CN118566499A - 一种GluN1和GluN2B亚基融合表达检测抗NMDAR抗体的CBA方法及检测试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药工程技术领域，是一种GluN1和GluN2B亚基融合表达检测抗NMDAR抗体的CBA方法及检测试剂，通过将含有GluN1部分序列、GluN2B部分序列以及跨膜序列的重组载体共转染细胞获得检测试剂，然后再将该检测试剂在抗NMDAR抗体的CBA方法中使用，其中，GluN1部分序列如SEQ ID NO：1所示，GluN2B部分序列如SEQ ID NO：2所示，跨膜序列为CD8a hinge。可实现在细胞膜上过表达具有完整的NMDAR抗原结构域重组蛋白，同时在不需要添加NMDAR拮抗剂的前提下，可稳转的用于抗NMDAR抗体CBA法检测的细胞系。

Description

一种GluN1和GluN2B亚基融合表达检测抗NMDAR抗体的CBA方 法及检测试剂
技术领域
本发明是一种GluN1和GluN2B亚基融合表达检测抗NMDAR抗体的CBA方法及检测试剂，具体涉及一种将GluN1和GluN2B亚基的部分特定序列融合并过表达到真核细胞的细胞膜上形成重组蛋白，以特异性接合域与待检样本中抗NMDAR抗体能发生特异性结合的细胞免疫荧光法（CBA法）检测抗NMDAR抗体的方法，及其使用的检测试剂，属于生物医药工程技术领域。
背景技术
抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎（以下简称NMDAR脑炎）是自身免疫性脑炎（以下简称AE脑炎）中最常见的一种，约占所有AE脑炎的80%左右，其特征是由自身免疫机制介导的脑炎，自身针对神经元细胞表面的NMDA受体产生抗NMDAR抗体并发起攻击，导致神经元功能障碍。抗NMDAR脑炎的症状多样，包括精神行为异常、认知障碍、近事记忆力下降、癫痫发作、言语障碍、运动障碍、不自主运动、意识水平下降与昏迷、自主神经功能障碍等。
目前诊断NMDAR脑炎需要综合临床表现、辅助检查、确诊实验以及排除其他病因，辅助检查包括脑脊液检查、头MRI、脑电图等，确诊所需的临床辅助检查依赖于准确的检测血清和脑脊液中的抗NMDAR抗体，通常采用基于组织底物的猴脑组织切片免疫荧光法（Tissue based assay）即TBA法或基于细胞底物的实验（Cell based assay）即CBA法，根据Graus与Dalmau标准(2016年)，确诊的抗NMDAR脑炎需要符合以下3个条件：(1)下列6项主要症状中的1项或者多项：①精神行为异常或者认知障碍；②言语障碍；③癫痫发作；④运动障碍/不自主运动；⑤意识水平下降；⑥自主神经功能障碍或者中枢性低通气。(2)抗NMDAR抗体阳性：建议以脑脊液CBA法抗体阳性为准。若仅有血清标本可供检测，除了CBA结果阳性，还需要采用TBA与培养神经元进行IIF予以最终确认，且低滴度的血清阳性(1∶10)不具有确诊意义。(3)合理地排除其他病因。指南（中国自身免疫性脑炎诊治专家共识（2022年版），中华神经科杂志 2022 年9 月第 55 卷第 9 期）指出目前CBA 采用表达神经元细胞表面抗原的转染细胞，TBA 采用动物的脑组织切片为抗原底物。CBA 具有较高的特异度和敏感度。应尽量对患者配对的脑脊液与血清标本进行检测，脑脊液与血清的起始稀释滴度分别为 1∶1 与 1∶10。抗NMDAR抗体阳性建议以脑脊液CBA法抗体阳性为准。
