CN118434442A

CN118434442A - 用于肺癌的治疗性rna

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Publication number: CN118434442A
Application number: CN202280079010.1A
Authority: CN
Inventors: 尤格·萨因; 大卫·韦伯; 卡丽娜·沃尔特; 戴安娜·巴里亚罗丹; 鲁普雷希特·库纳; 梅兰妮·海因; 马丁·苏克汉; 韦雷娜·基斯勒; 莉娜·马林·克兰兹
Original assignee: Biotechnology Europe Inc; TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH
Current assignee: Biotechnology Europe Inc; TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH
Priority date: 2021-10-11
Filing date: 2022-10-10
Publication date: 2024-08-02

Abstract

本公开涉及用RNA治疗肺癌的领域，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)。肺癌在女性中是第三最常见的恶性肿瘤，并且在男性中是第二最常见的恶性肿瘤。NSCLC占所有肺癌的约85％。本文公开了用于治疗肺癌的组合物、用途和方法。向本文公开的患有肺癌的患者施用治疗性RNA可以减小肿瘤大小、延长进行性疾病的时间，和/或防止肿瘤的转移和/或复发，并最终延长存活时间。

Description

用于肺癌的治疗性RNA

本公开涉及使用RNA治疗肺癌的领域，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)。肺癌在女性中是第三最常见的恶性肿瘤，并且在男性中是第二最常见的恶性肿瘤。NSCLC占所有肺癌的约85％。

本文公开了用于治疗肺癌的组合物、用途和方法。向本文公开的患有肺癌的患者施用治疗性RNA可以减小肿瘤大小、延长进行性疾病的时间，和/或防止肿瘤的转移和/或复发，并最终延长存活时间。

发明内容

本发明通常包括对受试者的免疫治疗处理，包括施用RNA(即疫苗RNA)，所述RNA编码一组氨基酸序列(即疫苗抗原)，每个所述氨基酸序列包括肿瘤抗原、其免疫原性变体，或肿瘤抗原或其免疫原性变体的免疫原性片段(即抗原性肽或蛋白质)。因此，疫苗抗原包括肿瘤抗原的表位，用于在受试者中诱导针对肿瘤抗原的免疫应答。施用编码疫苗抗原的RNA以提供(在适当的靶细胞表达多核苷酸之后)抗原，用于诱导(即刺激，引发和/或扩增)针对靶抗原(肿瘤抗原)或其加工产物的免疫应答。在一个实施方案中，根据本公开诱导的免疫应答是T细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中，免疫应答是抗癌免疫应答，特别是抗肺癌免疫应答，例如抗非小细胞肺癌(NSCLC)免疫应答。本文所述的疫苗RNA处理与包括施用除本文所述的疫苗RNA以外的其它治疗剂的额外的治疗组合。在某些实施方案中，这种进一步的治疗剂包括一个或多个免疫检查点抑制剂、一个或多个化疗药物，或其的组合。

本文所述的疫苗包括作为活性成分的单链RNA，所述单链RNA可以在进入受体细胞时翻译成相应的蛋白质。除了野生型或密码子优化的编码抗原序列的序列之外，RNA可以含有一个或多个结构元件，所述结构元件被优化用于RNA的稳定性和翻译效率的最大功效(5’帽、5’UTR、3’UTR和poly(A)尾)。在一个实施方案中，RNA含有所有这些元件。在一个实施方案中，β-S-ARCA(D1)(m₂ ^7,2’-OGppSpG)可用作RNA药物物质的5’端的特异性帽化结构。作为5’UTR序列，可以使用人α-珠蛋白质mRNA的5’UTR序列，任选地与优化的“Kozak序列”一起，以提高翻译效率。作为3’UTR序列，可以使用两个序列元件(F1元件)的组合，所述两个序列元件来源自“分离的氨基端增强子”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)，所述12S核糖体RNA置于编码序列和poly(A)尾之间以确保更高的最大蛋白质水平和延长的mRNA持久性。这些是通过对赋予RNA稳定性和增强总蛋白质表达的序列的离体选择方法来鉴定的(参见WO2017/060314，在此引入作为参考)。此外，可以使用长度为110个核苷酸的poly(A)尾，其由30个腺苷残基的延伸，随后是(随机核苷酸的)10个核苷酸的接头序列和另外70个腺苷残基组成。设计该poly(A)尾序列以增强RNA稳定性和翻译效率。

在一个实施方案中，本文所述的疫苗抗原包括破坏免疫耐受性的氨基酸序列。破坏免疫耐受性的氨基酸序列可以直接或通过接头分开与疫苗序列的C端融合，即抗原性肽或蛋白质。任选地，破坏免疫耐受性的氨基酸序列可以连接抗原肽或蛋白质和MITD，如下文进一步描述的。破坏免疫耐受性的氨基酸序列可以是RNA编码的。在一个实施方案中，抗原靶向RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA一起施用。这种编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA可以含有上述编码抗原的RNA的稳定性和翻译效率而优化的用于RNA的最大功效的结构元件(5’帽、5’UTR、3’UTR、poly(A)尾)。

在一个实施方案中，破坏免疫耐受性的氨基酸序列包括辅助表位。在一个实施方案中，辅助表位可以是破伤风类毒素κ来源的，例如，来源自破伤风梭菌(Clostridiumtetani)的破伤风类毒素(TT)的P2P16氨基酸序列。这些序列可以通过在引发过程中提供肿瘤非特异性T细胞帮助来支持克服用于有效诱导对自身抗原的免疫应答的自身耐受性机制。破伤风类毒素重链包括可以与MHC II类等位基因混杂结合并在几乎所有接种破伤风的个体中诱导CD4+记忆T细胞的表位。此外，与单独应用肿瘤相关抗原相比，已知TT辅助表位与肿瘤相关抗原的结合通过在引发过程中提供CD4+介导的T细胞帮助来改善免疫刺激。为了降低刺激CD8+ T细胞的风险，已知含有混杂结合辅助表位的两个肽序列可用于确保尽可能多地结合MHC II类等位基因，例如P2和P16。

此外，sec(分泌信号肽)和/或MITD(MHC I类运输结构域)可能与抗原编码区域和/或辅助表位编码区域融合，使得相应元件分别以N端或C端标签的形式被翻译。来自编码人MHC I类复合物(HLA-B51、单倍型A2、B27/B51和Cw2/Cw3)的序列的融合蛋白标签已经显示出改善抗原加工和呈递。sec可对应于编码分泌信号肽的78bp片段，所述片段指导新生多肽链转运到内质网中。MITD可对应于MHC I类分子的跨膜结构域和细胞质结构域，也称为MHCI类运输结构域。具有它们自己的分泌信号肽和跨膜结构域的抗原(如CLDN6)可能不需要添加融合标签。编码主要由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的短连接体肽的序列(通常用于融合蛋白)可以用作GS/接头。

疫苗RNA可以与脂质体复合以产生用于静脉内(i.v.)施用的血清稳定的RNA-脂质体复合物(RNA(LIP))。如果使用不同RNA的组合，则可以将RNA分别与脂质体复合以产生用于静脉内(i.v.)施用的血清稳定的RNA-脂质体复合物(RNA(LIP))。RNA(LIP)靶向淋巴器官中的抗原呈递细胞(APC)，其导致免疫系统的有效刺激。

RNA脂质体复合物颗粒可以使用脂质体制备，所述脂质体是通过将脂质在乙醇中的溶液注射到水或合适的水相中可获得的。在一个实施方案中，水相具有酸性pH。在一个实施方案中，水相包括例如约5mM的量的乙酸。脂质体可用于通过将脂质体与RNA混合来制备RNA脂质体复合物颗粒。在一个实施方案中，脂质体和RNA脂质体复合物颗粒包括至少一种阳离子脂质和至少一种额外的脂质。在一个实施方案中，至少一种阳离子脂质包括1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)。在一个实施方案中，至少一种额外的脂质包括1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一个实施方案中，至少一种阳离子脂质包括1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且至少一种额外的脂质包括1,2-二-(9Z-十八烯基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一个实施方案中，脂质体和RNA脂质体复合物颗粒包括1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一个实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种额外的脂质的摩尔比为约2:1。在一个实施方案中，在生理pH下，RNA脂质体复合物颗粒中正电荷与负电荷的电荷比是约1.6:2至约1:2，或约1.6:2至约1.1:2。在具体的实施方案中，在生理pH下，RNA脂质体复合物颗粒中正电荷与负电荷的电荷比是约1.6:2.0、约1.5:2.0、约1.4:2.0、约1.3:2.0、约1.2:2.0、约1.1:2.0或约1:2.0。

在一个实施方案中，疫苗RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制为脂质体复合物颗粒。

在一个方面，本发明涉及组合物或药物制剂，其包括：

(a)至少一种RNA，其中至少一种RNA编码以下氨基酸序列：

(i)氨基酸序列，其包括claudin 6(CLDN6)、其免疫原性变体，或CLDN6或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(ii)氨基酸序列，其包括Kita-kyushu肺癌抗原1(KK-LC-1)、其免疫原性变体，或KK-LC-1或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(iii)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)、其免疫原性变体，或MAGE-A3或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(iv)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)、其免疫原性变体，或MAGE-A4或其免疫原性变体的免疫原性片段；和

(v)氨基酸序列，其包括黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、其免疫原性变体，或PRAME或其免疫原性变体的免疫原性片段；和

(b)进一步的治疗剂，其选自：免疫检查点抑制剂、化疗剂或其组合。

在一个实施方案中，至少一种RNA进一步编码以下氨基酸序列中的一个或两个：

(vi)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)、其免疫原性变体，或MAGE-C1或其免疫原性变体的免疫原性片段；和

(vii)氨基酸序列，其包括纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)、其免疫原性变体，或NY-ESO-1或其免疫原性变体的免疫原性片段。

在一个实施方案中，至少一种RNA进一步编码：

(vi)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)、其免疫原性变体，或MAGE-C1或其免疫原性变体的免疫原性片段。

在一个实施方案中，至少一种RNA编码：

(iv)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)、其免疫原性变体，或MAGE-A4或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(vi)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)、其免疫原性变体，或MAGE-C1或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。

在一个实施方案中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)下的每个氨基酸序列由单独的RNA编码。

在一个实施方案中，

(i)编码(i)下的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(i)下的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，

(i)编码(ii)下的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(ii)下的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，

(i)编码(iii)下的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(iii)下的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，

(i)编码(iv)下的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(iv)下的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，

(i)编码(v)下的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(v)下的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％,85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，

(i)编码(vi)下的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(vi)下的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，

(i)编码(vii)下的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(vii)下的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)下的至少一个氨基酸序列包括破坏免疫耐受性的氨基酸序列和/或至少一种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA共同施用。在一个实施方案中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)下的每个氨基酸序列包括破坏免疫耐受性的氨基酸序列和/或每种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA共同施用。在一个实施方案中，破坏免疫耐受性的氨基酸序列包括辅助表位，优选破伤风类毒素来源的辅助表位。在一个实施方案中，

(i)编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:34的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:34的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)破坏免疫耐受性的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或与SEQID NO:33的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)下的至少一个氨基酸序列由与野生型编码序列相比密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。在一个实施方案中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中的每一个氨基酸序列由与野生型编码序列相比密码子优化和/或其G/C含量增加的编码序列编码，其中密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。

在一个实施方案中，至少一种RNA是修饰的RNA，特别是稳定的mRNA。在一个实施方案中，至少一种RNA包括取代至少一个尿苷的修饰的核苷。在一个实施方案中，至少一种RNA包括取代每个尿苷的修饰的核苷。在一个实施方案中，每种RNA包括取代至少一个尿苷的修饰的核苷。在一个实施方案中，每种RNA包括取代每个尿苷的修饰的核苷。在一个实施方案中，修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。

在一个实施方案中，至少一种RNA包括5’帽m₂ ^7,2’-OGpp_sp(5’)G。在一个实施方案中，每种RNA包括5’帽m₂ ^7,2’-OGpp_sp(5’)G。

在一个实施方案中，至少一种RNA包括5’UTR，所述5’UTR包括SEQ ID NO:35的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，每种RNA包括5’UTR，所述5’UTR包括SEQID NO:35的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

在一个实施方案中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)下的至少一个氨基酸序列包括增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列。在一个实施方案中，(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)下的每个氨基酸序列包括增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列。在一个实施方案中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)下的每个氨基酸序列包括增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列。在一个实施方案中，增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列包括对应于MHC分子、优选MHC I类分子的跨膜结构域和细胞质结构域的氨基酸序列。在一个实施方案中，

(i)编码增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:32的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:32的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列进一步包括编码分泌信号肽的氨基酸序列。在一个实施方案中，

(i)编码分泌信号肽的RNA，所述分泌信号肽包括SEQ ID NO:30的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)分泌信号肽，其包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，至少一种RNA包括3’UTR，所述3’UTR包括SEQ ID NO:36的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，每种RNA包括3’UTR，所述3’UTR包括SEQID NO:36的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

在一个实施方案中，至少一种RNA包括poly-A序列。在一个实施方案中，每种RNA包括poly-A序列。在一个实施方案中，poly-A序列包括至少100个核苷酸。在一个实施方案中，poly-A序列包括SEQ ID NO:37的核苷酸序列或由SEQ ID NO:37的核苷酸序列组成。

在一个实施方案中，RNA被配制为液体、被配制为固体，或其组合。在一个实施方案中，RNA被配制用于注射。在一个实施方案中，RNA被配制用于静脉内施用。

在一个实施方案中，RNA被配制或将被配制为脂质体复合物颗粒。在一个实施方案中，通过将RNA与脂质体混合可获得RNA脂质体复合物颗粒。在一个实施方案中，编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)下的氨基酸序列的至少一种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制或将被共同配制为脂质体复合物颗粒。在一个实施方案中，编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)下的氨基酸序列的每种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制或将被共同配制为脂质体复合物颗粒。在一个实施方案中，编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)下的氨基酸序列的RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制或将被共同配制为脂质体复合物颗粒，其中比例为约4:1至约16:1、约6:1至约14:1、约8:1至约12:1，或约10:1。

在一个实施方案中，组合物或药物制剂包括：

(i)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列；

(ii)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

(iii)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列；

(iv)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；

(v)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和

(vi)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

在一个实施方案中，组合物或药物制剂包括：

(i)RNA，其包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列；

(ii)RNA，其包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列；

(iii)RNA，其包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列；

(iv)RNA，其包括SEQ ID NO:16的核苷酸序列；

(v)RNA，其包括SEQ ID NO:20的核苷酸序列；和

(vi)RNA，其包括SEQ ID NO:24的核苷酸序列。

在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括一种或多种化疗剂。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括紫杉烷(例如多西他赛和/或紫杉醇)、叶酸抗代谢物(例如培美曲塞)、铂化合物(例如顺铂和/或卡铂)或其组合。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括多西他赛。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括多西他赛和雷莫芦单抗。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括多西他赛和尼达尼布。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括紫杉醇。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括紫杉醇和铂化合物，例如顺铂和/或卡铂。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括培美曲塞。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括培美曲塞和铂化合物，例如顺铂和/或卡铂。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括顺铂。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括卡铂。

在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括一种或多种免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括抗体，所述抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及其组合。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括抗PD-1抗体。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括西米普利单抗(LIBTAYO，REGN2810)、纳武单抗(OPDIVO；BMS-936558)、派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475)、匹地利珠单抗(CT-011)、斯巴达珠单抗(PDR001)、MEDI0680(AMP-514)、多塔利单抗(TSR-042)、西利单抗(JNJ63723283)、特瑞普利单抗(JS001)、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、替雷利珠单抗(BGB-A317)、ABBV-181、B1754091或SHR-1210。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括西米普利单抗。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括阿特珠单抗(TECENTRIQ；RG7446；MPDL3280A；R05541267)、度伐利尤单抗(MEDI4736)、BMS-936559、阿维鲁单抗(bavencio)、洛达利单抗(LY3300054)、CX-072(Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035或MDX-1105。

在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括一种或多种化疗剂和一种或多种免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括顺铂和免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括卡铂和免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括紫杉醇和顺铂和/或卡铂的组合(例如，紫杉醇和顺铂的组合、紫杉醇和卡铂的组合，或紫杉醇、顺铂和卡铂的组合)和免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括培美曲塞和顺铂和/或卡铂的组合(例如，培美曲塞和顺铂的组合、培美曲塞和卡铂的组合，或培美曲塞、顺铂和卡铂的组合)和免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗体，所述抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及其组合。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括西米普利单抗(LIBTAYO，REGN2810)、纳武单抗(OPDIVO；BMS-936558)、派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475)、匹地利珠单抗(CT-011)、斯巴达珠单抗(PDR001)、MED10680(AMP-514)、多塔利单抗(TSR-042)、西利单抗(JNJ63723283)、特瑞普利单抗(JS001)、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、替雷利珠单抗(BGB-A317)、ABBV-181、B1754091或SHR-1210。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括西米普利单抗。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括阿特珠单抗(TECENTRIQ；RG7446；MPDL3280A；R05541267)、度伐利尤单抗(MEDI4736)、BMS-936559、阿维鲁单抗(bavencio)、洛达波单抗(LY3300054)、CX-072(Proclaim’CX-072)、FAZ053、KN035或MDX-1105。

在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括一种或多种化疗剂和西米普利单抗。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括顺铂和西米普利单抗。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括卡铂和西米普利单抗。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括紫杉醇和顺铂和/或卡铂的组合(例如，紫杉醇和顺铂的组合、紫杉醇和卡铂的组合，或紫杉醇、顺铂和卡铂的组合)和西米普利单抗。在某些实施方案中，组合物或药物制剂包括培美曲塞和顺铂和/或卡铂的组合(例如，培美曲塞和顺铂的组合、培美曲塞和卡铂的组合，或培美曲塞、顺铂和卡铂的组合)和西米普利单抗。

在某些实施方案中，西米普利单抗包括抗体，所述抗体选自：

(i)抗体，其包括重链和轻链序列，其中：

(a)重链，其包括氨基酸序列：

和

(b)轻链，其包括氨基酸序列：

(iii)抗体，其包括来自SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63的六个CDR序列(例如，来自SEQ ID NO:62的三个重链CDR和来自SEQ ID NO:63的三个轻链CDR)；

(iv)抗体，其包括来自SEQ ID NO:62的重链可变区和来自SEQ ID NO:63的轻链可变区；

(v)抗体，其包括：(a)重链可变区(VH)，其包括CDR-1、CDR-2和CDR-3，所述CDR-1包括氨基酸序列FTFSNFG，所述CDR-2包括氨基酸序列ISGGGRDT，并且所述CDR-3包括氨基酸序列VKWGNIYFDY，和(b)轻链可变区(VL)，其包括CDR-1、CDR-2和CDR-3，所述CDR-1包括氨基酸序列LSINTF，所述CDR-2包括氨基酸序列AAS，并且所述CDR-3包括氨基酸序列QQSSNTPFT的CDR-3。

