所述柔性片段为含有G和/或S氨基酸的连接肽；在一些实施方案中，所述柔性片段为(GS)_XG多肽，其中，X优选为1至6的任意整数；或者，所述柔性片段选自(G_xS)_y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自0-6的整数；在一些实施方案中，所述柔性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：39所示；在一些实施方案中，所述TGFβRII突变体片段具有SEQ ID NO：3～5任一所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，所述抗TIGIT抗体包括重链可变区和轻链可变区；在一些实施方案中，所述抗TIGIT抗体，其中，

A)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：64中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：65中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；

B)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：66中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：67中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；

C)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：68中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：69中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；或

D)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：70中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：71中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；

在一些实施方案中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3由IMGT编号系统定义，或由Kabat编号系统定义，或由Chothia编号系统定义，或由Contact编号系统定义，或由AbM编号系统定义；

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，所述抗TIGIT抗体，其中，

A)所述抗TIGIT抗体的重链可变区HCDR1包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列；和轻链可变区LCDR1包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列；

B)所述抗TIGIT抗体的重链可变区HCDR1包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列；和轻链可变区LCDR1包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列；或

C)所述抗TIGIT抗体的重链可变区HCDR1包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列；和轻链可变区LCDR1包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列；

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，所述抗TIGIT抗体，其中，

A)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：64所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：65所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；

B)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：66所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：67所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；

C)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：68所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：69所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；或

D)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：70所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：71所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，所述抗TIGIT抗体包含恒定区，在一些实施方案中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ或λ链恒定区；在一些实施方案中，所述恒定区的种属来源为鼠或人；在一些实施方案中，所述重链恒定区选自人IgG1的重链恒定区，所述轻链恒定区选自人κ链恒定区；在一些实施方案中，所述重链恒定区选自鼠mIgG2a的重链恒定区，所述轻链恒定区选自鼠κ链恒定区.

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，所述抗TIGIT抗体，A)所述抗TIGIT抗体重链包含SEQ ID NO：58所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链包含SEQID NO：59所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；

B)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：44所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：45所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；

C)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：52所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：53所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；或

D)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：55所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：56所示或与其具有至少90％(例如85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，其中：

A)所述TGF-β受体部分的C端与抗TIGIT抗体的重链的N端直接或通过连接子连接；

B)所述TGF-β受体部分的N端与抗TIGIT抗体的重链的C端直接或通过连接子连接；

C)所述TGF-β受体部分的C端与抗TIGIT抗体的轻链的N端直接或通过连接子连接；和/或

D)所述TGF-β受体部分的N端与抗TIGIT抗体的轻链的C端直接或通过连接子连接；

在一些实施方案中，所述连接子为肽连接子；在一些实施方案中，所述连接选自(G_xS)_y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自0-6的整数；在一些实施方案中，所述连接子为SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：39所示连接子。

在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，其中所述TIGIT抗体部分包括重链可变区VH和重链恒定区CH，以及轻链可变区VL和轻链恒定区CL；在一些实施方案中，其中，

I)所述融合蛋白包括两条具有以下式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链，

(a):[VH]-[CH]，

(b):[VL]-[CL]-[L1]-[TGF-βR]，

[TGF-βR]-[L1]-[VL]-[CL],或

[TGF-βR-1]-[L1]-[VL]-[CL]-[L2]-[TGF-βR-2]；

II)所述融合蛋白包括两条具有以下式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链

(a):[TGF-βR]-[L1]-[VH]-[CH],

[VH]-[CH]-[L1]-[TGF-βR]，或

[TGF-βR-1]-[L1]-[VH]-[CH]-[L2]-[TGF-βR-2]，

(b):[VL]-[CL]；

III)所述融合蛋白包括两条具有以下式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链，

(a):[VH]-[CH]-[L1]-[TGF-βR]，

(b):[TGF-βR]-[L1]-[VL]-[CL],或[VL]-[CL]-[L1]-[TGF-βR]；或者

IV)所述融合蛋白包括两条具有以下式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链，

(a):[TGF-βR]-[L1]-[VH]-[CH]，

(b):[TGF-βR]-[L1]-[VL]-[CL],或[VL]-[CL]-[L1]-[TGF-βR]；

所述I)、II)、III)和IV)中，其中TGF-βR-1、TGF-βR-2、TGF-βR为TGF-β受体，所述式(a)和式(b)中的L1和L2为连接子，L1和L2优选为肽连接子；在一些实施方案中，所述L1、L2独立地选自(G_xS)_y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自0-6的整数；在一些实施方案中，所述L1、L2连接子如SEQ ID NO：12或39所示；

在一些实施方案中，所述融合蛋白，其中

A)所述第一链包括SEQ ID NO：47、49、50所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ IDNO：45所示的氨基酸序列；

B)所述第一链包括SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：46、48、51所示的氨基酸序列；

C)所述第一链包括SEQ ID NO：50、47所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；或者

D)所述第一链包括SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列；

E)所述第一链包括SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列；

F)所述第一链包括SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列；

G)所述第一链包括SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列；

H)所述第一链包括SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：61、62所示的氨基酸序列；或

I)所述第一链包括SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提出了一种制备前面任一项所述的融合蛋白以及TGFβRII突变体片段的方法。在一些实施方案中，所述TGFβRII突变体的氨基酸序列是从TGFβRII胞外结构域的N-末端开始，截短至少14个氨基酸，插入不超过20个氨基酸而得到。野生型TGFβRII碎片含量非常高，且在纯化过程中很难去除，影响药效，发明人经过大量的实验探索，根据本发明实施例的突变方式对TGFβRII胞外结构域的N-末端进行截短后，获得的TGFβRII突变体片段具有与TGF-β结合的生物活性，且所述片段不易解离，因此不容易被折断，包含所述片段的TGFβRII突变体同样具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中，其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性。

在一些实施方案中，本发明提出了一种TGFβRII突变体片段。根据本发明的实施例所述的方法制备获得的。根据本发明实施例，具有所述片段的TGFβRII突变体具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中，其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性。

在一些实施方案中，本发明提出了一种TGFβRII突变体及其制备方法，所述TGFβRII突变体包括胞外区、跨膜区和胞内区；所述方法包括：从TGFβRII胞外结构域的N-末端截短至少14个氨基酸，插入不超过20个氨基酸。鉴于现有技术制备的野生型TGFβRII碎片含量非常高，且在纯化过程中很难去除，影响药效，发明人经过大量的实验探索，根据本发明实施例的方法获得的TGFβRII突变体具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中，其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性。

在一些实施方案中，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面任一项所述的融合蛋白。

在一些实施方案中，本发明提出了一种表达载体。所述表达载体包含前面任一项所述的核酸分子。

在一些实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其含前面任一项所述的表达载体或核酸分子。本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞包含前面任一项所述的核酸分子或表达载体。

在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含前面任一项所述的融合蛋白、或核酸分子、或表达载体、或细胞；在一些实施方案中，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包括药学上可接受的辅剂，所述药学上可接受的辅剂包括稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂的至少之一；所述药物组合物呈片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、冻干制剂的至少一种。在一些实施方案中，所述药物组合物能够控制肿瘤细胞周围表达上调的TGF-β的含量，从而长效、有效的预防或治疗肿瘤。

在一些实施方案中，本发明提供前面任一项所述的融合蛋白、或所述的核酸分子、或所述的表达载体、或所述的细胞、或所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

在一些实施方案中，本发明提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的前面任一项所述的融合蛋白、或所述的核酸分子、或所述的表达载体、或所述的细胞、或所述的药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于治疗肿瘤的前面任一项所述的融合蛋白、或所述的核酸分子、或所述的表达载体、或所述的细胞、或所述的药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供一种制备前面任一项所述融合蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：1)前面任一项所述的表达载体；2)将所述表达载体导入宿主细胞中，获得重组细胞，以表达所述融合蛋白。

附图说明

为了更清楚地说明本公开实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本公开的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的TGFβRII突变体的结构示意图，其中，insertion表示插入的氨基酸序列，即：将TGFβRII胞外结构域的N-末端的第1至第X个氨基酸进行截短后、再插入柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段。

图2是根据本发明实施例的截短TGFβRII胞外结构域的N-末端、或截短后再插入柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段后得到的TGFβRII突变体形成的融合蛋白在纯化过程中所产生的碎片及高聚体的含量的结果图，其中：横坐标所示的各融合蛋白依次为WT、Trunc#1-Trunc#19、Trunc#21、Trunc#22；也即R0805:WT表示本发明表1中的融合蛋白WT、R0749:7-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#1、R0776:8-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#2、R0777:9-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#3、R0778:10-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#4、R0779:11-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#5、R0780:12-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#6、R0781:13-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#7、R0782:14-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#8、R0783:1-6+15-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#9、R0784:16-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#10、R0785:17-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#11、R0786:18-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#12、R0787:19-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#13、R0788:1-6+20-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#14、R0789:21-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#15、R0790:1-6+22-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#16、R0791:23-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#17、R0792:24-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#18、R0793:G4S5G+8-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#19、R0795:G4S5G+8-136mut表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#21、R0796:IP6+GSGSGSGSG+20-136表示本发明表1中的融合蛋白Trunc#22；横坐标所示的各融合蛋白只表示了TGFβRII突变体的突变方式，如，R0749:7-136表示该融合蛋白中TGFβRII突变体是将TGFβRII胞外结构域的N-末端的第1-6位氨基酸进行截短；R0796：1-6+GSGSGSGSG+20-136表示该融合蛋白中TGFβRII突变体是将TGFβRII胞外结构域的N-末端的第1-19位氨基酸进行截短，然后插入TGFβRII胞外结构域的N-末端的第1-6位氨基酸(IPPHVQ(SEQ ID NO：1))和柔性片段(GSGSGSGSG(SEQ ID NO：2))。

图3是根据本发明实施例的截短TGFβRII胞外结构域的N-末端后、再插入柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段得到的TGFβRII突变体形成的融合蛋白在纯化过程中所产生的碎片及高聚体的含量的结果图，其中，横坐标所示的各融合蛋白中TGFβRII突变体的具体突变方式见表1。

图4是根据本发明实施例的融合蛋白与人源TGF-β1的ELISA结合活性检测结果图。

图5是根据本发明实施例的融合蛋白阻断人源TGF-β1与TGF-βRⅡ的结合活性检测结果图。

图6是根据本发明实施例的截短TGFβRII胞外结构域的N-末端后得到的TGFβRII突变体形成的融合蛋白对T细胞增殖影响的实验结果图。

图7是根据本发明实施例的截短TGFβRII胞外结构域的N-末端后、再插入柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段得到的TGFβRII突变体形成的融合蛋白对T细胞增殖影响的实验结果图。