NMDAR是一种异源四聚体复合物，由2个GluN1和2个GluN2或GluN3亚基组成，大多数的NMDAR是由2个GluN1和2个GluN2亚基组成的。每个亚基的胞外部分都是由一个氨基端结构域（ATD）和一个配体结合结构域（LBD）组成的。研究表明GluN1和GluN2B亚单位都参与了NMDAR的主要免疫原性区域（Steinke S, et al. NMDA-receptor-Fc-fusionconstructs neutralize anti-NMDA receptorantibodies(嵌合自身抗体受体T细胞消耗NMDA受体特异性B细胞NMDA受体-Fc融合构建体中和抗NMDA受体抗体). Brain. 2023 May2;146(5):1812-1820.）。文献亦指出了来自不同患者的抗NMDAR抗体具有蛋白结构上的多样性，但GluN1和GluN2B亚单位表面的结合域是必须的，且需要在细胞膜上正确表达（Reincke SM, von Wardenburg N, Homeyer MA, et al. Chimeric autoantibodyreceptor T cellsdeplete NMDA receptor-specific B cells(嵌合自身抗体受体T细胞消耗NMDA受体特异性B细胞). Cell. 2023;186(23):5084-5097.e18. doi:10.1016/j.cell.2023.10.001）。
目前用于检测抗NMDAR抗体的CBA方法主要有两种：
第一种是同时过表达GluN1和GluN2亚基（GluN2B或GluN2A），但过表达GluN1和GluN2亚基形成的重组蛋白会产生功能，在转染细胞产生兴奋性毒性，需要添加NMDAR拮抗剂（例如TCN 213或MK-801等），价格昂贵，否则共表达GluN1和GluN2亚基的细胞会死亡。例如：一种将GluN1和GluN2B的同时过表达的人胚胎肾(HEK) 293细胞的被用于抗NMDAR抗体的测定，其添加了10 μM MK-801用于神经保护（Tanaka, K., Kitagawa, Y., Hori, K.,Kinoshita, M.,&Tanaka, M. (2021). Evaluation of the concordance betweenGluN1-GluN2 heteromerlive-cell-based assay and GluN1 monomer biochip kitassay on anti-NMDAR autoantibody detection(GluN1-GluN2异聚体活细胞检测法和GluN1单体生物芯片试剂盒检测抗NMDAR自身抗体的一致性评价).Journal ofimmunological methods(免疫法杂志), 499, 113150. ）。
另一种是单独表达GluN1亚基，但单独表达GluN1亚基具有几个转录异构体，其中涉及的GluN1-1a是经典的GluN1转录异构体，单独表达时无法表达到膜上，只存在于胞质中，后续CBA法则需要对细胞进行固定透化处理，易造成整体荧光背景变高，继而使得检测灵敏度降低；此外，GluN1-4a是表达到膜上最多的转录异构体，但单独过表达的GluN1-4a，还是多数存在于胞内，少数定位到细胞膜上，也会导致检测灵敏度不高，同时由于GluN1和GluN2B亚单位都参与了NMDAR的主要免疫原性区域，因此，不论用GluN1-1a还是GluN1-4a转录异构体，在某些样本检测时，无法达到GluN1和GluN2亚基共转的检测效果，仍然会出现假阴性结果。
现有技术中，中国专利CN114891091A公开了一种抗NMDAR脑炎重组抗原（重组蛋白）及其在制备检测抗NMDAR脑炎抗体试剂盒的应用，该试剂盒包括胶体金免疫层析试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、酶联免疫检测试剂盒和纳米磁微粒管式化学发光检测试剂盒，该抗NMDAR脑炎重组抗原包括NR1蛋白、NR2A蛋白、NR2B蛋白、NR2C蛋白中的任一种或几种的N端结构域，其中NR1蛋白的N端结构域基因包括编码NR1蛋白的19～559氨基酸序列；NR2A蛋白的N端结构域基因包括编码NR2A蛋白的23～555氨基酸序列；NR2B蛋白的N端结构域基因包括编码NR2B蛋白的27~557氨基酸序列；NR2C蛋白的N端结构域基因包括编码NR2C蛋白的20~554氨基酸序列。