在一个实施方案中，组合物或药物制剂是药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

在一个实施方案中，药物制剂是试剂盒。在一个实施方案中，RNA和另外的治疗剂在单独的小瓶中。

在一个实施方案中，组合物或药物制剂进一步包括使用组合物或药物制剂治疗或预防肺癌的说明书。

在一个实施方案中，组合物或药物制剂用于药物用途。在一个实施方案中，药物用途包括对疾病或病症的治疗性或预防性治疗。在一个实施方案中，对疾病或病症的治疗性或预防性治疗包括治疗或预防肺癌。在一个实施方案中，组合物或药物制剂用于对人施用。

在另一个方面，本发明涉及治疗受试者的肺癌的方法，其包括施用：

(a)至少一种针对受试者的RNA，其中至少一种RNA编码以下氨基酸序列：

在一个实施方案中，至少一种RNA进一步编码：

在一个实施方案中，至少一种RNA编码：

在一个实施方案中，

(i)编码(i)下的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:3或4的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

在一个实施方案中，

(i)编码(iii)中的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

在一个实施方案中，

(i)编码(iv)中的氨基酸序列的RNA，其包括SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

在一个实施方案中，

(ii)(v)下的氨基酸序列包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，

在一个实施方案中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中的至少一个氨基酸序列由与野生型编码序列相比密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。在一个实施方案中，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)中的每一个氨基酸序列由与野生型编码序列相比密码子优化和/或其G/C含量增加的编码序列编码，其中密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。

在一个实施方案中，至少一种RNA包括55’帽m₂ ^7,2’-OGpp_sp(5’)G。在一个实施方案中，每种RNA包括5’帽m₂ ^7,2’-OGpp_sp(5’)G。

(i)编码分泌信号肽的RNA，其包括SEQ ID NO:30的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

在一个实施方案中，RNA通过注射施用。在一个实施方案中，RNA通过静脉内施用来施用。

在一个实施方案中，RNA被配制成脂质体复合物颗粒。在一个实施方案中，通过将RNA与脂质体混合可获得RNA脂质体复合物颗粒。在一个实施方案中，编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)下的氨基酸序列的至少一种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制为脂质体复合物颗粒。在一个实施方案中，编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)下的氨基酸序列的每种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA共同配制为脂质体复合物颗粒。在一个实施方案中，编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)下的氨基酸序列的RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制为脂质体复合物颗粒，其中比例为约4:1至约16:1、约6:1至约14:1、约8:1至约12:1，或约10:1。

在一个实施方案中，方法包括施用：

(i)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:2；

(ii)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:6；

(iii)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:10；

(iv)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的RNA；

(v)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:18；和

(vi)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:22。

在一个实施方案中，方法包括施用：

(i)RNA，其包括核苷酸序列SEQ ID NO:4；

(ii)RNA，其包括核苷酸序列SEQ ID NO:8；

(iii)RNA，其包括核苷酸序列SEQ ID NO:12；

(iv)RNA，其包括核苷酸序列SEQ ID NO:16；

(v)RNA，其包括核苷酸序列SEQ ID NO:20；和

(vi)RNA，其包括核苷酸序列SEQ ID NO:24。

在某些实施方案中，方法包括施用一种或多种化疗剂。在某些实施方案中，方法包括施用紫杉烷(例如多西他赛和/或紫杉醇)、叶酸抗代谢物(例如培美曲塞)、铂化合物(例如顺铂和/或卡铂)或其组合。在某些实施方案中，方法包括施用多西他赛。在某些实施方案中，方法包括施用多西他赛和雷莫芦单抗。在某些实施方案中，方法包括施用多西他赛和尼达尼布。在某些实施方案中，方法包括施用紫杉醇。在某些实施方案中，方法包括施用紫杉醇和铂化合物(例如顺铂和/或卡铂)。在某些实施方案中，方法包括施用培美曲塞。在某些实施方案中，方法包括施用培美曲塞和铂化合物(例如顺铂和/或卡铂)。在某些实施方案中，方法包括施用包括顺铂。在某些实施方案中，所述方法包括施用卡铂。

在某些实施方案中，方法包括施用一种或多种免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，方法包括施用抗体，所述抗体选自：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及其组合的。在某些实施方案中，方法包括施用抗PD-1抗体。在某些实施方案中，方法包括施用西米普利单抗(LIBTAYO，REGN2810)、纳武单抗(OPDIVO；BMS-936558)、派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475)、匹地利珠单抗(CT-011)、斯巴达珠单抗(PDRO01)、MEDI0680(AMP-514)、多塔利单抗(TSR-042)、西利单抗(JNJ63723283)、特瑞普利单抗(JSO01)、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、替雷利珠单抗(BGB-A317)、ABBV-181、BI 754091或SHR-1210。在某些实施方案中，方法包括施用西米普利单抗。在某些实施方案中，方法包括施用抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，方法包括施用阿特珠单抗(TECENTRIQ；RG7446；MPDL3280A；R05541267)、度伐利尤单抗(MEDI4736)、BMS-936559、阿维鲁单抗(bavencio)、洛达利单抗(LY3300054)、CX-072(Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035或MDX-1105。

在某些实施方案中，方法包括施用一种或多种化疗剂和一种或多种免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，方法包括施用顺铂和免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，方法包括施用卡铂和免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，方法包括施用紫杉醇和顺铂和/或卡铂的组合(例如，紫杉醇和顺铂的组合、紫杉醇和卡铂的组合，或紫杉醇、顺铂和卡铂的组合)和免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，方法包括施用培美曲塞和顺铂和/或卡铂的组合(例如，培美曲塞和顺铂的组合、培美曲塞和卡铂的组合，或培美曲塞、顺铂和卡铂的组合)和免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗体，所述抗体选自：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及其组合。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括西米普利单抗(LIBTAYO，REGN2810)、纳武单抗(OPDIVO；BMS-936558)、派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475)、匹地利珠单抗(CT-011)、斯巴达珠单抗(PDR001)、MEDI0680(AMP-514)、多塔利单抗(TSR-042)、西利单抗(JNJ63723283)、特瑞普利单抗(JS001)、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、替雷利珠单抗(BGB-A317)、ABBV-181、BL 754091或SHR-1210。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括西米普利单抗。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括阿特珠单抗(TECENTRIQ；RG7446；MPDL3280A；R0S541267)、度伐利尤单抗(MEDI4736),、BMS-936559、阿维鲁单抗(bavencio)、洛达利单抗(LY3300054)、CX-072(Proclaim-CX-072)、FAZ053,KN035或MDX-1105。

在某些实施方案中，方法包括施用一种或多种化疗剂和西米普利单抗。在某些实施方案中，方法包括施用顺铂和西米普利单抗。在某些实施方案中，方法包括施用卡铂和西米普利单抗。在某些实施方案中，方法包括施用紫杉醇与顺铂和/或卡铂的组合(例如，紫杉醇和顺铂的组合、紫杉醇和卡铂的组合，或紫杉醇、顺铂和卡铂的组合)和西米普利单抗。在某些实施方案中，方法包括施用培美曲塞和顺铂和/或卡铂的组合(例如，培美曲塞和顺铂的组合、培美曲塞和卡铂的组合，或培美曲塞、顺铂和卡铂的组合)和西米普利单抗。

在某些实施方案中，西米普利单抗包括选自以下的抗体：

(i)抗体，其包括重链和轻链序列，其中：

(a)重链，其包括氨基酸序列：

和

(b)轻链，其包括氨基酸序列：

(v)抗体，其包括：(a)重链可变区(VH)，其包括CDR-1、CDR-2和CDR-3，所述CDR-1包括氨基酸序列FTFSNFG，所述CDR-2包括氨基酸序列ISGGGRDT，并且所述CDR-3包括氨基酸序列VKWGNIYFDY，和(b)轻链可变区(VL)，其包括CDR-1、CDR-2和CDR-3，所述CDR-1包括氨基酸序列LSINTF，所述CDR-2包括氨基酸序列AAS，并且所述CDR-3包括氨基酸序列QQSSNTPFT。

在一个实施方案中，受试者是人。

在一个方面，本文提供了本文所述的RNA用于本文所述的方法，例如，

(i)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括claudin 6(CLDN6)、其免疫原性变体，或CLDN6或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(ii)编码包括氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括Kita-kyushu肺癌抗原1(KK-1LC-1)、其免疫原性变体，或KK-LC-1或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(iii)编码包括氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)、其免疫原性变体，或MAGE-A3或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(iv)编码包括氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)、其免疫原性变体，或MAGE-A4或其免疫原性变体的免疫原性片段；和

(v)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、其免疫原性变体，或PRAME或其免疫原性变体的免疫原性片段；

和任选地一种或多种：

(vi)编码包括氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)、其免疫原性变体，或MAGE-C1或其免疫原性变体的免疫原性片段；和/或

(vii)编码包括氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括纽约食管鳞状细胞癌-1(NV-ESO-1)、其免疫原性变体，或NV-ESO-1或其免疫原性变体的免疫原性片段。

用于所述用途的RNA的实施方案如本文所述，例如关于本发明的组合物或药物制剂或方法。

附图说明

图1：在881个NSCLC肿瘤和37个正常组织部位中靶基因的RNA表达强度。

从肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)和正常组织部位的RNA测序数据计算表达值，单位为每千基对百万读数(rpkm)。

图2：881个NSCLC肿瘤的表达靶点的肿瘤百分比和累积覆盖率。

包括阳性肿瘤的RNA测序表达数据和截止值以比较表达肿瘤百分比的各个靶点和通过靶组合获得的累积覆盖。顶部的数字表示存在、缺失和靶点表达值。靶点从左到右按最高的附加值排序以增加累积覆盖率。

图3：在881个NSCLC肿瘤中表达至少两个、三个或更多个与四个不同的靶组相关的靶点的肿瘤部分。

5核心靶组包括KK-LC-1、MAGEA3、PRAME、MAGEA4和CLDN6，作为覆盖约60％肿瘤的最小靶组，具有5个靶中的至少两个。两个6靶组包括MAGEC1或NY-ESO-1。7靶组包括所有给定的靶点。

图4：164个NSCLC和其它肺部肿瘤以及43个正常组织部位中靶点的RNA表达。

由肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)、其它肺部肿瘤和正常组织部位的定量实时PCR数据计算表达值。归一化的表达值以任意单位(a.u)给出。

图5：164个NSCLC和其它肺部肿瘤的表达靶基因的肿瘤百分比和累积覆盖率。

包括阳性肿瘤的qRT-PCR表达数据和靶特异性截止值以比较通过靶组合实现的表达肿瘤百分比和累积覆盖率的单个靶点。顶部的数字表示存在、缺失和靶点表达值。靶点从左到右按最高的附加值排序以增加累积覆盖率。

图6：在164个NSCLC和其它肺部肿瘤中表达至少两个、三个或更多个与四种不同的靶组相关的靶点的肿瘤部分。

图7：MAGEA3-、KK-LC-1-、CLDN6-、NY-ESO-1-、MAGEA4-、PRAME-和MAGEC1编码RNA在脾中诱导抗原特异性T细胞。

IFN-γELISPOT分析来自用编码MAGEA3、KK-LC-1、CLDN6、NY-ESO-1、MAGEA4、PRAME和MAGEC1的脂质体复合物配制的RNA免疫的小鼠脾的T细胞效应。在最终免疫后5天获得的脾细胞用覆盖相应人蛋白质的肽池或用不相关的对照肽再次刺激。在MAGEC1RNA的情况下，使用电穿孔培养的小鼠BMDC进行脾细胞刺激，用MAGEC1的抗原编码RNA或无关RNA电穿孔作为阴性对照。点代表动物个体；水平条表示三只动物的平均值±SD。

图8：针对KKLC1、CLDN6(A)和PRAME(B)的疫苗诱导的CD8⁺和CD4⁺ T细胞应答。在使用单独的TAA PepMix脉冲PBMC后，测量患者WO5YAH(A)和患者AW8VMT(B)在8次疫苗接种前(V1)和接种后(FU)的体外T细胞应答。阴性对照，PBMC/仅细胞：与培养基孵育的PBMC；阳性对照，PBMC与抗CD3抗体孵育。

图9：通过RT-qPCR分析基因表达的方法的概述。

图10：通过BNT116在人HLA转基因的AZ/DR1小鼠中诱导的从头抗原特异性CD8⁺ T细胞

在第1天、第8天和第15天，C57BL/6A2/DR1小鼠通过IV接种三次2μg MAGE-A3 RNA-LPX(RBL003.3[研究级]，n＝5)(A)或PRAME、CLDN6、KK-LC-1、MAGE-A4或MAGE-C1 RNA-LPX(n＝3/组)(B)(分别为RBL012.2、RBL005.3、RBL007.2、RBL027.2或RBL035.2[CTM])。在第20天通过ELISpot用BNT116肽混合物或P2P16P17肽混合物(覆盖辅助表位P2P16)离体再刺激后脾细胞的IFN-γ产生来分析抗原特异性T细胞的诱导。对照用无关的人巨细胞病毒(hCMV)pp65_495-504肽再次刺激。单个数据点代表每只小鼠三次重复的平均值。水平线和误差条表示每组的平均值±SEM。用PRAME PepMix对PRAME RNA-LPX免疫组中一只小鼠的脾细胞进行再刺激导致IFN-γ斑点数太多而不能计数。假定斑点数为1,700，以便进行统计分析(B)。通过单向重复测量ANOVA和Dunnett多重比较试验确定用同源或不相关肽混合物再刺激的组之间的统计学显著性。注意：(A)和(B)中的数据集之间的斑点计数灵敏度不同，并且不能比较绝对值。*p≤0.05，**p≤0.01，****p<0.0001。

ANOVA＝方差分析；CTM＝临床试验材料；ELISpot＝酶联免疫吸附斑点；hCMV＝人巨细胞病毒；IFN＝干扰素；IV＝静脉注射；RNA-LPX＝核糖核酸脂质体复合物。

来源：研究号R-21-0164(A)，R-21-0358(B)。

图11：通过单次注射BNT116，在人源HLA转基因A2/DR1小鼠中从头诱导抗原特异性T细胞。

在第1天，第8天和第15天，C57BL/6A2/DR1小鼠通过IV接种三次所有六个BNT116RNA(PRAME[RBL012.2]、CLDN6[RBL005.3]、KK-LC-1[RBL007.2]、MAGE-3[RBL003.3]、MAGE-A4[RBL027.2]和MAGE-C1[RBL035.2])的混合物，或是先配制然后混合(方法1)，或是先混合然后配制(方法2)。根据方法1接受BNT116的小鼠每只小鼠施用10.8μg，根据方法2接受BNT116的小鼠每只小鼠施用9.2μg。在第20天通过ELISpot用BNT116肽混合物或P2P16P17肽混合物(覆盖辅助表位P2P16)离体再刺激后脾细胞的IFN-γ产生来分析抗原特异性T细胞的诱导。对照孔用无关的人巨细胞病毒(hCMV)pp65495-504肽再次刺激。单个数据点代表每只小鼠三次重复的平均值。水平线和误差条表示每组的平均值±SEM。根据格拉布斯法异常值检验(Grubbs'outlier test)去除异常值(α＝0.05；在PRAME，过程2中去除异常值；KK-LC-1，方法1和方法2；MAGE-A3，方法2；MAGE-A4，方法2；对照，方法1)。通过未配对的双尾t检验确定统计学显著性。

**p≤0.01。只有显著的差异被标记。

序列描述

下表提供了本文引用的某些序列的列表。

具体实施方式

尽管下文详细描述了本公开，但应理解，本公开不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，且不旨在限定本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

优选地，本文所用的术语如“生物技术术语的多语言术语表：(IUPAC建议)(Amultilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations))”，H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.编,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,瑞士,(1995)。

除非另有说明，本公开的实践将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，这些方法在本领域的文献中进行了解释(参见，例如，MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。

在下文中，将描述本公开的元件。这些元件与特定实施方案一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式和以任何数量组合以创建额外的实施方案。各种描述的实例和实施方案不应被解释为将本公开仅限于明确描述的实施方案。该描述应当被理解为公开并包括将明确描述的实施方案与任何数量的所公开的元件相结合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本说明书应认为所有所述元件的任何排列和组合都是公开的。

术语“约”是指大致或接近，并且在本文所述的数值或范围的上下文中，在一个实施方案中是指所述或要求保护的数值或范围的±20％、±10％、±5％或±3％。

在描述本公开(尤其是在权利要求的上下文中)的上下文中使用的术语“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”和类似的参考是用来描述公开内容的，除非此处另有明确指示或上下文明确与之相矛盾，否则旨在涵盖单数和复数形式。本文中值的范围的表述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独的值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值被并入说明书中，就好像其在本文中被单独地陈述一样。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，而不对权利要求的范围构成限定。本说明书中的语言不应被解释为指示实施本公开所必需的任何未要求保护的要素。

除非另有明确说明，否则术语“包括”在在本文档的上下文中用于表明除了由“包括”引入的成员列表之外，还可以选择性地存在其它成员。然而，作为本公开的具体实施方案，预期术语“包括”涵盖不存在其它成员的可能性，即，出于本实施方案的目的，“包括”应理解为具有“由……组成”的含义。

在本说明书全文中引用了数篇文献。本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是上文还是下文，都通过引用全文结合到本文中。本文中的任何内容都不应被解释为承认本公开内容不具有先于这种公开内容的权利。

定义

在下文中，将提供适用于本公开的所有方面的定义。除非另有说明，以下术语具有以下含义。任何未定义的术语具有其本领域公认的含义。

如本文所用的术语例如“减少”、“降低”、“抑制”或“损害”涉及总减少或引起总减少的能力，优选至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、至少75％或甚至更高的水平。这些术语包括完全或基本上完全的抑制，即减少至零或基本上至零。

术语例如“增加”、“增强”或“超过”优选涉及增加或增强至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少100％、至少200％、至少500％或甚至更多。

如本文所用的“生理pH”是指约7.5的pH。

术语“离子强度”是指特定溶液中不同种类离子种类的数目与其各自电荷之间的数学关系。因此，离子强度I在数学上由下式表示

其中c是特定离子种类的摩尔浓度并且z是其电荷的绝对值。求和Σ涵盖溶液中所有不同种类的离子(i)。

根据本公开，在一个实施方案中，术语“离子强度”涉及单价离子的存在。关于二价离子的存在，特别是二价阳离子的存在，由于螯合剂的存在，它们的浓度或有效浓度(游离离子的存在)在一个实施方案中足够低以防止RNA的降解。在一个实施方案中，二价离子的浓度或有效浓度低于RNA核苷酸之间的磷酸二酯键的水解的催化水平。在一个实施方案中，游离二价离子的浓度为20μM或更低。在一个实施方案中，不存在或基本上不存在游离二价离子。