图8是双特异性融合蛋白的结构示意图。

图9是双特异性融合蛋白与CHO-mTIGIT细胞的结合活性结果图。

图10双特异性融合蛋白与JurkahTIGIT细胞的结合活性结果图。

图11双特异性融合蛋白与TGF-β1和TGF-β3蛋白的结合图，附图11中，R1097是无关靶点的mIgG2a抗体的重链C端通过连接子(G4S)4G连接野生型TGFβRII胞外结构域(SEQ IDNO：10)构建的分子，Trap control是无关靶点的人IgG1的重链C端通过连接子(G4S)4G连接野生型TGFβRII胞外结构域(SEQ ID NO：10)构建的分子。

图12双特异性融合蛋白对表达于CHO-TGF-βRⅡ细胞表面的TGF-βRⅡ与TGF-β结合的阻断检测结果。

图13抗TIGIT抗体R0226构建的双特异性融合蛋白双端同时结合的结合活性检测结果。

图14抗TIGIT人源化抗体构建的双特异性融合蛋白双端同时结合的结合活性检测结果。

图15抗TIGIT抗体R0226构建的双特异性融合蛋白解除TGF-β抑制T细胞增殖活性检测结果。

图16抗TIGIT人源化抗体构建的双特异性融合蛋白解除TGF-β抑制T细胞增殖活性检测结果。

图17抗TIGIT抗体R0226构建的双特异性融合蛋白抗体介导的细胞杀伤活性检测结果。

图18抗TIGIT人源化抗体构建的双特异性融合蛋白抗体介导的细胞杀伤活性检测结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明中，所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。另外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。术语“多个”的含义是至少两个，例如2个、3个、4个等，除非另有明确具体的限定。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物或氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸；常见的天然氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝胺酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。

在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，该术语涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体融合蛋白、三特异性抗体、四特异性抗体等)、鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单域抗体、全长抗体或其抗原结合片段(或称抗原结合部分)，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。

“天然抗体”指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个重链可变区(VH，又称作可变重域)，接着是重链恒定区(CH)，天然IgG重链恒定区通常包括三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个轻链可变区(VL，又称作可变轻域)，接着是一个轻链恒定区(CL，也称轻链恒定域)。

术语“全长抗体”或“完整抗体”指包含与天然抗体结构基本类似的结构，其重链包含Fc区的抗体。

术语“双特异性抗体融合蛋白”指能够对两个不同抗原或受体，或同一抗原的至少两个不同抗原表位特异性结合的抗体融合蛋白。现有技术已公开了各种结构的双特异性抗体融合蛋白，根据IgG分子的完整性可分为IgG样双特异性抗体融合蛋白和抗体片段型双特异性抗体融合蛋白，根据抗原结合区域的数量可分为二价、三价、四价或更多价的双特异性抗体融合蛋白，根据结构左右是否对称可分为对称结构双特异性抗体融合蛋白和不对称结构双特异性抗体融合蛋白。IgG样双特异性抗体融合蛋白(例如具有Fc片段)，这类抗体相对分子量较大，Fc片段有助于抗体后期的纯化，并提高其溶解性、稳定性，Fc部分还可能会与受体FcRn结合，增加抗体血清半衰期，典型的双特异性抗体融合蛋白结构模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、FcΔAdp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2:1TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等双特异性抗体融合蛋白(参见Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585–608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019Feb 11；2019:4516041)。本发明中，“TGF-β和TIGIT双特异性融合蛋白”是能够对TGF-β和TIGIT两个抗原特异性结合的抗体融合蛋白，例如由TGF-β受体部分和结合TIGIT抗原的抗TIGIT抗体部分连接而成的融合蛋白。

术语抗体“可变区”指抗体重链或轻链中涉及抗体结合抗原的区域。抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)各包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。“特异性结合TIGIT的抗体部分”是包含抗TIGIT抗体可变区的TIGIT抗体的部分；在一些实施方式中，抗TIGIT抗体可变区参见国际专利申请PCT/CN2022/120984中的抗TIGIT抗体的可变区(例如15H10L3的轻重链可变区)，本发明通过引用将PCT/CN2022/120984全文并入本发明。

术语“互补决定区”或“CDR”指可变区内主要促成与抗原特异性结合的区域；“框架”或“FR”是指除CDR残基之外的可变结构域残基。VH包含3个CDR区：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3个CDR区：LCDR1、LCDR2和LCDR3。每个VH和VL由从氨基末端(也称N末端)排到羧基末端(也称C末端)按以下顺序排列的3个CDR和4个FR构成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链中2个以上CDR。可以通过各种公知方案来确定CDR的氨基酸序列边界，例如：“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则、“ABM”编号规则、“contact”编号规则(参见Martin,ACR.Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003))等；各种编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。

术语“抗原结合片段”“抗原结合域”指包含完整抗体的部分，所述部分能够与完整抗体所结合的抗原特异性结合。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv(由VH和VL组成)、Fab(由一条轻链和一条重链的恒定区1(CH1)及重链可变区组成)、Fab'(由Fab区和铰链区组成)、Fab'-SH(Fab'片段的铰链区的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团)、(Fab')2(二聚化Fab')、scFv(单链抗体分子，由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过连接子连接)、scFab(单链Fab)、dsFv(二硫键稳定化的Fv片段)、(dsFv)2(二聚化dsFv)，VHH(单域抗体的重链可变区),以及由抗体结合片段形成的多特异性抗体。

术语“Fc区”用于定义抗体重链的C末端区域，包括天然Fc区和改造的Fc区。在一些实施方式中，用于本文所述抗体的Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2a、IgG2b)、IgG3和IgG4的Fc区。在一些实施方式中，Fc区为包含DLE突变的人IgG1。在一些实施方式中，Fc区的边界还可以变化，例如缺失Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)或缺失Fc区的C末端甘氨酸和赖氨酸(根据EU编号系统的残基446和447)。除非另有说明，Fc区的编号规则为EU编号系统，又称作EU索引。在一些实施方式中，Fc区的C末端赖氨酸残基(K)突变成丙氨酸(A)，以减少融合蛋白的切割水解。

术语“嵌合抗体”指抗体中，其重链和/或轻链的一部分源自一种物种，而重链和/或轻链的其它部分源自其它的物种。

术语“人源化抗体”是保留非人抗体的反应性，同时在人中具有较低免疫原性的抗体。例如，可以通过保留非人CDR区，其余部分用人源抗体对应物(即，恒定区以及可变区的框架区部分)替换来实现。

术语“人抗体”、“人源抗体”、“全人抗体”、“完全人抗体”可以互换使用，意指可变区及恒定区是人序列的抗体。

术语“连接子”、“Linker”或“接头”指连接两个多肽片段的连接单元，通常具有一定的柔性，接头的使用不会使蛋白质结构域原有的功能丧失。连接子可以是肽连接子，其包含一个或多个氨基酸，典型的约1-30个、2-24个或3-15个氨基酸。在一些实施方案中，所述连接子为选自(GxS)y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自0-6的整数，在一些实施方案中，所述连接子为选自(GxS)y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自1-6的整数。

术语“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合部位与其结合配体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总体的强度。除非另外指明，如本文所用，结合“亲和力”是指内部结合亲和力，其反映出结合对(例如，抗体与抗原)的成员之间1:1相互作用。分子X对其配体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量。术语“kassoc”或“ka”指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，术语“kdis”或“kd”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。术语“KD”指解离常数，其获得自kd与ka的比率(即kd/ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公知的方法测定抗体的KD值。例如，使用生物传感系统例如系统测量表面等离子体共振(例如Biacore)，或通过溶液平衡滴定法(SET)测量溶液中的亲和力。

术语“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列突变的Fc区)的生物学活性。抗体效应子功能的例子包括但不限于：C1q结合和补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

术语“单克隆抗体”指基本上均质的抗体的群，即在该群中包含的抗体分子的氨基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突变以外。相比之下，多克隆抗体制剂通常包含在其可变结构域具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，其通常特异性针对不同表位。“单克隆”表示从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。在一些实施方式中，本发明提供的抗体是单克隆抗体。

术语“抗原”是指能够由抗原结合蛋白(例如抗体)选择性结合剂结合的分子。抗原可具有一个或多个能够与不同的抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用的表位。

术语“表位”指能够与抗体特异性结合的抗原上的区域(area或region)。表位可以由连续氨基酸串(线性表位)形成或包含非连续氨基酸(构象表位)，例如因抗原的折叠(即通过蛋白质性质的抗原的三级折叠)而变成空间接近。构象表位和线性表位的差别在于：在变性溶剂的存在下，抗体对构象表位的结合丧失。构象表位包含处于独特空间构象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10个氨基酸。筛选结合特定表位的抗体(即那些结合相同表位的)可以使用本领域例行方法来进行，例如丙氨酸扫描，肽印迹，肽切割分析，表位切除，表位提取，抗原的化学修饰(见Prot.Sci.9(2000)487-496)，和交叉阻断。

与参照抗体结合相同表位的抗体或与参照抗体竞争结合的抗体意指在竞争测定法中，将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，或其对抗原的结合被参照抗体阻断50％或更多的抗体。例如，为了测定待测抗体是否与参照抗体结合相同表位，在饱和条件下容许参照抗体结合抗原，然后在去除过量的参照抗体后，评估待测抗体结合抗原的能力；如果该待测抗体能够在参照抗体的饱和结合之后结合抗原，那么可以得出结论，该待测抗体与参照抗体结合不同表位；而如果该待测抗体在参照抗体的饱和结合之后不能够结合抗原，那么该待测抗体可结合与参照抗体结合相同的表位。为了确认待测抗体是否结合相同表位，可以使用常规实验(例如，肽突变和使用ELISA、RIA、表面等离子共振、流式细胞术或本领域可获得的任何其它定量或定性抗体结合测定的结合分析)检测。在一些实施方案中，如在竞争性结合测定中所测量的(参见例如，Junghans等，Cancer Res.50(1990)1495-1502)，如果一个抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量抑制另一个抗体的结合至少50％、至少75％、至少90％或甚至99％或更多，则认为两个抗体结合相同或重叠的表位。

术语“能够特异性结合”、“特异性结合”或“结合”是指相比其他抗原或表位，抗体能够以更高的亲和力结合至某个抗原或该抗原内的表位。通常地，抗体以约100nM或更小(例如约100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或抗原内的表位。在一些实施方式中，抗体与抗原结合的KD为该抗体结合至非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10％或更低(例如1％)。可使用已知的方法来测量KD，包括但不限于Biacore测定法、Octet方法、微量热泳法、HPLC-MS方法和流式细胞荧光分选技术。