中国专利CN114144427A还公开了用于检测和分离NMDAR自身抗体的NMDA受体构建体（重组蛋白），该构建体包括NMDAR亚基GluN1的胞外结构域（ECD）或其片段和NMDAR亚基GluN2A、GluN2B、GluN2C或GluN2D中的至少一种的ECD或其片段，该专利记载的重组蛋白为同源二聚体或异源二聚体，其与膜表达的四聚体NMDAR受体结构并不相同。
由此可见，现有技术中均未针对抗NMDAR抗体的CBA法设计相应的检测试剂，现有专利虽然提供了将GluN1、GluN2等NMDAR亚基的部分结构域重组表达NMDAR蛋白作为抗原检测试剂，但这些检测试剂仅提供了其在免疫胶体金技术、免疫印迹法、酶联免疫法（ELISA法）中具有较好的灵敏性和特异性，并未解决如何满足在细胞膜上过表达具有完整的抗原结构域NMDAR受体蛋白，同时在不需要添加NMDAR拮抗剂的前提下，如何构建可稳转的重组蛋白过表达的用于抗NMDAR抗体CBA法检测的细胞系。
发明内容
本发明旨在解决现有技术缺陷，提供了一种GluN1和GluN2B亚基融合表达检测抗NMDAR抗体的CBA方法及检测试剂，该方法是将GluN1和GluN2B亚基部分特定序列的重组蛋白表达到细胞膜表面，能够以较高的灵敏度和特异性检测抗NMDAR抗体的CBA方法，该方法及检测试剂能同时实现以下技术：在细胞膜上过表达具有完整的NMDAR抗原结构域重组蛋白，同时在不需要添加NMDAR拮抗剂的前提下，可稳转的用于抗NMDAR抗体CBA法检测的细胞系。
本发明通过下述技术方案实现：一种GluN1和GluN2B亚基融合表达检测抗NMDAR抗体的CBA方法，将含有GluN1部分序列、GluN2B部分序列以及跨膜序列的重组载体共转染细胞获得检测试剂，将该检测试剂在抗NMDAR抗体的CBA方法中使用，
GluN1部分序列如SEQ ID NO：1所示，GluN2B部分序列如SEQ ID NO：2所示，跨膜序列为CD8a hinge。
具体而言，GluN1部分序列来自转录异构体GluN1-1a的N端结构域上1-400氨基酸序列，其序列如SEQ ID NO：1所示如下：
MSTMRLLTLALLFSCSVARAACDPKIVNIGAVLSTRKHEQMFREAVNQANKRHGSWKIQLNATSVTHKPNAIQMALSVCEDLISSQVYAILVSHPPTPNDHFTPTPVSYTAGFYRIPVLGLTTRMSIYSDKSIHLSFLRTVPPYSHQSSVWFEMMRVYSWNHIILLVSDDHEGRAAQKRLETLLEERESKAEKVLQFDPGTKNVTALLMEAKELEARVIILSASEDDAATVYRAAAMLNMTGSGYVWLVGEREISGNALRYAPDGILGLQLINGKNESAHISDAVGVVAQAVHELLEKENITDPPRGCVGNTNIWKTGPLFKRVLMSSKYADGVTGRVEFNEDGDRKFANYSIMNLQNRKLVQVGIYNGTHVIPNDRKIIWPGGETEKPRGYQMSTRLKI。
GluN2B部分序列来自GluN2B的29-408氨基酸序列，其序列如SEQ ID NO：2所示如下：
QKSPPSIGIAVILVGTSDEVAIKDAHEKDDFHHLSVVPRVELVAMNETDPKSIITRICDLMSDRKIQGVVFADDTDQEAIAQILDFISAQTLTPILGIHGGSSMIMADKDESSMFFQFGPSIEQQASVMLNIMEEYDWYIFSIVTTYFPGYQDFVNKIRSTIENSFVGWELEEVLLLDMSLDDGDSKIQNQLKKLQSPIILLYCTKEEATYIFEVANSVGLTGYGYTWIVPSLVAGDTDTVPAEFPTGLISVSYDEWDYGLPARVRDGIAIITTAASDMLSEHSFIPEPKSSCYNTHEKRIYQSNMLNRYLINVTFEGRNLSFSEDGYQMHPKLVIILLNKERKWERVGKWKDKSLQMKYYVWPRMCPETEEQEDDHLSI。