术语“冷冻”涉及液体的固化，通常伴随着热量的去除。

术语“冻干(lyophilizing)”或“冻干(lyophilization)”是指通过冷冻物质并随后降低周围压力以允许物质中的冷冻介质直接从固相升华到气相来冷冻干燥该物质。

术语“喷雾干燥”是指通过在容器(喷雾干燥器)内混合(加热)气体和雾化(喷雾)的流体来喷雾干燥物质，其中来自形成的液滴的溶剂蒸发，导致干粉。

术语“冷冻保护剂”涉及添加到制剂中以便在冷冻阶段期间保护活性成分的物质。

术语“冻干保护剂”涉及添加到制剂中以便在干燥阶段期间保护活性成分的物质。

术语“重构”涉及向干燥产物中加入溶剂(如水)以使其返回到液态，如其原始液态。

“分离的”是指从天然状态改变或移除。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞。

在本公开的上下文中，术语“重组的”是指“通过基因工程制备的”。在一个实施方案中，本公开的上下文中的“重组对象”不是天然存在的。

如本文所用的术语“天然存在的”是指对象可以在自然中被找到的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离并且在实验室中没有被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”是指“在自然界中存在”，并且包括已知对象以及尚未被发现和/或从自然界中分离，但是在将来可以被发现和/或从自然源中分离的对象。

在本公开的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如微米或纳米尺寸的致密结构。

在本公开的上下文中，术语“RNA脂质体复合物颗粒”涉及含有脂质的颗粒，特别是阳离子脂质和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA脂质体复合物颗粒的复合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可以使用阳离子脂质(例如DOTMA)和额外的脂质(例如DOPE)合成。在一个实施方案中，RNA脂质体复合物颗粒是纳米颗粒。

在颗粒制剂中，可以将每种RNA(例如编码不同疫苗抗原的RNA)分别配制为单独的颗粒制剂。在那种情况下，每种单独的颗粒制剂将包括一种RNA。单独的颗粒制剂可以作为单独的实体存在，例如在单独的容器中。这样的制剂可通过分别提供每种RNA(通常每种为含RNA的溶液的形式)以及颗粒形成剂来获得，从而允许形成颗粒。当形成颗粒(单独的颗粒制剂)时，各个颗粒将仅包括所提供的特定RNA种类。在一个实施方案中，组合物如药物组合物包括一种以上的单独颗粒制剂。相应的药物组合物被称为混合颗粒制剂。根据本发明的混合颗粒制剂可通过分别形成如上所述的单个颗粒制剂，随后混合单个颗粒制剂的步骤来获得。通过混合步骤，可以获得包括包含RNA颗粒混合群的制剂(为了便于说明：例如，第一颗粒群可以含有编码疫苗抗原的RNA，第二颗粒群可以含有编码不同疫苗抗原的RNA)。单个颗粒群可以在一个容器中在一起，包括单个颗粒制剂的混合群。或者，可以将药物组合物的不同RNA种类(例如编码疫苗抗原的RNA和编码不同疫苗抗原的RNA)一起配制为组合的颗粒制剂。这种制剂可通过提供不同RNA种类的组合制剂(通常为组合溶液)以及颗粒形成剂来获得，从而允许形成颗粒。与混合的颗粒制剂相反，组合的颗粒制剂通常包括含有多于一种RNA的颗粒。在组合的颗粒组合物中，不同的RNA种类通常一起存在于单个颗粒中。

如本公开中使用的，“纳米颗粒”是指包括RNA和至少一种阳离子脂质的颗粒，并且所述颗粒具有适于静脉内施用的平均直径。

术语“平均直径”是指通过动态光散射(DLS)用使用所谓累积算法的数据分析测量的颗粒的平均流体动力学直径，所述累积算法作为结果提供了具有长度维度的所谓的Z_平均值，以及长度的维度和多分散性指数(PI)，所述多分散性指数是无量纲的(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,pp 4814-4820,ISO 13321)。此处，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”被用作Z_平均值的同义词。

术语“多分散性指数”在本文中用作颗粒(例如，纳米颗粒)集合的尺寸分布的量度。基于动态光散射测量通过所谓的累积量分析计算多分散性指数。

术语“乙醇注射技术”是指一种方法，其中包括脂质的乙醇溶液通过针快速注射到水溶液中。这种动作将脂质分散在整个溶液中并促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成，如脂质体形成。通常，本文所述的RNA脂质体复合物颗粒可通过将RNA加入到胶体脂质体分散体中而获得。在一个实施方案中，使用乙醇注射技术，这样的胶体脂质体分散体如下形成：在搅拌下将包括脂质(例如阳离子脂质(例如DOTMA)和额外的脂质)的乙醇溶液注射到水溶液中。在一个实施方案中，本文所述的RNA脂质体复合物颗粒可在没有挤出步骤的情况下获得。

术语“挤出(extruding)”或“挤出(extrusion)”是指产生具有固定的横截面轮廓的颗粒。特别地，它是指颗粒的尺寸减小，由此迫使颗粒通过具有限定的孔的过滤器。

如本文所用的，“指导材料”或“说明书”包括出版物、记录、图表或可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的任何其它表达介质。本发明试剂盒的指导材料可以例如固定到含有本发明组合物的容器上或与含有该组合物的容器一起运输。或者，指导材料可以与容器分开运输，目的是指导材料和组合物由接受者协同使用。

如本文所用的，术语“疫苗”是指在接种到受试者后诱导免疫应答的组合物。在一些实施方案中，诱导的免疫应答提供治疗性免疫力。

肺癌(lung cancer)，也称为肺癌(lung carcinoma)，是一种恶性肺部肿瘤，其特征在于肺组织中不受控制的细胞生长。这种生长可以通过转移到附近组织或身体其它部位的过程而扩散到肺之外。肺癌是女性中第三最常见的恶性肿瘤和男性中第二最常见的恶性肿瘤，并且是男性中癌症相关死亡的最常见原因，和乳腺癌后女性中癌症相关死亡的第二最常见原因。肺癌是癌——由上皮细胞引起的恶性肿瘤。肺癌根据组织病理学家在显微镜下看到的恶性细胞的大小和外观进行分类。为了治疗的目的，区分两大类：非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。NSCLC的三种主要亚型是腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。罕见的亚型包括肺肠腺癌。

大约40％的肺癌是腺癌，其通常来自外周肺组织。鳞状细胞癌引起约30％的肺癌。它们通常出现在靠近大气道的地方。通常在肿瘤的中心发现空腔和相关的细胞死亡。大约9％的肺癌是大细胞癌。之所以这样命名，是因为癌细胞较大，具有过量的细胞质、大的细胞核和明显的核仁。

如本文所用的术语“共同施用(co-administered)”或“共同施用(co-administration)”等是指同时、并行或基本上同时施用两种或更多种药剂，无论作为单一制剂的一部分还是作为通过相同或不同途径施用的多个制剂。如本文所用的“基本上同时”是指在彼此的约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时或6小时内。

本公开分别描述了与给定核酸序列或氨基酸序列具有一定程度同一性的核酸序列和氨基酸序列(参考序列)。

两个核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。

术语“同一性百分比(％identical)”、“同一性百分比(％identity)”或类似术语特别指的是在待比较的序列之间的最佳对齐中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯统计性的，并且两个序列之间的差异可以是但不一定是随机分布在要比较的序列的整个长度上的。两个序列的比较通常通过在最佳对齐之后将序列与片段或“比较窗口”进行比较来进行，以便识别相应序列的局部区域。用于比较的最佳对齐可以手动进行或借助于Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源算法，以及Neddleman andWunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法，以及Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性搜索算法，或使用所述算法(GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA在Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group,575Science Drive,Madison,Wis.)的计算机程序进行。在一些实施方案中，使用BLASTN或BLASTP算法确定两个序列的同一性百分比，其可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝align2seq)上获得。在一些实施方案中，用于NCBI网站上的BLASTN算法的算法参数包括：(i)期望阈值设置为10；(ii)单词长度设置为3；(iii)查询区域内的最大匹配数设置为0；(iv)匹配/不匹配分数设置为1、-2；(v)空位成本设置为线性；以及(vi)使用低复杂性区域的过滤器。在一些实施方案中，用于NCBI网站上的BLASTP算法的算法参数包括：(i)期望阈值设置为10；(ii)单词长度设置为3；(iii)查询区域内的最大匹配数设置为0；(iv)矩阵设置为BLOSUM62；(v)空位成本设置为存在：11扩展：1；和(vi)条件性组成得分矩阵调整。

通过确定待比较的序列对应的相同位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目(例如，参考序列中的位置的数目)并将该结果乘以100来获得同一性百分比。

在一些实施方案中，给出了至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的参考序列全长的区域的同一性程度。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则在连续核苷酸的一些实施方案中，给出至少约100个核苷酸、至少约120个核苷酸、至少约140个核苷酸、至少约160个核苷酸、至少约180个核苷酸或约200个核苷酸的同一性程度。在一些实施方案中，给出了参考序列的整个长度的同一性程度。

分别与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定程度同一性的核酸序列或氨基酸序列可以具有所述给定序列的至少一种功能特性，例如，并且在一些情况下，与所述给定序列在功能上等同。一个重要的特性包括免疫原性特性，特别是当施用于受试者时。在一些实施方案中，与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定程度同一性的核酸序列或氨基酸序列在功能上等同于给定序列。

RNA

在本公开中，术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中，RNA含有全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文所用的，“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2’位具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA(如部分纯化的RNA)、基本纯净的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及修饰的RNA，所述修饰的RNA通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA。这种改变可以涉及向内部RNA核苷酸或RNA的端添加非核苷酸材料。本文还考虑RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开，这些改变的RNA被认为是天然存在的RNA的类似物。

在本公开的某些实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)，其涉及编码肽或蛋白质的RNA转录物。如本领域所公认的，mRNA通常含有5’非翻译区(5’-UTR)、肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。在一些实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，使用DNA模板通过体外转录产生mRNA，其中DNA是指含有脱氧核糖核苷酸的核酸。

在一个实施方案中，RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入到用于体外转录的适当载体中而获得。cDNA可以通过RNA的反转录获得。在一个实施方案中，RNA可以具有修饰的核苷。在一些实施方案中，RNA包括取代至少一个(例如，每一个)尿苷的修饰的核苷酸。

如本文所用的术语“尿嘧啶”描述了RNA核酸中可以存在的一种核碱基。尿嘧啶的结构为：

如本文所用的术语“尿苷”描述了RNA中可以存在的一种核苷。尿苷的结构是：

UTP(尿苷5’-三磷酸)具有以下结构：

假UTP(假尿苷5’-三磷酸)具有以下结构：

“假尿苷”是修饰的核苷的一个实例，其是尿苷的异构体，其中尿嘧啶经由碳-碳键而不是氮-碳糖苷键连接至戊糖环。

另一种示例性的修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)，其具有以下结构：

N1-甲基-假UTP具有以下结构：

另一个示例性的修饰的核苷是5-甲基-尿苷(m5U)，其具有以下结构：

在一些实施方案中，本文所述RNA中的一个或多个尿苷被修饰的核苷取代。在一些实施方案中，修饰的核苷是修饰的尿苷。

在一些实施方案中，取代尿苷的修饰的尿苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。

在一些实施方案中，取代RNA中的一个或多个(例如全部)尿苷的修饰的核苷可以是3-甲基尿苷(m³U)、5-甲氧基尿苷(mo⁵U)、5-氮杂尿苷、6-氮杂尿苷、2-硫代-5-氮杂尿苷、2-硫代-尿苷(s²U)、4-硫代-尿苷(s⁴U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho⁵U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo⁵U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo⁵U)、5-羧甲基-尿苷(cm⁵U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm⁵U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm⁵U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm⁵U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm⁵s²U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm⁵se²U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm⁵U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm⁵s²U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm⁵se²U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm⁵U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm⁵U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm⁵s²U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-氨基尿苷(τm⁵U)、1-氨基甲基-假尿苷、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-氨基甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m⁵s²U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m¹s⁴ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m³ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m⁵D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp³U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp³ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm⁵U),5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm⁵s²U)、α-硫代尿苷，2’-O-甲基尿苷(Um)、5，2’-O-二甲基-尿苷(m⁵Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基尿苷(s²Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm⁵Um)、5-氨基甲酰甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm⁵Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm⁵Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m³Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm⁵Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-ara-尿苷、2’-F-尿苷，2’-OH-ara-尿苷、5-(2-甲酯基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷中的任何一个或多个，或本领域已知的任何其它修饰的尿苷。

在一些实施方案中，至少一种RNA包括取代至少一个尿苷的经修饰的核苷。在一些实施方案中，至少一种RNA包括取代每个尿苷的修饰的核苷。在一些实施方案中，每种RNA包括取代至少一个尿苷的修饰的核苷。在一些实施方案中，每种RNA包括取代每个尿苷的修饰的核苷。

在一些实施方案中，修饰的核苷独立地选自：假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(mlψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，至少一种RNA可以包括多于一种类型的修饰的核苷，并且修饰的核苷独立地选自：假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括假尿苷(ψ)和5-甲基尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包括假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。

在一个实施方案中，RNA包括其它修饰的核苷或包括其它修饰的核苷，例如修饰的胞苷。例如，在一个实施方案中，在RNA中5-甲基胞苷被胞苷部分或完全，优选完全取代。在一个实施方案中，RNA包括5-甲基胞苷和一种或多种选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)的物质。在一个实施方案中，RNA包括5-甲基胞苷和N1-甲基-假尿苷(mIL)。在一些实施方案中，RNA包括5-甲基胞苷代替每个胞苷，并且N1-甲基-假尿苷(M11-JJ)取代每个尿苷。

在一些实施方案中，根据本公开的RNA包括5’帽。在一个实施方案中，本公开的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。在一个实施方案中，RNA可以被5’帽类似物修饰。术语“5’帽”是指在mRNA分子的5’端发现的结构，并且通常由通过5’至5’-三磷酸键连接到mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。提供具有5’帽或5’帽类似物的RNA可以通过体外转录来实现，其中5’帽被共转录地表达到RNA链中，或者可以使用加帽酶在转录后与RNA连接。

在一些实施方案中，RNA的构成单元帽是m₂ ^7,3’-OGppp(m₁ ^2’-O)ApG(有时也称为m₂ ^7,3` ^OG(5’)ppp(5’)m^2’-OApG)，其具有以下结构：

以下是示例性CAPL RNA，其包括RNA和m₂ ^7,3`OG(5’)ppp(5’)m^2’-OApG：

以下是另一个示例性CAPL RNA(无帽类似物)：

在一些实施方案中，RNA使用“CAPO”结构修饰，在一个实施方案中，使用具有以下结构的帽类似物抗逆帽(ARCA Cap(m₂ ^7,3`OG(5’)ppp(5’)G))：

以下是示例性Cap0 RNA，其包括RNA和m₂ ^7,3`OG(5’)ppp(5’)G：

在一些实施方案中，使用具有以下结构的帽类似物β-S-ARCA(m₂ ^7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)产生“Cap0”结构：

以下是示例性Capo RNA，其包括β-S-ARCA(m₂ ^7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)和RNA:

特别优选的帽，其包括5’帽m₂ ^7,2`OG(5’)ppSp(5’)G。在一些实施方案中，本文所述的至少一种RNA，其包括5’帽m₂ ^7,2`OG(5’)ppSp(5’)G。在一些实施方案中，本文所述的每种RNA，其包括5’帽m₂ ^7,2`OG(5’)ppSp(5’)G。Beta-S-ARCA的“D1”对映异构体或“β-S-ARCA(D1)”是β-S-ARCA的对映异构体，与β-S-ARCA的D2非对映体(β-S-ARCA(D2))相比，所述β-S-ARCA首先在HPLC柱上洗脱，因此具有更短的保留时间(参见，WO2011/015347通过引用并入本文)。特别优选的帽是β-S-ARCA(D1)(m₂ ^7,2'-OGppSpG)。

在一些实施方案中，根据本公开的RNA，其包括5’UTR和/或3’UTR。术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中转录但不翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可以存在于开阅读框(5’UTR)的5’(上游)和/或开放读框(3’UTR)的3’(下游)。如果存在的话，5’UTR位于蛋白质编码区起始密码子上游的5’端。5’UTR在5’帽(如果存在)的下游，例如直接邻近5’帽。如果存在的话，3’UTR位于蛋白质编码区终止密码子的3’端，蛋白质编码区的终止密码子的下游，但术语“3’UTR”优选不包括poly-A序列。因此，3’UTR位于poly-A序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly-A序列相邻。

特别优选的5’UTR，其包括SEQ ID NO:35的核苷酸序列。特别优选的3’UTR，其包括SEQ ID NO:36的核苷酸序列。

在一些实施方案中，至少一种RNA，其包括5’UTR，所述5’UTR包括SEQ ID NO:35的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每种RNA，其包括5’UTR，所述5’UTR包括SEQ ID NO:35的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，至少一种RNA，其包括3’UTR，所述3’UTR包括SEQ ID NO:36的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每种RNA，其包括3’UTR，所述3’UTR包括SEQ ID NO:36的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，根据本公开的RNA包括3’poly(A)序列。

如本文所用的，术语“poly-A尾”或“poly-A序列”是指通常位于RNA分子3’端的不间断或间断的腺苷酸残基序列。poly-A尾或poly-A序列是本领域技术人员已知的，并且可以跟在本文所述的RNA中的3’UTR之后。不间断的poly-A尾部的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly-A尾是典型的。本文公开的RNA在转录后可具有通过模板非依赖性RNA聚合酶附着于RNA的游离3’端的poly-A尾或由DNA编码并由模板依赖性RNA聚合酶转录的poly-A尾。

已经证明，约120个核苷酸的poly-A尾对转染的真核细胞中RNA的水平，以及对从poly-A尾上游(5’)的开放阅读框翻译的蛋白质的水平具有有益的影响(Holtkamp et al.,2006,Blood,vol.108,pp.4009-4017)。

poly-A尾部可以是任何长度。在一些实施方案中，poly-A尾包括、基本上由或由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个，或至多150个核苷酸，且特别是约120个核苷酸组成。在这种情况下，“基本上由......组成”是指poly-A尾中的大多数核苷酸，通常至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的poly-A尾中的核苷酸是A核苷酸，但允许剩余的核苷酸是除A核苷酸以外的核苷酸。例如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在本文中，“由……组成”是指poly-A尾中的所有核苷酸，即poly-A尾中100％数量的核苷酸是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。