本发明提供的抗TIGIT抗体与TIGIT的结合也可以用“半最大有效浓度”(EC50)值表示，一般EC50越小亲和力越好，表示更低的浓度下即可以与抗原结合。可以通过本领域已知的结合检测法，例如直接或间接结合检测法(例如酶联免疫吸附检测法(ELISA)、流式细胞荧光分选技术和其他结合检测法)来测定EC50值。

“TGFβRII”是TGF-βII型受体，包括野生型及其突变体片段，TGFβRII通过与TGF-β结合介导TGF-β信号传导。野生型人TGFβRII细胞外自N端开始的一段长136个氨基酸残基的肽段具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，野生型TGFβRII胞外结构域序列：

IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVW RKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNP D(SEQ IDNO：10)。

在一些实施方式中，所述TGFβRII为中国专利申请202111026893.3、202111028163.7、202111026881.0、或202210476344.4及以中国专利申请202111026893.3、202111028163.7、202111026881.0、或202210476344.4作为优先权的PCT申请(例如PCT/CN2022/116320)或中国专利申请中所述的TGFβRII，这些专利全文通过引用并入本发明。

在一些实施方式中，本发明提供一种TGFβRII突变体片段，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端的至多122个氨基酸(例如112、113、114、115、116、117、118、119、120、121或122个TGFβRII胞外结构域的C-末端的氨基酸残基)；所述TGFβRII突变体片段进一步包括柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段。在一些实施方案中，发明人创造性的发现，根据本发明实施例的突变方式对TGFβRII胞外结构域的N-末端进行截短后，获得的TGFβRII突变体片段具有TGF-β结合的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中，TGFβRII突变体片段氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低，包含所述片段的TGFβRII突变体具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性。

根据本发明的一个具体的实施例，所述柔性片段的N端与所述TGFβRII胞外结构域的N-末端片段的C端相连，所述柔性片段的C端与所述TGFβRII胞外结构域的C-末端的至多122个(例如112、113、114、115、116、117、118、119、120、121或122个)氨基酸的N端相连。一些实施方式，所述柔性片段的C端与所述TGFβRII胞外结构域的C-末端的112、113、114、115、116、117、118、119或120个氨基酸的多肽的N端相连。

根据本发明的一些实施方式，所述TGFβRII突变体片段中，所述TGFβRII胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为TGFβRII胞外结构域的N-端截短多肽；在一些实施方式中，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为TGFβRII胞外结构域的N-端截短连续14-23个(例如14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个)氨基酸残基的多肽；在一些实施方式中，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为TGFβRII胞外结构域的N-端截短连续16-23个氨基酸残基的多肽；在一些实施方式中，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为TGF-βTrap(15-136)、TGF-βTrap(16-136)、TGF-βTrap(17-136)、TGF-βTrap(18-136)、TGF-βTrap(19-136)、TGF-βTrap(20-136)、TGF-βTrap(21-136)、TGF-βTrap(22-136)、TGF-βTrap(23-136)、TGF-βTrap(24-136)、或其突变序列，所述突变序列为在TGFβRII胞外结构域的C-末端片段上具有一个或多个氨基酸的取代，例如TGFβRII胞外结构域具有N18A和/或/N19A氨基酸取代；其中，TGF-βTrap(X-136)代表TGFβRII胞外结构域的第X至第136位氨基酸残基的多肽(所述位点为相对于SEQ ID NO：10的自然顺序编号，例如，TGF-βtrap(20-136)代表截断TGFβRII胞外结构域(SEQ ID NO：10)的N-末端的第1-19位氨基酸(也即只保留TGFβRII胞外结构域的第20-136位残基)的多肽)。在一些实施方式中，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43所示多肽。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的N末端的0～6个氨基酸。在一些实施方式中，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的N末端的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸；在一些实施方式中，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的N末端的6个氨基酸残基。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII胞外结构域的N-末端片段具有SEQID NO：1所示的氨基酸序列。IPPHVQ(SEQ ID NO：1)。

根据本发明的一个具体的实施例，所述柔性片段为含有G、S氨基酸的连接肽。在一些实施方式中，所述柔性片段为(GS)_XG多肽，其中，X优选为1至6的任意整数；在一些实施方式中，所述柔性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：39所示。

根据本发明的一个具优选的实施例，所述柔性片段含有5～15个氨基酸。

根据本发明的一个具体的实施例，所述柔性片段具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。GSGSGSGSG(SEQ ID NO：2)。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端的至多115个、至多117个氨基酸。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端的112～117个氨基酸。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端的112个、115个或117个氨基酸。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体片段具有SEQ ID NO：3～5任一所示的氨基酸序列。

IPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDE NITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ ID NO：3)。

IPPHVQGSGSGSGSGVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVW RKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNP D(SEQID NO：4)。

IPPHVQGSGSGSGSGVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENI TLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ ID NO：5)。

本发明提供一种TGFβRII突变体，包括胞外区、跨膜区和胞内区；其中，所述胞外区包括第一方面所述的TGFβRII突变体片段。

本发明提供一种制备前面所述的TGFβRII突变体片段的方法，所述TGFβRII突变体片段的氨基酸序列是从TGFβRII胞外结构域的N-末端截短至少14个氨基酸，插入不超过20个氨基酸而得到。在一些实施方式中，鉴于现有技术制备的TGFβRII碎片含量非常高，且在纯化过程中很难去除，影响药效，发明人经过大量的实验探索，根据本发明实施例的突变方式对TGFβRII胞外结构域的N-末端进行截短后，获得的TGFβRII突变体片段具有与TGF-β结合的生物活性，且所述片段不易解离，因此不容易被折断，包含所述片段的TGFβRII突变体同样具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中，其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体片段的氨基酸序列是对TGFβRII胞外结构域的N-末端截短14-23个(例如14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个)氨基酸而得到。发生突变的所述位点与制备TGFβRII过程中产生的碎片的含量具有一定的联系，因此，当截短14-23个氨基酸后，所述片段仍具有与TGF-β结合的生物活性，且制备所述TGFβRII突变体片段的过程中，其氨基酸序列不容易解离，因此碎片含量显著降低，提高了其成药性。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体片段的氨基酸序列是对TGFβRII胞外结构域的N-末端截短14-21个氨基酸而得到。当截短14-21个氨基酸后，获得的TGFβRII突变体片段仍具有与TGF-β结合的生物活性，且不容易解离，碎片含量显著降低，包含所述片段的TGFβRII突变体同样具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中，其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体片段的氨基酸序列是对TGFβRII胞外结构域的N-末端截短14个、19个、或21个氨基酸而得到。当截短14个、19个、或21个氨基酸后，获得的TGFβRII突变体片段仍具有与TGF-β结合的生物活性，且所述片段不容易解离，碎片含量显著降低，包含所述片段的TGFβRII突变体具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中其氨基酸序列不容易解离，碎片和高聚体含量均极显著降低、提高了其成药性。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体片段的氨基酸序列是在TGFβRII胞外结构域的N-末端插入不超过15个氨基酸而得到。当插入不超过15个氨基酸时，所述TGFβRII突变体在制备过程中其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性，且体内半衰期延长。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体片段的氨基酸序列是在TGFβRII胞外结构域的N-末端插入15个氨基酸而得到。当插入15个氨基酸时，所述TGFβRII突变体片段仍然具备与TGF-β结合的生物活性，其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低，包含所述片段的TGFβRII突变体在制备过程中其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性，且体内半衰期延长。

根据本发明的一个具体的实施例，所述插入的氨基酸片段包含TGFβRII胞外结构域的N-末端片段。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII胞外结构域的N-末端片段具有SEQID NO：1所示的氨基酸序列。IPPHVQ(SEQ ID NO：1)。

根据本发明的一个具体的实施例，所述插入的氨基酸片段还包含柔性片段。根据本发明的具体实施例，所述柔性片段不受特别限制，常规的柔性片段均可使用。

″柔性片段″是指含有由肽键连接的2个或更多个氨基酸残基、并且为其连接的2个多肽(例如TGFβRII胞外结构域的N-末端片段、TGFβRII胞外结构域的C-末端片段)提供更大转动自由度的肽。

根据本发明的一个具体的实施例，所述柔性片段具有SEQ ID NO：2所示(GSGSGSGSG)的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述柔性片段为如SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：39所示的多肽。

根据本发明的一个具体的实施例，所述柔性片段的N端与TGFβRII胞外结构域的N-末端片段的C端相连，所述柔性片段的C端与截短后剩余的TGFβRII胞外结构域N-末端的N端相连。

根据本发明的一个具体实施例，所述SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列排列在所述TGFβRII胞外结构域的N-末端片段之后(例如，当TGFβRII胞外结构域的N-末端氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示时，所述插入的片段为：IPPHVQGSGSGSGSG(SEQ ID NO：11))。所述TGFβRII突变体在制备过程中其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性，且体内半衰期延长。

本发明提供一种TGFβRII突变体片段，是通过前面所述的制备TGFβRII突变体的方法制备获得的。

根据本发明的具体实施例，制备TGFβRII时易产生碎片和TGFβRII的氨基酸序列中某些位点易被折断具有紧密的联系，因此，采用本发明具体实施例所提供的方法，在制备TGFβRII突变体片段时可以采用将TGFβRII胞外结构域的N-末端易被折断或解离的位点截短和/插入的方式获得生产过程中碎片和高聚体含量低的TGFβRII突变体片段，生产包含所述TGFβRII突变体片段的TGFβRII突变体过程中，其高聚体以及碎片含量依然较低。

本发明提供一种制备前面所述的TGFβRII突变体的方法，所述TGFβRII突变体包括胞外区、跨膜区和胞内区；所述方法包括：从TGFβRII胞外结构域的N-末端截短至少14个氨基酸，插入不超过20个氨基酸。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体可以从TGFβRII胞外结构域的N-末端截短14-23个氨基酸而得到。发生突变的所述位点与制备TGFβRII过程中产生的碎片的含量具有一定的联系，因此，当截短14-23个氨基酸后，获得的TGFβRII突变体具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中，其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体是从TGFβRII胞外结构域的N-末端截短14-21个氨基酸而得到。当截短14-21个氨基酸后，获得的TGFβRII突变体具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中，其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体的氨基酸序列是对TGFβRII胞外结构域的N-末端截短14个、19个、或21个氨基酸而得到。当截短14个、19个、或21个氨基酸后，获得的TGFβRII突变体具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在制备TGFβRII突变体的过程中其氨基酸序列不容易解离，碎片和高聚体含量均极显著降低、提高了其成药性。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体的氨基酸序列是在TGFβRII胞外结构域的N-末端插入不超过15个氨基酸而得到。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII突变体的氨基酸序列是在TGFβRII胞外结构域的N-末端插入15个氨基酸而得到。当插入15个氨基酸时，所述TGFβRII突变体在制备过程中其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性，且体内半衰期延长。

