CN118524851A

CN118524851A - 用于癌症的组合疗法

Info

Publication number: CN118524851A
Application number: CN202280086492.3A
Authority: CN
Inventors: H·C·W·海斯; C·B·伍德; F·C·登普西; S·J·克莱顿; J·A·英厄姆; C·法比安
Original assignee: Medannex Ltd
Current assignee: Medannex Ltd
Priority date: 2021-11-18
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2024-08-20
Also published as: GB202208893D0

Abstract

本发明涉及结合人ANXA1的特异性结合分子与第二活性剂组合用于治疗癌症的用途。第二活性剂包括胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、检查点抑制剂、蛋白酶体抑制剂、紫杉烷、铂基化疗剂和核苷类似物。优选的治疗的癌症是胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤和套细胞淋巴瘤。还提供了相关的试剂盒、产品和用途。

Description

用于癌症的组合疗法

技术领域

本发明涉及用针对膜联蛋白A1(ANXA1)的特异性结合分子与某些其他治疗剂组合来治疗癌症。

背景技术

癌症是一组以异常细胞生长为特征的疾病。典型地，与癌症相关的异常细胞生长导致肿瘤的形成(由于异常细胞生长而形成的固体细胞团)，尽管并非总是如此(特别是在血癌中)。在2010年，全世界死于癌症的人(约800万人)比死于任何其他单一原因的人都要多(Lozano等，Lancet 380：2095-2128，2012)。此外，随着世界人口的老龄化，预计癌症发病率会增加。因此，迫切需要用于癌症的新的和改进的疗法。

此外，许多癌症死亡是癌症对化疗药物产生耐药性的结果。Housman等(Cancers6:1769-1792,2014)综述了癌症产生耐药性的方法。如其中所详述的，癌症可以通过多种不同的机制产生耐药性，所述机制包括药物的失活或代谢(或防止其代谢活化)、药物靶点的突变或改变以及经由ABC转运体的药物外排。此类机制可能导致癌症产生多药耐药性(MDR)。对基于药物的疗法的耐药性发展是当今肿瘤学面临的重大挑战。因此需要针对已经对传统化学疗法有耐药性或已经产生耐药性的癌症的新治疗选择。

本发明提供了癌症的新治疗选择，具体是其中针对膜联蛋白A1(ANXA1)的特异性结合分子(例如抗体)与某些特定伴侣药物组合使用的新疗法。如以下实施例所示，本文所提供的组合在治疗癌症或某些类型的癌症中特别有效。

全长人ANXA1具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。ANXA1是膜联蛋白蛋白家族的成员。该家族的大多数蛋白质(包括ANXA1)的特征在于存在一个包含四个同源重复结构域的“核心”区，每个结构域均包含至少一个Ca²⁺结合位点。该家族的每个成员都以独特的N-端区为特征。ANXA1是一种单体两亲性蛋白，主要位于表达它的细胞的细胞质中。但是，ANXA1也可以输出，导致细胞表面定位(D'Acquisto等，Br.J.Pharmacol.155：152-169，2008)。

已知ANXA1在免疫系统的调节中起作用，涉及先天性免疫系统和适应性免疫系统的各种细胞类型的稳态。例如，ANXA1已显示出对先天性免疫系统的细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞)进行稳态控制，并且还通过调节T细胞受体(TCR)信号传导的强度从而在T细胞中起作用(D'Acquisto等，Blood 109：1095-1102，2007)。已显示，使用针对ANXA1的中和抗体来抑制ANXA1在适应性免疫系统中的作用在治疗各种T细胞介导的疾病中有效，包括诸如类风湿性关节炎和多发性硬化症的自身免疫性疾病(WO 2010/064012；WO 2011/154705)。

针对ANXA1的抗体还被显示在治疗某些精神疾病中有用，特别是焦虑症、强迫症(OCD)和相关疾病(WO 2013/088111)，尽管其发生机制尚不清楚。

WO 2018/146230中公开了许多识别人ANXA1的单克隆抗体。如WO 2020/030827中详述的，发现这些抗体在包含第197-206位、第220-224位和第227-237位氨基酸的不连续表位处(即，在包含SEQ ID NO：17的第197-206位、第220-224位和第227-237位氨基酸的表位处)结合人ANXA1。WO 2018/146230中公开的抗体具有特别有利的性质，因为它们能够以非常高的亲和力与人ANXA1结合。WO 2018/146230中公开的抗体随后显示出具有很强的抗癌活性(WO 2020/030827)。正如WO 2020/030827所证明的，这些抗体展示了对多种癌细胞系具有抗增殖作用，并且还展示了在三阴性乳腺癌的小鼠模型中具有治疗功效。

本发明人现已发现，WO 2018/146230中公开的抗ANXA1抗体与某些其他特定治疗剂的组合治疗提供了意想不到的增强的抗癌效果。

发明内容

因此，在第一方面，本发明提供了用于受试者的癌症的治疗的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中：

(i)所述特异性结合分子包含互补决定区(CDR)VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3、VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，每个所述CDR具有如下氨基酸序列：

VLCDR1具有SEQ ID NO：1、7或8所示的序列，或其包含第9位和/或第11位的保守氨基酸取代的修饰版本；

VLCDR2具有SEQ ID NO：2所示的序列；

VLCDR3具有SEQ ID NO：3所示的序列；

VHCDR1具有SEQ ID NO：4所示的序列；

VHCDR2具有SEQ ID NO：5所示的序列；以及

VHCDR3具有SEQ ID NO：6所示的序列；以及

(ii)所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂。换而言之，本发明提供用于治疗受试者的癌症的如本文定义的特异性结合分子，其中在所述治疗中，将所述特异性结合分子和如本文定义的第二活性剂给药至所述受试者，即，在所述治疗中组合使用所述特异性结合分子和所述第二活性剂。

在第二方面，本发明提供用于受试者的乳腺癌的治疗的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子如上文关于第一方面所定义，所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂。换而言之，本发明提供用于治疗受试者的乳腺癌的如本文定义的特异性结合分子，其中在所述治疗中，将所述特异性结合分子和如本文定义的第二活性剂给药至所述受试者，即，在所述治疗中组合使用所述特异性结合分子和所述第二活性剂。

在第三方面，本发明提供用于受试者的胰腺癌的治疗的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子如上文关于第一方面所定义，所述第二活性剂是核苷类似物。换而言之，本发明提供用于治疗受试者的胰腺癌的如本文定义的特异性结合分子，其中在所述治疗中，将所述特异性结合分子和如本文定义的第二活性剂给药至所述受试者，即，在所述治疗中组合使用所述特异性结合分子和所述第二活性剂。

相关地，在第四方面，本发明提供治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者给药结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子如上文关于第一方面所定义，所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂。

在第五方面，本发明提供治疗受试者的乳腺癌的方法，其包括向所述受试者给药结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子如上文关于第一方面所定义，所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂。

在第六方面，本发明提供治疗受试者的胰腺癌的方法，其包括向所述受试者给药结合人ANXA1的特异性结合分子和核苷类似物，其中所述特异性结合分子如上文关于第一方面所定义。

相关地，在第七方面，本发明提供结合人ANXA1的特异性结合分子在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述特异性结合分子如上文关于第一方面所定义，并且所述癌症的治疗包括向受试者给药所述药物和第二活性剂，其中所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂。

在第八方面，本发明提供结合人ANXA1的特异性结合分子在制造用于治疗乳腺癌的药物中的用途，其中所述特异性结合分子如上文关于第一方面所定义，并且所述乳腺癌的治疗包括向受试者给药所述药物和第二活性剂，其中所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂。

在第九方面，本发明提供结合人ANXA1的特异性结合分子在制造用于治疗胰腺癌的药物中的用途，其中所述特异性结合分子如上文关于第一方面所定义，所述胰腺癌的治疗包括向受试者给药所述药物和核苷类似物。

在第十方面，本发明提供一种药物组合物，其包含结合人ANXA1的特异性结合分子、第二活性剂和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，

其中所述特异性结合分子和所述第二活性剂如上文关于第一方面所定义。

在第十一方面，本发明提供一种试剂盒，其包含结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子和所述第二活性剂如上文关于第一方面所定义。

在第十二方面，本发明提供一种产品，其包含如上文关于第一方面所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，用于在治疗受试者的癌症中单独、同时或顺序使用，其中所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂。

在第十三方面，本发明提供一种产品，其包含如上文关于第一方面所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，用于在治疗受试者的乳腺癌中单独、同时或顺序使用，其中所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂。

在第十四方面，本发明提供了一种产品，其包含如上文关于第一方面所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子和核苷类似物，用于在治疗受试者的胰腺癌中单独、同时或顺序使用。

如下文所述，第三活性剂也可以用于本发明的上述方面。

发明描述

本发明提供有效治疗癌症的新组合。所述组合可用于增加组分相对于其单独使用的功效。在一个实例中，其中一种组分可能会加强其他效果不佳的药物的效果。这对于治疗耐药性癌症特别有用，例如来提供一种新的治疗或来增强癌症已产生耐药性的药物的效果。此外，鉴于使用所述组合实现的增强效果，本发明允许使用较低水平的组分(例如第二或第三活性剂)。在一个优选的方面，所述组合显示出协同作用，即显示出比叠加效应更好的效果。特别地，在这种情况下，可以通过组合使用，来减少一种或两种组分(例如，第二或第三活性剂)的用量，以及来加强组分(例如，第二或第三活性剂)的效果。特异性结合分子可以提供加强第二(或第三)活性剂活性的组合组分，或反之亦然。

如上所述，本发明(部分地)提供用于受试者的癌症(或某些特定癌症)的治疗的结合人ANXA1的特异性结合分子。如本文所定义的“特异性结合分子”是一种与特定分子伴侣特异性结合的分子，在这种情况下，所述分子伴侣为人ANXA1。与人ANXA1特异性结合的分子是一种与人ANXA1结合的亲和力比与其他分子或至少大多数其他分子结合的亲和力更大的分子。因此，例如，如果使结合人ANXA1的特异性结合分子与人类细胞的裂解物接触，则该特异性结合分子将主要结合ANXA1。特别地，所述特异性结合分子与存在于所述人ANXA1上的序列或构型结合。当所述特异性结合分子是抗体时，所述序列或构型是特异性结合分子所结合的表位。上文详细描述了被用于根据本发明用途的特异性结合分子结合的ANXA1表位。

用于本文用途的特异性结合分子不一定只与人ANXA1结合：所述特异性结合分子可能会与某些其他未定义的靶分子交叉反应，或者当与大量分子的混合物(例如细胞裂解物等)接触时，可能会表现出一定程度的非特异性结合。例如，所述特异性结合分子可能会与人膜联蛋白家族的其他成员和/或与来自其他动物的ANXA1蛋白表现出一定程度的交叉反应性。无论如何，用于根据本发明用途的特异性结合分子对ANXA1显示出特异性。技术人员将能够使用本领域中的标准技术，例如ELISA、Western印迹、表面等离振子共振(SPR)等，来容易地鉴定特异性结合分子是否对ANXA1显示出特异性。在具体的实施方案中，用于本文用途的特异性结合分子以小于20nM、15nM或10nM的K_D(解离常数)结合人ANXA1。在一个优选的实施方案中，用于本文用途的特异性结合分子以小于5nM的K_D结合人ANXA1。

测定特异性结合分子与ANXA1结合的K_D的结合条件优选为Ca²⁺离子以至少1mM的浓度存在，并且任选地HEPES以10mM-20mM的浓度存在，并且pH在7至8之间，优选在7.2至7.5(包括)之间的生理水平。可以存在NaCl，例如以100mM-250mM的浓度存在，还可以存在低浓度的去污剂，例如聚山梨酯20。这种低浓度可以是例如从0.01％v/v到0.5％v/v。可以计算出特异性结合分子与其配体之间相互作用的K_D的多种方法在本领域中是公知的。已知技术包括SPR(例如，Biacore)和偏振调制斜入射反射率差(OI-RD)。

如上所述，“与人ANXA1结合”的分子对人ANXA1分子显示出特异性。人ANXA1有三种人类亚型，由四种选择性剪切的ANXA1mRNA翻译获得。全长人ANXA1蛋白是由ANXA1-002或ANXA1-003转录物的翻译获得的，并且如上所述，具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。ANXA1-004和ANXA1-006转录物编码全长人ANXA1蛋白的片段，其分别具有SEQ ID NO：18和19所示的氨基酸序列。

用于根据本发明用途的特异性结合分子结合全长人ANXA1(即SEQ ID NO：17的ANXA1，由ANXA1-002或ANXA1-003转录物编码，其是有346个氨基酸的蛋白)。所述特异性结合分子也可以与全长ANXA1的特定片段、部分或变体结合，例如由ANXA1-004和ANXA1-006转录物编码的片段。