在一些实施方案中，poly-A尾在RNA转录过程中(例如在体外转录RNA的制备过程中)基于包含重复dT核苷酸(脱氧胸腺嘧啶)的DNA模板附加的。编码poly-A尾的DNA序列(编码链)被称为poly(A)盒。

在一些实施方案中，存在于DNA编码链中的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但被4个核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。在WO 2016/005324 A1中公开了这种盒，在此引入作为参考。WO 2016/005324A1中公开的任何poly(A)盒可用于本发明。poly(A)盒，其基本上由dA核苷酸组成，但被具有相等分布的四个核苷酸(dA、dC、dG、dT)和具有例如5至50个核苷酸的长度的随机序列中断，在DNA水平上显示质粒DNA在大肠杆菌中的恒定增殖，在RNA水平上仍然与关于支持RNA稳定性和翻译效率的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文所述的RNA分子中包括的poly-A尾基本上由A核苷酸组成，但被4个核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。

在一些实施方案中，poly-A尾的3’端没有除A核苷酸以外的其它核苷酸，即poly-A尾部其3’端没有被掩盖或跟随任何非A核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾，其包括SEQID NO:37的序列。

在一些实施方案中，至少一种RNA，其包括poly-A尾。在一些实施方案中，每种RNA，其包括poly-A尾。在一些实施方案中，poly-A尾可包括至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个、或至多150个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾可基本上由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个，或至少100个且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个，或至多150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly-A尾可由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个，或至少100个且至多500个、至多400个、至多300个、至多200个，或至多150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly-A尾可以包括SEQ ID NO:37所示的poly-A尾。在一些实施方案中，poly-A尾包括至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾包括约150个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾包括约120个核苷酸。

在一些实施方案中，至少一种RNA，其包括poly-A尾，所述poly-A尾含有SEQ IDNO:37的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:37的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每种RNA，其包括poly-A尾，所述poly-A尾含有SEQ ID NO:37的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:37的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

在本公开的上下文中，术语“转录”涉及一种过程，其中DNA序列中的遗传密码被转录成RNA。随后，RNA可以被翻译成肽或蛋白质。

根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及在无细胞系统中体外合成RNA的方法，特别是mRNA的方法，优选使用合适的细胞提取物。

优选地，克隆载体用于产生转录本。这些克隆载体通常被命名为转录载体，并且根据本发明被术语“载体”所包括。根据本发明，在本发明中使用的RNA优选是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶。优选地，本发明的体外转录由T7启动子或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入到用于体外转录的适当载体中而获得。cDNA可以通过RNA的反转录获得。

关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及细胞的核糖体中的过程，通过该过程mRNA链指导氨基酸序列的组装以制备肽或蛋白质。

在一个实施方案中，在施用本文所述的RNA(例如配制为RNA脂质体复合物颗粒)后，将RNA的至少一部分递送至靶细胞。在一个实施方案中，将RNA的至少一部分递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA被靶细胞翻译以产生其编码的肽或蛋白质。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专业抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是树突细胞或巨噬细胞。本文所述的RNA脂质体复合物颗粒可用于将RNA递送至这种靶细胞。因此，本公开内容还涉及用于将RNA递送至受试者的靶细胞的方法，方法包括将本文所述的RNA脂质体复合物颗粒施用至受试者。在一个实施方案中，RNA被递送至靶细胞的细胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA被靶细胞翻译以产生由RNA编码的肽或蛋白质。根据本公开，术语“RNA编码”是指RNA(如果存在于适当的环境中(例如存在于靶组织的细胞内))可以指导氨基酸的装配以在翻译过程中产生其编码的肽或蛋白质。在一个实施方案中，RNA能够与允许肽或蛋白质翻译的细胞翻译机制相互作用。细胞可以在细胞内(例如，在细胞质中和/或在细胞核中)产生所编码的肽或蛋白质，可以分泌所编码的肽或蛋白质，或可以在表面上产生所编码的肽或蛋白质。

根据本公开，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包括通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，以及至多约50个、约100个或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大的肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但术语“肽”和“蛋白质”在本文中通常用作同义词。

术语“抗原”涉及试剂，其包括可针对其产生免疫应答的表位。术语“抗原”特别包括蛋白质和肽。在一个实施方案中，抗原由免疫系统的细胞呈递，例如抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞。抗原或其加工产物如T细胞表位在一个实施方案中与T细胞或B细胞受体结合，或与免疫球蛋白质分子(如抗体)结合。因此，抗原或其加工产物可以与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。在一个实施方案中，抗原是与疾病相关的抗原，例如肿瘤抗原，并且表位来源自这样的抗原。

术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是含有表位的分子，所述表位将刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的特异性细胞免疫应答和/或体液抗体应答。因此，疾病相关抗原或其表位可用于治疗目的。疾病相关抗原可与癌症(通常为肿瘤)相关。

术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可以来源自细胞质、细胞表面和细胞核。特别地，它是指在细胞内或作为肿瘤细胞上的表面抗原产生的那些抗原。

本文公开的肿瘤抗原可以是CLDN6(SEQ ID NO:1)、KK-LC-1(SEQ ID NO:5)、MAGE-A3(SEQ ID NO:9)、MAGE-A4(SEQ ID NO:13)、PRAME(SEQ ID NO:17)、MAGE-CL(SEQ ID NO:21)或NY-ESO-1(SEQ ID NO:25)。

术语“表位”是指被免疫系统识别的分子(如抗原)的部分或片段。例如，表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可以包括抗原的连续或不连续部分，并且长度可以在约5至约100个氨基酸之间。在一个实施方案中，表位长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包括T细胞表位。

术语“T细胞表位”指的是蛋白质的一部分或片段，在MHC分子的背景下被T细胞识别。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。MHC蛋白质或分子对于免疫反应中淋巴细胞和抗原呈递细胞或患病细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白质或分子结合肽表位并呈递它们以供T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如侵入微生物的片段)。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常为约8至约10个氨基酸长，尽管更长或更短的肽可能是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常为约10至约25个氨基酸长，特别是约13至约18个氨基酸长，而更长和更短的肽可能是有效的。

在本公开的某些实施方案中，RNA编码至少一个表位。在某些实施方案中，表位来源自如本文所述的肿瘤抗原。

在一些实施方案中，本文所述的氨基酸序列由编码序列编码，所述氨基酸序列包括肿瘤抗原、其免疫原性变体，或肿瘤抗原或其免疫原性变体的免疫原性片段，所述编码序列与野生型编码序列相比密码子优化和/或其G/C含量增加。这也包括其中编码序列的一个或多个序列区与野生型编码序列的相应序列区相比是密码子优化和/或G/C含量增加的实施方案。在一个实施方案中，密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。

术语“密码子优化的”是指改变核酸分子的编码区中的密码子，以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不优选改变核酸分子编码的氨基酸序列。在本发明的上下文中，优选对编码区进行密码子优化，以便使用本文所述的RNA分子在待治疗的受试者中进行最佳表达。密码子优化基于翻译效率也由细胞中tRNA出现的频率不同决定的发现。因此，RNA的序列可以被修饰，使得经常出现的tRNA可用的密码子被插入以代替“稀有密码子”。

在本发明的一些实施方案中，与野生型RNA的相应编码序列的G/C含量相比，本文所述RNA的编码区的鸟苷/胞嘧啶(G/C)含量增加，其中与野生型RNA编码的氨基酸序列相比，优选不修饰RNA编码的氨基酸序列。RNA序列的这种修饰是基于以下事实：待翻译的任何RNA区域的序列对于该mRNA的有效翻译是重要的。G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量增加的序列比A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量增加的序列更稳定。关于几个密码子编码一个相同的氨基酸(所谓的遗传密码的退化)的事实，可以确定用于稳定性的最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。根据待由RNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比，有各种修饰RNA序列的可能性。特别地，含有A和/或U核苷酸的密码子可以通过用其它密码子替代这些密码子来修饰，这些密码子编码相同的氨基酸，但不含A和/或U或含有较低含量的A和/或U核苷酸。

在各种实施方案中，与野生型RNA的编码区的G/C含量相比，本文所述RNA的编码区的G/C含量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。

施用RNA

在一些实施方案中，本文所述的组合物或药物制剂包括编码claudin 6(CLDN6)疫苗抗原的RNA、编码Kita-kyushu肺癌抗原1(KK-LC-1)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)疫苗抗原的RNA，以及编码黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)疫苗抗原的RNA和编码纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)疫苗抗原的RNA中的一种或两种。在一些实施方案中，本文所述的组合物或药物制剂包括编码claudin 6(CLDN6)疫苗抗原的RNA、编码Kita-kyushu肺癌抗原1(KK-LC-1)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)疫苗抗原的RNA和编码黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)疫苗抗原的RNA。同样，本文所述的方法包括施用编码claudin 6(CLDN6)疫苗抗原的RNA、编码Kita-kyushu肺癌抗原1(KK-LC-1)疫苗抗原的RNA，编码黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)疫苗抗原的RNA，以及编码黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)疫苗抗原的RNA和编码纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)疫苗抗原的RNA中的一种或两种。在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用编码claudin 6(CLDN6)疫苗抗原的RNA、编码Kita-kyushu肺癌抗原1(KK-LC-1)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)疫苗抗原的RNA、编码黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)疫苗抗原的RNA和编码黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)疫苗抗原的RNA。

CLDN6疫苗抗原的分子结构与功能

人claudin 6基因(CLDN6)位于第16号染色体上并含有编码220个氨基酸的蛋白质的两种异构体。CLDN6在物种之间是高度保守的，并且属于由至少27个成员组成的紧密连接蛋白质。通常，紧密连接蛋白质(包括CLDN6)对于上皮屏障调节是重要的，并且属于紧密连接分子组。CLDN6包括四个跨膜结构域、两个细胞外环、细胞内N端和C端，和PDZ结合结构域，并且已经显示在表皮细胞中保持渗透性屏障和跨上皮细胞抗性中起作用。额外地，CLDN6似乎是正常囊胚形成所必需的。在一个实施方案中，CLDN6具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

claudin 6(CLDN6)疫苗抗原包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括CLDN6、其免疫原性变体，或CLDN6或其免疫原性变体的免疫原性片段，并且可以具有包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的氨基酸序列，或具有至少与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列有99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。编码CLDN6疫苗抗原的RNA(i)可以包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列，或与SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或(ii)可编码包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

KK-LC-1疫苗抗原的分子结构与功能

kita-kyushu肺癌抗原1(KK-LC-1)，也称癌症/睾丸抗原83、CT83、CXorf61，是来自癌症/睾丸抗原组的蛋白质和肿瘤抗原。KK-LC-1具有113个氨基酸的长度。KK-LC-1在健康细胞(除免疫特许性精母细胞外)中很少作为肿瘤抗原被发现，但经常在各种肿瘤中表达，例如非小细胞肺癌。在一个实施方案中，KK-LC-1具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

Kita-kyushu肺癌抗原1(KK-LC-1)疫苗抗原包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括KK-LC-1、其免疫原性变体，或KK-LC-1或其免疫原性变体的免疫原性片段，并且可以具有包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。编码KK-LC-1疫苗抗原的RNA(i)可以包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:7或8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％,85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或(ii)可以编码包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

MAGE-A3疫苗抗原的分子结构与功能

人黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)基因是黑色素瘤相关抗原基因家族的成员。该家族的成员编码彼此具有50％至80％序列同一性的蛋白质。MAGEA基因在染色体Xq28位置聚集。它们已经涉及一些遗传性疾病，例如先天性角化不良。MAGE-A3在健康细胞中的正常功能尚不清楚。在一个实施方案中，MAGE-A3具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)疫苗抗原包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括MAGE-A3、其免疫原性变体，或MAGE-A3或其免疫原性变体的免疫原性片段，并且可以具有包括SEQID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。编码MAGE-A3疫苗抗原的RNA(i)可以包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或(ii)可以编码包括SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

MAGE-A4疫苗抗原的分子结构与功能

人黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)基因是MAGEA基因家族的成员。该家族的成员编码彼此具有50％至80％序列同一性的蛋白质。MAGEA基因在染色体Xq28位置聚集。它们已经涉及一些遗传性疾病，例如先天性角化不良。在一个实施方案中，MAGE-A4具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)疫苗抗原包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括MAGE-A4、其免疫原性变体，或MAGE-A4或其免疫原性变体的免疫原性片段，并且可以具有包括SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。编码MAGE-A4疫苗抗原的RNA(i)可以包括SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或(ii)可以编码包括SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:14的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

PRAME疫苗抗原的分子结构与功能

人黑色素瘤优先表达(PRAME)基因位于第22号染色体，并包含八种异构体，其中七种编码509个氨基酸的相同蛋白质，而第八种异构体缺少前16个氨基酸。使用FLAG或GFP标记的PRAME的定位研究表明蛋白质的核定位。此外，PRAME在细胞凋亡和细胞增殖中起关键作用。进一步的功能研究揭示PRAME抑制视黄酸受体信号传导并由此引起其在细胞凋亡和分化中的作用。PRAME属于由32个PRAME类似基因和假基因组成的多基因家族。PRAME的最接近的蛋白质编码家族与蛋白质表现出53％的同源性(使用blastp软件包的blastp命令)。详细的基于RT-qPCR的分析揭示了PRAME在睾丸、附睾和子宫中的高表达。在一个实施方案中，PRAME具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。

黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)疫苗抗原包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括PRAME、其免疫原性变体，或PRAME或其免疫原性变体的免疫原性片段，并且可以具有包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。编码PRAME疫苗抗原的RNA(i)可包括SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的核苷酸序列，或与SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或(ii)可编码包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

MAGE-C1疫苗抗原的分子结构与功能

黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)，也称癌症/睾丸抗原7(CT7)，是来自癌症/睾丸抗原组的人肿瘤抗原。MAGE-C1具有1,142个氨基酸的长度和123,643Da的质量。它在多达4个丝氨酸上磷酸化(S63、S207、S382和S1063)。MAGE-C1具有抗凋亡特性并结合NY-ESO-1。它不会出现在健康细胞中(除免疫特权的精母细胞外)，但经常在肿瘤中表达。例如，多发性骨髓瘤。在肿瘤中它由恶性浆细胞形成。在一个实施方案中，MAGE-C1具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)疫苗抗原包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括MAGE-C1、其免疫原性变体，或MAGE-C1或其免疫原性变体的免疫原性片段，并且可以具有包括SEQID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。编码MAGE-C1疫苗抗原的RNA(i)可包括SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或(ii)可编码包括SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

NY-ESO-1疫苗抗原的分子结构与功能

纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)，也称癌症/睾丸抗原1、LAGE2或LAGE2B，是一种在人类中由CTAG1B基因编码的蛋白质。CTAG1B位于染色体X的长臂上(Xq28)。该基因编码180个氨基酸的多肽，从胚胎发育期间的18周直到出生时在人胎儿睾丸中表达。它也在成年睾丸的精原细胞和原代精母细胞中强烈表达，但不在减数分裂后细胞或睾丸体细胞中表达。NY-ESO-1属于癌症睾丸抗原(CTA)家族，其在mRNA和蛋白质水平上在多种恶性肿瘤中表达，但也仅限于正常成人组织中的睾丸生殖细胞。在一个实施方案中，NY-ESO-1具有SEQ IDNO:25的氨基酸序列。

纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)疫苗抗原包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括NY-ESO-1、其免疫原性变体或NY-ESO-1的免疫原性片段或其免疫原性变体，并且可以具有包括SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。编码NY-ESO-1疫苗抗原的RNA(i)可包括SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或(ii)可编码包括SEQ ID NO：25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列

来源自破伤风梭菌的破伤风类毒素的氨基酸序列可用于克服自身耐受性机制，以便通过在启动期间中提供T细胞帮助来有效地对自身抗原进行免疫应答。

已知破伤风类毒素重链包括能与MHC II类等位基因混杂结合并在几乎所有接种破伤风的个体中诱导CD4⁺记忆T细胞的表位。此外，已知破伤风类毒素(TT)辅助表位与肿瘤相关抗原的组合与单独应用肿瘤相关抗原相比通过在启动期间提供CD4⁺介导的T细胞帮助来改善免疫刺激。为了降低用破伤风序列刺激CD8⁺ T细胞的风险，所述破伤风序列可能与肿瘤抗原特异性T细胞应答的预期诱导竞争，不使用破伤风类毒素的完整片段C，因为已知其含有CD8⁺ T细胞表位。选择含有混杂结合辅助表位的两个肽序列，以确保与尽可能多的MHC II类等位基因结合。基于离体的研究数据，选择了众所周知的表位p2(QYIKANSKFIGITEL；TT_830-844)和p16(MTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQG；TT_578-609)。p2表位已经用于临床试验中的肽疫苗接种以增强抗黑素瘤活性。

目前的非临床数据(未发表)表明，编码肿瘤抗原加上混杂结合破伤风类毒素序列的RNA疫苗导致针对肿瘤抗原的CD8⁺ T细胞应答增强和耐受性的破坏。从接种包含这些序列的疫苗的患者的免疫监测数据表明，所选的破伤风序列能够在几乎所有患者中诱导破伤风特异性T细胞反应。

根据某些实施方案，破坏免疫耐受性的氨基酸序列直接或通过接头(例如，具有氨基酸序列GGSGGGGSGG的接头)与抗原肽或蛋白质(即，CLDN6(SEQ ID NO：1)、KK-1LC-1(SEQID NO：5)、MAGE-A3(SEQ ID NO：9)、MAGE-A4(SEQ ID NO:13),PRAME(SEQ ID NO:17),MAGE-C1(SEQ ID NO:21)或NY-ESO-1(SEQ ID NO:25)，其变体或其片段)融合。

这种破坏免疫耐受性的氨基酸序列优选位于抗原肽或蛋白质的C端(并任选地位于增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列的N端，其中破坏免疫耐受性的氨基酸序列和增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列可以直接融合或通过接头融合，例如具有氨基酸序列GSSGGGGSPGGGSS的接头)，但不限于此。如本文所定义的破坏免疫耐受性的氨基酸序列优选改善T细胞应答。在一个实施方案中，破坏如本文所定义的免疫耐受性的氨基酸序列包括但不限于来源自破伤风类毒素来源的辅助序列p2和p16(P2P16)的序列，特别是包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其功能变体的序列。

在一个实施方案中，破坏免疫耐受性的氨基酸序列包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列，与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:33的氨基酸序列的功能片段。或与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，破坏免疫耐受性的氨基酸序列包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列。