根据本发明的一个具体的实施例，所述插入的氨基酸片段包含TGFβRII胞外结构域的N-末端片段。

根据本发明的一个具体的实施例，所述TGFβRII胞外结构域的N-末端片段具有SEQID NO：1所示的氨基酸序列。

根据本发明的一个具体的实施例，所述插入的氨基酸片段还包含柔性片段。根据本发明的具体实施例，所述柔性片段不受特别限制，常规的柔性片段均可使用。

根据本发明的一个具体的实施例，所述柔性片段具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述柔性片段为如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：39所示的多肽。

根据本发明的一个具体的实施例，所述柔性片段的N端与TGFβRII胞外结构域的N-末端片段的C端相连，所述柔性片段的C端与截短后剩余的TGFβRII胞外结构域N-末端的N端相连。

根据本发明的一个具体实施例，所述SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列排列在所述TGFβRII胞外结构域的N-末端片段之后(例如，当TGFβRII胞外结构域的N-末端氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示时，所述插入的片段为：IPPHVQGSGSGSGSG(SEQ ID NO：11))。此时，所述TGFβRII突变体在制备过程中其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性，且体内半衰期延长。

本发明提供一种TGFβRII突变体，是通过前面所述的方法制备获得的。

根据本发明的具体实施例，制备TGFβRII时易产生碎片和TGFβRII的氨基酸序列中某些位点易被折断具有紧密的联系，因此，采用本发明具体实施例所提供的方法，在制备TGFβRII突变体时可以采用将TGFβRII胞外结构域的N-末端易被折断或解离的位点截短和/插入的方式获得生产过程中碎片和高聚体含量低的TGFβRII突变体。

根据本发明的一个具体的实施例，本发明的融合蛋白，所述连接肽的N端与所述抗体Fc区的C端相连，所述连接肽的C端与所述的TGFβRII突变体片段的N端相连。根据本发明的一个具体的实施例，所述抗体Fc区来源于人源IgG抗体分子。根据本发明的一个具体的实施例，所述抗体Fc区包含hIgG1抗体的Fc。根据本发明的一个具体的实施例，所述抗体Fc区的C末端的赖氨酸突变为丙氨酸。将赖氨酸突变为丙氨酸后，能够减少融合蛋白的切割水解，从而降低制备融合蛋白过程中碎片的含量。根据本发明的一个具体的实施例，所述抗体Fc区具有如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGA(SEQ ID NO：6)；

根据本发明的一个具体的实施例，所述抗体Fc区的N末端添加精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(例如，RGDRGD(SEQ ID NO：53))，可提高融合蛋白结合细胞表面整合素能力，根据本发明的一个具体的实施例，所述抗体Fc区具有如SEQ ID NO：54所示氨基酸序列：

RGDRGDDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGA(SEQ ID NO：54)

根据本发明的一个具体的实施例，所述连接肽为柔性连接肽。所述连接肽不受特别限制，本领域常规的柔性片段均可使用。

根据本发明的一个具体的实施例，所述连接肽包含(G₄S)_XG氨基酸序列，其中，X为大于0的整数。在一些实施方式中，所述连接肽为(G₄S)_XG多肽，其中，X优选为1至6的任意整数。在一些实施方式中，所述连接肽为如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：39所示的多肽。

根据本发明的一个具体的实施例，所述连接肽包含(G₄S)₄G(SEQ ID NO：12)序列。

根据本发明的一个具体的实施例，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO：7～9任一所示的氨基酸序列。

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ ID NO：7)。

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ ID NO：8)。

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ ID NO：9)。

本发明提供一种融合蛋白，其包括结合TGF-β的TGF-β受体部分和结合TIGIT抗原的抗TIGIT抗体部分。在一些实施方案中，所述TGF-β受体部分直接或通过连接子连接抗TIGIT抗体重链或轻链的C端或N端；在一些实施方案中，所述TGF-β受体部分的C端与抗TIGIT抗体重链或轻链的N端连接。在一些实施方案中，所述TGF-β受体为TGFβRII多肽；TGFβRII可选自中国专利申请202111026893.3、202111028163.7、202111026881.0、或202210476344.4及以中国专利申请202111026893.3、202111028163.7、202111026881.0、或202210476344.4作为优先权的PCT申请或中国专利申请中所述的TGFβRII，这些专利全文通过引用并入本发明。

在一些实施方案中，本发明提供融合蛋白，所述抗TIGIT抗体可选自WO2016191643A2或WO2022105872A1中所述的抗TIGIT抗体或其人源化抗体(例如中国专利申请202111123523.1及以中国专利申请202111123523.1作为优先权的PCT申请或中国专利申请中所述的抗TIGIT抗体)，这些专利全文通过引用并入本发明。在一些实施方案中，前面任一项所述融合蛋白，所述抗TIGIT抗体包括重链可变区和轻链可变区；在一些实施方案中，所述抗TIGIT抗体，其中，A)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：64中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：65中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；B)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：66中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：67中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；C)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：68中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：69中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；或D)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：70中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：71中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。

术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被靶细胞与具有裂解活性的效应细胞(诸如自然杀伤细胞(NK)、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)发生的相互作用。例如，NK细胞表达FcγRIIIa，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa。本文提供的抗体的ADCC活性可使用体外测定，使用表达抗原的细胞作为靶细胞和NK细胞作为效应细胞进行评定。根据从裂解的细胞中释放的标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白)来检测细胞裂解。

术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“ADCP”)是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。

术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的Fc效应域结合并激活补体成分C1q，C1q继而激活补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的激活也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)来促进CDC。

术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。编码多肽或融合蛋白的分离的核酸指编码多肽或融合蛋白的一个或更多个核酸分子，包括在单一载体或分开的载体中的这样的一个或更多个核酸分子，和存在于宿主细胞中一个或更多个位置的这样的一个或更多个核酸分子。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，如下详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语序列“同一性”指，当对两条序列进行最佳比对时(必要时引入间隙，以获取最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分)，两条序列的氨基酸/核酸在等价位置相同的程度(百分比)。为测定序列同一性百分比，比对可以通过本领域技术已知的技术来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。

术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接附加的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体(AAV或AAV2)，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。术语“表达载体”或“表达构建体”是指可对宿主细胞进行转化，且含有指导和/或控制(连同宿主细胞一起)与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译且在存在内含子时影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞包括原核和真核宿主细胞，其中真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞系植物细胞和真菌细胞。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞和HEK-293细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、海藻毕赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(Pichia koclamae)、膜状毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母(Pichiaopuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酿酒酵母属、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、勒克氏菌(Chrysosporium lucknowense)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusarium gramineum)、菜镰刀菌(Fusariumvenenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。毕赤酵母属、任何酿酒酵母属、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、任何克鲁维酵母属、白色念珠菌(Candida albicans)、任何曲霉属、里氏木霉(Trichoderma reesei)、勒克霉菌(Chrysosporium lucknowense)、任何镰刀菌属、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。

如在本申请中所使用的，“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，并且所有这样的名称均包括子代。词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来源于其的培养物，而与传代的次数无关。还应理解的是，由于有意或无意的突变，使得并非所有子代均具有完全相同的DNA内容物。包括与筛选出其的原始转化细胞具有相同功能或生物活性的突变子代。

在一些实施方案中，本发明供一种核酸分子，所述核酸分子编码前面所述的融合蛋白。根据本发明具体实施例的核酸分子编码的所述融合蛋白具有与野生型TGFβRII一致的生物活性，且在融合蛋白的制备过程中其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性及体内半衰期，所述融合蛋白能够控制肿瘤细胞周围表达上调的TGF-β的含量，从而长效、有效的预防或治疗肿瘤。

在一些实施方案中，本发明提供一种表达载体。根据本发明具体实施例的表达载体包含前面所述的编码融合蛋白的核酸分子。在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。

根据本发明的一个具体的实施例，所述表达载体为真核表达载体。

本发明提供一种重组细胞，根据本发明具体实施例的重组细胞携带前面所述的编码融合蛋白的核酸分子、或表达载体。根据本发明的具体实施例的重组细胞能够表达前面所述的融合蛋白，且在融合蛋白的制备过程中其氨基酸序列不容易解离，碎片含量显著降低、提高了其成药性及体内半衰期，所述融合蛋白能够控制肿瘤细胞周围表达上调的TGF-β的含量，从而长效、有效的预防或治疗肿瘤。

根据本发明的一个具体的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞，如：人HEK-293F细胞或CHO-K1细胞。

根据本发明的一个具体实施例，所述重组细胞不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。

根据本发明的一个具体的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞，哺乳动物例如人、猴、兔、犬、牛等；哺乳动物细胞如：如：人HEK-293F细胞或CHO-K1细胞。

根据本发明的一个具体实施例，所述重组细胞不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。

在一些实施方案中，本发明的肿瘤可以是非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌或胃癌等等。

术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述的抗体等活性成分与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。

术语“药学上可接受的载体”指药学配制剂中与活性成分不同的成分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语“受试者”或“个体”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类(例如，食蟹猴)、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。如本文所使用的，术语“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“施用”或“给予”，当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。

术语“样本”是指从受试者分离的类似流体、细胞、或组织的采集物，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本为生物流体，诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等，组织活检样本、细针穿刺、手术切除的组织、器官培养物或细胞培养物。

“治疗(treatment或treat)”指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。

“有效量”一般是足以降低症状的严重程度及/或频率、消除这些症状及/或潜在病因、预防症状及/或其潜在病因出现及/或改良或改善由疾病状态引起或与其相关的损伤(例如肺病)的量。在一些实施例中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以治疗疾病状态或症状、尤其与该疾病状态相关的状态或症状，或者以其他方式预防、阻碍、延迟或逆转该疾病状态或以任何方式与该疾病相关的任何其他不理想症状的进展的量。完全治疗或预防效未必在给予一个剂量之后便发生，可能在给予一系列剂量之后发生。因而，治疗或预防有效量可以一次或多次给予的方式给予。“治疗有效量”和“预防有效量”可取决于多种因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括例如患者改善的健康状况。

在本发明公开了抗体的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员可以采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体，其均属于本发明的保护范围。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明制备厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1.TGFβRII trap融合蛋白的制备和分析

实施例1.1制备TGFβRII trap融合蛋白

利用同源重组技术，以(G₄S)₄G(SEQ ID NO：12)作为连接肽，将hIgG1抗体的Fc重链片段(SEQ ID NO：6)的C末端与不同突变形式(表1)的TGFβRII突变体片段连接，得到TGFβRII trap融合蛋白。在融合结合处，将hIgG1抗体的Fc重链片段的C末端的赖氨酸残基(K)突变成丙氨酸(A)(得到SEQ ID NO：6所示的序列)，以减少融合蛋白的切割水解。