如下文所讨论的，抗体(和含有CDR的分子)形成用于根据本发明用途的优选的特异性结合分子。

如上所述，WO 2018/146230中公开了许多识别人ANXA1的单克隆抗体。WO 2018/146230中公开的一种抗体具有以下CDR序列：

VLCDR1：RSSQSLENSNAKTYLN(SEQ ID NO：1)；

VLCDR2：GVSNRFS(SEQ ID NO：2)；

VLCDR3：LQVTHVPYT(SEQ ID NO：3)；

VHCDR1：GYTFTNYWIG(SEQ ID NO：4)；

VHCDR2：DIYPGGDYTNYNEKFKG(SEQ ID NO：5)；以及

VHCDR3：ARWGLGYYFDY(SEQ ID NO：6)。

WO 2018/146230中公开的另一种抗体具有以下CDR序列：

VLCDR1：RSSQSLENSNGKTYLN(SEQ ID NO：7)；

VLCDR2：GVSNRFS(SEQ ID NO：2)；

VLCDR3：LQVTHVPYT(SEQ ID NO：3)；

VHCDR1：GYTFTNYWIG(SEQ ID NO：4)；

VHCDR2：DIYPGGDYTNYNEKFKG(SEQ ID NO：5)；以及

VHCDR3：ARWGLGYYFDY(SEQ ID NO：6)。

WO 2018/146230中公开的另一种抗体具有以下CDR序列：

VLCDR1：RSSQSLENTNGKTYLN(SEQ ID NO：8)；

VLCDR2：GVSNRFS(SEQ ID NO：2)；

VLCDR3：LQVTHVPYT(SEQ ID NO：3)；

VHCDR1：GYTFTNYWIG(SEQ ID NO：4)；

VHCDR2：DIYPGGDYTNYNEKFKG(SEQ ID NO：5)；以及

VHCDR3：ARWGLGYYFDY(SEQ ID NO：6)。

(按照标准命名法，VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别表示抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3，而VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别表示抗体重链的CDR1、CDR2和CDR3。)

因此，WO 2018/146230中公开的抗体具有相同的CDR序列，VLCDR1序列除外。SEQID NO：7的VLCDR1序列是在鼠抗体MDX-001中发现的野生型VLCDR1序列，鼠抗体MDX-001由从保藏于ECACC、保藏号为10060301的杂交瘤获得的次要mRNA序列构建而成。

产生了MDX-001的人源化版本，令人惊讶的是，发现这些人源化抗体中VLCDR1序列的修饰产生了增强的抗体。SEQ ID NO：7的第11位甘氨酸残基的取代增强了抗体的稳定性和功能。不受理论的束缚，人们认为这是通过去除CDR的翻译后修饰的位点而实现的。具体而言，人们认为该甘氨酸残基的取代从蛋白质上去除了脱酰胺位点。SEQ ID NO：7所示的VLCDR1序列包含序列基序Ser-Asn-Gly。该序列基序与Asn残基的脱酰胺作用有关，Asn残基的脱酰胺作用导致天冬酰胺残基转化为天冬氨酸或异天冬氨酸，这会影响抗体的稳定性和靶标结合。Ser-Asn-Gly基序中的任何一个残基的取代均被认为可以去除脱酰胺位点。

如WO 2018/146230所详述，在SEQ ID NO：7的第11位上的甘氨酸残基(是位于上述脱酰胺位点中的甘氨酸残基)被丙氨酸取代的抗体相对于天然的MDX-001抗体显示与其靶标(ANXA1)的结合增强。包含在第11位的甘氨酸被丙氨酸取代的VLCDR1具有氨基酸序列RSSQSLENSNAKTYLN(标粗的氨基酸为通过上述取代引入的丙氨酸)，如SEQ ID NO：1所示。此外，还发现包含在第9位被修饰(丝氨酸被苏氨酸取代)的VLCDR1的人源化抗体相对于MDX-001表现出与ANXA1的结合增强。包含在第9位的丝氨酸被苏氨酸取代的VLCDR1具有氨基酸序列RSSQSLENTNGKTYLN(标粗的残基为通过上述取代引入的苏氨酸)，如SEQ ID NO：8所示。

用于根据本发明用途的特异性结合分子包含WO 2018/146230中公开的三种抗体中的任一种的CDR序列或其变体。具体地，如上所述，WO 2018/146230中公开的抗体的VLCDR1已被发现至少耐受VLCDR1在第9位和第11位的保守氨基酸取代。因此，用于根据本发明用途的特异性结合分子包含具有如下氨基酸序列的CDR：

VLCDR2具有SEQ ID NO：2所示的序列；

VLCDR3具有SEQ ID NO：3所示的序列；

VHCDR1具有SEQ ID NO：4所示的序列；

VHCDR2具有SEQ ID NO：5所示的序列；以及

VHCDR3具有SEQ ID NO：6所示的序列。

如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸趋于具有相似的特性，因此，对多肽的结构或功能有重要作用的氨基酸的保守取代可以预期比在相同位置的非保守氨基酸取代对多肽的结构/功能的影响要更小。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中被定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，保守氨基酸取代可以被认为是其中特定氨基酸残基被同一家族中的不同氨基酸取代的取代。

因此，在一个具体实施方案中，用于根据本发明用途的特异性结合分子包含VLCDR1，所述VLCDR1是SEQ ID NO：1、7或8的修饰版本，其包含相对于SEQ ID NO：1、7或8所示序列在第9位的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，用于根据本发明用途的特异性结合分子包含VLCDR1，所述VLCDR1是SEQ ID NO：1、7或8的修饰版本，其包含相对于SEQ IDNO：1、7或8所示序列在第11位的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，用于根据本发明用途的特异性结合分子包含VLCDR1，所述VLCDR1是SEQ ID NO：1、7或8的修饰版本，其包含相对于SEQ ID NO：1、7或8同时在第9位和第11位的保守氨基酸取代。

在一个优选的方面，

a)相对于SEQ ID NO：7或1所示的序列在第9位(当该位置的氨基酸为丝氨酸时)的保守氨基酸取代为天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸或酪氨酸；

b)相对于SEQ ID NO：8所示的序列在第9位(当该位置的氨基酸为苏氨酸时)的保守氨基酸取代为天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸或酪氨酸；

c)相对于SEQ ID NO：7或8所示的序列在第11位(当该位置处的氨基酸是甘氨酸时)的保守氨基酸取代为半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；或者

d)相对于SEQ ID NO：1所示的序列在第11位(当该位置的氨基酸为丙氨酸时)的保守氨基酸取代为甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。

在一个优选的实施方案中，用于根据本发明用途的特异性结合分子包含具有如下氨基酸序列的CDR：

VLCDR1具有SEQ ID NO：1、7或8所示的序列；

VLCDR2具有SEQ ID NO：2所示的序列；

VLCDR3具有SEQ ID NO：3所示的序列；

VHCDR1具有SEQ ID NO：4所示的序列；

VHCDR2具有SEQ ID NO：5所示的序列；以及

VHCDR3具有SEQ ID NO：6所示的序列。

最优选地，用于根据本发明用途的特异性结合分子包含具有如下氨基酸序列的CDR：

VLCDR1具有SEQ ID NO：1所示的序列；

VLCDR2具有SEQ ID NO：2所示的序列；

VLCDR3具有SEQ ID NO：3所示的序列；

VHCDR1具有SEQ ID NO：4所示的序列；

VHCDR2具有SEQ ID NO：5所示的序列；以及

VHCDR3具有SEQ ID NO：6所示的序列。

如所指出的，用于根据本发明用途的特异性结合分子包含6个由多肽序列组成的CDR。如本文所用，“蛋白质”和“多肽”是可互换的，并且各自是指2个或更多个氨基酸通过一个或多个肽键连接的序列。因此，特异性结合分子可以是多肽。或者，特异性结合分子可以包含一个或多个包含CDR序列的多肽。优选地，用于根据本发明用途的特异性结合分子是抗体或抗体片段。

构成CDR序列的氨基酸可以包括非天然存在的氨基酸，但它们是天然存在的氨基酸的修饰。如果这些非天然存在的氨基酸不改变序列并且不影响特异性，则它们可以用于产生本文所述的CDR而不降低序列同一性，即被认为提供了CDR的氨基酸。例如，可以使用氨基酸的衍生物，例如甲基化的氨基酸。在一个实施方案中，用于根据本发明用途的特异性结合分子不是天然分子，即不是自然界中发现的分子。

用于根据本发明用途的特异性结合分子可以通过本领域已知的任何方法合成。特别地，可以使用蛋白质表达系统来合成特异性结合分子，例如使用原核(例如细菌)细胞或真核(例如酵母、真菌、昆虫或哺乳动物)细胞的细胞表达系统。可替代的蛋白质表达系统是无细胞的体外表达系统，其中编码特异性结合分子的核苷酸序列在体外转录成mRNA并将该mRNA翻译成蛋白质。无细胞表达系统试剂盒是广泛可得的，并且可以从例如Thermo FisherScientific(美国)购买。或者，可以在非生物系统中化学合成特异性结合分子。液相合成或固相合成可以用于产生能够形成用于根据本发明用途的特异性结合分子的或被包含在用于根据本发明用途的特异性结合分子中的多肽。技术人员可以使用本领域常见的适当方法学容易地产生特异性结合分子。特别地，特异性结合分子可以在哺乳动物细胞(如CHO细胞)中重组表达。

如果需要，用于根据本发明用途的特异性结合分子可以被分离(即被纯化)。如本文所用，“分离”是指特异性结合分子是提供它的任何溶液等的主要组分(即，多数组分)。特别地，如果特异性结合分子最初是产生在混合物或混合溶液中的，则特异性结合分子的分离意味着特异性结合分子已经从其中分离或纯化。因此，例如，如果所述特异性结合分子是多肽，并且使用如上所述的蛋白质表达系统产生所述多肽，则将特异性结合分子分离以使得特异性结合分子是其存在的溶液或组合物中最丰富的多肽，优选构成溶液或组合物中的大多数多肽，并且相对于原始生产培养基中存在的其他多肽和生物分子是富集的。特别地，用于根据本发明用途的特异性结合分子被分离，使得其是溶液或组合物中的主要(多数)特异性结合分子。在优选的特征中，当相对于溶液或组合物中的其他组分(特别是其他多肽组分)的存在进行评估时，特异性结合分子以至少60％w/w、70％w/w、80％w/w、90％w/w、95％w/w或99％w/w的纯度存在于溶液或组合物中。

如果所述特异性结合分子是蛋白质，例如产生在蛋白表达系统中，则可以通过定量蛋白质组学分析特异性结合分子的溶液，以鉴定用于根据本发明用途的特异性结合分子是否是主要的，并因此是分离的。例如，可以使用2D凝胶电泳和/或质谱。这种分离的分子可以存在于下文所述的制剂或组合物中。

可以使用本领域已知的任何技术来分离本发明的特异性结合分子。例如，特异性结合分子可以伴随诸如聚组氨酸标签、链霉素标签、FLAG标签、HA标签等亲和标签一起产生，以能够使用适当的结合伴侣通过亲和层析来分离所述分子，例如可以使用Ni²⁺离子纯化带有聚组氨酸标签的分子。在其中特异性结合分子是抗体的实施方案中，可以利用一种或多种抗体结合蛋白，例如蛋白G、蛋白A、蛋白A/G或蛋白L，使用亲和层析来分离特异性结合分子。或者，可以通过例如尺寸排阻层析或离子交换层析来分离特异性结合分子。相反，通过化学合成(即通过非生物方法)产生的特异性结合分子很可能以分离的形式产生。因此，如果用于根据本发明用途的特异性结合分子以产生分离的分子的方式合成，则其被认为是分离的，不需要特定的纯化或分离步骤。

可以使用任何合适的技术，例如编码DNA序列的定点诱变或固态合成，对SEQ IDNO：1-8所示的CDR的氨基酸序列进行修饰。

除了上述的CDR之外，用于根据本发明用途的特异性结合分子还可包含接头部分或框架序列以允许CDR的适当呈现。还可以存在其他序列，其可以方便地赋予其他性质，例如，允许分离或鉴定含有CDR的分子的肽序列，例如上文所述的那些。在这种情况下，可以产生融合蛋白。

如上所述，用于根据本发明用途的特异性结合分子优选是抗体或抗体片段。本文使用的术语“抗体”是指含有天然免疫球蛋白的所有特征的抗体(如本领域已知的，参见例如WO 2020/030827中的描述，其通过引用并入本文)，以及天然存在的抗体的变体(或包含天然免疫球蛋白的所有特征)，所述变体保留CDR但存在于不同的框架中，如下文所述，并且其以相同的方式起作用，即保留对抗原的特异性。因此，抗体包括功能性等同物或同源物，其中天然存在的结构域已被以相同方式起作用的天然或非天然等同物或同源物部分或全部替换。

当用于根据本发明用途的特异性结合分子是抗体时，它优选是单克隆抗体。“单克隆抗体”是指由单一抗体种类组成的抗体制剂，即制剂中的所有抗体具有相同的氨基酸序列，包括相同的CDR，因此结合其靶抗原(“靶抗原”是指含有被特定抗体结合的表位的抗原，即抗Anx-A1抗体的靶抗原是Anx-A1)上的相同表位并具有相同的效果。换句话说，用于根据本发明用途的抗体优选不是抗体的多克隆混合物的一部分。

如本领域公知的，在抗体中，CDR序列位于重链和轻链的可变域中。CDR序列位于多肽框架内，该框架适当地定位CDR以进行抗原结合。因此，可变域的其余部分(即可变域序列中不形成任何一个CDR的部分的部分)构成框架区。成熟的可变域的N-端形成框架区1(FR1)；CDR1和CDR2之间的多肽序列形成FR2；CDR2和CDR3之间的多肽序列形成FR3；将CDR3连接至恒定域的多肽序列形成FR4。在用于根据本发明用途的抗体或其片段中，可变区框架区可以具有任何合适的氨基酸序列，使得该抗体或其片段通过其CDR与人ANXA1结合。恒定区可以是任何哺乳动物(优选人)抗体同种型的恒定区。