跨膜序列为CD8a hinge，即CD8a的铰链区的183-206氨基酸序列，其序列如SEQ IDNO：3所示如下：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。
重组载体还包括连接肽和荧光标签，连接肽包括连接GluN1部分序列和GluN2B部分序列的第一连接肽，连接GluN2B部分序列和跨膜序列的第二连接肽，以及连接跨膜序列和荧光标签的第三连接肽。
第一连接肽的序列如SEQ ID NO：4所示，第二连接肽的序列如SEQ ID NO：5所示，第三连接肽的序列如SEQ ID NO：6所示。
具体而言，第一连接肽的序列为GSTGGGGSGGGGSGGGGSGAASR；第二连接肽的序列为ASGGGGSGGGGSSG；第三连接肽的序列为AEAAAKEAAAKA。
荧光标签为mCherry，其序列如SEQ ID NO：7所示如下：
MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK。
将重组载体共转染至CHO细胞或293细胞，获得表达GluN1-GluN2B-CD8a hinge-mCherry融合蛋白的检测试剂。
所述CBA方法包括固定CBA法或活细胞CBA法。
一种如上述内容所述CBA方法中使用的检测试剂，该检测试剂是将含有GluN1部分序列、GluN2B部分序列以及跨膜序列的重组载体共转染细胞而获得，即GluN1和GluN2B亚基中部分特定序列融合表达为重组蛋白并在细胞膜上表达，具有抗NMDAR抗体抗原结合域，但不具有原有的NMDAR完整功能，不产生神经毒性，可检测抗NMDAR抗体。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明截取部分GluN1和GluN2B开放阅读框的部分序列，用连接肽连接起来融合表达，并在融合蛋白C端添加跨膜序列，使GluN1和GluN2B双亚基抗原表位正确折叠并能表达到细胞膜表面，能够与NMDAR患者脑脊液或血液中的抗NMDAR抗体特异性结合，并以较高灵敏度显示其结合性，实现用固定CBA法或活细胞CBA法来检测抗NMDAR抗体的目的。
（2）本发明设计的融合蛋白通过截取GluN1和GluN2B亚基中特定部分的序列，未在细胞膜表面形成具有功能性的NMDA受体异四聚体离子通道，所以不会导致细胞兴奋性死亡，细胞转染后也不用额外添加拮抗剂用于保护细胞，转染后可获得稳转细胞，能构建稳定的抗NMDAR抗体CBA检验方法和生产出性能稳定的检测试剂。
综上所述，本发明通过构建特定的细胞膜表达重组蛋白，满足在细胞膜上过表达具有完整的GluN1和GluN2B亚基抗原结构域NMDAR受体蛋白，同时在不需要添加NMDAR拮抗剂的前提下，构建可稳转的重组蛋白过表达的用于抗NMDAR抗体CBA法检测的细胞系。
附图说明
图1为本发明中慢病毒载体的图谱。
图2为本发明实施例4中阳性样本的免疫荧光图。
图3为本发明实施例4中阴性样本的免疫荧光图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：构建慢病毒载体
本实施例涉及构建融合蛋白GluN1-GluN2B-CD8a hinge-mCherry的慢病毒载体的过程。
将GluN1部分序列、GluN2B部分序列、跨膜序列CD8a hinge以及荧光标签mCherry依次通过三个连接肽连接形成慢病毒载体。其中，GluN1部分序列来自转录异构体GluN1-1a的N端结构域上1-400氨基酸序列，其序列如SEQ ID NO：1所示；GluN2B部分序列来自GluN2B的29-408氨基酸序列，其序列如SEQ ID NO：2所示；跨膜序列CD8a hinge的序列如SEQ IDNO：3所示；荧光标签mCherry的序列如SEQ ID NO：7所示。