对于TGFβRII trap融合蛋白，采用瞬时转染或稳定转染的标准方案，用位于相同表达载体或分开的表达载体中的编码Fc-TGFβRII受体的DNA来转染哺乳动物细胞，瞬时转染人HEK-293F细胞制备TGFβRII trap融合蛋白，稳定转染CHO-K1细胞制备TGFβRII trap融合蛋白，得到TGFβRII trap融合蛋白。

TGFβRII突变体的结构示意图如图1所示。不同突变形式的TGFβRII突变体形成的TGFβRII trap融合蛋白如表1所示。

表1

备注：表1中，Fc代表抗体Fc区(SEQ ID NO：6)；(G₄S)₄G代表序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO：12)、(G₄S)₅G代表序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO：39)；TGF-βTrap(WT)代表野生型TGFβRII胞外结构域的氨基酸序列(SEQ IDNO：10)；TGF-βtrap(X-136)代表TGFβRII胞外结构域的第X至第136位氨基酸残基的多肽(所述位点为相对于SEQ ID NO：10的自然顺序编号，下同)，例如，TGF-βtrap(20-136)代表截短TGFβRII胞外结构域的N-末端的第1-19位氨基酸(也即只保留TGFβRII胞外结构域的第20-136位残基)的多肽，TGF-βtrap(8-136，N10G/N11G/N18A/N19A)代表截短TGFβRII胞外结构域的N-末端的第1-7位氨基酸(也即只保留TGFβRII胞外结构域的第8-136位残基)，同时对第10位、11位、18位和19位(所述突变位点为相对于SEQ ID NO：10的自然顺序编号)进行N10G、N11G、N18A、N19A氨基酸突变后的多肽；IP(XXX)表示TGFβRII胞外结构域的N-末端的前XXX位，例如IP0、IP3、IP6、IP9、IP12依次代表TGFβRII胞外结构域的N-末端的前0位、前3位、前6位、前9位、前12位氨基酸；GS9代表连接肽(SEQ ID NO：2)；SA6代表序列GGGGSA(SEQID NO：32)；EG14代表序列EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO：36)；AE17代表序列AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO：37)；QF18代表序列KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：38)；另外，表1中的“截短/插入氨基酸个数”，该列的数值为对应的融合蛋白中，IP(XXX)+TGF-βtrap(X-136)+连接肽(连接IP(XXX)和TGF-βtrap(X-136)的多肽)的氨基酸个数与野生型TGFβRII胞外结构域(SEQ ID NO：10)的氨基酸个数的差值，例如Fc-(G4S)4G-IP6-GS9-TGF-βTrap(20-136)融合蛋白中IP6-GS9-TGF-βTrap(20-136)的氨基酸个数为132，其比野生型TGFβRII胞外结构域少4个氨基酸，因此，其对应的“截短/插入氨基酸个数”为-4。

TGF-βtrap(X-136)代表TGFβRII胞外结构域的第X至第136位氨基酸序列，示例性地，

TGF-βtrap(20-136)的氨基酸序列为(SEQ ID NO：41)：

GAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD；

TGF-βtrap(15-136)的氨基酸序列为(SEQ ID NO：42)：

VTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD；

TGF-βtrap(22-136)的氨基酸序列为(SEQ ID NO：43)：

VKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

实施例1.2TGFβRII trap融合蛋白纯化

将实施例1瞬时转染人HEK-293F细胞所获得的制备TGFβRII trap融合蛋白的人HEK-293F细胞培养液、以及稳定转染CHO-K1细胞获得的能够制备TGFβRII trap融合蛋白的CHO-K1细胞培养液分别进行高速离心后收集上清液。

将收集到的上清液利用亲合层析进行第一步纯化，其中，层析介质为可与Fc相互作用的Protein A或者衍生填料，如GE的Mabselect；平衡缓冲液为1×PBS，平衡5倍管柱体积后，将细胞上清液上样与层析介质进行结合，流速控制为样品在亲和层析管柱上的保留时间≧1min。上样结束后，用1×PBS(pH7.4)冲洗管柱，记录紫外光波长为280nm时的光吸收值，直至A280紫外吸收降至基线。然后用0.1M甘胺酸(pH为3.0)的洗脱缓冲液冲洗层析管柱，根据A280紫外吸收峰收集洗脱峰，收集的洗脱样品用1M Tris(pH 8.5)进行中和。

将上述中和后的洗脱样品超滤装置浓缩后进行体积排阻层析，其中，体积排阻层析的缓冲液为1×PBS，层析管柱为XK26/60Superdex200(GE)，流速控制在4mL/min，上样体积小于5mL，根据A280紫外吸收合并目的蛋白峰，收集的TGFβRII trap融合蛋白经SEC-HPLC鉴定纯度。

实施例1.3TGFβRII trap融合蛋白截短分析

发明人对SEC-HPLC结果显示的不同TGFβRII trap融合蛋白纯化过程中的高聚体和碎片进行了分析。

截短TGFβRII胞外结构域的N-末端、或截短后再插入柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段后得到的TGFβRII突变体形成的融合蛋白在纯化过程中所产生的碎片及高聚体的含量的结果如图2所示，可以看到：截短数量从6个氨基酸增加到13个氨基酸过程中，高聚体含量增加了7％；截短数量增加到15个氨基酸时，高聚体含量增加了13％；截短数量增加到20个氨基酸，高聚体含量增加到20％以上；同时，发明人观察到当截短6～15个氨基酸时，碎片含量变化并不明显；但是当截短16～23个氨基酸时，碎片含量明显减少。因此，截短范围为16～23个氨基酸时，能够有效减少碎片含量。

实施例1.4TGFβRII trap融合蛋白的插入改造分析

在图2中，一个值得注意的现象是，与WT相比，将TGFβRII胞外结构域的N-末端的第1-19位氨基酸进行截短，然后插入TGFβRII胞外域的N-末端的第1-6位氨基酸(IPPHVQ(SEQID NO：1))和柔性片段(GSGSGSGSG(SEQ ID NO：2))后，得到的TGFβRII trap融合蛋白(Trunc#22)，不但没有碎片，高聚体也降低很多。因此，发明人针对Trunc#22的结构进行了进一步研究，分别对保留部分、插入部分和截短部分的组合进行了优化。

首先，对于TGFβRII Trap的N-末端保留部分的探索，发明人尝试保留TGFβRIITrap的N-末端的前1～12个氨基酸进行比较(Trunc#22、Trunc#23、Trunc#25、Trunc#26、Trunc#27)。

截短TGFβRII胞外结构域的N-末端后、再插入柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段得到的TGFβRII突变体形成的融合蛋白在纯化过程中所产生的碎片及高聚体的含量的结果如图3所示，可以看到：相较于只截短的对照组Trunc#31，Trunc#22、Trunc#23、Trunc#25、Trunc#26、Trunc#27这5个重组蛋白分子高聚体明显减少；且随着保留的氨基酸数量增加，碎片逐渐增多，从2.8％增加到10％以上。其中，Trunc#22的碎片含量较少，同时高聚体含量也得到有效控制，少量高聚体在后续纯化过程中可以有效去除。

此外，为了验证保留序列是否必须为TGFβRII胞外结构域的N-末端氨基酸序列，发明人尝试了其他序列，如GGGSAG(Trunc#24)。

结果如图3所示，可以看到：相较于Trunc#22，Trunc#24出现了5％的碎片，同时高聚体也明显增加；说明保留序列选择TGFβRII胞外结构域的N-末端片段(IPPHVQ(SEQ IDNO：1))效果较佳。

其次，对于插入部分的探索，发明人尝试了多种序列，包括不同长度的柔性linker、刚性linker和随机序列，其中，Trunc#32中插入序列为柔性linker、Trunc#33中插入序列为刚性linker、Trunc#34插入序列为随机序列。

结果如图3所示，Trunc#32和Trunc#33的插入使得碎片含量和高聚体含量都大幅度增加，Trunc#34的插入高聚体含量较少，但是碎片含量相较于野生型TGFβRII没有明显改善。说明插入部分只能是柔性片段，并且插入部分的长度要小于14个氨基酸。

最后，为了验证在保留段、插入段与Trunc#22相同情况下，最优的截短组合，发明人构建了Trunc#35和Trunc#36。

结果如图3所示，可以看到：相较于野生型TGFβRII，Trunc#35和Trunc#36的碎片含量都有所降低，并且Trunc#36的碎片含量更少；相较于Trunc#28和Trunc#31，Trunc#35和Trunc#36的高聚体含量明显减少，并且Trunc#35的高聚体含量较Trunc#36更少。因此，Trunc#35、Trunc#36和Trunc#22都能解决表达过程中碎片和高聚体的问题，其中以Trunc#22效果最佳。

实施例1.5TGFβRII trap融合蛋白的ELISA结合检测

TGFβRII Trap融合蛋白Trap端结合检测所用蛋白为human TGF-β1(CA59，购自Novoprotein)，检测流程如下：

a.用1×磷酸盐缓冲液(PBS)稀释TGF-β1至0.5μg/mL，100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；

b.250μL 1×PBST(PBS+0.5％ Tween20)洗涤3次，加入200μL含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS室温封闭1小时；

c.250μL 1×PBST洗涤3次，加入梯度稀释的TGFβRII trap，室温孵育2小时；

d.250μL 1×PBST洗涤3次，每孔加入100μL稀释好的Goaanti-human Fc-HRP藕联抗体(Sigma，1:15k)，室温孵育1小时；

e.250μL 1×PBST洗涤3次，每孔加入100μL TMB显色液，室温避光孵育10分钟，加入50μL 2NH₂SO₄终止反应；

f.用iX3酶标仪(Molecular Device公司)读取450nM处的吸收值，分析作图。

融合蛋白与人源TGF-β1的ELISA结合活性检测结果如图4所示，可以看出：所有TGFβRII Trap都能够结合包被在板上的TGF-β1，并且截短改造均不影响TGFβRII与TGF-β1的结合。