在本发明的某些实施方案中，特异性结合分子可以是多特异性的，例如，双特异性单克隆抗体。多特异性结合分子含有与至少两种不同的分子结合伴侣结合(例如与两种或更多种不同的抗原或表位结合)的区域或结构域(抗原结合区)。在双特异性抗体的情况下，该抗体以标准形式包含两条重链和轻链，除了两条重链和两条轻链的可变域分别不同，因此形成两个不同的抗原结合区。在用于根据本发明用途的多特异性(例如双特异性)结合分子中，例如单克隆抗体中，其中一个抗原结合区具有如本文所定义的用于根据本发明用途的特异性结合分子的CDR序列，因此结合ANXA1。用于根据本发明用途的多特异性结合分子的其他一个或多个抗原结合区与通过用于根据本发明用途的CDR形成的抗原结合区不同，例如，具有序列与本文定义的用于根据本发明用途的特异性结合分子的CDR不同的CDR。特异性结合分子(例如在双特异性抗体中)的一个或多个其他(例如第二)抗原结合区也可以结合ANXA1，但是与结合ANXA1的第一抗原结合区(具有用于根据本发明用途的特异性结合分子的CDR)在不同的表位上结合ANXA1。或者，一个或多个其他(例如第二)抗原结合区可以结合一个或多个非ANXA1的其他的(例如第二)不同抗原。在一个替代性的实施方案中，特异性结合分子中(例如抗体中)的两个或更多个抗原结合区可以各自结合相同的抗原，即提供多价(例如二价)分子。

特异性结合分子可以是能够结合人ANXA1的抗体片段或合成构建体。因此，用于根据本发明用途的抗体片段包含抗原结合域(即，由其衍生的抗体的抗原结合域)，即是抗体的抗原结合片段。在Rodrigo等，Antibodies，第4(3)卷，第259-277页，2015中讨论了抗体片段。用于根据本发明用途的抗体片段优选为单克隆的(即它们不是抗体片段的多克隆混合物的一部分)。抗体片段包括例如Fab、F(ab')₂、Fab′和Fv片段。在Roitt等，免疫学第二版(Immunology second edition)(1989)，伦敦Churchill Livingstone中讨论了Fab片段。Fab片段由抗体的抗原结合域组成，即，单个抗体可以视为含有两个Fab片段，每个Fab片段由轻链和与其相连的重链N-端部分组成。因此，Fab片段包含完整的轻链以及与其结合的重链的V_H和C_H1结构域。Fab片段可以通过用木瓜蛋白酶消化抗体来获得。

F(ab')₂片段由抗体的两个Fab片段以及重结构域的铰链区组成，包括将两条重链连接在一起的二硫键。换句话说，F(ab')₂片段可以看作是两个共价连接的Fab片段。F(ab')₂片段可以通过用胃蛋白酶消化抗体来获得。F(ab')₂片段的还原产生两个Fab'片段，产生的Fab'片段可以看作是含有额外巯基的Fab片段，所述巯基可以用于将该片段与其他分子缀合。

Fv片段仅由轻链和重链的可变域组成。它们不是共价连接的，而是仅通过非共价相互作用微弱地保持在一起。可以修饰Fv片段以产生称为单链Fv(scFv)分子的合成构建体。这种修饰通常以重组的方式进行，通常通过工程改造抗体基因以产生其中单个多肽同时包含V_H和V_L结构域的融合蛋白。scFv片段通常包括共价连接V_H和V_L区的肽接头，这有助于分子的稳定性。所述接头可以包含1至20个氨基酸，例如1、2、3或4个氨基酸，5、10或15个氨基酸，或其他方便的在1至20范围内的中间数。肽接头可以由任何一般方便的氨基酸残基形成，例如由甘氨酸和/或丝氨酸形成。合适的接头的一个实例是Gly₄Ser。可以使用这样的接头的多聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体或五聚体，例如(Gly₄Ser)₂、(Gly₄Ser)₃、(Gly₄Ser)₄或(Gly₄Ser)₅。然而，接头不是必需存在的，并且V_L结构域可以通过肽键连接至V_H结构域。scFv在本文中被定义为抗体片段。

特异性结合分子可以是scFv的类似物。例如，scFv可以连接至其他特异性结合分子(例如其他scFv、Fab抗体片段和嵌合IgG抗体(例如，具有人框架))。scFv可以与其他scFv连接以形成其为多特异性结合蛋白的多聚体，例如二聚体、三聚体或四聚体。双特异性scFv有时被称为双抗体(diabody)，三特异性scFv被称为三抗体(triabody)，四特异性scFv被称为四抗体(tetrabody)。在其他实施方案中，用于根据本发明用途的scFv可以与其他相同的scFv分子结合，从而形成为单特异性的但多价的多聚体，例如可以形成二价二聚体或三价三聚体。

可以使用的合成构建体包括CDR肽。这些是包含抗原结合决定簇的合成肽。也可以使用肽模拟物。这些分子通常是构象受限的有机环，其模拟CDR环的结构，并包括与抗原相互作用的侧链。

如上所述，用于根据本发明用途的特异性结合分子包含具有SEQ ID NO：1、7或8(或其变体)和2-6所示的氨基酸序列的CDR。具体来说，它们衍生自鼠抗体MDX-001或由鼠抗体MDX-001修饰而来。然而，用于根据本发明用途的抗体或其片段优选是人源化的。

用于根据本发明用途的抗体或抗体片段可以是人/小鼠嵌合抗体，或优选地可以是人源化的。对于单克隆抗体和抗体片段尤其如此。当将分子用作人治疗剂时，人源化或嵌合抗体或抗体片段是期望的。出于多种原因，使用非人(例如鼠)抗体对人进行的治疗性治疗可能无效，例如，抗体的体内半衰期短；外源重链恒定区介导的效应子功能弱，这是由于人免疫效应细胞上的Fc受体对非人重链恒定区的识别低；患者对抗体的敏化，以及(在鼠抗体的情况下)人抗小鼠抗体(HAMA)反应的产生；以及HAMA对小鼠抗体的中和作用导致治疗功效的丧失。

嵌合抗体是具有源自一种物种的可变区和源自另一物种的恒定区的抗体。因此，用于根据本发明用途的抗体或抗体片段可以是包含鼠可变域和人恒定域的嵌合抗体或嵌合抗体片段。

用于根据本发明用途的抗体(包括嵌合抗体)可以具有任何抗体同种型(特别是任何人抗体同种型)以及每个同种型内的任何亚型的恒定区。例如，抗体可以是同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体(即，嵌合抗体可以分别包含重链α、δ、ε、γ或μ的恒定域)，尽管优选地，用于根据本发明用途的抗体是IgG同种型。用于根据本发明用途的抗体(例如嵌合抗体)的轻链可以是κ或λ轻链，特别地，它可以包含人λ轻链或人κ轻链的恒定区。相应地，嵌合抗体片段是包含恒定域的抗体片段(例如，Fab、Fab′或F(ab')₂片段)。用于根据本发明用途的嵌合抗体片段的恒定域可以如上文关于嵌合单克隆抗体所述。

嵌合抗体可以使用任何合适的技术产生，例如重组DNA技术，其中将鼠可变域的DNA序列与一个或多个人恒定域的DNA序列融合，以编码嵌合抗体。嵌合抗体片段可以通过使用重组DNA技术产生编码这种多肽的DNA序列来获得，或者通过加工用于根据本发明用途的嵌合抗体以产生需要的片段来获得，如上所述。可以预期嵌合抗体将克服在人类治疗中与使用外源抗体(例如，鼠抗体)相关的体内半衰期短和效应子功能弱的问题，并且可以降低患者敏化和HAMA发生的可能性。然而，由于在可变域中存在鼠序列，因此当向人类患者给药嵌合抗体时，仍然可能发生患者敏化和HAMA。

因此，优选地，用于根据本发明用途的抗体或抗体片段是完全人源化的。人源化抗体是衍生自另一种物种(例如，小鼠)的抗体，其中抗体链的恒定域被人恒定域替换，并且可变区的氨基酸序列被修饰以用人框架序列替换外源(例如鼠)框架序列，从而，优选地，抗体中唯一的非人类序列是CDR序列。人源化抗体可以克服在人体中与非人抗体的治疗性使用相关的所有问题，包括避免或最小化患者敏化和HAMA发生的可能性。

抗体人源化通常通过称为CDR移植的过程进行，尽管可以使用本领域中的任何其他技术。在Williams,D.G.等，Antibody Engineering，第1卷，由R.Kontermann和S.Dübel编辑，第21章，第319-339页中详细地描述了抗体移植。在该过程中，首先产生如上所述的嵌合抗体。因此，在抗体人源化的情况下，首先将非人恒定域替换为人恒定域，产生包含人恒定域和非人可变域的嵌合抗体。

随后的外源(例如鼠)可变域的人源化涉及将来自每个免疫球蛋白链的鼠CDR插入最合适的人可变区的FR内。这是通过将鼠可变域与已知的人可变域的数据库(例如IMGT或Kabat)进行比对来完成的。从最佳匹配的可变域中识别出合适的人框架区，例如人框架区和鼠框架区之间具有高序列一致性的结构域、含有相同长度的CDR的结构域、具有最相似结构(基于同源建模)的结构域等。然后使用重组DNA技术将鼠CDR序列在适当位置移植到先导人框架序列中，然后产生人源化抗体并测试与靶抗原的结合。抗体人源化的过程是技术人员已知和理解的，技术人员可以在没有进一步指导的情况下进行该技术。许多商业公司也提供抗体人源化服务，例如GenScript(美国/中国)或MRC Technology(英国)。如上所述，人源化抗体片段可以容易地从人源化抗体获得。

因此，用于根据本发明用途的抗体或抗体片段可以衍生自任何物种，例如其可以是鼠抗体或抗体片段。然而，优选抗体或抗体片段是嵌合抗体或抗体片段，即，仅抗体或抗体片段的可变域是非人的，而恒定域都是人的。最佳地，用于根据本发明用途的抗体或抗体片段是人源化的抗体或抗体片段。

MDX-001的人源化版本已由发明人开发，如WO 2018/146230中详述。人源化轻链可变域已经被开发，具有SEQ ID NO：9(称为L1M2可变区)和SEQ ID NO：10(称为L2M2可变区)所示的氨基酸序列，其含有上文所述的CDR。在一个具体的实施方案中，用于根据本发明用途的抗体或其片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或与其具有至少70％(优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列或由其组成，其中CDR序列VLCDR1-3如上所定义。

人源化重链可变域已经被开发，具有SEQ ID NO：11(称为H4可变区)和SEQ ID NO：12(称为H2可变区)所示的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，用于根据本发明用途的抗体或其片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或与其具有至少70％(优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列或由其组成，其中CDR序列如上所定义。

优选地，用于根据本发明用途的抗体或其片段包含：

(i)轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或与其具有至少70％(优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列或由其组成，其中CDR序列VLCDR1-3如上所定义；以及

(ii)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或与其具有至少70％(优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列或由其组成，其中CDR序列如上所定义。

在一个特定的实施方案中，用于根据本发明用途的特异性结合分子是IgG1同种型的单克隆抗体，并且包含κ亚型的轻链。L1M2轻链是κ亚型，并具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。H4重链具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，用于根据本发明用途的特异性结合分子是包含L1M2轻链和H4重链的L1M2H4抗体(该抗体也被称为MDX-124)。因此，用于根据本发明用途的特异性结合分子可以是单克隆抗体，其包含以下或由以下组成：

(i)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或与其具有至少70％(优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列或由其组成，其中CDR序列VLCDR1-3如上所定义；以及

(ii)重链，所述重链包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或与其具有至少70％(优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列或由其组成，其中CDR序列VHCDR1-3如上所定义。

类似地，L2M2轻链是κ亚型，并且具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。H2重链具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，用于根据本发明用途的特异性结合分子是包含L2M2轻链和H2重链的L2M2H2抗体(该抗体也被称为MDX-222)。因此，用于根据本发明用途的特异性结合分子可以是单克隆抗体，其包含：

(i)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或与其具有至少70％(优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列或由其组成，其中CDR序列VLCDR1-3如上所定义；以及

(ii)重链，所述重链包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％(优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列或由其组成，其中CDR序列VHCDR1-3如上所定义。

在一个替代性实施方案中，L1M2轻链可以与H2重链配对，并且L2M2轻链可以与H4重链配对。

如技术人员已知的，抗体链本质上是带信号序列产生的。抗体信号序列是位于轻链和重链的N-端处的、在可变区的N-端的氨基酸序列。信号序列指导抗体链从产生它们的细胞中输出。如果在细胞表达系统中产生，则可以编码带有信号序列的具有SEQ ID NO：13-16的氨基酸序列的轻链和重链。L1M2和L2M2轻链的信号序列示于SEQ ID NO：20；H2和H4重链的信号序列示于SEQ ID NO：21。如果带有信号序列合成，则因此L1M2链可以合成为SEQID NO：22所示的氨基酸序列；H4链可以合成为SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；L2M2链可以合成为SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，H2链可以合成为SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。编码这样的序列的核苷酸序列可以由技术人员容易地得到，但是编码SEQ ID NO：22-25的抗体链并且可以用于其合成的合适的核苷酸序列的实例分别示于SEQ ID NO：26-29。