代替使用与破伤风类毒素辅助表位融合的抗原RNA，肿瘤-抗原RNA可以在接种期间与编码TT辅助表位的单独RNA共同施用。在此，TT辅助表位编码的RNA可以在制备前添加到每个抗原编码RNA中。以这种方式，形成包括抗原和辅助表位编码RNA两者的混合脂质体复合物纳米颗粒，以便将两种化合物递送至给定APC。

因此，在一些实施方案中，本文所述的组合物可包以括编码破伤风类毒素来源的辅助序列p2和p16(P2P16)的RNA。同样，本文所述的方法可以包括施用编码破伤风类毒素来源的辅助序列p2和p16(P2P16)的RNA。

因此，另一个方面涉及组合物，例如药物组合物，所述药物组合物包括颗粒，例如脂质体复合物颗粒，所述脂质体复合物颗粒包括：

(i)编码疫苗抗原的RNA

(ii)RNA编码：破坏免疫耐受性的氨基酸序列。

这种组合物可用于诱导针对疫苗抗原并因此针对疾病相关抗原的免疫应答的方法中。

另一个方面涉及诱导免疫应答的方法，其包括施用颗粒，例如脂质体复合物颗粒，所述脂质体复合物颗粒包括：

(i)编码疫苗抗原的RNA

(ii)RNA编码：破坏免疫耐受性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，破坏免疫耐受性的氨基酸序列包括辅助表位，优选破伤风类毒素来源的辅助表位。

在一个实施方案中，编码疫苗抗原的RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制为颗粒(例如脂质体复合物颗粒)，其中比例为约4:1至约16:1、约6:1至约14:1、约8:1至约12:1或约10:1。

根据某些实施方案，信号肽直接或通过接头(例如，具有氨基酸序列GGSGGGGSGG的接头)与抗原肽或蛋白质(例如，MAGE-A3(SEQ ID NO：9)、PRAME(SEQ ID NO：17)、MAGE-C1(SEQ ID NO：21)或MAGE-C1(SEQ ID NO：21)、NY-ESO-1(SEQ ID NO:25)，其变体或其片段)融合。

这种信号肽是这样的序列，其通常显示约15至30个氨基酸的长度，并且优选位于抗原肽或蛋白质的N端，但不限于此。如本文所定义的信号肽优选允许由RNA编码的抗原性肽或蛋白质转运到所定义的细胞区室，优选细胞表面、内质网(ER)或内体-溶酶体区室。在一个实施方案中，如本文所定义的信号肽序列包括，但不限于，来源自编码人MHC I类复合物(HLA-B51、单倍型A2、B27/B51、Cw2/Cw3)的序列的信号肽序列，并且优选对应于编码分泌信号肽的78bp片段，其指导新生多肽链转运到内质网中。并且特别包括包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其功能变体的序列。

在一个实施方案中，信号序列包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的功能片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，信号序列包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列。

优选使用这种信号肽以促进所编码的抗原性肽或蛋白质的分泌。更优选地，本文定义的信号肽与本文定义的编码的抗原性肽或蛋白质融合。

因此，在特别优选的实施方案中，本文所述的RNA包括至少一个编码抗原性肽或蛋白质和信号肽的编码区，所述信号肽优选与抗原性肽或蛋白质融合，更优选与本文所述的抗原性肽或蛋白质的N端融合。

根据某些实施方案，增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列直接或通过接头与抗原肽或蛋白质(例如MAGE-A3(SEQ ID NO：9)、MAGE-A4(SEQ ID NO：13)、PRAME(SEQ IDNO：17)、MAGE-C1(SEQ ID NO:21)或NY-ESO-1(SEQ ID NO:25)，其变体或其片段)融合。

这种增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列优选位于抗原肽或蛋白质的C端(并任选地位于破坏免疫耐受性的氨基酸序列的C端，其中破坏免疫耐受性的氨基酸序列和增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列可以直接融合或通过接头融合，例如具有氨基酸序列GSSGGGGSPGGGSS的接头)，但不限于此。如本文所定义的增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列优选改善抗原加工和呈递。在一个实施方案中，如本文所定义的增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列包括但不限于来源自人MHC I类复合物(HLA-B51、单倍型A2、B27/B51、Cw2/Cw3)的序列，特别是包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其功能变体的序列。

在一个实施方案中，增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸序列的功能片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列包括SEQID NO:31的氨基酸序列。

优选使用增强抗原加工和/或抗原呈递的这种氨基酸序列，以促进抗原加工和/或所编码的抗原肽或蛋白质的呈递。更优选地，如本文所定义的增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列与如本文所定义的编码的抗原肽或蛋白质融合。

因此，在特别优选的实施方案中，本文所述的RNA包括至少一个编码抗原性肽或蛋白质的编码区和增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列，所述增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列优选与抗原性肽或蛋白质融合，更优选与本文所述的抗原性肽或蛋白质的C端融合。

在下文中，描述了疫苗RNA的实施方案，其中当描述其要素时使用的某些术语具有以下含义：

hAg-Kozak：人α-珠蛋白质mRNA的5’UTR序列，其具有优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。

sec/MITD：来源于编码人MHC I类复合物(HLA-B51、单倍型A2、B27/B51、Cw2/Cw3)的序列的融合蛋白标签，其已经显示出改善抗原加工和呈递。sec对应于编码分泌信号肽的78bp片段，其指导新生多肽链转运到内质网中。MITD对应于MHC I类分子的跨膜结构域和细胞质结构域，也称为MHC I类运输结构域。

抗原：编码相应肿瘤抗原的序列。

甘氨酸-丝氨酸接头(GS)：编码主要由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的短接头肽的序列，通常用于融合蛋白。

P2P16：编码破伤风类毒素来源的辅助表位以破坏免疫耐受性的序列。

FI元件：3’UTR是来源自“分离的氨基端增强子”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的两个序列元件的组合。通过对赋予RNA稳定性和增强总蛋白质表达的序列进行离体选择过程来确定这些序列。

A30L70：测量长度为110个核苷酸的poly(A)尾，由一段30个腺苷残基，随后是10个核苷酸的接头序列和另外的70个腺苷残基组成，被设计用于增强树突细胞中的RNA稳定性和翻译效率。

在一个实施方案中，特别是在CLDN6(SEQ ID NO:1)或KK-LC-1(SEQ ID NO:5)的情况下，本文所述的疫苗RNA具有以下结构：

β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-抗原-GS(2)-P2P16-FI-A30L70

在一个实施方案中，本文所述的疫苗抗原具有以下结构：

抗原-GS(2)-P2P16

在一个实施方案中，特别是在MAGE-A4(SEQ ID NO:13)的情况下，本文所述的疫苗RNA具有以下结构：

β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-抗原-GS(2)-P2P16-GS(3)-MITD-FI-A30L70

在一个实施方案中，本文所述的疫苗抗原具有以下结构：

抗原-GS(2)-P2P16-GS(3)-MITD

在一个实施方案中，特别是在MAGE-A3(SEQ ID NO:9)、PRAME(SEQ ID NO:17)、MAGE-C1(SEQ ID NO:21)或NY-ESO-1(SEQ ID NO:25)的情况下，本文所述的疫苗RNA具有以下结构：

β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-sec-GS(L)-抗原-GS(2)-P2P16-GS(3)-MITD-FI-A30L70

在一个实施方案中，本文所述的疫苗抗原具有以下结构：

sec-GS(1)-抗原-GS(2)-P2P16-GS(3)-MITD

在一个实施方案中，hAg-Kozak包括SEQ ID NO:35的核苷酸序列。在不同的实施方案中，抗原包括选自以下的氨基酸序列：CLDN6(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列、KK-1LC-1(SEQID NO：5)的氨基酸序列、MAGE-A3(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列、MAGE-A4(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列、PRAME(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列、MAGE-C1(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列和NY-eso1(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列。在一个实施方案中，sec包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在CLDN6、KK-LC-1和MAGE-A4的情况下，存在内源信号肽，因此，不需要向SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:13添加进一步的信号肽。在一个实施方案中，P2P16包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一个实施方案中，MITD包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一个实施方案中，GS(1)包括氨基酸序列GGSGGGGSGG。在一个实施方案中，GS(2)包括氨基酸序列GGSGGGGSGG。在一个实施方案中，GS(3)包括氨基酸序列GSSGGGGSPGGGSS。在一个实施方案中，FI包括SEQ ID NO:36的核苷酸序列。在一个实施方案中，A30L70包括SEQ ID NO:37的核苷酸序列。

“片段”，是指氨基酸序列(肽或蛋白质)，其涉及氨基酸序列的一部分，即代表在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)可例如通过翻译缺失开放阅读框架3’端的截短的开放阅读框架获得。在N-端缩短的片段(C端片段)可例如通过翻译缺失开放阅读框的5’端的截短的开放阅读框获得，只要截短的开放阅读框包括用于起始翻译的起始密码子。氨基酸序列的片段包括例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％来自氨基酸序列的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包括来自氨基酸序列的至少6个，特别是至少8个，至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个，或至少100个连续氨基酸。

本文中的“变体”是指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本氨基酸序列不同的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的修饰形式。优选地，与亲本氨基酸序列相比，变体氨基酸序列具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比，1个至约20个氨基酸修饰，优选1个至约10个或1个至约5个氨基酸修饰。

本文中的“野生型”或“WT”或“天然的”是指在自然界中发现的氨基酸序列，包括等位基因变异。野生型氨基酸序列、肽或蛋白质具有未被有意修饰的氨基酸序列。

为了本公开的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰的变体、构象、异构体、等位基因变体，物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。术语“变体”特别包括氨基酸序列的片段。

氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中插入一个或两个或多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列中的特定位点，尽管随机插入和对结果产品的适当筛选也是可能的。氨基酸添加变体包括一个或多个氨基酸的氨基端和/或羧基端融合体，例如1个、2个、3个、5个、10个、20个、30个、50个或更多个氨基酸。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中除去一个或多个氨基酸，例如通过除去1个、2个、3个、5个、10个、20个、30个、50个或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白质的任何位置。在蛋白质的N端和/或C端包括缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。氨基酸取代变体的特征在于序列中的至少一个残基被去除并且另一个残基被插入其位置。优选在氨基酸序列中在同源蛋白质或肽之间不保守的位置上的修饰和/或用具有相似特性的其它氨基酸替换氨基酸。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即，类似带电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守性氨基酸变化涉及在其侧链中相关的氨基酸家族之一的取代。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有时被组合分类为芳族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸取代包括以下组中的取代：

甘氨酸，丙氨酸；

缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；

天冬氨酸，谷氨酸；

天冬酰胺，谷氨酰胺；

丝氨酸，苏氨酸；

赖氨酸，精氨酸；和

苯丙氨酸，酪氨酸。

优选地，给定氨基酸序列和作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性的程度将是至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。相似性或同一性的程度优选为参考氨基酸序列全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选给出至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸、优选连续氨基酸的相似性或同一性。在优选的实施方案中，对参考氨基酸序列的全长给出相似性或同一性。

“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。

在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能片段”或“功能变体”。术语氨基酸序列的“功能片段”或“功能变体”涉及表现出与其来源的氨基酸序列相同或相似的一种或多种功能特性的任何片段或变体，即，其在功能上是等同的。对于抗原或抗原序列，一种特定的功能是一种或多种由衍生片段或变体的氨基酸序列显示的免疫原性活性。如本文所用的术语“功能片段”或“功能变体”特别指包括氨基酸序列的变体分子或序列，所述氨基酸序列与母体分子或序列的氨基酸序列相比被一个或多个氨基酸改变并且仍然能够实现母体分子或母体序列的一个或多个功能，例如，诱导免疫应答。在一个实施方案中，母体分子或母体序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变分子或序列的特征。在不同的实施方案中，功能片段或功能变体的功能可以降低但仍然显著存在，例如，功能变体的免疫原性可以是母体分子或母体序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在其它实施方案中，与母体分子或母体序列相比，功能片段或功能变体的免疫原性可以增强。

氨基酸序列(肽，蛋白质或多肽)“来源自”指定的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源自特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本相同或同源的氨基酸序列。来源自特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列的变体或其片段。例如，本领域普通技术人员将理解，适用于本文的抗原可以被改变，使得它们在序列上与它们所来源的天然存在的或天然的序列不同，同时保留天然序列的所需活性。

本文所述的肽和蛋白质抗原(CLDN6蛋白、KK-LC-1蛋白、MAGE-A3蛋白、MAGE-A4蛋白、PRAME蛋白、MAGE-C1蛋白和NY-ESO-1蛋白)当通过施用编码抗原的RNA(即疫苗抗原)提供给受试者时，优选导致受试者T细胞的刺激、启动和/或扩增。所述经刺激、启动和/或扩增的T细胞优选针对靶抗原，特别是由患病细胞、组织和/或器官表达的靶抗原，即疾病相关抗原。因此，疫苗抗原可包括疾病相关抗原，或其片段或变体。在一个实施方案中，这样的片段或变体在免疫学上等同于疾病相关抗原。在本公开的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”是指导致刺激、启动和/或扩增T细胞的试剂，所述T细胞刺激、启动和/或扩增的T细胞靶向疾病相关抗原，特别是当表达在疾病细胞、组织和/或器官表面时。因此，根据本公开内容施用的疫苗抗原可以对应于或可以包括疾病相关抗原，可以对应于或可以包括疾病相关抗原的片段，或可以对应于或可以包括与疾病相关抗原或其片段同源的抗原。如果根据本公开施用的疫苗抗原包括疾病相关抗原的片段或与疾病相关抗原的片段同源的氨基酸序列，则所述片段或氨基酸序列可包括疾病相关抗原的表位或与疾病相关抗原的表位同源的序列，其中T细胞结合所述表位。因此，根据本发明，抗原可以包括疾病相关抗原的免疫原性片段或与疾病相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开的“抗原的免疫原性片段”优选涉及能够刺激、启动和/或扩增T细胞的抗原片段。优选疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)提供用于T细胞结合的相关表位。还优选疫苗抗原(与疾病相关抗原相似)在细胞如抗原呈递细胞的表面上表达，以提供T细胞结合的相关表位。本发明的疫苗抗原可以是重组抗原。

术语“免疫等效”是指免疫学等效的分子(如免疫学等效的氨基酸序列)表现出相同或基本上相同的免疫学性质和/或发挥相同或基本上相同的免疫学效果，例如，关于免疫学效果的类型。在本公开的上下文中，术语“免疫学等效”优选就抗原或抗原变体的免疫学效果或特性而言使用。例如，如果所述氨基酸序列在暴露于与参照氨基酸序列结合的T细胞或表达参照氨基酸序列的细胞时诱导具有与参照氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，特别是T细胞的刺激、启动和/或扩增，则所述氨基酸序列与参照氨基酸序列免疫学等效。因此，免疫学等效于抗原的分子表现出与T细胞所靶向的抗原相同或基本相同的特性和/或在T细胞的刺激、启动和/或扩增方面发挥相同或基本相同的作用。

如本文所用的，“激活”或“刺激”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。激活也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应物功能有关。术语“激活的T细胞”尤其指正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“启动”是指过程，其中T细胞与其特异性抗原第一接触并导致分化成效应T细胞。

术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体增殖的过程。在本公开的上下文中，术语优选用于免疫应答的上下文中，其中淋巴细胞被抗原刺激、增殖，并且识别所述抗原的特定淋巴细胞被扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。

脂质体复合物颗粒

编码疫苗抗原的RNA可以被配制为颗粒，例如蛋白质和/或脂质颗粒。在本公开的某些实施方案中，本文所述的RNA可以存在于RNA脂质体复合物颗粒中。本文所述的RNA脂质体复合物颗粒和包括RNA脂质体复合物颗粒的组合物可用于在肠胃外施用后，特别是在静脉内施用后将RNA递送至靶组织。RNA脂质体复合物颗粒可以使用脂质体制备，所述脂质体可以通过将脂质在乙醇中的溶液注射到水或合适的水相中获得。在一个实施方案中，水相具有酸性pH。在一个实施方案中，水相包括乙酸，例如约5mM的量。在一个实施方案中，脂质体和RNA脂质体复合物颗粒包括至少一种阳离子脂质和至少一种额外的脂质。在一个实施方案中，至少一种阳离子脂质包括1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)。在一个实施方案中，至少一种额外的脂质包括1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。在一个实施方案中，至少一种阳离子脂质包括1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且至少一种额外的脂质包括1,2-二-(9Z-十八烯基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一个实施方案中，脂质体和RNA脂质体复合物颗粒包括1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。脂质体可用于通过将脂质体与RNA混合来制备RNA脂质体复合物颗粒。

在WO 2013/143683中描述了脾靶向RNA脂质体复合物颗粒，在此引入作为参考。已经发现，具有净负电荷的RNA脂质体复合物颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在施用RNA脂质体复合物颗粒后，在脾中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质体复合物颗粒可用于在脾中表达RNA。在一个实施方案中，在施用RNA脂质体复合物颗粒后，在肺和/或肝中没有或基本上没有RNA积累和/或RNA表达。在一个实施方案中，在施用RNA脂质体复合物颗粒后，在抗原呈递细胞(如脾中的专业抗原呈递细胞)中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质体复合物颗粒可用于在这种抗原呈递细胞中表达RNA。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。

RNA脂质体复合物颗粒直径

本文所述的RNA脂质体复合物颗粒在一个实施方案中具有约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250nm至约700nm、约400nm至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm的平均直径。在一个实施方案中，RNA脂质体复合物颗粒具有约250nm至约700nm的平均直径。在另一个实施方案中，RNA脂质体复合物颗粒具有约300nm至约500nm的平均直径。在一个示例性实施方案中，RNA脂质体复合物颗粒具有约400nm的平均直径。

在一个实施方案中，本文所述的RNA脂质体复合物颗粒表现出小于约0.5、小于约0.4或小于约0.3的多分散性指数。作为实例，RNA脂质体复合物颗粒可表现出在约0.1至约0.3范围内的多分散性指数。

脂质

在一个实施方案中，本文所述的脂质溶液、脂质体和RNA脂质体复合物颗粒包括阳离子脂质。如本文所用的，“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过与脂质基质的静电相互作用结合带负电荷的RNA。通常，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，脂质的头部基团通常带有正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；二十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基铵(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1,2-二油氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(DORIE)，和2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)。优选的是DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在具体的实施方案中，阳离子脂质是DOTMA和/或DOTAP。

可以掺入额外的脂质以调节RNA脂质体复合物颗粒的总正负电荷比和物理稳定性。在某些实施方案中，额外的脂质是中性脂质。如本文所用的，“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的实例包括但不限于1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在具体的实施方案中，额外的脂质是DOPE、胆固醇和/或DOPC。