实施例1.6TGFβRII trap融合蛋白的阻断活性检测

TGFβRII Trap融合蛋白Trap端结合检测所用蛋白为human TGF-β1(CA59，购自Novoprotein)，检测流程如下：

构建稳定转染表达人TGFβRII的CHO细胞(CHO-hTGFβRII)，挑取单克隆建系。采用如下方法对抗TGFβRII trap的阻断活性进行检测：

a.对CHO-hTGFβRII细胞进行计数，将细胞以2×10⁵每孔的密度铺至96孔U底板；

b.将铺好的CHO-hTGFβRII细胞于300g、4℃条件下离心处理5分钟，弃上清液。

c.用含1％ BSA的1×PBS稀释步骤b中获得的含有TGFβRII trap融合蛋白的沉淀，起始浓度为50nM，稀释倍数为4倍，共设置8个梯度，同时也对TGF-β1-biotin(购自Acrobiosystem)进行稀释，稀释后的浓度为1μg/mL。

d.将融合蛋白稀释液和TGF-β1-botin稀释液按1:1的体积比例混匀，室温下放置30min。

e.将步骤d获得的混合样品加入CHO-TGF-βRⅡ细胞中，100μL/孔，于4℃放置30min后，在室温、300g的条件下离心处理5min，甩去上清液。

f.向步骤e获得的产物中加入SA-PE(400倍稀释，Jackson immunoresearch，016-110-084)，添加体积为100μl/孔，轻微混匀，于4℃条件下放置1小时后，于室温、300g的条件下离心处理5min，甩去上清液；将获得的细胞中加入含1％ BSA的1×PBS，100μl/孔，重悬细胞，流式上机检测。

融合蛋白阻断人源TGF-β1与TGF-βRⅡ的结合活性检测结果如图5所示，截短TGFβRII Trap融合蛋白均能够抑制TGF-β1结合到TGF-βRⅡ，从EC50值来看，阻断能力与野生型TGFβRII Trap基本没有太大的差异。

实施例1.7T细胞增殖抑制试验

研究表明TGF-β1会明显抑制T细胞的增殖，为了检测不同改造的TGFβRII Trap融合蛋白Trap端在细胞水平的功能，我们检测了在TGF-β存在情况下，不同改造的TGFβRIITrap融合蛋白对T细胞增殖的影响。实验采用如下示例性方法：

a.使用人淋巴细胞分离液密度梯度离心从健康志愿者的全血中，分离外周血单个核细胞(PBMC)，使用人T细胞富集试剂盒(STEMCELL，10951)，根据说明从PBMC中分离T细胞，使用CFSE(eBioscience，85-65-0850-84)对T细胞进行染色，具体操作参考试剂说明书，CFSE的使用浓度为1M；

b.将TGFβRII Trap融合蛋白、CD3/CD28 beads(life，40203D)和经CFSE染色后的T细胞进行共孵育，T细胞的数量为5×10⁴个/孔，CD3/CD28 beads与T细胞的体积比例为1:5，在培养箱进行培养；

c.将步骤所述的T细胞培养至第五天后，流式检测T细胞的CFSE值，算出T细胞在每一代中所占的比例，主要观测最左侧的峰。

截短TGFβRII胞外结构域的N-末端后得到的TGFβRII突变体形成的融合蛋白对T细胞增殖影响的实验结果如图6所示，不加抗体组(No TGF&No Ab组)刺激后，增殖比例约为15.4％，加入TGF-β1后，增殖比例约为2.44％，产生了明显的增殖抑制。截短TGFβRII胞外结构域的N-末端的氨基酸序列后得到的TGFβRII突变体对应的融合蛋白加入后，增殖比例从2.44％明显增加，增加至5.98％～17.56％，并呈现出浓度依赖关系。其中，Trunc#1、Trunc#2、Trunc#6、Trunc#9、Trunc#14、Trunc#22组相较于WT组展现出更好促进T细胞增殖的效果；同时，Trunc#3、Trunc#7、Trunc#8、Trunc#11、Trunc#13、Trunc#15～Trunc#18组促进T细胞增殖的效果弱于WT组。

发明人进一步评估了插入柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段后得到的TGFβRII突变体对应的TGFβRII Trap融合蛋白的活性。

截短TGFβRII胞外结构域的N-末端后、再插入柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段得到的TGFβRII突变体形成的融合蛋白对T细胞增殖影响的实验结果如图7所示，其中，Trunc#25、Trunc#32、Trunc#35、Trunc#36相较于WT组展现出更好促进T细胞增殖的效果；Trunc#14、Trunc#22组作为对照，图7所示结果与图6所示结果一致，Trunc#14和Trunc#22相较于WT组展现出更好的促进T细胞增殖的效果。

实施例2.双特异性融合蛋白的制备

采用前面实施例1所述的TGFβRII作为融合蛋白中免疫调节分子部分，将抗TIGIT抗体(WO2016191643A2或WO2022105872A1中所述的抗TIGIT抗体或其人源化抗体，例如中国专利申请202111123523.1及以其作为优先权的中国专利申请或PCT申请(PCT/CN2022/120984)中所述的抗TIGIT人源化抗体，上述这些专利的全文通过引用并入本发明)所述的抗TIGIT抗体)作为融合蛋白的靶向部分，以(Gly4Ser)4G作为连接序列。将抗TIGIT抗体和TGFβRII胞外结构域连接，连接位置包括轻链和/或重链的N端和/或C端，连接形成Anti-TIGITGFβRII胞外区融合蛋白(anti-TIGITGFβRII trap)。

当TGFβRII连接处位于重链C端时，在融合结合处抗体重链的C末端赖氨酸残基(K)被突变成丙氨酸(A)，减少融合蛋白的切割水解。对于融合蛋白采用瞬时或稳定转染的标准方案用位于相同表达载体或分开的表达载体中的编码轻链的DNA和编码重链的DNA来转染哺乳动物细胞。

将构建表达的质粒瞬时转染人胚肾HEK 293细胞，分离纯化细胞产生的融合蛋白，其在非还原条件下于SDS-PAGE上的条带分子量约为170kD和203kD。

构建的双特异性融合蛋白的结构示意图见附图8，示例性地，

抗TIGIT抗体R0226及其构建的双特异性融合蛋白的重/轻链序列：

R0226重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)

QVQLESEGGLFKPTDTLTLTCTVSGSSLSSSYMSWVRQAPGKGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTTEDTATYFCARGGYRTSGMDPWGPGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

R0226轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)

DIVMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYDALKLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISGVESADAATYYCQQEHSVGNVDNVFGGGTEVVVKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

R1706重链的氨基酸序列同R0226重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)

R1706轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)

DIVMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYDALKLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISGVESADAATYYCQQEHSVGNVDNVFGGGTEVVVKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

R1707重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)

IPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGQVQLESEGGLFKPTDTLTLTCTVSGSSLSSSYMSWVRQAPGKGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTTEDTATYFCARGGYRTSGMDPWGPGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGA

R1707轻链的氨基酸序列同R0226轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)

R1708重链的氨基酸序列同R0226重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)

R1708轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：48)

IPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGDIVMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYDALKLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISGVESADAATYYCQQEHSVGNVDNVFGGGTEVVVKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

R1709重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)

IPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGQVQLESEGGLFKPTDTLTLTCTVSGSSLSSSYMSWVRQAPGKGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTTEDTATYFCARGGYRTSGMDPWGPGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

R1709轻链的氨基酸序列同R0226轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)

R1710重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)

QVQLESEGGLFKPTDTLTLTCTVSGSSLSSSYMSWVRQAPGKGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTTEDTATYFCARGGYRTSGMDPWGPGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

R1710轻链的氨基酸序列同R0226轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：45)

R1711重链的氨基酸序列同R0226重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)

R1711轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)

IPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGDIVMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYDALKLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISGVESADAATYYCQQEHSVGNVDNVFGGGTEVVVKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

R1901重链的氨基酸序列同R1710重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)

R1901轻链的氨基酸序列同R1706轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)

R1902重链的氨基酸序列同R1708重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)

R1902轻链的氨基酸序列同R1706轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)

R1903重链的氨基酸序列同R1710重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)

R1903轻链的氨基酸序列同R1708轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：48)

抗TIGIT人源化抗体15H9L2(R0771)及其构建的双特异性融合蛋白的重/轻链序列

R0771重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

R0771轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：53)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLIYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

R0973重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

R0973轻链的氨基酸序列同15H9L2轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：53)

抗TIGIT人源化抗体316H1L1(R0750)及其构建的双特异性融合蛋白的重/轻链序列

R0750重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：55)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFTDYFMDWVRQAPGQRLEWMGRLNPNNGRTSYNQKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDLGRWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

R0750轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGKSPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNSLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

R0975重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFTDYFMDWVRQAPGQRLEWMGRLNPNNGRTSYNQKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDLGRWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

R0975轻链的氨基酸序列同R0750轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)

抗TIGIT人源化抗体15H10L3(R0774)及其构建的双特异性融合蛋白的重/轻链序列

R0774重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

R0774轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：59)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

R2273重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：60)

IPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

R2273轻链的氨基酸序列同R0774轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：59)

R2274重链的氨基酸序列同R0774重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)

R2274轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：61)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

R2275重链的氨基酸序列同R0774重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)

R2275轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：62):

IPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

R2276重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：63):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQGSGSGSGSGGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

R2276轻链的氨基酸序列同R2274轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：61)

表2.抗TIGIT抗体可变区序列表

表3.抗体CDRs序列表

备注：上述表3所述抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根据Kabat编码系统确认。

实施例3.双特异性融合蛋白与肿瘤细胞的结合活性测定(FACS)

1.抗TIGIT抗体R0226构建的双特异性融合蛋白与相应细胞上的靶抗原结合。

本发明以构建表达鼠TIGIT的CHO-mTIGIT作为TIGIT阳性细胞，并以本发明制备的双特异性融合蛋白测定其细胞结合活性。利用流式分析法检测双特异性融合蛋白与CHO-mTIGIT细胞的结合活性。培养足够的CHO-mTIGIT细胞，离心收集细胞。同时用PBS+3％FBS稀释双特异性融合蛋白以及对应的单克隆抗体，浓度从100nmol开始，3倍梯度稀释，得到8个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+3％FBS洗一遍后加PBS+3％FBS重悬细胞至2×10⁶个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔100ul(2×10⁵个细胞)，加入100ul稀释好的抗体，4℃孵育30分钟；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的Alexa Fluor 647标记的抗鼠IgG Fab抗体(Jackson immunoresearch，115-605-072)重悬细胞，4℃避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism7.0进行分析计算抗体与CHO-MTIGIT的结合亲和力EC50值。实验中同型对照R0860(mIgG2aISO，是无关靶点的mIgG2a蛋白)。

实验结果如图9所示，本发明的双特异性融合蛋白(尤其是R1706，R1710，R1901)具有良好的TIGIT结合活性。

2.抗TIGIT人源化抗体构建的双特异性融合蛋白与相应细胞上的靶抗原结合。

本发明以构建表达人TIGIT的JurkahTIGIT作为TIGIT阳性细胞，并以本发明制备的双特异性融合蛋白测定其细胞结合活性。利用流式分析法检测双特异性融合蛋白与JurkahTIGIT细胞的结合活性。