三个连接肽包括第一连接肽、第二连接肽和第三连接肽，第一连接肽用于连接GluN1部分序列和GluN2B部分序列，其序列如SEQ ID NO：4所示；第二连接肽用于连接GluN2B部分序列和跨膜序列，其序列如SEQ ID NO：5所示；第三连接肽用于连接跨膜序列和荧光标签，其序列如SEQ ID NO：6所示。
由此构建得到的慢病毒载体的图谱如图1所示。
实施例2：制备检测试剂
本实施例涉及CBA方法检测抗NMDAR抗体的检测试剂的制备过程。
将实施例1中制得的慢病毒载体转染CHO或293细胞，再将转染细胞通过有限稀释法进行筛选，获得表达GluN1-GluN2B-CD8a hinge-mCherry融合蛋白的单克隆细胞，然后取长满了转染GluN1-GluN2B-CD8ahinge-mCherry细胞的培养皿，用胰酶（trypsin-EDTA）溶液消化成单细胞悬液，再用细胞计数板计算出细胞密度，再用完全培养基稀释细胞，采用有限稀释法将细胞稀释成4个/100uL，2个/100uL，1个/100uL，然后，分别按100uL/孔接种到96孔板中，筛选出单细胞群的孔，选取红色荧光强的孔进行冻存、一抗免疫荧光检测。符合的细胞可用于制备后续免疫荧光实验使用的检测试剂。
细胞片的接种：取消化的CHO-GluN1-GluN2B-CD8a hinge-mCherry单克隆细胞和对照空载细胞，按单克隆细胞∶对照细胞=1∶2的比例混合均匀，按总密度1×2×105/mL接种到96孔板或细胞爬片，用F12K+10%FBS+NEAA培养，生长48小时左右，汇合度为90-100%时停止培养。
可采用活细胞法直接将生长好的细胞孔板或玻片用于下一步的免疫荧光实验，也可采用多聚甲醛固定细胞片，保存备用。
实施例3：抗NMDAR抗体的免疫荧光检测
本实施例涉及免疫荧光实验的具体过程，包括以下操作：
准备血液或脑脊液样品，样品稀释液含如下成分：
磷酸缓冲液（pH7.0-7.4），BSA（2%）；
用样品稀释液对样本进行初次测定稀释，血清的稀释比例为1∶10，脑脊液采用原液（不稀释）；
样品孵育：37摄氏度孵育1小时，PBS洗涤3次；
用样品稀释液稀释二抗：采用羊抗人IgG（H+L），其稀释比例为1∶500，室温孵育45分钟，PBS洗涤3次；
判读：显微镜下判读样本阴阳性。
实施例4：
按实施例1和实施例2的方法，将构建的GluN1部分序列（1-400aa）+第一连接肽+GluN2B部分序列（29-408aa）+第二连接肽+CD8a hinge（183-206aa）+第三连接肽+mCherry，融合表达检测抗NMDAR抗体，采用固定CBA法，筛选出的稳转细胞和野生型CHO或HEK293细胞混合铺到96孔细胞培养板，培养48小时后，由多聚甲醛进行固定。
对比例1：
本对比例是采用GluN1-1a全序列（1-938aa）（参见NM_007327）来表达检测抗NMDAR抗体的过程。
通过构建含以上序列的真核瞬时表达载体，用Lipofectamine™ 3000 转染试剂瞬时转染CHO和293细胞，培养48小时后，由多聚甲醛进行固定。
对比例2：
本对比例是采用GluN1-4a全序列（1-885aa）（参见NM_000832.7）来表达检测抗NMDAR抗体的过程。
通过构建含以上序列的真核瞬时表达载体，用Lipofectamine™ 3000 转染试剂瞬时转染CHO和293细胞，培养48小时后，由多聚甲醛进行固定。
对比例3：
本对比例是采用GluN1-1a全序列（1-938aa）和GluN2B全序列（1-1484aa）（参见NM_000834.5）分别构建载体，共表达检测抗NMDAR抗体的过程。
通过构建含以上序列的真核瞬时表达载体，用Lipofectamine™ 3000 转染试剂瞬时转染CHO和293细胞（转染同时加入NMDAR拮抗剂犬尿酸2mM），培养48小时后，由多聚甲醛进行固定。