序列同一性可以通过任何方便的方法来评估。但是，为了确定序列之间的序列同一性程度，可以使用成对或多序列比对的计算机程序，例如EMBOSS Needle或EMBOSSstretcher(二者均见Rice,P.等，Trends Genet.16,(6)，第276-277页,2000)可以用于成对序列比对，而Clustal Omega(Sievers F等，Mol.Syst.Biol.7：539，2011)或MUSCLE(Edgar，R.C.，Nucleic Acids Res.32(5)：1792-1797，2004)可以用于多序列比对，尽管可以使用任何其他合适的程序。无论是成对比对还是多个比对，都必须全局(即跨整个参考序列)而不是局部进行。

序列比对和百分比同一性计算可以使用例如标准Clustal Omega参数确定：矩阵Gonnet，空位开放罚分6，空位延伸罚分1。或者，可以使用标准EMBOSS Needle参数：矩阵BLOSUM62，空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5。或者也可以使用任何其他合适的参数。

为了本申请的目的，在通过不同方法获得的序列同一性值之间存在争议的情况下，使用带有默认参数的EMBOSS Needle通过全局成对比对获得的值应视为有效。

如上所述，本发明提供了与各种第二活性剂组合用于一般癌症的治疗和各种特定癌症的治疗的特异性结合分子(如上所定义)。任选地，可以使用其他的活性剂，例如如下文所述的第三活性剂。或者，可以在没有第三活性剂的情况下进行治疗，特别是仅使用特异性结合分子和第二活性剂的情况下。特异性结合分子和第二活性剂(以及任选的第三活性剂，当存在时)作为活性治疗药物。根据本发明可以治疗任何类型的癌症，包括癌(包括腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、移行细胞癌等)、肉瘤、白血病和淋巴瘤。可治疗的癌症包括黑色素瘤、肺癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤癌、淋巴瘤(特别是霍奇金淋巴瘤或套细胞骨髓瘤)、膀胱癌、肾癌、间皮瘤、肝癌和骨髓瘤。

根据本发明，可以治疗任何阶段(或等级)的癌症，包括I期、II期、III期和IV期癌症。转移性和局部性(即非转移性)癌症均可被治疗。在一个优选的方面，通过本发明治疗的癌症是耐药性的，例如是多药耐药性的(MDR)。耐药性癌症是指对一种化疗药物具有耐药性的癌症。癌症具有耐药性的药物可以是第二或第三活性剂。MDR癌症对多于一种化疗药物，特别是对多于一种化疗药物家族有耐药性。MDR癌症可能对2、3、4或5种或更多种不同的化疗药物或化疗药物家族(或类别)有耐药性。术语“MDR癌症”在本领域中是公知的，并且根据其在本领域中的含义在本文中使用。MDR癌症可能对所有已知的化疗药物都有耐药性。多药耐药性可以通过ABC转运体多药耐药性蛋白1(MDR1)、多药耐药性相关蛋白1(MRP1)和乳腺癌耐药性蛋白(BCRP)中的一种或多种的表达来介导。这三种都具有广泛的底物特异性，并且能够从表达它们的细胞中排出多种不同类别的化疗剂。

在本发明的第一方面，本文提供用于受试者的癌症的治疗的如上所定义的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述第二活性剂是胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂或蛋白酶体抑制剂。也就是说，本发明提供与第二活性剂组合用于治疗癌症的如上所定义的特异性结合分子，其中所述第二活性剂是胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂或蛋白酶体抑制剂。

核碱基类似物可以是任何适合用于癌症治疗的核碱基类似物。如本文所提及的，核碱基类似物是一种可以取代核酸分子中的天然核碱基的化合物，例如可以与母体核碱基(核碱基类似物是其类似物)相同的配对碱基形成碱基对。核碱基类似物可以是胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶的任何类似物，其对癌细胞具有细胞毒性作用，和/或适合用于化疗。在一个特定的实施方案中，核碱基类似物是嘧啶类似物，优选尿嘧啶类似物。5-氟尿嘧啶是可以根据本发明使用的核碱基类似物化疗剂。

胸苷酸合成酶抑制剂抑制胸苷酸合成酶。胸苷酸合成酶催化脱氧尿苷单磷酸(dUMP)转化为脱氧胸苷单磷酸(dTMP)，脱氧胸苷单磷酸是一种用于DNA合成的核苷酸。因此，胸苷酸合成酶的抑制会抑制dTMP产生和DNA合成。因此，胸苷酸合成酶抑制剂是抑制胸苷酸合成酶产生dTMP的任何试剂。这种抑制剂可以具有任何作用模式，例如竞争性或非竞争性的。根据本发明可以使用任何适用于化疗的胸苷酸合成酶抑制剂。本领域已知几种胸苷酸合成酶抑制剂(例如上述核碱基类似物5FU是一种胸苷酸合成酶抑制剂)，并且胸苷酸合成酶抑制剂还可以使用测定胸苷酸合成酶活性的已知技术来鉴定，例如氚化5-氟-dUMP结合试验(参见例如Takezawa等，British Journal of Cancer 103：354-361，2010)。

最优选地，核碱基类似物或胸苷酸合成酶抑制剂是5-氟尿嘧啶(5FU)。5FU的结构如下式I所示：

式I(5-氟尿嘧啶)

可以根据本发明使用的另一种示例性胸苷酸合成酶抑制剂是卡培他滨，其在体内转化为5FU(即，其为5FU前药)，因此具有与5FU相同的作用机制。卡培他滨的结构如下式II所示：

式II(卡培他滨)

当特异性结合分子与核碱基类似物或胸苷酸合成酶抑制剂(例如5FU)组合使用时，所述药物可以用于治疗任何癌症。例如，所述组合可以用于治疗结直肠癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌或皮肤癌。在一个优选的实施方案中，所述组合用于治疗胰腺癌或结直肠癌。也就是说，在一个优选的实施方案中，本发明提供如上所定义的特异性结合分子和5FU，用于治疗胰腺癌或结直肠癌。在另一个优选的实施方案中，本发明提供如上所定义的特异性结合分子和卡培他滨，用于治疗胰腺癌。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供如上所定义的特异性结合分子和5FU，用于胰腺癌的治疗。在另一个优选的实施方案中，本发明提供如上所定义的特异性结合分子和5FU，用于结直肠癌的治疗。

根据本发明的这一方面治疗的胰腺癌可以是任何胰腺癌。在一个具体的实施方案中，所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。

如下面的实施例所示，当用于体外治疗胰腺癌细胞系时，用于根据本发明用途的特异性结合分子和5FU的组合在它们对细胞系的抗增殖作用方面表现出显著的协同作用，证明组合这两种药物类型用于治疗癌症有意想不到的好处。

检查点抑制剂是阻断免疫检查点活性的分子。这些抑制剂已被用作抗癌药物，通过激活患者的免疫系统攻击癌细胞。免疫检查点通过防止杀伤健康细胞和自身免疫来控制免疫系统。它们通过阻止T细胞的激活来充当免疫系统的“刹车”。检查点蛋白在免疫细胞表面表达，并与靶细胞或抗原呈递细胞表面的检查点配体结合，从而抑制免疫细胞活性。

PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)是免疫检查点的一个实例。PD-1由T细胞表达，并结合细胞(包括靶细胞、淋巴细胞和抗原呈递细胞)表面表达的PD-L1(程序性死亡配体1)和PD-L2。PD-L1或PD-L2的结合激活PD-1会抑制T细胞的激活和增殖。因此，癌细胞对PD-L1和/或PD-L2的上调作为一种防止其被T细胞破坏的保护机制。肿瘤附近的健康细胞上调PD-L1和/或PD-L2对免疫反应具有类似的削弱作用。

本发明人已发现本文所定义的特异性结合分子与阻断PD-1和PD-L1相互作用的检查点抑制剂的组合在癌细胞的治疗中产生意想不到的有益效果。阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂可以是阻断该相互作用的任何分子，以抑制PD-1并阻断其激活，从而防止对癌症的免疫反应下调。阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂与这些蛋白质中的一种结合，并阻止两种蛋白质之间发生相互作用。因此，阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂可以与PD-1结合或可以与PD-L1结合。在优选的实施方案中，检查点抑制剂与PD-1或PD-L1结合。特别地，这种检查点抑制剂可以与PD-1的PD-L1结合位点或PD-L1的PD-1结合位点结合。为了阻断PD-1与PD-L1和PD-L2两个之间的相互作用，使用与PD-1结合的检查点抑制剂以阻断PD-1与其配体之间的相互作用可能是有益的。

在本发明的特定实施方案中，阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂是与PD-1结合的抗体(优选单克隆抗体，或其衍生物或片段)。在其他实施方案中，阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂是与PD-L1结合的抗体(优选单克隆抗体，或其衍生物或片段)。许多这样的抗体是本领域已知的，例如纳武利尤单抗(Nivolumab)(Bristol-Myers Squibb)，一种人单克隆抗PD1IgG4抗体；派姆单抗(Pembrolizumab)，一种人源化IgG4抗PD-1抗体(Merck)；西米普利单抗(Cemiplimab)(Regeneron/Sanofi)，一种人IgG4抗PD-1抗体；阿替利珠单抗(Atezolizumab)，一种人源化抗PD-L1抗体(Genentech)；和度伐利尤单抗(Durvalumab)，一种人抗PD-L1抗体(Medimmune/Astrazeneca)，均已获得监管部门批准，并且可以根据本发明使用。许多其他这类抗体目前正在开发/试验中，例如替雷利珠单抗(Tislelizumab)，一种人源化抗PD-1抗体(BeiGene)；阿维鲁单抗(Avelumab)，一种全人抗PD-L1抗体((Pfizer/Merck)，并且也可以根据本发明使用。

当特异性结合分子与阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂组合使用时，这些药物可以用于治疗任何癌症。例如，所述组合可以用于治疗黑素瘤、肺癌、乳腺癌、淋巴瘤(特别是霍奇金淋巴瘤)、胃癌、膀胱癌、食管癌、肾癌、间皮瘤、结直肠癌或肝癌。或者，所述组合可以用于治疗具有错配修复缺陷或微卫星不稳定性和/或其是肿瘤突变负荷高(TMB-H)的任何癌症。

微卫星(也称为“短串联重复序列”)是分散在整个基因组(包括编码区和非编码区)中的DNA序列，由重复单元序列组成。单个微卫星通常包含10至60个拷贝的重复单元，所述重复单元的长度范围为1至6个碱基对。由于微卫星的重复性，DNA聚合酶在这些区域比在基因组的其他区域更容易出错。在具有功能性错配修复(MMR)系统的细胞中，MMR机制“校对”新合成的DNA链，纠正聚合酶产生的错误。具有MMR机制缺陷的癌细胞无法校正这些错误，因此其微卫星中的点突变增加了100到1000倍。这种微卫星突变率的增加称为微卫星不稳定性(MSI)(Dudley等，Clin Cancer Res 22(4)：813-820，2016)。“微卫星不稳定性高”(MSI-H)的癌症是一种表现出MSI的癌症。“错配修复缺陷”的癌症是一种缺乏功能性MMR机制的癌症。

TMB-H癌症被定义为是具有≥10个突变/兆碱基的肿瘤。TMB-H和MSI-H肿瘤之间存在重大但不完全的相关性，即大多数但并非全部TMB-H肿瘤也是MSI-H，反之亦然。因此，根据本发明的该实施方案治疗的癌症可以是MSI-H但不是TMB-H、TMB-H但不是MSI-H、或者MSI-H且TMB-H。

优选地，如上所定义的特异性结合分子与阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂组合使用以治疗乳腺癌或肺癌。也就是说，在一个优选的实施方案中，本发明提供用于乳腺癌的治疗的如上所定义的特异性结合分子和阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂。在另一个优选的实施方案中，本发明提供用于肺癌的治疗的如上所定义的特异性结合分子和阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂。

根据本发明的这一方面治疗的乳腺癌可以是任何类型的乳腺癌，但在特定的实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌(即缺乏雌激素受体、孕激素受体和激素表皮生长因子受体HER2表达的乳腺癌)。或者，根据本发明的这一方面治疗的乳腺癌可以是激素受体阳性乳腺癌，即表达雌激素受体、孕激素受体和HER2中的一种或多种。

类似地，根据本发明的这一方面治疗的肺癌可以是任何类型的肺癌，特别地其可以是非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌(SCLC)。

如下面的实施例所示，当用于治疗肺癌和乳腺癌小鼠模型时，用于根据本发明用途的特异性结合分子与阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂的组合表现出显著增强的抗肿瘤效果，证明将这两种药物类型组合用于癌症治疗具有意想不到的益处。

蛋白酶体抑制剂可以是任何适合用于癌症治疗的蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体是细胞中的蛋白质复合物，蛋白酶体在受损(例如错误折叠)或不需要的蛋白质被泛素标记后通过蛋白水解作用降解这些蛋白。哺乳动物中主要的蛋白酶体是胞质26S蛋白酶体，它含有一个20S蛋白亚基(核心颗粒)和两个19S调节帽亚基。核心颗粒由α亚基(结构性)和β亚基(催化性)组成。临床和临床前数据支持了蛋白酶体在维持骨髓瘤细胞永生表型中的作用。蛋白酶体抑制涉及防止促凋亡因子的降解，从而引发肿瘤细胞的程序性细胞死亡。