培养足够的JurkahTIGIT细胞，离心收集细胞。同时用PBS+3％FBS稀释双特异性融合蛋白以及对应的单克隆抗体，浓度从50nmol开始，4倍梯度稀释，得到7个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+3％FBS洗一遍后加PBS+3％FBS重悬细胞至2×10⁶个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔100ul(2×10⁵个细胞)，加入100ul稀释好的抗体，4℃孵育30分钟；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的Alexa Fluor 647标记的抗人IgG Fab抗体(Jackson immunoresearch，109605097)重悬细胞，4℃避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism 7.0进行分析计算抗体与JurkahTIGIT的结合亲和力EC50值。实验中同型对照R0861(hIgG1 ISO,为无关靶点的人IgG1蛋白)。

实验结果如图10所示，本发明的双特异性融合蛋白能与TIGIT阳性细胞特异性结合。

实施例3.双特异性融合蛋白与TGF-β1和TGF-β3结合活性的测定(ELISA)

检测了双特异性融合蛋白与TGF-β1和TGF-β3蛋白的结合情况。

提前用50mmol Coating Buffer将hTGF-β1重组蛋白和hTGF-β3重组蛋白稀释成0.5μg/mL，每孔100μL,4℃放置过夜。弃上清，用1×PBST缓冲液洗板三次，之后按照100μL/孔加入PBS+1％FBS，置于37℃封闭1小时，同时用PBS+1％FBS稀释双特异性融合蛋白以及对应的单克隆抗体，浓度从100nmol开始，4倍梯度稀释，得到8个浓度梯度，备用。封闭结束弃上清，加入100μL稀释好的抗体，37℃孵育1小时，孵育结束后用1×PBST缓冲液洗板四次，再加入稀释好的偶联HRP的抗鼠IgG Fab抗体(Sigma，AQ112P)100μL/孔或抗人IgG Fab抗体(Sigma，A168)100μL/孔(抗TIGIT人源化抗体构建的双特异性融合蛋白),37℃孵育30分钟，孵育结束后用1×PBST缓冲液洗板五次，加入显色液适当显色后终止显色，通过酶标仪读值，再以OD450nm，通过用软件GraphPadPrism 7.0进行分析计算抗体与TGF-β1重组蛋白和TGF-β3重组蛋白结合的EC50值。

实验结果如图11所示，本发明的双特异性融合蛋白(尤其是R1707、R1709、R1710、R1711、R1902)与hTGF-β1和hTGF-β3具有良好的结合活性。

实施例4.双特异性融合蛋白对TGF-β/TGF-βRⅡ阻断活性的测定(FACS)

检测双特异性融合蛋白对表达于CHO-TGF-βRⅡ细胞表面的TGF-βRⅡ与TGF-β结合的阻断情况。

培养足够的CHO-TGF-βRⅡ细胞，离心收集细胞。同时用PBS+3％FBS稀释双特异性融合蛋白以及对应的单克隆抗体，浓度从100nmol开始，3倍梯度稀释，得到8个浓度梯度，备用。将TGF-β.biotin与抗体1:1混合后4℃孵育30分钟，将收集的细胞用PBS+3％FBS洗一遍后加PBS+3％FBS重悬细胞至2×10⁶个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔100ul(2×10⁵个细胞)，离心去上清，加入100ul混合好的抗体，4℃孵育1小时；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的SA-PE抗体(Biolegend，740452)重悬细胞，4℃避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism 7.0进行分析计算抗体阻断TGF-βRⅡ与TGF-β结合的IC50值。

实验结果如图12所示，实验结果显示，本发明的融合蛋白R1707、R1709、R1710、R1711、R1902具有更好的阻断活性。

实施例5.双特异性融合蛋白与TIGIT和TGF-β结合活性的测定(FACS)

1.检测了抗TIGIT抗体R0226构建的双特异性融合蛋白同时结合TIGIT和TGF-β的结合活性。

培养足够的CHO-MTIGIT细胞，离心收集细胞。同时用PBS+3％FBS稀释双特异性融合蛋白以及对应的单克隆抗体，浓度从100nmol开始，4倍梯度稀释，得到8个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+3％FBS洗一遍后加PBS+3％FBS重悬细胞至2×10⁶个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔100ul(2×10⁵个细胞)，加入100ul稀释好的抗体，4℃孵育30分钟；孵育去上清，用PBS洗细胞两遍，加入稀释好的TGF-β.biotin(0.5μg/mL)，4℃避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用稀释好的SA-PE抗体(Biolegend，740452)重悬细胞，4℃孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism7.0进行分析计算抗体与CHO-MTIGIT以及TGF-β同时结合的结合亲和力EC50值。

实验结果如图13所示，实验结果显示，本发明的双特异性融合蛋白，其与CHO-MTIGIT细胞结合后，仍可与hTGF-β结合。

2.检测了抗TIGIT人源化抗体构建的双特异性融合蛋白双端同时结合的结合活性。

培养足够的JurkahTIGIT细胞，离心收集细胞。同时用PBS+3％FBS稀释双特异性融合蛋白以及对应的单克隆抗体，浓度从200nmol开始，4倍梯度稀释，得到8个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+3％FBS洗一遍后加PBS+3％FBS重悬细胞至2×106个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔100ul(2×105个细胞)，加入100ul稀释好的抗体，4℃孵育30分钟；孵育去上清，用PBS洗细胞两遍，加入稀释好的TGF-β.biotin(0.5μg/mL)，4℃避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用稀释好的SA-PE抗体(Biolegend，740452)重悬细胞，4℃孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism7.0进行分析计算抗体与JurkahTIGIT以及TGF-β同时结合的结合亲和力EC50值。

实验结果如图14所示，实验结果显示，本发明的双特异性融合蛋白能够同时与TIGIT和TGF-β结合。

实施例6.双特异性融合蛋白解除T细胞增殖抑制检测

1.检测抗TIGIT抗体R0226构建的双特异性融合蛋白解除TGF-β抑制T细胞增殖活性。

T细胞的获得：抽取人静脉血，使用Ficoll淋巴分离液获得PBMC细胞，使用EasySepTM Human TCell Enrichment Kit(STEMCELL，19051)分离得T细胞。

T细胞增殖抑制实验：用细胞培养基稀释抗体，配置浓度为20nM，10倍梯度稀释，设4个浓度梯度；同时稀释TGF-β1为20ng/ml(终浓度为5ng/ml)，两者均加入U形板中，室温共孵育30min；从培养箱中取出T细胞，用CFSE(BD Bioscience，565082)标记，标记完成的T细胞用完全培养基洗两遍后，用培养基重悬至1×10⁶个细胞/ml，根据细胞的数量按照Tcell：beads＝30:1的比例将beads加入到细胞中，混匀后将细胞铺板于96孔U底板中，每孔100ul(1×10⁵个细胞)，加入提前孵育好的抗体和TGF-β1混合液100μl/孔，置于37℃二氧化碳培养箱中孵育5天。孵育结束后离心去上清，再用100ul PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism 7.0进行分析计算T细胞增殖率。

结果如图15所示，T细胞增殖抑制恢复，二价分子中R1710更优，R1706、R1707次之；四价分子中R1901更优。

2.检测抗TIGIT人源化抗体构建的双特异性融合蛋白解除TGF-β抑制T细胞增殖活性。

T细胞的获得：抽取人静脉血，使用Ficoll淋巴分离液获得PBMC细胞，使用EasySepTM Human TCell Enrichment Kit(STEMCELL，19051)分离得T细胞。

T细胞增殖抑制实验：用细胞培养基稀释抗体，配置浓度为50nM，20倍梯度稀释，设3个浓度梯度；同时稀释TGF-β1为20ng/ml(终浓度为5ng/ml)，两者均加入U形板中，室温共孵育30min；从培养箱中取出T细胞，用CFSE(BD Bioscience，565082)标记，标记完成的T细胞用完全培养基洗两遍后，用培养基重悬至1×106个细胞/ml，根据细胞的数量按照Tcell：beads＝30:1的比例将beads加入到细胞中，混匀后将细胞铺板于96孔U底板中，每孔100ul(1×105个细胞)，加入提前孵育好的抗体和TGF-β1混合液100μl/孔，置于37℃二氧化碳培养箱中孵育5天。孵育结束后离心去上清，再用100ul PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism 7.0进行分析计算T细胞增殖率。

结果如图16所示，R2275与R2276在低浓度时也具有较好T细胞增殖抑制接触能力，其与分子解除T细胞增殖抑制能力基本接近。

实施例7.双特异性融合蛋白抗体介导的细胞杀伤活性检测(FACS)

1.检测抗TIGIT抗体R0226构建的双特异性融合蛋白抗体介导的细胞杀伤活性。

培养足够的CHO-mTIGIT细胞，离心收集细胞，用CFSE(BD Bioscience，565082)标记后重悬细胞，调整细胞密度为4×10⁵个细胞/ml，备用。收集培养的NK92细胞，离心后用靶细胞培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁶个细胞/ml，同时用靶细胞培养基稀释双特异性融合蛋白以及对应的单克隆抗体，浓度从50nmol开始，10倍梯度稀释，得到6个浓度梯度，备用。将收集的靶细胞重悬后按照每孔50ul(2×10⁴个细胞)铺板，加入收集的效应细胞每孔100ul(1×10⁵个细胞)，之后加入50ul稀释好的抗体，37℃孵育6小时；之后离心去上清，用稀释好的Propidium Iodide Solution(Biolegend，421301)重悬细胞，每孔100ul，室温避光孵育20分钟，重悬后，上机检测，再以FITC⁺PE⁺百分比，通过用软件GraphPadPrism7.0进行分析计算抗体介导的细胞杀伤EC50值。

实验结果如图17所示，R1707杀伤效果最好，R1706杀伤效果次之，与TIGIT单抗R0226接近。

2，检测抗TIGIT人源化抗体构建的双特异性融合蛋白抗体介导的细胞杀伤活性。

培养足够的JurkahTIGIT细胞，离心收集细胞，用eBioscience^TMCellProliferation Dye eFluor^TM670(Invitrogen^TM，65-0840-90)标记后重悬细胞，调整细胞密度为4×105个细胞/ml，备用。收集培养的NK92细胞，离心后用靶细胞培养基重悬，调整细胞密度为1×106个细胞/ml，同时用靶细胞培养基稀释双特异性融合蛋白以及对应的单克隆抗体，浓度从50nmol开始，20倍梯度稀释，得到6个浓度梯度，备用。将收集的靶细胞重悬后按照每孔50ul(2×104个细胞)铺板，加入收集的效应细胞每孔100ul(1×105个细胞)，之后加入50ul稀释好的抗体，37℃孵育6小时；之后离心去上清，用稀释好的PropidiumIodide Solution(Biolegend，421301)重悬细胞，每孔100ul，室温避光孵育20分钟，重悬后，上机检测，再以APC+PE+百分比，通过用软件GraphPadPrism 7.0进行分析计算抗体介导的细胞杀伤EC50值。