对比例4：
本对比例是采用GluN1-1a全序列（1-938aa）+第一连接肽+GluN2B全序列（1-1484aa）+第二连接肽+CD8a hinge（183-206aa）+第三连接肽+mCherry，融合表达检测抗NMDAR抗体的过程。
通过构建含以上序列的真核瞬时表达载体，用Lipofectamine™ 3000 转染试剂瞬时转染CHO和293细胞（转染同时加入NMDAR拮抗剂犬尿酸2mM），培养48小时后，由多聚甲醛进行固定。
对比例5：
本对比例是采用GluN1-1a部分序列（1-400）+第二连接肽+CD8a hinge（183-206aa）+第三连接肽+mCherry，融合表达检测抗NMDAR抗体的过程。
通过构建含以上序列的真核瞬时表达载体，用Lipofectamine™ 3000 转染试剂瞬时转染CHO和293细胞，培养48小时后，由多聚甲醛进行固定。
对比例6：
本对比例是采用GluN2B部分序列（29-408aa）+第二连接肽+CD8a hinge（183-206aa）+第三连接肽3+mCherry，融合表达检测抗NMDAR抗体的过程。
通过构建含以上序列的真核瞬时表达载体，用Lipofectamine™ 3000 转染试剂瞬时转染CHO和293细胞，培养48小时后，由多聚甲醛进行固定。
对比例7：
本对比例是采用GluN1部分序列（1-560aa）+第一连接肽+GluN2B部分序列（29-960aa）+第二连接肽+CD8a hinge（183-206aa）+第三连接肽+mCherry，融合表达检测抗NMDAR抗体的过程。
通过构建含以上序列的真核瞬时表达载体，用Lipofectamine™ 3000 转染试剂瞬时转染CHO和293细胞，培养48小时后，由多聚甲醛进行固定。
对比例8：
本对比例是采用GluN1部分序列（200-400aa）+第一连接肽+GluN2B部分序列（29-208aa）+第二连接肽+CD8a hinge（183-206aa）+第三连接肽+mCherry，融合表达检测抗NMDAR抗体的过程。
通过构建含以上序列的真核瞬时表达载体，用Lipofectamine™ 3000 转染试剂瞬时转染CHO和293细胞，培养48小时后，由多聚甲醛进行固定。
将以上实施例4，对比例1至对比例8制备的固定细胞，分别加入临床诊断为NMDAR抗体病的阳性样本，根据NMDAR脑炎专家共识的诊断标准，选择了328例确诊抗NMDAR脑炎的样本。
样本应满足A、B与C 三个条件：
A. 以下6项主要症状中的1项或者多项：（1）精神行为异常或者认知障碍；（2）言语障碍；（3）癫痫发作；（4）运动障碍/不自主运动；（5）意识水平下降；（6）自主神经功能障碍或者中枢性低通气。
B.抗NMDAR抗体阳性：建议以脑脊液CBA法抗体阳性为准。若仅有血清标本可供检测，除了 CBA结果阳性，还需要采用TBA与培养神经元进行 IIF 予以最终确认，且低滴度的血清阳性（1∶10）不具有确诊意义。
C.合理排除其他病因。
血清的稀释比例为1∶10、1∶32、1∶100；脑脊液采用原液，不进行稀释，孵育（37摄氏度孵育1小时），PBS洗孔3次，加入二抗（采用羊抗人IgG，其稀释比例为1:500）孵育（室温45分钟），PBS洗涤3次后，加入少量PBS浸泡细胞，显微镜下判读。结果见图2和下表1：抗NMDAR抗体病阳性样本对比。
图2为实施例4中阳性样本的免疫荧光图，图中A为GluN1和GluN2B融合蛋白本身红光，B为阳性样本和二抗孵育后二抗绿色荧光，C为红光和绿光原位重叠，说明该样本检测为阳性。
表1：抗NMDAR抗体病阳性样本检出率对比
将以上实施例4，对比例1至对比例8制备的固定细胞，分别加入健康人血清样本24例和非NMDAR脑炎的其他患者血清45例和脑脊液样本38例。
血清的稀释比例为1∶10、1∶32、1∶100；脑脊液采用原液，不进行稀释，孵育（37摄氏度孵育1小时），PBS洗孔3次，加入二抗（采用羊抗人IgG，其稀释比例为1∶500）孵育（室温45分钟），PBS洗涤3次后，加入少量PBS浸泡细胞，显微镜下判读。结果见图3和下表2：健康人阴性样本对比。