如本文所提及的，蛋白酶体抑制剂部分或完全抑制蛋白酶体的活性并对癌细胞、特别是多发性骨髓瘤癌细胞具有细胞毒性作用。优选的抑制剂通过结合26S蛋白酶体的催化位点来抑制26S蛋白酶体，但可以通过任何作用模式发挥其抑制作用，例如，竞争性或非竞争性的，并且抑制可以是可逆的或不可逆的。优选地，抑制剂抑制蛋白酶体β亚基5型(PSMB5)。

优选的蛋白酶体抑制剂是肽类似物。优选的抑制剂是硼替佐米、伊沙佐米和卡非佐米。

硼替佐米、伊沙佐米和卡非佐米的结构如下式III-V所示：式III(硼替佐米)

式IV(伊沙佐米)

式V(卡非佐米)

当特异性结合分子与蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、伊沙佐米或卡非佐米)组合使用时，所述药物可以用于治疗任何癌症。例如，所述组合可以用于治疗黑素瘤、肺癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤癌、淋巴瘤(特别是霍奇金淋巴瘤或套细胞骨髓瘤)、膀胱癌、肾癌、间皮瘤、肝癌和骨髓瘤。在一个优选的实施方案中，所述组合用于治疗骨髓瘤(也称为多发性骨髓瘤)或套细胞淋巴瘤。也就是说，在一个优选的实施方案中，本发明提供如上所定义的特异性结合分子和硼替佐米、伊沙佐米或卡非佐米，用于骨髓瘤或套细胞淋巴瘤(特别是硼替佐米，用于治疗骨髓瘤)的治疗。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供一种如上所定义的特异性结合分子和硼替佐米、伊沙佐米或卡非佐米，用于骨髓瘤或套细胞淋巴瘤的治疗。

如下面的实施例所示，当用于体外治疗骨髓瘤细胞系时，用于根据本发明用途的特异性结合分子与硼替佐米的组合对细胞系表现出显著改善的抗增殖作用，证明将这两种药物类型组合用于癌症治疗具有意想不到的益处。特别是，特异性结合分子显示增强了硼替佐米的作用。

在进一步的实施方案中，可以在癌症治疗中使用第三活性剂。第三活性剂可以选自本文针对本发明的这一实施方案或其他实施方案所描述的第二活性剂(即可以使用两种第二活性剂)或者可以使用替代的治疗分子。在本发明的一些方面，还可以使用另外的活性剂，但是在本发明的一些方面，仅使用所述特异性结合分子和所述第二活性剂(和任选的所述第三活性剂)。

在本发明的第二方面，本文提供用于受试者的乳腺癌的治疗的如上所定义的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂。也就是说，本发明提供与第二活性剂组合用于治疗乳腺癌的如上所定义的特异性结合分子，其中所述第二活性剂是紫杉烷或铂基化疗剂。

根据本发明的这一方面治疗的乳腺癌可以是任何乳腺癌。在一个实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在另一个实施方案中，乳腺癌是激素受体阳性乳腺癌。

如上所述，在本发明的这一方面，特异性结合分子可以与紫杉烷组合使用。紫杉烷通过与微管结合并使其稳定来在功能上影响细胞生长，导致细胞周期停滞和细胞凋亡。紫杉烷落入二萜类并含有紫杉二烯核心。可以使用对癌细胞具有细胞毒性作用和/或适合用于化疗的任何紫杉烷，例如紫杉醇、多西紫杉醇或卡巴他赛。在一个优选的实施方案中，所述紫杉烷是紫杉醇。紫杉醇的结构如下式VI所示：

式VI(紫杉醇)

紫杉醇可以以多种制剂形式提供。例如，它可以以紫杉醇蛋白结合制剂的形式提供，例如与白蛋白结合，例如白蛋白结合型紫杉醇(紫杉醇的白蛋白结合纳米颗粒制剂)。紫杉醇的此类替代制剂被认为通过引用紫杉醇而被涵盖。类似的考虑适用于本文描述的其他活性物质。

如上所述，在本发明的这一方面，特异性结合分子可以替代地与铂基化疗剂(即含有铂离子或原子的化疗剂，尤其是作为铂的配位络合物的化疗剂)组合使用。铂基化疗剂可以被称为铂基抗肿瘤剂或铂类(platin)。所有铂基化疗剂以基本相同的方式作用，通过与鸟嘌呤残基的N-7位置反应形成链间和链内DNA交联和DNA-蛋白质交联。所述交联抑制DNA合成和/或修复，并导致细胞凋亡启动(Shen等，Pharmacol.Rev.64:706-721，2012)。可以使用任何铂基化疗剂，例如顺铂、奥沙利铂、奈达铂或卡铂。在一个优选的实施方案中，铂基化疗剂是顺铂。顺铂的结构如下式VII所示：

式VII(顺铂)

因此，在一个优选的实施方案中，本发明的第二方面提供用于受试者的乳腺癌的治疗的如上所定义的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述第二活性剂选自紫杉醇和顺铂(也就是说，其中第二活性剂是紫杉醇或顺铂)。在一个特定的实施方案中，本发明提供用于治疗受试者的乳腺癌的如上所定义的特异性结合分子和紫杉醇。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗受试者的乳腺癌的如上所定义的特异性结合分子和顺铂。

如下面的实施例所示，当用于体外治疗乳腺癌细胞系(具体地，三阴性乳腺癌细胞系)时，用于根据本发明用途的特异性结合分子与顺铂(或紫杉醇)的组合表现出在它们对细胞系的抗增殖作用中具有协同作用，证明将这两种药物类型组合用于乳腺癌治疗具有意想不到的益处。

在进一步的实施方案中，可以在乳腺癌治疗中使用第三活性剂。第三活性剂可以选自本文针对本发明的该实施方案或其他实施方案所描述的第二活性剂(即可以使用两种第二活性剂)或者可以使用替代的治疗分子。在本发明的一些方面，还可以使用另外的活性剂，但是在本发明的一些方面，仅使用所述特异性结合分子和所述第二活性剂(和任选的所述第三活性剂)。

在本发明的第三方面，本文提供用于受试者的胰腺癌的治疗的如上所定义的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述第二活性剂是核苷类似物。也就是说，本发明提供与第二活性剂组合用于治疗胰腺癌的如上所定义的特异性结合分子，其中所述第二活性剂是核苷类似物。

如技术人员所知，核苷由与5碳糖(核糖或2'-脱氧核糖)缀合的核碱基组成。它们与核苷酸的不同之处在于，核苷酸还包含至少一个与糖部分缀合的磷酸基团。

核苷类似物可以是任何核苷的类似物，即腺苷、脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷、胸苷、尿苷、胞苷或脱氧胞苷的类似物。如本文所提及的，核苷类似物是可以取代核酸分子中的天然核苷的化合物，例如可以与母体核苷(核苷类似物是其类似物)相同的配对碱基形成碱基对。用于根据本发明用途的核苷类似物，无论其所基于的天然核苷如何，都具有细胞毒性和/或化学治疗作用，即适合用于癌症治疗。也就是说它是一种化疗核苷类似物。在一个优选的实施方案中，核苷类似物是胞苷和/或脱氧胞苷的类似物。最优选地，核苷类似物是吉西他滨。吉西他滨的结构如下式VIII所示：

式VIII(吉西他滨)

如下面的实施例所示，当用于体外治疗胰腺癌细胞系时，用于根据本发明用途的特异性结合分子与吉西他滨的组合对细胞系表现出显著增强的抗增殖作用，证明将这两种药物类型组合用于胰腺癌治疗具有意想不到的益处。

在进一步的实施方案中，可以在胰腺癌治疗中使用第三活性剂。第三活性剂可以选自本文针对本发明的该实施方案或其他实施方案所描述的第二活性剂(即可以使用两种第二活性剂)或者可以使用替代的治疗分子。在本发明的一些方面，还可以使用另外的活性剂，但是在本发明的一些方面，仅使用所述特异性结合分子和所述第二活性剂(和任选的所述第三活性剂)。

在一个优选的方面，第三活性剂是紫杉烷，优选紫杉醇。

如下面的实施例所示，当用于治疗小鼠模型的胰腺癌时，用于根据本发明用途的特异性结合分子、吉西他滨和紫杉醇的组合对肿瘤表现出显著增强的抗增殖作用，证明将这些药物类型组合用于胰腺癌治疗具有意想不到的益处。因此，在一个优选的方面，胰腺癌使用吉西他滨和紫杉醇来治疗。

用于癌症治疗的优选组合如实施例中所述。

在本发明的上述所有方面中，根据本发明治疗的癌症可以表达ANXA1(这意味着癌症中的细胞表达ANXA1，例如在细胞表面表达)。对于技术人员来说确定癌症是否表达ANXA1是简单的。可以在癌症的活检样本中分析ANXA1表达，例如通过样品的免疫组织化学分析在蛋白质水平上进行。可以按照本领域的标准程序使用抗ANXA1抗体(例如上述抗体)对样品进行免疫染色以检测ANXA1表达。通过透化样品(例如使用去污剂，如本领域标准化的)，可以检测细胞内和细胞外的ANXA1。

或者，可以在核酸水平分析ANXA1表达，例如通过定量PCR(qPCR)。可以使用本领域标准程序从组织样品中提取mRNA并反转录成DNA。然后可以通过靶ANXA1序列的定量扩增来确定ANXA1表达水平。合适的qPCR技术，例如TaqMan，在本领域中是公知的。

在一个具体的实施方案中，所述癌症过表达ANXA1。“过表达ANXA1”是指与来自相同来源的健康组织相比，癌症以更高的水平表达ANXA1。也就是说，癌细胞比来自相同来源的健康细胞(即非癌细胞)以更高的水平表达ANXA1。相同来源是指相同的组织。例如，如果胰腺导管腺癌以比健康胰腺导管组织更高水平的表达ANXA1，则可以认为胰腺导管腺癌过表达ANXA1。因此，癌组织是否过表达ANXA1需要对至少两种不同组织(癌组织和健康对照组织)中的ANXA1表达进行定量比较。可以使用任何适当的技术来进行该比较，尽管qPCR可能是最合适的。对于本领域技术人员而言确定癌症是否过表达ANXA1是简单的。在一个特定的实施方案中，在过表达ANXA1的癌症与健康组织中的ANXA1表达水平之间的差异在统计学上是显著的。在其他实施方案中，癌组织中ANXA1表达相对于相应的健康组织增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更多。

根据本发明治疗的并且表达ANXA1的癌症可以在其表面表达ANXA1(也就是说，ANXA1可以在癌细胞的表面表达)。癌细胞表面ANXA1的表达是指细胞表达ANXA1，并且表达的ANXA1被输出并定位在细胞表面。ANXA1的细胞表面表达可以通过免疫组织化学来鉴定，如上所述。特别地，为了分析ANXA1的细胞表面表达，免疫组织化学分析在没有细胞透化的情况下进行。这意味着用于检测组织上ANXA1的抗体无法进入细胞内部，只能检测到细胞外(例如位于表面的)蛋白质。输出的ANXA1通常附着在细胞表面(而不是释放到血浆或任何其他细胞外空间)，因此任何通过非透化细胞的免疫组织化学检测到的ANXA1都可以被认为是表面定位的ANXA1。但是，按照标准方案，可以在染色之前对组织进行清洗，以去除包括蛋白质在内的松散的细胞外物质。

特异性结合分子、第二和第三活性剂(当使用时)中的一种或多种(优选全部)可以是游离形式的(即不与诸如载体的另一分子结合或缔合)。因此，在一个优选的方面，没有载体用于特异性结合分子、第二和第三活性剂中的一种或多种(优选全部)。

或者，特异性结合分子、第二和第三活性剂(当使用时)中的一种或多种可以与载体结合或缔合。载体可以是颗粒、囊泡或其他固体支持物(例如支架)。在优选的方面，载体(当使用时)不是固体支持物，即特异性结合分子和/或第二活性剂(和/或第三活性剂，当其存在时)与载体缔合，但不结合于载体。在该方面，载体可以例如用于包装特异性结合分子、第二和第三活性剂中的一种或多种，而不与那些分子结合。在一个实施方案中，举例来说，载体可以封装特异性结合分子、第二和第三活性剂中的一种或多种，例如，载体可以是自由移动的脂质囊泡，例如脂质体。

在另一个替代方案中，当使用与特异性结合分子、第二和/或第三活性剂结合或缔合的载体时，所使用的载体是蛋白质的。

当使用载体时，它可以结合特异性结合分子、第二和/或第三活性剂中的一种或多种。然而，当使用时，载体优选仅结合特异性结合分子、第二和/或第三活性剂中的一种。在这种情况下，不同的载体可以用于不同的分子/试剂和/或一种或多种分子/试剂可以是游离形式的。