在某些实施方案中，RNA脂质体复合物颗粒包括阳离子脂质和额外的脂质。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，并且额外的脂质是DOPE。不希望受理论束缚，与至少一种额外的脂质的量相比，至少一种阳离子脂质的量可影响重要的RNA脂质体复合物颗粒特性，例如电荷、粒度、稳定性、组织选择性和RNA的生物活性。因此，在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种额外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2，或约3:1至约1:1。在具体的实施方案中，摩尔比可以是约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1或约1:1。在一个示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种额外的脂质的摩尔比为约2:1。

电荷比

本公开的RNA脂质体复合物颗粒的电荷是存在于至少一种阳离子脂质中的电荷和存在于RNA中的电荷的总和。电荷比是存在于至少一种阳离子脂质中的正电荷与存在于RNA中的负电荷的比例。存在于至少一种阳离子脂质中的正电荷与存在于RNA中的负电荷的电荷比通过以下等式计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中的正电荷的总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中的负电荷的总数)]。RNA的浓度和至少一种阳离子脂质的量可以由本领域技术人员使用常规方法来确定。

在一个实施方案中，在生理pH下，RNA脂质体复合物颗粒中正电荷与负电荷的电荷比是约1.6:2至约1:2，或约1.6:2至约1.1:2。在具体的实施方案中，在生理pH下，RNA脂质体复合物颗粒中正电荷与负电荷的电荷比是约1.6:2.0、约1.5:2.0、约1.4:2.0、约1.3:2.0、约1.2:2.0、约1.1:2.0或约1:2.0。

已经发现，具有这种电荷比的RNA脂质体复合物颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在一个实施方案中，在施用RNA脂质体复合物颗粒之后，在脾中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质体复合物颗粒可用于在脾中表达RNA。在一个实施方案中，在施用RNA脂质体复合物颗粒后，在肺和/或肝中没有或基本上没有RNA积累和/或RNA表达。在一个实施方案中，在施用RNA脂质体复合物颗粒后，在抗原呈递细胞(如脾中的专业抗原呈递细胞)中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质体复合物颗粒可用于在这种抗原呈递细胞中表达RNA。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。

A.盐和离子强度

根据本公开，本文所述的组合物可以包括盐，例如氯化钠。不希望受理论束缚，氯化钠在与至少一种阳离子脂质混合之前用作预处理RNA的离子渗透压剂。某些实施方案考虑了本公开内容中氯化钠的替代有机盐或无机盐。可供选择的盐包括但不限于氯化钾、磷酸二钾、磷酸一钾、乙酸钾、碳酸氢钾、硫酸钾、乙酸钾、磷酸二钠、磷酸一钠、乙酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、乙酸钠、氯化锂、氯化镁、磷酸镁、氯化钙和乙二胺四乙酸(EDTA)的钠盐。

通常，包括本文所述RNA脂质体复合物颗粒的组合物包括氯化钠，其浓度优选为0mM至约500mM、约5mM至约400mM，或约10mM至约300mM。在一个实施方案中，包括RNA脂质体复合物颗粒的组合物包括对应于这种氯化钠浓度的离子强度。

B.稳定剂

本文所述的组合物可以包括稳定剂以避免在冷冻、冻干、喷雾干燥或存储(例如冷冻、冻干或喷雾干燥组合物的存储)期间产品质量的大量丧失，特别是RNA活性的大量丧失。

在一个实施方案中，稳定剂是碳水化合物。如本文所用的术语“碳水化合物”是指并包括单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。

在本公开的实施方案中，稳定剂是甘露糖、葡萄糖、蔗糖或海藻糖。根据本公开，本文所述的RNA脂质体复合物颗粒组合物具有适于组合物稳定性、特别是适于RNA脂质体复合物颗粒稳定性和适于RNA稳定性的稳定剂浓度。

C.pH和缓冲液

根据本公开，本文所述的RNA脂质体复合物颗粒组合物具有适于RNA脂质体复合物颗粒的稳定性，特别是适于RNA的稳定性的pH。在一个实施方案中，本文所述的RNA脂质体复合物颗粒组合物具有约5.5至约7.5的pH。

根据本公开，提供了包括缓冲液的组合物。不希望受理论的束缚，使用缓冲液在组合物的制造、储存和使用过程中保持组合物的pH。在本公开的某些实施方案中，缓冲液可以是碳酸氢钠、磷酸一钠、磷酸二钠、磷酸一钾、磷酸二钾、[三(羟甲基)甲基氨基]丙磺酸(TAPS)、2-(双(2-羟基乙基)氨基)乙酸(Bicine)、2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)、N-(2-羟基-1,1-双(羟基甲基)乙基)甘氨酸(Tricine)、3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸(TAPSO)、2-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(TES)、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、二甲基胂酸、2-吗啉-4-基乙磺酸(MES)、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(MOPSO)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其它合适的缓冲剂可以是盐中的乙酸，盐中的柠檬酸，盐中的硼酸和盐中的磷酸。

在一个实施方案中，缓冲液是HEPES。

在一个实施方案中，缓冲液具有约2.5mM至约15mM的浓度。

D.螯合剂

本公开的某些实施方案考虑了螯合剂的使用。螯合剂是指化合物，其能够与金属离子形成至少两个配位共价键，从而产生稳定的水溶性复合物。不希望受理论束缚，螯合剂降低了游离二价离子的浓度，否则在本公开中可以诱导加速的RNA降解。合适的螯合剂的实例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA的盐、去铁胺B、去铁胺、二硫代卡巴钠、青霉胺、五乙酸钙、五乙酸的钠盐、琥珀酸酯、曲恩汀、次氮基三乙酸、反式-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、双(氨基乙基)乙二醇醚-N,N,N',N'-四乙酸、亚氨基二乙酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸或其盐。在某些实施方案中，螯合剂是EDTA或EDTA的盐。在一个示例性实施方案中，螯合剂是EDTA二钠二水合物。

在一些实施方案中，EDTA的浓度为约0.05mM至约5mM。

E.本公开的组合物的物理状态

在实施方案中，本公开的组合物是液体或固体。固体的非限制性实例包括冷冻形式或冻干形式。在一个优选的实施方案中，组合物是液体。

在一些实施方案中，本公开的组合物包括如本文所述的编码疫苗抗原的RNA、缓冲液(例如HEPES)、阳离子脂质(例如DOTMA)、辅助脂质(例如DOPE)、稳定剂(例如EDTA)、渗透压剂(例如氯化钠)、冷冻保护剂(例如蔗糖)和溶剂(例如注射用水)。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如DOTMA)和辅助脂质(例如DOPE)复合RNA。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如DOTMA)和辅助脂质(例如DOPE)与RNA一起形成RNA脂质体复合物颗粒。在一些实施方案中，本公开的组合物包括如本文所述的编码疫苗抗原的RNA、HEPES、DOTMA、DOPE、EDTA、氯化钠、蔗糖和注射用水。

额外的治疗

在某些实施方案中，可以将额外的治疗与使用本文所述的疫苗RNA的治疗组合给予患者。这种额外的治疗包括一种或多种选自例如放射疗法、外科手术、高温疗法和施用除本文所述疫苗RNA以外的进一步的治疗剂。在某些实施方案中，此类进一步的治疗剂包括一种或多种免疫检查点抑制剂、一种或多种化疗剂或其组合。

免疫检查点抑制剂

如本文所用的，“免疫检查点”是指免疫系统的调节因子，并且特别是调节抗原的T细胞受体识别的幅度和质量的共刺激和抑制信号。在某些实施方案中，免疫检查点是抑制信号。在某些实施方案中，抑制信号是PD-1与PD-L1和/或PD-L2之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用以取代CD28结合。在某些实施方案中，抑制信号是LAG-3和MHC II类分子之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是TIM-3与其一个或多个配体之间的相互作用，所述配体是例如半乳糖凝集素9、PtdSer、HMGB1和CEACAM1。在某些实施方案中，抑制信号是一个或几个KIR与其配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是TIGIT与其配体PVR、PVRL2和PVRL3中的一个或多个之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是CD94/NKG2A与HLA-E之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是VISTA与其结合配偶体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是一个或多个Siglecs与其配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是GARP与其一个或多个配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是CD47与SIRPA之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是PVRIG与PVRL2之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是CSF1R与CSF1之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是BTLA与HVEM之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是由CD39和CD73产生的腺苷能通路的一部分，例如，A2AR和/或A2BR与腺苷之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号是B7-H3与其受体和/或B7-H4与其受体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号由IDO、CD20、NOX或TDO介导。

“程序性死亡-1(PD-1)”受体是指属于CD28家族的免疫抑制受体。PD-1在体内主要在先前激活的T细胞上表达，并与两个配体PD-11(也称为B7-H1或CD274)和PD-12(也称为87-DC或CD273)结合。如本文所用的术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hPD-1共有的表位的类似物。“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两个细胞表面糖蛋白质配体之一(另一个是PD-L2)，其在结合PD-1时下调T细胞激活和细胞因子分泌。如本文所用的术语“PD-11”包括人PD-11(hPD-L1)、hPD-11的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hPD-11共有的表位的类似物。如本文所用的术语“PD-L2”包括人PD-12(hPD-L2)、hPD-12的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hPD-12共有的表位的类似物。PD-1的配体(PD-11和PD-12)在抗原呈递细胞(如树突细胞或巨噬细胞)和其它免疫细胞的表面上表达。PD-1与PD-L1或PD-L2的结合导致T细胞激活的下调。表达PD-L1和/或PD-12的癌细胞能够关闭表达PD-1的T细胞，这导致抗癌免疫应答的抑制。PD-1与其配体之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞的减少、T细胞受体介导的增殖的减少和癌细胞的免疫逃逸。免疫抑制可以通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用来逆转，并且当PD-1与PD-12的相互作用也被阻断时，效果是累加的。

“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)”(也称为CD152)是T细胞表面分子并且是免疫球蛋白超家族的成员。该蛋白通过与CD80(B7-1)和CD86(B7-2)结合而下调免疫系统。如本文所用的术语“CTLA-4”包括人CTLA-4(hCTLA-4)、hCTLA-4的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hCTLA-4共有的表位的类似物。CTLA-4是刺激检查点蛋白CD28的同源物，其对CD80和CD86具有高得多的结合亲和力。CTLA-4在激活的T细胞表面表达，其配体在专业抗原呈递细胞表面表达。CTLA-4与其配体的结合阻止CD28的共刺激信号并产生抑制信号。因此，CTLA-4下调T细胞激活。

“具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体”(TIGIT，也称为WUCAM或Vstm3)是T细胞和自然杀伤(NK)细胞上的免疫受体，并且与DC、巨噬细胞等上的PVR(CD155)和PVRL2(CD112；nectin-2)和PVRL3(CD113；nectin-3)结合，并调节T细胞介导的免疫。如本文所用的术语“TIGIT”包括人TIGIT(hTIGIT)、hTIGIT的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hTIGIT共有的表位的类似物。如本文所用的术语“PVR”包括人PVR(HPVR)、HPVR的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与HPVR共有的表位的类似物。如本文所用的术语“PVRL2”包括人PVRL2(hPVRL2)、hPVRL2的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hPVRL2共有的表位的类似物。如本文所用的术语“PVRL3”包括人PVRL3(hPVRL3)、hPVRL3的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hPVRL3共有的表位的类似物。

“B7家族”是指具有未确定受体的抑制配体。B7家族包括B7-H3和B7-H4，两者都在肿瘤细胞和肿瘤浸润细胞上上调。如本文所用的术语“B7-H3”和“B7-H4”包括人B7-H3(hB7-H3)和人B7-H4(hB7-H4)，它们的变体、异构体和物种同源物，以及分别具有至少一个与B7-H3和B7-H4共有的表位的类似物。

“B和T淋巴细胞衰减因子”(BTLA，也称为CD272)是在Th1而不是Th2细胞中表达的TNFR家族成员。BTLA的表达在T细胞激活期间被诱导，特别是在CD8⁺ T细胞表面表达。如本文所用的术语“BTLA”包括人BTLA(hBTLA)、hBTLA的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hBTLA共有的表位的类似物。BTLA的表达在人CD8⁺ T细胞分化成效应细胞表型期间逐渐下调。肿瘤特异性人CD8⁺ T细胞表达高水平的BTLA。BTLA与“疱疹病毒入侵介质”(HVEM，也称为TNFRSF14或CD270)结合并参与T细胞抑制。如本文所用的术语“HVEM”包括人HVEM(hHVEM)、hHVEM的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hHVEM共有的表位的类似物。BTLA-HVEM复合物负调节T细胞免疫应答。

“杀伤细胞免疫球蛋白样受体”(KIR)是NK T细胞和NK细胞上的MHC I类分子受体，其参与健康细胞和患病细胞之间的分化。KIR与抑制正常免疫细胞激活的人白细胞抗原(HLA)A、(HLA)B和(HLA)C结合。如本文所用的术语“KIR”包括人KIR(hKIR)、hKIR的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hKIR共有的表位的类似物。如本文所用的术语“HLA”包括HLA的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与HLA共有的表位的类似物。如本文所用的KIR特别指KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3。

“淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)”(也称为CD223)是抑制性受体，其通过结合MHC II类分子而抑制淋巴细胞活性。该受体增强调节性T细胞的功能并抑制CD8+效应T细胞功能，导致免疫应答抑制。LAG-3在激活的T细胞、NK细胞、B细胞和DC上表达。如本文所用的术语“LAG-3”包括人LAG-3(hLAG-3)、hLAG-3的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。

“T细胞膜蛋白-3(TIM-3)”(也称为HAVcr-2)是抑制受体，其通过抑制Th1细胞应答而参与抑制淋巴细胞活性。其配体是半乳糖凝集素9(GAL9)，其在各种类型的癌症中上调。其它TIM-3配体包括磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)和癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)。如本文所用的术语“TIM-3”包括人Tim3(hTIM-3)、hTIM-3的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。如本文所用的术语“GAL9”包括人GAL9(hGAL9)、hGAL9的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。如本文所用的术语“PdtSer”包括具有至少一个共有的表位的变体和类似物。如本文所用的术语“HMGB1”包括人HMGB1(hHMGB1)、hHMGB1的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。如本文所用的术语“CEACAM1”包括人CEACAM1(hCEACAM1)、hCEACAM1的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。

“CD94/NKG2A”是主要在自然杀伤细胞和CD8+ T细胞表面表达的抑制性受体。如本文所用的术语“CD94/NKG2A”包括人CD94/NKG2A(hCD94/NKG2A)、hCD94/NKG2A的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。CD94/NKG2A受体是包括CD94和NKG2A的异二聚体。它可能通过结合配体(如HLA-E)，抑制NK细胞激活和CD8+ T细胞功能。CD94/NKG2A限制自然杀伤细胞(NK细胞)、自然杀伤T细胞(NK-T细胞)和T细胞(α/β和γ/δ)的细胞因子释放和细胞毒性应答。NKG2A经常在肿瘤浸润细胞中表达，而HLA-E在几种癌症中过表达。

“吲哚胺2,3-双加氧酶”(IDO)是具有免疫抑制特性的色氨酸分解代谢酶。如本文所用的术语“IDO”包括人IDO(h1DO)、h1DO的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。IDO是色氨酸降解中催化其转化为犬尿氨酸的限速酶。因此，IDO参与必需氨基酸的消耗。已知其涉及T细胞和NK细胞的抑制、调节性T细胞和髓源性抑制细胞的产生和激活，以及肿瘤血管生成的促进。IDO在许多癌症中过表达，并且显示出促进肿瘤细胞的免疫系统逃逸并且当由局部炎症诱导时促进慢性肿瘤进展。

在如本文所用的“腺苷能通路”或“腺苷信号通路”中，ATP通过外核苷酶CD39和CD73转化为腺苷，通过腺苷结合的一种或多种抑制性腺苷受体“腺苷A2A受体”(A2AR，也称为adora2a)和“腺苷A2B受体”(A2BR，也称为ADORA2B)导致抑制性信号传导。腺苷是具有免疫抑制特性的核苷，并且以高浓度存在于肿瘤微环境中，限制免疫细胞浸润、细胞毒性和细胞因子产生。因此，腺苷信号传导是癌细胞避免宿主免疫系统清除的策略。通过A2AR和A2BR的腺苷信号传导在癌症治疗中是一个重要的检查点，其被通常存在于肿瘤微环境中的高腺苷浓度激活。CD39、CD73、A2AR和A2BR由大多数免疫细胞表达，包括T细胞、恒定自然杀伤细胞、B细胞、血小板、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。通过A2AR和A2BR的腺苷信号传导抵消了T细胞受体介导的免疫细胞的激活，并导致调节性T细胞数量增加和DC和效应T细胞的激活降低。如本文所用的术语“CD39”包括人CD39(hCD39)、hCD39的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。如本文所用的术语“CD73”包括人CD73(hCD73)、hCD73的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。如本文所用的术语“A2AR”包括人A2AR(hA2AR)、hA2AR的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。如本文所用的术语“A2BR”包括人A2BR(hA2BR)、hA2BR的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。

“T细胞激活V结构域Ig抑制剂”(VISTA，也称为C10orf54)与PD-L1具有同源性，但显示出限制于造血区室的独特表达模式。如本文所用的术语“VISTA”包括人VISTA(hVISTA)、hVISTA的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。VISTA诱导T细胞抑制并且由肿瘤内的白细胞表达。

“唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素”(Siglec)家族成员识别唾液酸并且涉及“自身”和“非自身”之间的区别。如本文所用的术语“Siglecs”包括人Siglecs(hSiglecs)、hSiglecs的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个具有一个或多个hSiglecs的共有的表位的类似物。人类基因组含有14个Siglecs，其中几个涉及免疫抑制，包括但不限于Siglec-2、Siglec-3、Siglec-7和Siglec-9。Siglec受体结合含有唾液酸的聚糖，但在它们对唾液酸残基的键合区域化学和空间分布的识别方面不同。该家族的成员也具有不同的表达模式。广泛的恶性肿瘤过度表达一种或多种Siglecs。

“CD20”是在B和T细胞表面上表达的抗原。CD20的高表达可以在癌症中发现，例如B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和黑色素瘤癌症干细胞。如本文所用的术语“CD20”包括人CD20(hCD20)、hCD20的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。

“糖蛋白A主导重复序列”(GARP)在免疫耐受和肿瘤逃逸患者免疫系统的能力中起作用。如本文所用的术语“GARP”包括人GARP(hGARP)、hGARP的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个共有的表位的类似物。GARP在淋巴细胞上表达，包括外周血的调节性T细胞和肿瘤部位的肿瘤浸润性T细胞。它可能与潜在的“转化生长因子β”(TGF-β)结合。调节性T细胞中GARP信号传导的破坏导致耐受性降低并抑制调节性T细胞迁移至肠道和细胞毒性T细胞的增殖。