实验结果如图18所示，相比较而言，R2275及R2274分子具有较好ADCC活性。

实施例10：双特异性融合蛋白在CT26小鼠结肠癌模型的抗肿瘤作用

1)目的：观察双特异性融合蛋白分子在CT26小鼠结肠癌模型的抗肿瘤活性，同时设置同型单药组及联用组。

实验材料：Balb/c小鼠，雌性，6-8周(来源：广东维通利华实验动物技术有限公司，No.320726200100235255)；CT26细胞(上海细胞库，目录号：TCM37)；RPMI 1640培养基(Gibco,61870036)，FBS(Gibco,10091-148)，0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco,25200056)，青霉素-链霉素(Gibco,15140122)，DMSO(Sigma,D2650)，DPBS(Hyclone,SH30028.02)

仪器设备：电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，JA12002)，游标卡尺(上海美耐特实业有限公司，MN150T)，显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司，BDS200)，医用离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司，L530R)，数显恒温水浴锅(普瑞斯机械有限公司，HH-S)，二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社，MCO-18AC)，生物安全柜(广州千江实验科技有限公司，ACZ-451)，细胞技术器(上海睿钰生物，IC1000)

实验方法

细胞培养：将CT26细胞培养在含有10％胎牛血清(Gibco)、1％谷氨酰胺与1％青霉素-链霉素(1:1)的RPMI 1640培养基(Gibco)中。

接种：收集对数生长期的CT26细胞，用DPBS洗两次，用DPBS调节细胞浓度为1X10⁶/mL。取雌性Balb/c小鼠，皮下接种CT26细胞，接种体积为0.1mL/小鼠，即1X10⁵/小鼠。

给药：接种当天记为第0天(D0)，当平均瘤体积达到60-80mm3，对小鼠按瘤体积随机分组，保证每组小鼠的平均瘤体积相同或相近，本实验第9天(D9)，将小鼠按瘤体积随机分为5组，每组7只，开始给药(给药方案见下表4)。

表4CT26肿瘤模型给药剂量，方式以及频率

注：n，动物数量；i.p.,腹腔注射；Q2D*4,每2天给药一次，连续4次；如给药期间体重下降超过15％，给药方案将做调整；Isotype control是同型对照(无关靶点的mIgG2a抗体)，R2079是无关靶点的mIgG2a抗体重链C端通过连接子(G4S)4G连接IP6-GS9-TGF-βTrap(20-136)构建的融合蛋白。

记录：

D9开始测量肿瘤体积并记录，之后每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。以公式：(1/2)X长径X(短径)²计算肿瘤体积。每只小鼠达到实验终点时(体重下降超20％或肿瘤体积超过2000mm³达到仁慈终点)，CO₂窒息法处死小鼠。

表5双特异性融合蛋白在CT26小鼠结肠癌模型的抗肿瘤活性

“/”：表示已达仁慈终点，动物已安乐死

数据计算、统计与分析：

两组之间比较可用独立样本T检验。3组以上比较应用One-Way ANOVA。如果F值显示有显著性差异，可进行多组间的事后分析。数据使用Prism GraphPad处理，当p<0.05时表示统计学上有显著性差异。肿瘤体积V＝0.5a x b2,a和b分别为肿瘤的长短径。肿瘤生长抑制TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，Ti为第i天治疗组的平均瘤体积，T0为治疗开始时治疗组的平均瘤体积，Vi为第i天溶剂对照组的平均瘤体积，V0为治疗开始时溶剂对照组的平均瘤体积。

实验结果：计算D24天的肿瘤生长抑制率(TGI)，R1706,R1708的抗肿瘤作用显著，TGI分别为87.9％，92.0％，优于Tigit单抗R0226组(TGI＝83.8％)；TGF-β单药的TGI为-0.6％。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (13)

1.一种融合蛋白，其包括结合TGF-β的TGF-β受体部分和结合TIGIT的抗TIGIT抗体部分；可选地，所述TGF-β受体部分直接或通过连接子连接至抗TIGIT抗体重链或轻链的C端或N端；可选地，所述TGF-β受体部分的C端与抗TIGIT抗体重链或轻链的N端连接。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述TGF-β受体为TGFβRII多肽；

可选地，所述TGF-β受体为TGFβRII突变体片段，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端片段、柔性片段和TGFβRII胞外结构域的N-末端片段，其中，所述C-末端片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端的至多122个氨基酸；所述柔性片段的N端与所述TGFβRII胞外结构域的N-末端片段的C端相连，所述柔性片段的C端与所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段的N端相连。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的C-末端的112～122个氨基酸；

可选的，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为TGFβRII胞外结构域的N-端截短多肽；可选地，所述TGFβRII胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，

可选的，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为TGFβRII胞外结构域的N-端截短连续14-23个氨基酸残基的多肽，可选截短连续16-23个氨基酸残基的多肽；

可选的，所述TGFβRII胞外结构域的C-末端片段为SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或SEQID NO：43所示多肽。

4.根据权利要求2或3所述的融合蛋白，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的N末端的0～6个氨基酸；

可选的，所述TGFβRII突变体片段包括TGFβRII胞外结构域的N末端的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸；

可选的，所述TGFβRII胞外结构域的N-末端片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

5.根据权利要求4任一项所述的融合蛋白，所述柔性片段为含有G和/或S氨基酸的连接肽，

可选地，所述柔性片段为(GS)_XG多肽，其中，X优选为1至6的任意整数；或者，所述柔性片段选自(G_xS)_y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自0-6的整数；

可选的，所述柔性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：39所示；

可选的，所述TGFβRII突变体片段具有SEQ ID NO：3～5任一所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述抗TIGIT抗体包括重链可变区和轻链可变区；

可选地，所述抗TIGIT抗体，其中，

A)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：64中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：65中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；

B)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：66中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：67中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；

C)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：68中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：69中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；或

D)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：70中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：71中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；

可选地，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3由IMGT编号系统定义，或由Kabat编号系统定义，或由Chothia编号系统定义，或由Contact编号系统定义，或由AbM编号系统定义；

可选地，所述抗TIGIT抗体，其中，

A)所述抗TIGIT抗体的重链可变区HCDR1包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列；和轻链可变区LCDR1包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列和LCDR3包含SEQID NO：77的氨基酸序列；

B)所述抗TIGIT抗体的重链可变区HCDR1包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列；和轻链可变区LCDR1包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列和LCDR3包含SEQID NO：83的氨基酸序列；或

C)所述抗TIGIT抗体的重链可变区HCDR1包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列；和轻链可变区LCDR1包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列和LCDR3包含SEQID NO：89的氨基酸序列；

可选地，所述抗TIGIT抗体，其中，

A)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：64所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：65所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；

B)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：66所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：67所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；

C)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：68所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：69所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；或

D)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：70所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：71所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；

可选地，所述抗TIGIT抗体包含恒定区，可选地，

A)所述抗TIGIT抗体重链包含SEQ ID NO：58所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链包含SEQ ID NO：59所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；

B)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：44所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：45所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；

C)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：52所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：53所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；或

D)所述抗TIGIT抗体重链可变区包含SEQ ID NO：55所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，和所述轻链可变区包含SEQ ID NO：56所示或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中：

A)所述TGF-β受体部分的C端与抗TIGIT抗体的重链的N端直接或通过连接子连接；

B)所述TGF-β受体部分的N端与抗TIGIT抗体的重链的C端直接或通过连接子连接；

C)所述TGF-β受体部分的C端与抗TIGIT抗体的轻链的N端直接或通过连接子连接；和/或

D)所述TGF-β受体部分的N端与抗TIGIT抗体的轻链的C端直接或通过连接子连接；

可选地，所述连接子为肽连接子；可选地，所述连接选自(G_xS)_y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自0-6的整数；可选地，所述连接子为SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：39所示连接子。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述TIGIT抗体部分包括重链可变区VH和重链恒定区CH，以及轻链可变区VL和轻链恒定区CL；可选地，

I)所述融合蛋白包括两条具有以下式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链，

(a):[VH]-[CH]，

(b):[VL]-[CL]-[L1]-[TGF-βR]，

[TGF-βR]-[L1]-[VL]-[CL],或

[TGF-βR-1]-[L1]-[VL]-[CL]-[L2]-[TGF-βR-2]；

II)所述融合蛋白包括两条具有以下式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链

(a):[TGF-βR]-[L1]-[VH]-[CH],

[VH]-[CH]-[L1]-[TGF-βR]，或

[TGF-βR-1]-[L1]-[VH]-[CH]-[L2]-[TGF-βR-2]，

(b):[VL]-[CL]；

III)所述融合蛋白包括两条具有以下式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链，

(a):[VH]-[CH]-[L1]-[TGF-βR]，

(b):[TGF-βR]-[L1]-[VL]-[CL],或[VL]-[CL]-[L1]-[TGF-βR]；或者

IV)所述融合蛋白包括两条具有以下式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链，

(a):[TGF-βR]-[L1]-[VH]-[CH]，

(b):[TGF-βR]-[L1]-[VL]-[CL],或[VL]-[CL]-[L1]-[TGF-βR]；

所述I)、II)、III)和IV)中，其中TGF-βR-1、TGF-βR-2、TGF-βR为TGF-β受体，所述式(a)和式(b)中的L1和L2为连接子，L1和L2优选为肽连接子；可选地，所述L1、L2独立地选自(G_xS)_y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自0-6的整数；可选地，所述L1、L2连接子如SEQ IDNO：12或39所示；

可选地，所述融合蛋白，其中

A)所述第一链包括SEQ ID NO：47、49、50所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列；

B)所述第一链包括SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：46、48、51所示的氨基酸序列；

C)所述第一链包括SEQ ID NO：50、47所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；或者

D)所述第一链包括SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列；

E)所述第一链包括SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列；

F)所述第一链包括SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列；

G)所述第一链包括SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列；

H)所述第一链包括SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：61、62所示的氨基酸序列；或

I)所述第一链包括SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列。

9.一种核酸分子，其编码权利要求1至8任一项所述的融合蛋白。

10.一种表达载体，其包含权利要求9所述的核酸分子。

11.一种宿主细胞，其含有根据权利要求10所述的表达载体或包含权利要求9所述核酸分子。

12.一种药物组合物，其包含权利要求1至8任一项所述的融合蛋白、或权利要求9所述的核酸分子、或权利要求10所述的表达载体、或权利要求11所述的细胞；可选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

13.权利要求1至8任一项所述的融合蛋白、或权利要求9所述的核酸分子、或权利要求10所述的表达载体、或权利要求11所述的细胞、或权利要求12所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。