如本文所述，特异性结合分子和第二活性剂(和第三活性剂，当存在时)可以单独(例如在单独的组合物中)、顺序或同时给药。在后一种情况下，不同的分子/试剂可以组合提供(即在一个组合物中)。在所有情况下，并且如上所述，分子/试剂可以提供用于在有或没有载体的情况下给药。当使用一种或多种载体时，优选每种载体上仅存在特异性结合分子、第二和/或第三活性剂中的一种，即当以相同组合物提供时，其他分子/试剂呈游离形式，或不同的分子/试剂可以使用单独的载体。因此，举例来说，特异性结合分子可以与第一载体一起提供，并且第二活性剂可以单独地与第二载体一起提供，并且第三活性剂(如果存在)可以以游离形式提供。然而，在优选的方面，所有试剂均以游离形式提供。

特异性结合分子、第二活性剂和任选的第三(或另外的)活性剂(当存在时)可以各自以药物组合物的形式给药至待治疗的受试者。这样的组合物可以包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。如本文所用，“药学上可接受的”是指与组合物的其他成分相容并且接受者生理上可接受的成分。组合物的性质和载体或赋形剂材料、剂量等可以根据选择和期望的给药途径等以常规方式选择。剂量同样可以以常规方式确定并且可以取决于分子的性质、患者的年龄、给药模式等。如下面进一步讨论的，特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)可以在相同的药物组合物中或在单独的药物组合物中给药至受试者。

药物组合物可以通过任何合适的方式制备以给药至受试者。此类给药可以是例如口腔、直肠、鼻腔、局部、阴道或肠胃外给药。本文所用的口腔给药包括颊给药和舌下给药。本文所用的局部给药包括经皮给药。如本文所定义的肠胃外给药包括皮下、肌内、静脉内、腹膜内和皮内给药。

本文所公开的药物组合物包括液体溶液或糖浆、固体组合物(例如粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂、乳膏、软膏剂)和本领域通常使用的任何其他形式的组合物。用于此类组合物的合适的药学上可接受的稀释剂、载体和赋形剂是本领域公知的。例如，合适的赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐、植物油、蜡、脂肪和多元醇。合适的载体或稀释剂包括羧甲基纤维素(CMC)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、右旋糖(dextrose)、海藻糖、脂质体、聚乙烯醇、药用级淀粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖(和其他糖)、碳酸镁、明胶、油、乙醇、去污剂和乳化剂(如聚山梨酸酯)。也可以使用稳定剂、湿润剂、乳化剂、甜味剂等。

液体药物组合物，无论其是溶液、悬浮液或是其他类似形式，都可以包括以下一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、林格氏液、等渗氯化钠、不挥发性油(例如合成的单甘酯或双甘酯，其可以用作溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如EDTA；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，例如右旋糖。肠胃外制剂可以装入安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。可注射的药物组合物优选为无菌的。

用于根据本发明用途的药物组合物可以以任何适当的方式给药。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是给药的量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重性这样的因素来确定。方便地，用于根据本发明用途的特异性结合分子和/或第二活性剂(以及任选的第三活性剂)可以以每天、每周或每月的剂量或以中等频率的剂量提供给受试者，例如，可以每2、3、4、5或6天，每2、3、4、5或6周，每2、3、4、5或6个月，每年或每半年提供一次剂量。该剂量可以提供总共至少2周、优选至少2个月，例如在3至24个月的期间内。剂量可以以100ng/kg体重到5g/kg体重的量，例如10μg/kg体重至1g/kg体重的量提供，例如1mg/kg体重至100mg/kg体重。剂量被认为是在单一时间或在连续时间段内应用特异性结合分子或第二活性剂(或第三活性剂)，例如，作为单次推注添加或在离散时间段内连续给药。

当使用已经获得许可的第二(或第三)活性剂时，可以方便地以其许可剂量使用该试剂。例如，5FU可以在第一天以400mg/m²静脉推注的形式给药，然后每两周在46小时内以连续输注的方式2400-3000mg/m²静脉给药。对于体重70kg的成年人，这相当于约11mg/kg(推注)、每次输注68-85mg/kg(视为单剂量)。派姆单抗可以以每3周静脉输注200mg或每6周静脉输注400mg(相当于成人约6-11mg/kg)的方式给药。硼替佐米可以静脉内或皮下给药，每周两次，持续至少两周，成人剂量为1-5mg，随后在后续周期中每周用药。伊沙佐米可以在4周的周期中每周口腔给药一次，成人剂量为1-5mg。卡非佐米可以在第一个周期中每周静脉给药两次，持续三周，成人剂量为10-100mg。其他现有疗法的许可剂量是本领域公知的。或者，第二活性剂(和任选的第三活性剂)与针对ANXA1的特异性结合分子的组合可以使第二活性剂(和/或任选的第三活性剂)的使用剂量低于目前许可使用的剂量，特别是当两种组分之间观察到协同作用时。例如，第二活性剂(和/或任选的第三活性剂)可以以比现有许可剂量低多达10％、20％、30％、40％或50％或更多的剂量使用。熟练的临床医生将能够基于所有相关因素，如年龄、身高、体重和待治疗的病情，计算出患者的适当剂量。

特异性结合分子和第二活性成分可以以上述的量提供，例如，按常规使用或以减少的量。方便地，特异性结合分子和第二活性成分以2000:1至1:2000的摩尔比使用。

优选地，用于根据本发明用途的特异性结合分子和第二活性剂(或含有它们的一种或多种药物组合物)(和任选的第三活性剂)以治疗有效量给药至需要其的受试者。“治疗有效量”是指足以显示出对受试者的病情有益的量。量是否足以显示出对受试者的病情有益，可以由医师/兽医确定。

如上所定义的特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)可以单独、同时或顺序给药至受试者。如本文所用，“单独”给药是指将特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)同时或至少基本同时但通过不同的给药途径给药至受试者。如本文所用，“同时”给药是指将特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)同时或至少基本上同时通过相同的给药途径给药至受试者。如本文所用，“顺序”给药是指将特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)在不同时间给药至受试者。特别地，特异性结合分子的给药在第二活性剂(和任选的第三活性剂)的给药开始之前完成(或反之亦然)。可以进行顺序给药，其中两种药物间隔10分钟至30天给药，例如间隔1小时到96小时(或2周)。当顺序给药至受试者时，两种药物可以通过相同的给药途径或通过不同的给药途径来给药。

用于根据本发明用途的特异性结合分子还可以与放射疗法和/或手术组合给药至受试者。

如上详述，本发明涉及受试者癌症的治疗。治疗可以是(或可以旨在是)治愈性的，但也可以是缓解性的(即仅旨在限制、减轻或改善癌症症状或延长生存期)。优选地，通过治疗减小肿瘤的大小，或者稳定或降低其生长速率。优选将肿瘤尺寸减少至少10％，优选减少至少20％、30％或50％(例如多达30％、50％、75％或100％)，并且优选减少相同水平的生长。

本发明治疗的受试者可以是任何哺乳动物，例如农场动物，如牛、马、绵羊、猪或山羊，宠物动物，例如兔子、猫或狗，或灵长类动物，例如猴子、黑猩猩、大猩猩或人。最优选地，受试者是人。受试者可以是任何患有癌症或被怀疑患有癌症的动物(优选人)。因此，受试者是需要治疗癌症(或如上文详述的本发明的各个方面中所述的具体癌症)的个体。

如上详述，本发明的第一方面提供用于受试者的癌症的治疗的如上所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)，其中所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂。本发明的这一方面可以被视为治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)，其中所述特异性结合分子如上文所定义，所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂。因此，此类方法构成本发明的第四方面。本发明的该第四方面的所有特征可以如上文关于第一方面所定义。

类似地，如上所述，本发明的第二方面提供用于受试者的乳腺癌的治疗的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)，其中所述特异性结合分子如上文所定义，所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂。或者，本发明的这一方面可以被视为提供治疗受试者的乳腺癌的方法，所述方法包括向所述受试者给药结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)，其中所述特异性结合分子如上文关于第一方面所定义，所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂。因此，此类方法构成本发明的第五方面。本发明的该第五方面的所有特征可以如上文关于第二方面所定义。

类似地，如上所述，本发明的第三方面提供用于受试者的胰腺癌的治疗的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)，其中所述特异性结合分子如上文所定义，所述第二活性剂是核苷类似物。或者，本发明的这一方面可以被视为提供治疗受试者的胰腺癌的方法，所述方法包括向受试者给药结合人ANXA1的特异性结合分子和核苷类似物(和任选的第三活性剂)，其中所述特异性结合分子如上所定义。因此，此类方法构成本发明的第六方面。本发明的该第六方面的所有特征可以如上文关于第三方面所定义。

或者，本发明的第一方面可以被视为提供结合人ANXA1的特异性结合分子在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述特异性结合分子如上所定义，并且所述癌症的治疗包括将所述药物和第二活性剂(和任选的第三活性剂)给药至受试者，其中所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂和蛋白酶体抑制剂。因此，此类用途构成本发明的第七方面。本发明的该第七方面的所有特征可以如上文关于第一方面所定义。在这一方面的替代方案中，第二活性剂(和任选的第三活性剂)可以用于制造所述药物，并且所述治疗包括给药所述药物和上文所定义的特异性结合分子。

或者，本发明的第二方面可以被视为提供结合人ANXA1的特异性结合分子在制造用于治疗乳腺癌的药物中的用途，其中所述特异性结合分子如上文所定义，并且所述乳腺癌的治疗包括将所述药物和第二活性剂(和任选的第三活性剂)给药至受试者，其中所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂。因此，此类用途构成本发明的第八方面。本发明的该第八方面的所有特征可以如上文关于第二方面所定义。在这一方面的替代方案中，第二活性剂(和任选的第三活性剂)可以用于制造所述药物，并且所述治疗包括给药所述药物和上文所定义的特异性结合分子。

或者，本发明的第三方面可以被视为提供结合人ANXA1的特异性结合分子在制造用于治疗胰腺癌的药物中的用途，其中所述特异性结合分子如上所定义，并且所述胰腺癌的治疗包括将所述药物和核苷类似物(和任选的第三活性剂)给药至受试者。因此，此类用途构成本发明的第九方面。本发明的该第九方面的所有特征可以如上文关于第三方面所定义。在这一方面的替代方案中，第二活性剂(和任选的第三活性剂)可以用于制造所述药物，并且所述治疗包括给药所述药物和上文所定义的特异性结合分子。

在本发明的第七、第八和第九方面，根据上述教导，所制造的药物可以包含结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂二者(和任选的第三活性剂)，或者可以仅包含结合人ANXA1的特异性结合分子或第二活性剂(和任选的第三活性剂)，在这种情况下所述两种(或三种)药物在单独药物的情况下给药至受试者。

在第十方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的结合人ANXA1的特异性结合分子、如本发明第一方面中所定义的第二活性剂(和任选的第三活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。药物组合物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂如上所述，所有这些教导都适用于本发明的药物组合物。本发明的药物组合物可以用于治疗癌症，特别是上文关于本发明的第一方面所述的癌症。

在第十一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子，以及如关于本发明第一方面所定义的第二活性剂(和任选的第三活性剂)。特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)可以作为单独的组分提供，例如在单独的组合物中，其可以一起在单一容器中提供或在单独的容器中提供。或者，特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)可以在单一容器中的单一组合物中提供。每种治疗剂可以以任何适当的形式提供，例如在水溶液中提供或作为冻干物提供。

在第十二方面，本发明提供一种产品，所述产品包含所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)，用于在治疗受试者的癌症中单独、同时或顺序使用，其中所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂。第十二方面的产品的特征及其用途可以如上文关于第一方面所定义。

在第十三方面，本发明提供一种产品，所述产品包含如上所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)，用于在治疗受试者的乳腺癌中单独、同时或顺序使用，其中所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂。第十三方面的产品的特征及其用途可以如上文关于第二方面所定义。

在第十四方面，本发明提供一种产品，所述产品包含如上文关于第一方面所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子和核苷类似物(和任选的第三活性剂)，用于在治疗受试者的胰腺癌中单独、同时或顺序使用。第十四方面的产品的特征及其用途可以如上文关于第三方面所定义。

在用于根据本发明用途的产品中，特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)可以作为单独的组分提供，例如在单独的组合物中，其可以一起在单一容器中提供或在单独的容器中提供。或者，特异性结合分子和第二活性剂(和任选的第三活性剂)可以在单一容器中的单一组合物中提供。每种治疗剂可以以任何适当的形式提供，例如在水溶液中提供或作为冻干物提供。

本申请中引用的所有文献在此均通过引用整体并入本文。

附图说明

可以通过参考以下的附图和非限制性实施例进一步理解本发明。

图1显示，将抗体MDX-124应用于胰腺癌细胞系MIA PaCa-2(A)和PANC-1(B)，当抗体作为单一试剂使用时，以及当与使用5FU的化疗组合使用时，均显著降低了体外癌细胞增殖。将抗体以0μM至10μM的浓度范围应用于细胞；5FU以其IC₅₀应用；****p<0.0001、***p<0.001以及**p<0.01(MDX-124v MDX-124+5FU IC₅₀)或^op<0.05以及^oop<0.01(MDX-124v IgG同种型对照)。

图2显示，将抗体MDX-124应用于胰腺癌细胞系PANC-1，当抗体作为单一试剂使用时，以及当与使用吉西他滨的化疗组合使用时，均显著降低了体外癌细胞增殖。将抗体以0μM至10μM的浓度范围应用于细胞；吉西他滨以其IC₅₀应用；****p<0.0001、***p<0.001以及**p<0.01(MDX-124v MDX-124+吉西他滨IC₅₀)或^oooop<0.0001(MDX-124v IgG同种型对照)。