图3为实施例4中阴性样本的免疫荧光图，图中A为GluN1和GluN2B融合蛋白本身红光，B为阴性样本和二抗孵育后二抗绿色荧光，由此可以说明该样本检测为阴性。
表2：健康人阴性样本对比
进一步的，由图2和表1可见，采用本发明方法的实施例4可以很好检出抗NMDAR抗体病阳性样本，且与对比例1至对比例8的检测结果比较时，在血清更高稀释倍数的情况下，具有更好的灵敏度；由图3和表2可见，采用本发明方法的实施例4可以很好检出阴性样本，特异性符合。
综上所述，本发明方法通过采用GluN1和GluN2B中特定的部分序列的融合表达可以用于NMDAR自身免疫抗体的检出，满足了检测来自不同患者的多样性抗NMDAR抗体，具有特异性和灵敏度，且其检测效果优于对比例1至对比例8的方法。
对比例1至对比例8中，对比例1和对比例2是单独表达GluN1全长（GluN1-1a或GluN1-4a转录本）的检测方法，对比例3和对比例4是融合表达GluN1和GluN2B全长的方法，对比例5至对比例8是融合表达GluN1和GluN2B部分序列的融合表达，但其融合序列与实施例4的融合序列并不相同，属于实施例4中GluN1和GluN2B部分序列加长或缩短的融合序列，由此可见，对比例1至对比例8即使采用GluN1和/或GluN2B全长表达，或者是GluN1和GluN2B部分序列融合表达，但该部分序列并不是本发明记载的特定部分序列，均无法达到本发明相关融合表达检测抗NMDAR抗体所能达到的特异性和灵敏度。
因此，可以将本发明所述GluN1-GluN2B-CD8a hinge-mCherry融合蛋白表达的细胞作为检测人血清和脑脊液中的抗NMDAR抗体的CBA检测试剂，且区别于现有专利CN114891091A和CN114144427A中的检测试剂（现有专利并未记载任何关于其检测试剂在CBA法中基于特异性和灵敏度的相关数据），实现CBA法中抗NMDAR抗体检测的特异性和灵敏度，并满足来自不同患者多样性抗NMDAR抗体的检测。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种GluN1和GluN2B亚基融合表达检测抗NMDAR抗体的CBA方法，其特征在于：将含有GluN1部分序列、GluN2B部分序列以及跨膜序列的重组载体共转染细胞获得检测试剂，将该检测试剂在抗NMDAR抗体的CBA方法中使用，
GluN1部分序列如SEQ ID NO：1所示，GluN2B部分序列如SEQ ID NO：2所示，跨膜序列为CD8a hinge。
2.根据权利要求1所述的CBA方法，其特征在于：重组载体还包括连接肽和荧光标签，连接肽包括连接GluN1部分序列和GluN2B部分序列的第一连接肽，连接GluN2B部分序列和跨膜序列的第二连接肽，以及连接跨膜序列和荧光标签的第三连接肽。
3.根据权利要求2所述的CBA方法，其特征在于：第一连接肽的序列如SEQ ID NO：4所示，第二连接肽的序列如SEQ ID NO：5所示，第三连接肽的序列如SEQ ID NO：6所示。
4.根据权利要求2所述的CBA方法，其特征在于：荧光标签为mCherry。
5.根据权利要求4所述的CBA方法，其特征在于：将重组载体共转染至CHO细胞或293细胞，获得表达GluN1-GluN2B-CD8a hinge-mCherry融合蛋白的检测试剂。
6.根据权利要求1所述的CBA方法，其特征在于：所述CBA方法包括固定CBA法或活细胞CBA法。
7.一种如权利要求1～6任一项所述CBA方法中使用的检测试剂，其特征在于：该检测试剂是将含有GluN1部分序列、GluN2B部分序列以及跨膜序列的重组载体共转染细胞而获得。
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