“CD47”是跨膜蛋白质，其与配体“信号调节蛋白质α”(SIRPα)结合。如本文所用的术语“CD47”包括人CD47(hCD47)、hCD47的变体，异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hCD47共有的表位的类似物。如本文所用的术语“SIRPα”包括人SIRPα(hSIRPα)、hSIRPα的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hSIRPα共有的表位的类似物。CD47信号传导涉及一系列细胞过程，包括细胞凋亡、增殖、粘附和迁移。CD47在许多癌症中过表达，并作为“别吃我”信号传递给巨噬细胞。通过抑制性抗CD47或抗SIRPα抗体阻断CD47信号传导使得巨噬细胞吞噬癌细胞并促进癌症特异性T淋巴细胞的激活。

“脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域”(PVRIG，也称为CD112R)与“脊髓灰质炎病毒受体相关2”(PVRL2)结合。PVRIG和PVRL2在许多癌症中过表达。PVRIG表达还诱导TIGIT和PD-1表达，并且PVRL2和PVR(TIGIT配体)在几种癌症中共同过表达。PVRIG信号通路的阻断导致T细胞功能和CD8+ T细胞应答的增加，并因此降低免疫抑制和干扰素应答的增加。如本文所用的术语“PVRIG”包括人PVRIG(hPVRIG)、hPVRIG的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hPVRIG共有的表位的类似物。如本文所用的“PVRL2”包括如上所定义的hPVRL2。

“集落刺激因子1”通路是可根据本公开靶向的另一检查点。CSF1R是结合CSF1的骨髓生长因子受体。CSF1R信号传导的阻断可以功能性地重新编程巨噬细胞应答，从而增强抗原呈递和抗肿瘤T细胞应答。如本文所用的术语“CSF1R”包括人CSF1R(hCSF1R)、hCSF1R的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hCSF1R共有的表位的类似物。如本文所用的术语“CSF1”包括人CSF1(hCSF1)、hCSF1的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hCSF1共有的表位的类似物。

“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH氧化酶”是指髓样细胞的NOX酶家族的酶，其产生免疫抑制活性氧物质(ROS)。已经发现五种NOX酶(NOX1至NOX5)参与癌症发展和免疫抑制。已经在几乎所有的癌症中检测到升高的ROS水平并且促进了肿瘤发展和进程的许多方面。NOX产生的ROS减弱NK细胞和T细胞功能，并且抑制髓样细胞中的NOX可改善相邻NK细胞和T细胞的抗肿瘤功能。如本文所用的术语“NOX”包括人NOX(hNOX)、hNOX的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hNOX共有的表位的类似物。

根据本公开可靶向的另一免疫检查点是由“色氨酸-2,3-双加氧酶”(TDO)介导的信号。TDO代表在色氨酸降解中IDO的替代途径并且涉及免疫抑制。由于肿瘤细胞可以通过TDO而不是IDO分解代谢色氨酸，因此TDO可以代表检查点阻断的额外的靶。实际上，已经发现数种癌细胞系上调TDO并且TDO可以补充IDO抑制。如本文所用的术语“TDO”包括人TDO(hTDO)、hTDO的变体、异构体和物种同源物，以及具有至少一个与hTDO共有的表位的类似物。

许多免疫检查点由特异性受体和配体对之间的相互作用调节，例如上述的那些。因此，免疫检查点蛋白介导免疫检查点信号传导。例如，检查点蛋白直接或间接调节T细胞激活、T细胞增殖和/或T细胞功能。癌细胞经常利用这些检查点通路来保护自身免受免疫系统的攻击。因此，根据本公开内容调节的检查点蛋白的功能通常是T细胞激活、T细胞增殖和/或T细胞功能的调节。因此，免疫检查点蛋白调节和维持自身耐受性以及生理免疫应答的持续时间和幅度。许多免疫检查点蛋白属于B7:CD28家族或肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，并且通过与特异性配体结合，激活招募到细胞质结构域的信号传导分子(Suzuki etal.,2016,Jap J Clin One,46:191-203)。

如本文所用的，术语“免疫检查点调节剂”或“检查点调节剂”是指调节一种或多种检查点蛋白的功能的分子或化合物。免疫检查点调节剂通常能够调节自身耐受性和/或免疫应答的幅度和/或持续时间。优选地，根据本公开使用的免疫检查点调节剂调节一种或多种人检查点蛋白的功能，因此是“人检查点调节剂”。在一个优选的实施方案中，如本文所用的人检查点调节剂是免疫检查点抑制剂。

如本文所用的，“免疫检查点抑制剂”或“检查点抑制剂”是指完全或部分减少、抑制、干扰或负调节一种或多种检查点蛋白或完全或部分减少、抑制、干扰或负调节一种或多种检查点蛋白的表达的分子。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂结合一种或多种检查点蛋白。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂结合一种或多种调节检查点蛋白的分子。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂结合一种或多种检查点蛋白的前体(例如在DNA或RNA水平上)。可以使用根据本公开的用作检查点抑制剂的任何试剂。

如本文所用的术语“部分”是指至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的水平，例如，抑制检查点蛋白的水平。

在某些实施方案中，适用于本文公开的方法的免疫检查点抑制剂是抑制信号的拮抗剂，例如靶向例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、B7-H3、B7-H4或TIM-3的抗体。这些配体和受体在Pardall,D.,Nature.12:252-264,2012中进行了综述。本文描述了可根据本公开靶向的进一步的免疫检查点蛋白。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂防止与免疫检查点相关的抑制信号。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体或其片段，其干扰与免疫检查点相关的抑制性信号传导。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是小分子抑制剂，其干扰抑制性信号传导。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是基于肽的抑制剂，其干扰抑制性信号传导。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抑制性核酸分子，其干扰抑制性信号传导。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体、其片段或抗体模拟物，其阻止检查点阻断蛋白(例如，抗体)或其片段之间的相互作用，从而阻止PD-1和PD-L1或PD-L2之间的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体、其片段或抗体模拟物，其阻止CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体、其片段或抗体模拟物，其阻止LAG-3和其配体，或TIM-3和其配体之间的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂通过CD39和/或CD73和/或A2AR和/或A2BR与腺苷的相互作用阻止抑制性信号传导。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止B7-H3与其受体和/或B7-H4与其受体相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止BTLA与其配体HVEM相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止一种或多种K1R与其相应配体相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止LAG-3与其一种或多个配体相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止TIM-3与其配体Galectin-9、PtdSer、HMGB1和CEACAM1中的一种或多种相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止TIGIT与其配体PVR、PVRL2和PVRL3中的一种或多种相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止CD94/NKG2A与HLA-E相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止VISTA与其结合配偶体中的一种或多种相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止一种或多种Siglecs与其相应配体的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止CD20信号传导。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止GARP与其配体中的一种或多种相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止CD47与SIRPA的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止PVRIG与PVRL2相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止CSF1R与CSF1的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止NOX信号传导。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止IDO和/或TDO信号传导。

如本文所述，抑制或阻断抑制性免疫检查点信号传导导致预防或逆转免疫抑制和针对癌细胞的T细胞免疫的建立或增强。在一个实施方案中，如本文所述的免疫检查点信号传导的抑制减少或抑制免疫系统的功能障碍。在一个实施方案中，如本文所述的免疫检查点信号传导的抑制使得功能障碍的免疫细胞的功能障碍较小。在一个实施方案中，如本文所述，免疫检查点信号传导的抑制使得功能障碍T细胞功能障碍更少。

如本文所用的术语“功能障碍(dysfunction)”是指对抗原刺激的免疫应答降低的状态。该术语包括可能发生抗原识别但随后的免疫应答对控制感染或肿瘤生长无效的耗竭和/或无能的共同要素。功能障碍还包括由于免疫细胞功能障碍而延缓抗原识别的状态。

如本文所用的术语“功能障碍(dysfunctional)”是指处于对抗原刺激的免疫应答降低状态的免疫细胞。功能障碍包括对抗原识别无反应和将抗原识别转化为下游T细胞效应子功能的能力受损，例如增殖、细胞因子产生(例如，IL-2)和/或靶细胞杀伤。

如本文所用的术语“无能”是指由通过T细胞受体(TCR)递送的不完全或不充分的信号引起的对抗原刺激无应答的状态。T细胞无能也可以在没有共刺激的情况下用抗原刺激时产生，导致即使在共刺激的情况下，细胞也变得难以随后被抗原激活。无应答状态经常被IL-2的存在所覆盖。无能T细胞不进行克隆扩增和/或获得效应子功能。

如本文所用的术语“耗竭”是指免疫细胞耗竭，例如T细胞耗竭作为T细胞功能障碍的状态，其由在许多慢性感染和癌症期间发生的持续TCR信号传导引起。它与无能的区别在于它不是通过不完全或不充分的信号传导而产生，而是从持续的信号传导而产生。耗竭定义为效应子功能差、抑制性受体的持续表达和不同于功能性效应子或记忆T细胞的转录状态。耗竭阻止了对疾病(例如感染和肿瘤)的最佳控制。耗竭可由外源性负调节通路(例如，免疫调节细胞因子)以及细胞内源性负调节通路(抑制性免疫检查点通路，如本文所述)两者引起。

“增强T细胞功能”是指诱导、引起或刺激T细胞具有持续或扩增的生物功能，或更新或重新激活耗竭的或不活跃的T细胞。增强T细胞功能的实例包括相对于干预前的水平增加的来自CD8+ T细胞的γ-干扰素分泌、增加的增殖、增加的抗原应答(例如肿瘤清除)。在一个实施方案中，增强水平为至少为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％或更多。测量这种增强的方式是本领域普通技术人员已知的。

免疫检查点抑制剂可以是抑制性核酸分子。如本文所用的术语“抑制性核酸”或“抑制性核酸分子”是指核酸分子，例如DNA或RNA，其完全或部分减少、抑制、干扰或负调节一种或多种检查点蛋白。抑制性核酸分子包括但不限于寡核苷酸、siRNA、shRNA、反义DNA或RNA分子以及适配体(例如DNA或RNA适配体)。

如本文所用的术语“寡核苷酸”是指核酸分子，其能够降低蛋白质表达，特别是检查点蛋白(如本文所述的检查点蛋白)的表达。寡核苷酸是短DNA或RNA分子，通常包括2个至50个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的。检查点抑制剂寡核苷酸可以是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸是与给定序列互补的单链DNA或RNA分子，特别是与检查点蛋白的核酸序列(或其片段)的序列互补的单链DNA或RNA分子。反义RNA通常用于通过与所述mRNA结合来防止mRNA(例如编码检查点蛋白的mRNA)的蛋白质翻译。反义DNA通常用于靶向特定的互补(编码或非编码)RNA。如果发生结合，这种DNA/RNA杂合体可以被RNA酶H降解。此外，morpholino反义寡核苷酸可以用于脊椎动物的基因敲除。例如，Kryczek et al.,2006(J Exp Med,203:871-81)设计了特异性阻断巨噬细胞中B7-H4表达的B7-H4特异性morpholino，导致增加的T细胞增殖和在具有肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞的小鼠中减少的肿瘤体积。

术语“siRNA”或“小干扰RNA”或“小抑制RNA”在本文中可互换使用，并且是指具有典型长度的20个至25个碱基对的双链RNA分子，其干扰具有互补核苷酸序列的特定基因(例如编码检查点蛋白的基因)的表达。在一个实施方案中，siRNA干扰mRNA，因此阻断翻译，例如免疫检查点蛋白的翻译。外源siRNA的转染可用于基因敲除，然而，该作用可能仅是瞬时的，特别是在快速分裂的细胞中。稳定的转染可以例如通过RNA修饰或通过使用表达载体来实现。用于用siRNA稳定转染细胞的有用修饰和载体是本领域已知的。也可以修饰siRNA序列以在两条链之间引入短环，从而产生“小发夹RNA”或“shRNA”。shRNA可以被Dicer加工成功能性siRNA。shRNA具有相对低的降解率和周转率。因此，免疫检查点抑制剂可以是shRNA。

如本文所用的术语“适配体”是指单链核酸分子，例如DNA或RNA，通常长度为25个至70个核苷酸，其能够结合靶分子，例如多肽。在一个实施方案中，适配体结合免疫检查点蛋白，例如本文所述的免疫检查点蛋白。例如，根据本公开的适配体可以特异性地结合免疫检查点蛋白或多肽，或结合调节免疫检查点蛋白或多肽表达的信号通路中的分子。适配体的产生和治疗用途是本领域熟知的(参见，例如，US 5,475,096)。

术语“小分子抑制剂”或“小分子”在本文中可互换使用，并且是指通常高达1000道尔顿的低分子量有机化合物，其完全或部分地减少、抑制、干扰或负调节一种或多种如上所述的检查点蛋白。这种小分子抑制剂通常通过有机化学合成，但也可以从天然来源(例如植物、真菌和微生物)中分离。小分子量允许小分子抑制剂快速扩散通过细胞膜。例如，本领域已知的各种A2AR拮抗剂是分子量低于500道尔顿的有机化合物。

免疫检查点抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、抗体模拟物或融合蛋白，其包括具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分。抗体或其抗原结合片段如本文所述。作为免疫检查点抑制剂的抗体或其抗原结合片段特别包括结合免疫检查点蛋白的抗体或其抗原结合片段，例如免疫检查点受体或免疫检查点受体配体。抗体或抗原结合片段也可以与本文所述的其它部分缀合。特别地，抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的或人抗体。优选地，免疫检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段是免疫检查点受体或免疫检查点受体配体的拮抗剂。

在优选的实施方案中，免疫检查点抑制剂的抗体是分离的抗体。

根据本公开的免疫检查点抑制剂的抗体或其抗原结合片段也可以是与任何已知的免疫检查点抑制剂抗体交叉竞争抗原结合的抗体。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂抗体与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂抗体交叉竞争。抗体交叉竞争结合抗原的能力表明这些抗体可以结合抗原的相同表位区域，或者当与另一个表位结合时，在空间上阻碍已知免疫检查点抑制剂抗体与该特定表位区域的结合。这些交叉竞争抗体可以具有与它们交叉竞争的那些抗体非常相似的功能特性，因为预期它们通过结合相同的表位或通过空间上阻碍配体的结合来阻断免疫检查点与其配体的结合。交叉竞争抗体可以基于其与一种或多种已知抗体在标准结合分析(如表面等离子体共振分析、ELISA分析或流式细胞术)中交叉竞争的能力很容易地识别(参见，例如，WO 2013/173223)。

在某些实施方案中，与一种或多种已知抗体相互竞争以结合给定抗原，或与给定抗原的相同表位区域结合的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。为了施用于人类患者，这些交叉竞争抗体可以是嵌合抗体，或人源化或人抗体。这种嵌合、人源化或人单克隆抗体可以通过本领域熟知的方法制备和分离。

检查点抑制剂还可以是分子(或其变体)本身的可溶性形式，例如可溶性PD-L1或PD-L1融合蛋白。

在本公开的上下文中，可以使用一种以上的检查点抑制剂，其中一种以上的检查点抑制剂靶向不同的检查点通路或相同的检查点通路。优选地，一种以上的检查点抑制剂是不同的检查点抑制剂。优选地，如果使用一种以上不同的检查点抑制剂，特别是使用至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同的检查点抑制剂，优选地使用2种、3种、4种或5种不同的检查点抑制剂，更优选地使用2种、3种或4种不同的检查点抑制剂，甚至更优选使用2种或3种不同的检查点抑制剂，最优选使用2种不同的检查点抑制剂。不同检查点抑制剂的组合的优选实例包括PD-1信号传导抑制剂和CTLA-4信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和TIGIT信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和B7-H3和/或87-H4信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和BTLA信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和KIR信号传导抑制剂的组合，PD-1信号传导抑制剂和LAG-3信号传导抑制剂的组合，PD-1信号传导抑制剂和TIM-3信号传导抑制剂的组合，PD-1信号传导抑制剂和CD94/NKG2A信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和IDO信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和腺苷信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和VISTA信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和Siglec信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和CD20信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和GARP信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和CD47信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和PVRIG信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和CSF1R信号传导抑制剂的组合、PD-1信号传导抑制剂和NOX信号传导抑制剂的组合、以及PD-1信号传导抑制剂和TDO信号传导抑制剂的组合。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂(免疫检查点阻断剂)是PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用PD-1信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，PD-1信号通路的检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在某些实施方案中，PD-1信号通路的检查点抑制剂是PD-1配体抑制剂，例如PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂。在优选的实施方案中，PD-1信号通路的检查点抑制剂是抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分破坏PD-1受体与其配体PD-L1和/或PD-L2中的一个或多个之间的相互作用。与PD-1结合并破坏PD-1与其一个或多个配体之间相互作用的抗体是本领域已知的。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性结合PD-1。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性结合PD-L1并抑制其与PD-1的相互作用，从而增加免疫活性。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性结合PD-L2并抑制其与PD-1的相互作用，从而增加免疫活性。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是CTLA-4信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用CTLA-4信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，CTLA-4信号通路的检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂。在某些实施方案中，CTLA-4信号通路的检查点抑制剂是CTLA-4配体抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是TIGIT信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用TIGIT信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，TIGIT信号通路的检查点抑制剂是TIGIT抑制剂。在某些实施方案中，TIGIT信号通路的检查点抑制剂是TIGIT配体抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是B7家族信号通路的组成部分。在某些实施方案中，B7家族成员是B7-H3和B7-H4。本公开的某些实施方案提供了向受试者施用B7-H3和/或B7-4的检查点抑制剂。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用靶向B7-H3或B7-H4的抗体或其抗原结合部分。B7家族不具有任何定义的受体，但这些配体在肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞上上调。临床前小鼠模型已显示阻断这些配体可增强抗肿瘤免疫。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是BTLA信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用BTLA信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，BTLA信号通路的检查点抑制剂是BTLA抑制剂。在某些实施方案中，BTLA信号通路的检查点抑制剂是HVEM抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是一种或多种KIR信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用一种或多种KIR信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，一种或多种KIR信号通路的检查点抑制剂是KIR抑制剂。在某些实施方案中，一种或多种KIR信号通路检查点抑制剂是KIR配体抑制剂。例如，根据本公开的KIR抑制剂可以是结合KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3的抗KIR抗体。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是LAG-3信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用LAG-3信号传导的检查点抑制剂。在某些实施方案中，LAG-3信号通路的检查点抑制剂是LAG-3抑制剂。在某些实施方案中，LAG-3信号通路的检查点抑制剂是LAG-3配体抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是TIM-3信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用TIM-3信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，TIM-3信号通路的检查点抑制剂是TIM-3抑制剂。在某些实施方案中，TIM-3信号通路的检查点抑制剂是TIM-3配体抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是CD94/NKG2A信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用CD94/NKG2A信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，CD94/NKG2A信号通路的检查点抑制剂是CD94/NKG2A抑制剂。在某些实施方案中，CD94/NKG2A信号通路的检查点抑制剂是CD94/NKG2A配体抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是IDO信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用IDO信号通路的检查点抑制剂，例如IDO抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是腺苷信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用腺苷信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号通路的检查点抑制剂是CD39抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号通路的检查点抑制剂是CD73抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号通路的检查点抑制剂是A2AR抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号通路的检查点抑制剂是A2BR抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是VISTA信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用VISTA信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，VISTA信号通路的检查点抑制剂是VISTA抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是一种或多种Siglec信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用一种或多种Siglec信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，一种或多种Siglec信号通路的检查点抑制剂是Siglec抑制剂。在某些实施方案中，一种或多种Siglec信号通路的检查点抑制剂是Siglec配体抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是CD20信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用CD20信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，CD20信号通路的检查点抑制剂是CD20抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是GARP信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用GARP信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，GARP信号通路的检查点抑制剂是GARP抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是CD47信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用CD47信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，CD47信号通路的检查点抑制剂是CD47抑制剂。在某些实施方案中，CD47信号通路的检查点抑制剂是SIRPα抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是PVRIG信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用PVRIG信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，PVRIG信号通路的检查点抑制剂是PVRIG抑制剂。在某些实施方案中，PVRIG信号通路的检查点抑制剂是PVRIG配体抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是CSF1R信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用CSF1R信号通路的检查点抑制剂。在某些实施方案中，CSF1R信号通路的检查点抑制剂是CSF1R抑制剂。在某些实施方案中，CSF1R信号通路的检查点抑制剂是CSF1抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是NOX信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用NOX信号通路的检查点抑制剂，例如，NOX抑制剂。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是TDO信号通路的组成部分。因此，本公开的某些实施方案提供了向受试者施用TDO信号通路的检查点抑制剂，例如TDO抑制剂。