图3显示，将抗体MDX-124应用于乳腺癌细胞系HCC1806，当抗体作为单一试剂使用时，以及当与使用顺铂的化疗组合使用时，均显著降低了体外癌细胞增殖。将抗体以0μM至10μM的浓度范围应用于细胞；顺铂以其IC₅₀应用；****p<0.0001(MDX-124v MDX-124+顺铂IC₅₀)或^op<0.05、^oop<0.01以及^ooop<0.001(MDX-124v IgG同种型对照)。该图代表两个独立实验。

图4显示，将抗体MDX-124应用于乳腺癌细胞系HCC1806，当抗体作为单一试剂使用时，以及当与使用紫杉醇的化疗组合使用时，均显著降低了体外癌细胞增殖。将抗体以0μM至10μM的浓度范围应用于细胞；紫杉醇以其IC₂₀应用；****p<0.0001(MDX-124v MDX-124+紫杉醇IC₂₀)或^ooop<0.001以及^oooop<0.0001(MDX-124v IgG同种型对照)。

图5显示EMT6乳腺癌小鼠模型中的平均肿瘤体积。给小鼠接种癌细胞，然后给药载体对照(PBS)、MDX-001(10mg/kg，QW)、抗PD-1抗体(10mg/kg，BIW)或MDX-001和抗PD1组合的方案(每组n＝10)。在所示时间点计算肿瘤体积。如图所示，组合治疗组在降低肿瘤生长方面展示出最佳结果。

图6显示图5中所分析的单个小鼠的EMT6肿瘤体积。结果显示了将用载体处理的小鼠与用抗PD-1抗体(A)或MDX-001加抗PD-1抗体组合疗法(B)处理的小鼠进行比较。如图所示，与给药抗PD-1单一疗法的组相比，给药MDX-001和抗PD-1抗体组合的组中有更多小鼠表现出肿瘤消退。

图7显示LL/2肺癌小鼠模型中的平均肿瘤体积。给小鼠接种癌细胞，然后给药载体对照(PBS)、MDX-001(10mg/kg，QW)、抗PD-1抗体(10mg/kg，BIW)或MDX-001和抗PD-1组合的方案(每组n＝10)。在所示时间点计算肿瘤体积。如图所示，MDX-001和抗PD-1抗体在单独给药时均未表现出抗肿瘤功效，但组合给药时，可看到显著的抗肿瘤效果。

图8显示Pan02胰腺癌小鼠模型中的平均肿瘤体积。给小鼠接种癌细胞，然后给药吉西他滨(80mg/kg，Q3D×4)和白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane，30mg/kg，Q3D×4)(n＝50)或MDX-124(10mg/kg，每周两次)加吉西他滨(80mg/kg，Q3D×4)和白蛋白结合型紫杉醇(30mg/kg，Q3D×4)(n＝30)。在所示时间点计算肿瘤体积并显示为平均肿瘤体积±SEM。

图9显示MDX-124+/-硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞系细胞凋亡的影响。(A)H929、(B)JJN3和(C)U266人骨髓瘤细胞系用MDX-124(20μM)、硼替佐米(20nM)或MDX-124和硼替佐米的组合处理。所有数据均表示为三个独立实验的平均值±SD，每个实验一式两份。统计分析采用双因素方差分析，多组比较采用Tukey校正。

图10显示MDX-124和硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞系中p-STAT3和p-BCL2表达的影响。将每种人多发性骨髓瘤细胞系的等分试样用MDX-124(20μM)、硼替佐米(20nM)或MDX-124和硼替佐米的组合处理4小时，然后用Alexa488标记的p-STAT3(Tyr705)抗体和PE标记的p-BCL2(pS70)抗体染色。将每个分别处理组的(A)p-BCL2和(B)p-STAT3的平均荧光强度值与未处理的对照细胞进行比较。所有数据均表示为三个独立实验的平均值±SD，每个实验一式两份。统计分析采用双因素方差分析，多组比较采用Tukey校正。

图11显示MDX-124和硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞系中细胞内IL-6产生的影响。将每种人多发性骨髓瘤细胞系的等分试样用MDX-124(20μM)、硼替佐米(20nM)或MDX-124和硼替佐米的组合处理24小时，然后在固定并且透化细胞中进行细胞内IL-6分析。将每个分别处理组的IL-6的平均荧光强度值与未处理的对照细胞进行比较。所有数据均表示为三个独立实验的平均值±SD，每个实验一式两份。统计分析采用双因素方差分析，多组比较采用Tukey校正。

具体实施方式

实施例

实施例1-抗ANXA1抗体组合体外针对癌细胞系的测试

MDX-124和5FU的组合针对胰腺癌细胞系

对胰腺癌细胞系MIA-PaCa-2和PANC-1进行MTT细胞增殖试验。细胞系获自英格兰公共卫生培养物保藏中心(Public Health England Culture Collections)。MIA-PaCa-2是人胰腺癌细胞系；PANC-1是人胰腺上皮样癌细胞系。MIA PaCa-2和PANC-1细胞在含有10％FBS、1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺的DMEM中在37℃于含有5％ CO₂的气氛中培养。

MDX-124在说明书上文中进行了描述：它是一种针对ANXA1的人源化IgG1抗体，具有SEQ ID NO：13的轻链和SEQ ID NO：14的重链。

使用MTT比色试验测定细胞增殖以测定细胞代谢活性。在该试验中，NADPH依赖性细胞氧化还原酶将黄色的四唑染料MTT还原为不溶性的紫色甲臜(formazan)产物，通过使用分光光度计在500-600nm处测定吸光度进行定量。甲臜的量与细胞增殖水平成正比，快速分裂的细胞会还原较高水平的MTT。一式三份进行试验。细胞以100μl的最终体积接种。MIAPaCa-2和PANC-1细胞以每孔1×10⁴个的密度接种。

然后在试验之前将细胞培养24小时，然后测定细胞增殖。在增殖试验中，在浓度为2.5-10μM的IgG同种型阴性对照(Thermo Fisher Scientific，美国，目录号31154)存在下，在MDX-124(2.5-10μM)存在下，或在MDX-124(2.5-10μM)与100μM(对于MIA PaCa-2细胞)或1mM(对于PANC-1细胞)的5FU组合存在下，培养细胞72小时。每种处理的抗增殖作用被测定为与未处理的对照细胞相比的百分比响应。

对于两种细胞系，5FU均以其IC₅₀使用。IC₅₀浓度代表物质发挥其最大抑制作用的一半时的浓度。每种细胞系的IC₅₀是通过用1nM至10mM范围内的一系列10倍稀释的5FU进行处理来计算的。MTT试验用于计算与每种浓度的5FU孵育72小时后的癌细胞生存力。这重复8次，将50％细胞无法存活时的平均浓度视为IC₅₀值。

正如预期的那样，MDX-124单独对两种细胞系(尤其是MIA-PaCa-2)表现出相对强大的抗增殖作用。即便如此，与任一单独处理相比，当与5FU(以其IC5₀)组合时，两种细胞系的癌细胞生存力均显著降低(图1)。MDX-124与5FU的组合使MIA PaCa-2和PANC-1细胞系的癌细胞生存力分别降低99.8％和91.2％。结果通过未配对t-检验并使用“SynergyFinder”软件(Ianevski等，Nucleic Acids Research 48(W1)：W488-W493,2020)进行分析，表明MDX-124在与5FU组合使用时具有强大的协同活性。

MDX-124与吉西他滨的组合针对胰腺癌细胞系

如上所述，对胰腺癌细胞系PANC-1进行MTT细胞增殖试验。

使用如上所述的MTT比色试验，使用相同的IgG同种型对照，来测定细胞增殖。在MDX-124(2.5-10μM)存在下或在MDX-124(2.5-10μM)与20μM(吉西他滨对PANC-1细胞的IC₅₀)的吉西他滨组合存在下培养细胞。如上所述计算IC₅₀，使用0.1nM至100μM的吉西他滨稀释范围，重复测定三次以确定50％细胞无法存活时的平均浓度(即IC₅₀)。

正如预期的那样，MDX-124单独对细胞系表现出相对强大的抗增殖作用。即便如此，与任一单独处理相比，当与吉西他滨(以其IC₅₀)组合时，癌细胞生存力显著降低(图2)。通过未配对t-检验分析结果。

MDX-124与顺铂的组合针对乳腺癌细胞系

对三阴性乳腺癌细胞系HCC1806进行MTT细胞增殖试验。细胞系获自ATCC。HCC1806细胞在含有10％ FBS、1％青霉素/链霉素和1％ L-谷氨酰胺的DMEM中在37℃于含有5％CO₂的气氛中培养。

使用如上所述的MTT比色试验，使用相同的IgG同种型对照，来测定细胞增殖。在MDX-124(2.5-10μM)存在下或在MDX-124(2.5-10μM)与0.65μM(顺铂对HCC1806细胞的IC₅₀)的顺铂组合存在下培养细胞。如上所述计算IC₅₀，使用0.1nM至100μM的顺铂稀释范围，重复试验四次以确定50％细胞无法存活时的平均浓度(即IC₅₀)。

正如预期的那样，MDX-124单独对细胞系表现出抗增殖作用，与顺铂组合大幅增强了该作用(图3)。通过未配对t-检验并使用“SynergyFinder”软件(见上文)对结果进行分析，表明MDX-124在与顺铂组合使用时具有强大的协同活性。

MDX-124与紫杉醇的组合针对乳腺癌细胞系

对三阴性乳腺癌细胞系HCC1806进行MTT细胞增殖试验。

使用如上所述的MTT比色试验，使用相同的IgG同种型对照，来测定细胞增殖。在MDX-124(2.5-10μM)存在下或在MDX-124(2.5-10μM)与0.4nM(紫杉醇对HCC1806细胞的IC₂₀)的紫杉醇组合存在下培养细胞。如上所述计算IC₂₀，使用0nM至10nM的紫杉醇稀释范围，重复试验两次以确定20％细胞无法存活时的平均浓度(即IC₂₀)。

正如预期的那样，MDX-124单独对细胞系表现出抗增殖作用，与紫杉醇组合大幅增强了该作用(图4)。通过未配对t-检验并使用“SynergyFinder”软件(见上文)对结果进行分析，表明MDX-124在与紫杉醇组合使用时具有强大的协同活性。

实施例2-在癌症体内模型中抗ANXA1抗体组合的测试

乳腺癌模型

九周龄的雌性BALB/c小鼠皮下接种5×10⁵个EMT6三阴性乳腺癌细胞。一旦肿瘤达到100mm³(使用卡尺测量)，小鼠(每组n＝10)被给予载体对照(PBS)、MDX-001(10mg/kg，每周)、抗PD-1抗体(10mg/kg，每周两次)或MDX-001(10mg/kg，每周)和抗PD-1抗体(10mg/kg，每周两次)的组合方案。每周测量肿瘤体积两次，持续三周。所使用的抗PD-1抗体是小鼠抗体RMP-1-14(Yamazaki等，Journal of Immunology 175(3)：1586-1592,2005)；PBS通过腹腔注射给药；抗体通过静脉注射给药。

如上所述，MDX-001是一种抗ANXA1抗体，它是MDX-124的母体。MDX-001具有分别有SEQ ID NO：30和31所示的氨基酸序列的轻链和重链。

与载体对照相比，MDX-001单一疗法没有显著影响肿瘤生长，但当小鼠接受抗PD-1单一疗法时肿瘤生长明显减慢。当抗PD-1抗体和MDX-001组合使用时，与抗PD-1单一疗法相比，平均肿瘤体积额外减少15％(图5)。值得注意的是，与第18天相比，接受MDX-001加抗PD-1组合疗法的小鼠中有30％在第21天显示出肿瘤消退的证据，而仅接受抗PD-1治疗的小鼠只有10％(图6)。任何处理组均未观察到体重减轻，MDX-001、抗PD-1或组合疗法处理均未观察到不良反应。

肺癌模型

九周龄的雌性C57BL/6小鼠皮下接种3×10⁵个LL/2肺癌细胞。一旦肿瘤达到100mm³(使用卡尺测量)，小鼠(每组n＝10)被给予载体对照(PBS)、MDX-124(10mg/kg，每周)、抗PD-1(10mg/kg，每周两次)或MDX-124(10mg/kg，每周)和抗PD-1(10mg/kg，每周两次)的组合方案。药物按照上述给药。在第2、5、8、12和15天(此时载体组和单一疗法组终止)测量肿瘤体积。组合疗法组在第19天再次测量，然后终止。

使用双因素重复测量方差分析/混合效应模型对结果进行分析。载体组与MDX-124或抗PD-1单一疗法之间没有发现显著差异。然而，MDX-124/抗PD-1组合组的肿瘤生长显著慢于载体对照(P＝0.022)、单独的MDX-124(P＝0.0003)或单独的抗PD-1(P＝0.037)，证明MDX-124和抗PD-1疗法的组合具有协同作用。组合组中的小鼠存活时间更长，并且一直持续研究到第19天，而其他组则在第15天终止研究(图7)。本研究中未发现体重减轻。

实施例3-在胰腺癌体内模型中抗ANXA1抗体组合的测试

胰腺癌模型

八周龄的雌性C57BL/6小鼠皮下接种5×10⁶个Pan02胰腺癌细胞，一旦肿瘤达到100mm³(使用卡尺测量)，就随机分配到处理组。在最初的13天处理阶段，小鼠被给予吉西他滨(Hospira公司，伊利诺伊州森林湖)(80mg/kg，Q3D×4)和白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane，Celgene公司，新泽西州萨米特；Celgene Europe，德国)(30mg/kg，Q3D×4)(n＝50)或MDX-124(10mg/kg，每周两次)加吉西他滨(80mg/kg，Q3D×4)和白蛋白结合紫杉醇(30mg/kg，Q3D×4)的组合方案(n＝30)。药物按照上述给药。还用盐水(BIW，10mL/kg)进行载体对照。在第3、7、10和13天测量肿瘤体积。

在第13天，接受MDX-124加吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的组合方案的组的平均肿瘤体积为92.6mm³，而相比之下单独接受吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的组的平均肿瘤体积为106.7mm³(或相对于载体对照处理的小鼠，数据未显示)。因此，在Pan02小鼠中，与单独给药吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇相比，向吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇中添加MDX-124增加了平均肿瘤生长抑制(图8)。

实施例4-抗ANXA1抗体组合对多发性骨髓瘤细胞系的体外测试

使用多个试验来评估MDX-124与硼替佐米组合对一组人多发性骨髓瘤癌细胞系的抗癌活性。

材料和方法

细胞凋亡试验

使用膜联蛋白V和7-AAD标记评估MDX-124、硼替佐米以及两种试剂的组合对细胞凋亡的影响。将人多发性骨髓瘤细胞系(H929、JJN3和U266，均来自DSMZ，莱布尼兹研究所，德国微生物和细胞培养物保藏中心，GmbH，德国)与MDX-124(20μM)、硼替佐米(20nM，CellSignaling Technology，美国马萨诸塞州)或两种试剂的组合(固定摩尔比为1000:1)在1mL补充有10％ FCS的RPMI培养基中孵育48小时。使用流式细胞术对每个处理组的高于未处理对照细胞水平的细胞凋亡百分比进行定量。

细胞凋亡相关蛋白的表达

使用流式细胞术评估MDX-124、硼替佐米以及两种试剂的组合对2种细胞凋亡相关蛋白p-BCL2和p-STAT3表达的影响。将每种人多发性骨髓瘤细胞系的等分试样用MDX-124(20μM)、硼替佐米(20nM)或MDX-124和硼替佐米的组合处理4小时，然后用Alexa488标记的p-STAT3(Tyr705，来自BD Biosciences，目录#557814)抗体和PE标记的p-BCL2(pS70，BDBiosciences，目录#562532)抗体染色。将每个处理组的平均荧光强度值与未处理的对照细胞进行比较。

IL-6的表达

使用流式细胞术评估每种试剂单独和组合对白介素6(IL-6)表达的影响。将每种人多发性骨髓瘤细胞系的等分试样用MDX-124(20μM)、硼替佐米(20nM)或MDX-124和硼替佐米的组合处理24小时，然后在固定并且透化细胞中进行细胞内IL-6分析。将每个分别处理组的IL-6的平均荧光强度值与未处理的对照细胞进行比较。

结果

细胞凋亡试验

MDX-124单独对细胞凋亡有影响，而单独的硼替佐米与未处理的对照细胞相比显著诱导细胞凋亡(图9)。然而，当与单独的硼替佐米相比时，在硼替佐米中添加MDX-124增强了所有测试细胞系的细胞凋亡(图9)。

细胞凋亡相关蛋白的表达

多发性骨髓瘤中的STAT3过表达与不良预后相关，并被认为在微环境依赖性治疗耐药性中发挥作用。除了其促增殖作用外，STAT3还在多发性骨髓瘤中上调抗细胞凋亡蛋白并导致microRNA失调(Chong等，2019，Cancers，第11(5)卷，731)。

BCL2蛋白是促进细胞存活的癌基因，在多发性骨髓瘤中经常被上调，使其成为有吸引力的靶标(Gupta等，2021，Blood Lymphat.Cancer，第11卷，11-24)。

MDX-124和硼替佐米均单独降低了所测试的多发性骨髓瘤细胞系中p-BCL2或p-STAT3的表达(图10)。然而，在所有测试的细胞系中，与任一单独处理相比，MDX-124和硼替佐米的组合导致p-BCL2和p-STAT3的较大降低(图10)。

IL-6的表达

IL-6不仅是一种生长因子，也是多发性骨髓瘤中的一种生存因子，抑制骨髓瘤细胞的细胞凋亡。降低IL-6的作用与肿瘤生长的消退有关(Harmer等，2019，Front.Endocrinol.，第9卷，doi：10.3389/fendo.2018.00788)。

MDX-124和硼替佐米均适度降低了细胞内IL-6表达，但与任一单独处理相比，MDX-124和硼替佐米的组合导致所有测试的细胞系中较大的降低(图11)。

总体而言，这些数据表明，在多发性骨髓瘤细胞系中，硼替佐米中添加MDX-124加强了任一试剂单独的抗癌作用。

序列表

序列表中提供的序列如下表所示：

Claims

1.用于受试者的癌症的治疗的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中：

VLCDR2具有SEQ ID NO：2所示的序列；

VLCDR3具有SEQ ID NO：3所示的序列；

VHCDR1具有SEQ ID NO：4所示的序列；

VHCDR2具有SEQ ID NO：5所示的序列；以及

VHCDR3具有SEQ ID NO：6所示的序列；以及

(ii)所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂。

2.用于根据权利要求1所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述癌症的治疗中使用第三活性剂。

3.用于根据权利要求1或2所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述第二活性剂为5FU。

4.用于根据权利要求3所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述癌症是胰腺癌或结直肠癌。

5.用于根据权利要求1或2所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述第二活性剂为结合PD-1的抗体或结合PD-L1的抗体。

6.用于根据权利要求5所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述结合PD-1的抗体是纳武利尤单抗、派姆单抗、西米普利单抗或替雷利珠单抗，或者所述结合PD-L1的抗体是阿替利珠单抗、度伐利尤单抗或阿维鲁单抗。

7.用于根据权利要求5或6所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述癌症是乳腺癌或肺癌。

8.用于根据权利要求7所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。

9.用于根据权利要求1或2所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述第二活性剂是硼替佐米、伊沙佐米或卡非佐米。

10.用于根据权利要求9所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述癌症是骨髓瘤或套细胞淋巴瘤。

11.用于受试者的乳腺癌的治疗的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子如权利要求1中所定义，所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂；

优选地，其中所述第二活性剂选自紫杉醇和顺铂。

12.用于根据权利要求11所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中在所述乳腺癌的治疗中使用第三活性剂。

13.用于受试者的胰腺癌的治疗的结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子如权利要求1中所定义，所述第二活性剂是核苷类似物，优选吉西他滨。

14.用于根据权利要求13所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中在所述胰腺癌的治疗中使用第三活性剂。

15.根据权利要求14所述的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述第二活性剂是吉西他滨，所述第三活性剂是紫杉醇。

16.用于根据权利要求1至15任一项所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子的CDR具有如下氨基酸序列：

VLCDR1具有SEQ ID NO：1所示的序列；

VLCDR2具有SEQ ID NO：2所示的序列；

VLCDR3具有SEQ ID NO：3所示的序列；

VHCDR1具有SEQ ID NO：4所示的序列；

VHCDR2具有SEQ ID NO：5所示的序列；以及

VHCDR3具有SEQ ID NO：6所示的序列。

17.用于根据权利要求1至16任一项所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子是抗体或其片段。

18.用于根据权利要求17所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述抗体或其片段是人源化的。

19.用于根据权利要求17或18所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述抗体是单克隆抗体，或者所述抗体片段是Fab、Fab′或F(ab')₂抗体片段或scFv分子。

20.用于根据权利要求19所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述抗体或其片段包含：

i)轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9或10所示的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和

ii)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：11或12所示的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

21.用于根据权利要求20所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子是单克隆抗体，其包含：

i)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和

ii)重链，所述重链包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

22.用于根据权利要求20所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子是单克隆抗体，其包含：

i)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和

ii)重链，所述重链包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

23.用于根据权利要求1至22任一项所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述癌症表达ANXA1。

24.用于根据权利要求1至23任一项所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中将所述特异性结合分子和第二活性剂，以及任选的所述第三活性剂(当存在时)，单独、同时或顺序给药至所述受试者。

25.用于根据权利要求1至24任一项所述用途的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述受试者是人。

26.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子如权利要求1或16-22任一项中所定义，所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂；

优选地，其中所述癌症如权利要求23中所定义，所述给药如权利要求24中所定义和/或所述受试者如权利要求25中所定义。

27.结合人ANXA1的特异性结合分子在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述特异性结合分子如权利要求1或16-22任一项中所定义，并且所述癌症的治疗包括向受试者给药所述药物和第二活性剂，其中所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂；

28.根据权利要求26所述的方法或权利要求27所述的用途，其中：

(i)所述第二活性剂是5FU并且所述癌症是胰腺癌或结直肠癌；

(ii)所述第二活性剂如权利要求5或6中所定义，并且所述癌症如权利要求7或8中所定义；

(iii)所述第二活性剂是硼替佐米、伊沙佐米或卡非佐米并且所述癌症是骨髓瘤或套细胞淋巴瘤；或者

(iv)在所述癌症的治疗中使用第三活性剂。

29.一种治疗受试者的乳腺癌的方法，所述方法包括向所述受试者给药结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，其中所述特异性结合分子如权利要求1或16-22任一项中所定义，所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂；

优选地，其中所述第二活性剂选自紫杉醇和顺铂，所述癌症如权利要求23中所定义，所述给药如权利要求24中所定义，所述受试者如权利要求25中所定义，和/或在所述乳腺症的治疗中使用第三活性剂。

30.一种治疗受试者的胰腺癌的方法，所述方法包括向所述受试者给药结合人ANXA1的特异性结合分子和核苷类似物，其中所述特异性结合分子如权利要求1或16-22任一项中所定义；

优选地，其中所述核苷类似物是吉西他滨，所述癌症如权利要求23中所定义，所述给药如权利要求24中所定义，所述受试者如权利要求25中所定义，和/或在所述胰腺癌的治疗中使用第三活性剂。

31.结合人ANXA1的特异性结合分子在制造用于治疗乳腺癌的药物中的用途，其中所述特异性结合分子如权利要求1或16-22任一项中所定义，并且所述乳腺癌的治疗包括向受试者给药所述药物和第二活性剂，其中所述第二活性剂选自紫杉烷和铂基化疗剂；

优选地，其中所述第二活性剂选自紫杉醇和顺铂，所述癌症如权利要求23中所定义，所述给药如权利要求24中所定义，所述受试者如权利要求25中所定义，和/或在所述乳腺癌的治疗中使用第三活性剂。

32.结合人ANXA1的特异性结合分子在制造用于治疗胰腺癌的药物中的用途，其中所述特异性结合分子如权利要求1或16-22任一项中所定义，所述胰腺癌的治疗包括向受试者给药所述药物和核苷类似物；

33.根据权利要求30所述的方法或权利要求32所述的用途，其中在所述胰腺癌的治疗中使用第三活性剂，并且所述第二活性剂是吉西他滨并且所述第三活性剂是紫杉醇。

34.一种药物组合物，所述药物组合物包含结合人ANXA1的特异性结合分子、第二活性剂和任选的第三活性剂以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，

其中所述特异性结合分子如权利要求1或16-22任一项中所定义，所述第二活性剂如权利要求1、3、5、6或9任一项中所定义，并且所述第三活性剂当存在时优选地如权利要求15中所定义。

35.一种试剂盒，所述试剂盒包含结合人ANXA1的特异性结合分子和第二活性剂，以及任选的第三活性剂，其中所述特异性结合分子如权利要求1或16-22任一项中所定义，所述第二活性剂如权利要求1、3、5、6或9任一项中所定义，并且所述第三活性剂当存在时优选如权利要求15中所定义。

36.一种产品，所述产品包含如权利要求1或16-22任一项中所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子、第二活性剂以及任选的第三活性剂，用于在治疗受试者的癌症中单独、同时或顺序使用，其中所述第二活性剂选自胸苷酸合成酶抑制剂、核碱基类似物、阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的检查点抑制剂以及蛋白酶体抑制剂。

37.用于根据权利要求36所述用途的产品，其中：

(i)所述第二活性剂是5FU，并且所述癌症是胰腺癌或结直肠癌；

(ii)所述第二活性剂如权利要求5或6中所定义，并且所述癌症如权利要求7或8中所定义；或

(iii)所述第二活性剂是硼替佐米、伊沙佐米或卡非佐米，并且所述癌症是骨髓瘤或套细胞淋巴瘤。

38.一种产品，所述产品包含如权利要求1或16-22任一项中所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子、第二活性剂以及任选的第三活性剂，用于在治疗受试者的乳腺癌中单独、同时或顺序使用，其中所述第二活性剂选自选自紫杉烷和铂基化疗剂；

优选地，其中所述第二活性剂选自紫杉醇和顺铂。

39.一种产品，所述产品包含如权利要求1或16-22任一项中所定义的结合人ANXA1的特异性结合分子、核苷类似物以及任选的第三活性剂，用于在治疗受试者的胰腺癌中单独、同时或顺序使用；

优选地，其中所述核苷类似物是吉西他滨和/或所述第三活性剂是紫杉醇。