示例性PD-1抑制剂包括但不限于：抗PD-1抗体，例如BGB-A317(Beigene；参见US8,735,553,WO 2015/35606和US 2015/0079109)、西米普利单抗(Regeneron；参见WO 2015/112800)和派姆单抗(例如，在WO 2008/156712中公开为hPD109A及其人源化衍生物h409A1、h409A16和h409A17)、AB137132(abeam)、EH12.2H7和RMPL-14(#BE0146；BioxcellLifesciences Pvt.LTD.)、MIH4(Affymetrix eBioscience)、纳武单抗(OPDIVO，BMS-936558；Bristol Myers Squibb；参见WO 2006/121168)、帕博利珠单抗(KEYTRUDA；MK-3475；Merck；参见WO 2008/156712),匹地利珠单抗(CT-011；CureTech；参见Hardy et al.,1994,Cancer Res.,54(22):5793-6和WO 2009/101611)、PDR001(Novartis；参见WO 2015/112900)、MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca；参见WO 2012/145493)、TSR-042(参见WO 2014/179664)、REGN-2810(H4H7798N；查阅US 2015/0203579)、J0001(TAIZHOU JUNSHI PHARMA；参见Si-Yang Liu et al.,2007,J.Hematol.Oneel.70:136)、AMP-224(GSK-2661380；查阅Li et al.,2016,Int J Mol Sci 17(7):1151和WO 2010/027827以及WO 2011/066342)、PF-06801591(Pfizer)、BGB-A317(Beigene；参见WO 2015/35606和US 2015/0079109)、BI754091、SHR-1210(参见WO 2015/085847)和如WO2006/121168,INCSHR1210(JiangsuHengrui Medicine；也称为SHR-1210；参见WO 2015/085847)所述的抗体17D8、2D3、4H1、7D3和5F4，TSR-042(Tesaro Biopharmaceutical；也称为ANB011；参见WO 2014/179664)、GLS-010(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals；也称为WBP3055；参见Si-Yang et al.,2017,J.Hematol.Oneel.70:136)、STI-1110(Sorrento Therapeutics；参见WO 2014/194302)、AGEN2034(Agenus；参见WO 2017/040790)、MGA012(Macrogenics；参见WO 2017/19846)、IBI308(Innovent；参见WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/132825和WO 2017/133540)，抗PD-1抗体，例如在US 7,488,802、US 8,008,449、US 8,168,757、WO 03/042402、WO 2010/089411(进一步公开了抗PD-L1抗体)、WO 2010/036959、WO 2011/159877(进一步公开了抗TIM-3的抗体)、WO 2011/082400、WO 2011/161699、WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2012/145493(进一步公开了抗PD-L1的抗体)、WO 2015/035606、WO 2014/055648(进一步公开了抗KIR抗体)、US 2018/0185482(进一步公开了抗PD-L1和抗TIGIT抗体)，US8,008,449、US 8,779,105、US 6,808,710、US 8,168,757、US2016/0272708和US 8,354,509中所述的，PD-1信号通路的小分子拮抗剂，例如在Shaabaniet al.,2018,Expert Op Ther Pat.,28(9):665-678和Sasikumar and Ramachandra,2018,BioDrugs,32(5):481-497中公开的，涉及PD-1的siRNA，例如在WO 2019/000146和WO2018/103501中公开的，可溶性PD-1蛋白，如WO 2018/222711中公开，以及包括可溶性PD-1形式的溶瘤病毒，例如在WO 2018/022831中所述的。

在某个实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗(OPDIVO；BMS-936558)、派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475)、匹地利珠单抗(CT-011)、PDR001、MEDI0680(AMP-514)、TSR-042、REGN2810、JS001、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、BGB-A317、BI 754091，或SHR-1210。

示例性PD-1配体抑制剂是PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂，并且包括但不限于：抗PD-L1抗体，例如MEDI4736(度伐利尤单抗；AstraZeneca；参见WO 2011/066389)、MSB-0010718C(参见US 2014/0341917)、YW243.55.S70(参见WO 2010/077634的SEQ ID NO:20和US 8,217,149)、MIH1(Affymetrix eBioscience；查阅EP 3 230 319)、MDX-1105(Roche/Genentech；参见WO2013019906和US 8,217,149)、ST1-1014(Sorrento；参见WO 2013/181634)、CK-301(检查点疗法)、KN035(3D Med/Alphamab；参见Zhang et al.,2017,CellDiscov.3:17004)、阿特珠单抗(TECENTRIQ；RG7446；MPDL3280A；R05541267；参见US 9,724,413)、BMS-936559(Bristol Myers Squibb；参见US 7,943,743，WO 2013/173223)、阿维鲁单抗(bavencio；查阅US 2014/0341917)、LY3300054(Eli Lilly Co.)、CX-072(Proclaim-CX-072；也称为CytomX；参见WO 2016/149201)、FAZ053、KN035(参见WO2017020801和WO2017020802)、MDX-1105(参见US 2015/0320859)、US7,943,743中公开的抗PD-L1抗体，包括3G10、12A4(也称为BMS-936559)、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4，抗PD-L1抗体，如WO 2010/077634、US 8,217,149、WO 2010/036959、WO 2010/077634、WO 2011/066342、US 8,217,149、US 7,943,743、WO 2010/089411、US 7,635,757、US 8,217,149、US2009/0317368、WO 2011/066389、WO2017/034916、WO2017/020291、WO2017/020858、WO2017/020801、WO2016/111645、WO2016/197367、WO2016/061142、WO2016/149201、WO2016/000619、WO2016/160792、WO2016/022630、WO2016/007235、WO2015/179654、WO2015/173267、WO2015/181342、WO2015/109124、WO2018/222711、WO2015/112805、WO2015/061668、WO2014/159562、WO2014/165082、WO2014/100079中所述的。

示例性CTLA-4抑制剂包括但不限于：单克隆抗体伊匹单抗(Yervoy；BristolMyers Squibb)和曲美木单抗(Pfizer/Medlmmune)、曲威利单抗、AGEN-1884(Agenus)和ATOR-1015，在WO 2001/014424、US 2005/0201994、EP 1212422、US 5,811,097、US 5,855,887、US 6,051,227、US 6,682,736、US 6,984,720、WO 01/14424、WO 00/37504、US 2002/0039581、US 2002/086014、WO 98/42752、US 6,207,156、US 5,977,318、US 7,109,003和US7,132,281中公开的抗CTLA4抗体，显性负蛋白阿巴西普(Orencia；参见EP 2 855 533)，其包括与CTLA-4ECD融合的IgG1的Fe区域，以及贝拉西普(Nulojix；参见WO 2014/207748)，第二代较高亲和力的CTLA-4-Ig变体，其在CTLA-4ECD中具有相对于阿巴西普的两个氨基酸取代，可溶性CTLA-4多肽，例如RG2077和CTLA4-IgG4m(参见US 6,750,334)，抗CTLA-4适配体和针对CTLA-4的siRNA，例如，如在US 2015/203848中公开的。示例性CTLA-4配体抑制剂在Pile et al.,2015(Encyclopedia of Inflammatory Diseases,M.Parnham(ed.),doi:10.1007/978-3-0348-0620-6_20)中描述。

TIGIT信号通路的示例性检查点抑制剂包括但不限于：抗TIGIT抗体，例如BMS-986207、COM902(CGEN-15137；Compugen)、AB154(Arcus Biosciences)或艾替利单抗(OMP-313M32；OncoMed Pharmaceuticals)，或WO2017/059095(特别是“MAB10”)、US2018/0185482、WO2015/009856和US2019/0077864中公开的抗体。

B7-H3的示例性检查点抑制剂包括但不限于：Fe优化的单克隆抗体依诺妥珠单抗(MGA271；Macrogenics；参见US 2012/0294796)和抗B7-H3抗体MGD009(Macrogenics)以及匹地利珠单抗(参见US 7,332,582)。

示例性的B7-H4抑制剂包括但不限于：在Dangaj et al.,2013(Cancer Research73:4820-9)和Smith et al.,2014(Gynecol Oncol,134:181-189)、WO 2013/025779(例如，由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4编码的2D1、由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:39编码的2H9，和由SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:43编码的2E11)和WO 2013/067492(例如，具有选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:8的氨基酸序列的抗体)中描述的抗体，morpholino反义寡核苷酸，例如，如Kryczek et al.,2006(J Exp Med,203:871-81)描述的，或B7-H4的可溶性重组形式，例如在US 2012/0177645中公开的。

示例性BTLA抑制剂包括但不限于：在Crawford and Wherry,2009(J LeukocyteBiol 86:5-8)、WO2011/014438(例如，4C7或包括根据SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18的重链和轻链的抗体)、WO2014/183885(例如，以编号CNCMI-4752保藏的抗体)和US 2018/155428中描述的抗BTLA抗体。

KIR信号传导的检查点抑制剂包括但不限于：单克隆抗体利瑞鲁单抗(1-7F9；IPH2102；参见US 8,709,411)、IPH4102(Innate Pharma；参见Marie-Cardine et al.,2014,Cancer 74(21):6060-70)，抗KIR抗体，如在例如US 2018/208652、US 2018/117147、US 2015/344576、WO2005/003168、WO2005/009465、WO2006/072625、WO2006/072626、WO2007/042573、WO2008/084106(例如，包括根据SEQ ID NOs:2和SEQ ID NOs:3的重链和轻链的抗体)、WO2010/065939、WO2012/071411、WO2012/160448和WO2014/055648中公开的。

LAG-3抑制剂包括但不限于：抗LAG-3抗体BMS-986016(Bristol-Myers Squibb；参见WO 2014/008218和WO 2015/116539)、25F7(参见US2011/0150892)、IMP731(参见WO2008/132601)、H5L7BW(查阅WO2014140180)，MK-4280(28g-10；Merck；参见WO 2016/028672)、REGN3767(Regneron/Sanofi)、BAP050(参见WO 2017/019894)、IMP-701(LAG-525；Novartis)Sym022(Symphogen)、TSR-033(Tesaro)、MGD013(由MacroGenics开发的靶向LAG-3和PD-1的双特异性DART抗体)、B1754111(Boehringer Ingelheim)、FS118(由F-star开发的靶向LAG-3和PD-1的双特异性抗体)、GSK2831781(GSK)和抗体，如在WO 2009/044273、WO2008/132601、WO 2015/042246、EP 2 320940、US 2019/169294、US 2019/169292、WO 2016/028672、WO 2016/126858、WO 2016/200782、WO 2015/200119、WO 2017/220569、WO 2017/087589、WO 2017/219995、WO 2017/019846、WO 2017/106129、WO 2017/062888、WO 2018/071500、WO 2017/087901、US2017/0260271、WO 2017/198741、WO2017/220555、WO2017/015560、WO2017/025498、WO2017/149143、WO 2018/069500、WO2018/083087、WO2018/034227WO2014/140180中公开的，LAG-3拮抗蛋白质AVA-017(Avacta)，可溶性LAG-3融合蛋白IMP321(eftilagimod；Immutep；参见EP 2 205 257和Brignone et al.,2007,J.lmmunol.,179:4202-4211)，和WO2018/222711中公开的可溶性LAG-3蛋白质。

Tim-3抑制剂包括但不限于：靶向TIM-3的抗体，例如F38-2E2(Biolegend)、考伯利单抗(TSR-022；Tesaro)、LY3321367(Eli Lilly)、MBG453(Novartis)和抗体，如在例如WO2013/006490、WO 2018/085469(例如，包括由根据SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的核酸序列编码的重链和轻链序列的抗体)、WO 2018/106588、WO 2018/106529(例如，包括SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:11的重链和轻链序列的抗体)中公开的。

Tim-3配体抑制剂包括但不限于：CEACAM1抑制剂，例如抗CEACAM1抗体CM10(cCAMBiotherapeutics；参见WO 2013/054331),WO 2015/075725中公开的抗体(例如CM-24、26H7、5F4、TEC-11、12-140-4、4/3/17、COL-4、F36-54、34B1、YG-C28F2、D14HD11、M8.7.7、D11-AD11、HEA81、BI.I、CLB-gran-10、F34-187、T84.1、B6.2、B 1.13、YG-C94G7、12-140-5、scFv DIATHIS1、TET-2；cCAM Biotherapeutics)，由Watt et al.,2001(Blood,98:1469-1479)和在WO 2010/12557WO2010/12557中描述的抗体，以及PtdSer抑制剂，例如巴维昔单抗(Peregrine)。

CD94/NKG2A抑制剂包括但不限于：莫那利珠单抗(IPH2201；Innate Pharma)以及抗体及其生产方法，如US9,422,368(例如人源化2199；参见EP 2 628 753)、EP 3 193 929和WO2016/032334(例如，人源化2270；参见EP 2 628 753)中公开的。

IDO抑制剂包括但不限于：exiguamine A、艾卡哚司他(INCB024360；InCyte；参见US 9,624,185)、吲哚莫德(Newlink Genetics；CAS#：110117-83-4)、NLG919(NewlinkGenetics/Genentech；CAS#：1402836-58-1)、GDC-0919(Newlink Genetics/Genentech；CAS#：1402836-58-1)、F001287(Flexus Biosciences/BMS；CAS#：2221034-29-1)、KHK2455(Cheong et al.,2018,Expert Opin Ther Pat.28(4):317-330)、PF-06840003(参见WO2016/181348)、那伏莫德(RG6078、GDC-0919、NLG919；CAS#：1402837-78-8)、林罗司他(BMS-986205；Bristol-Myers Suibb；CAS#：1923833-60-6)，小分子如1-甲基-色氨酸、吡咯烷-2,5-二酮衍生物(参见WO 2015/173764)和Sheridan,2015,Nat Biotechnol 33:321-322公开的IDO抑制剂。

CD39抑制剂包括但不限于：A001485(Arcus Biosciences)、PSB 069(CAS#:78510-31-3)和抗CD39单克隆抗体IPH5201(Innate Pharma；参见Perrot et al.,2019,CellReports 8:2411-2425.E9)。

CD73抑制剂包括但不限于：抗CD73抗体，例如CP1-006(CorvusPharmaceuticals)、MED19447(Medlmmune；参见WO2016075099)、IPH5301(Innate Pharma；参见Perrot et al.,2019,Cell Reports 8:2411-2425.E9)，WO2018/110555中描述的抗CD73抗体，小分子抑制剂PBS 12379(Tocris Bioscience；CAS#：1802226-78-3)、A000830、A001190和A001421(Arcus Biosciences；参见Becker et al.,2018,Cancer Research78(13Supplement):3691-3691,doi:10.1158/1538-7445.AM2018-3691)，CB-708(CalitheraBiosciences)和基于嘌呤细胞毒性核苷类似物的二膦酸酯，如Allard et al.,2018(lmmunol Rev.,276(1):121-144)描述的。

A2AR抑制剂包括但不限于：小分子抑制剂，例如伊斯特拉德尼林(KW-6002；CAS#:155270-99-8)、PBF-509(Palobiopharma)、ciforadenant(CP1-444:Corvus Pharma/Genentech；CAS#：1202402-40-1)、ST1535([2-丁基-9-甲基-8-(2H-1,2,3-三唑-2-基)-9H-嘌呤-6-基胺]；CAS#:496955-42-1)、ST4206(参见Stasi et al.,2015,Europ J Pharm761:353-361；CAS#：1246018-36-9)、tozadenant(SYN115；CAS#：870070-55-6)、V81444(参见WO2002/055082)、瑞德南特(SCH420814；Merck；CAS#：377727-87-2)、vipadenant(BIIB014；CAS#：442908-10-3)、ST1535(CAS#：496955-42-1)、SCH412348(CAS#：377727-26-9)、SCH442416(Axon 2283；Axon Medchem；CAS#：316173-57-6)、ZM241385(4-(2-(7-氨基-2-(2-呋喃基)-(1，2，4)三唑并(2,3-a)-(1,3,5)三嗪-5-基-氨基)乙基)苯酚；CAS#：139180-30-6)、AZD4635(AstraZeneca)、AB928(双A2AR/A2BR小分子抑制剂；Arcus Biosciences)和SCH58261(参见Popoli et al.,2000,Neuropsychopharm 22:522-529；CAS#:160098-96-4)。

A2BR抑制剂包括但不限于：AB928(双A2AR/A2BR小分子抑制剂；ArcusBiosciences)、MRS 1706(CAS#：264622-53-9)、GS6201(CAS#：752222-83-6)和PBS 1115(CAS#：152529-79-8)。

Vista抑制剂包括但不限于：抗VISTA抗体，例如JNJ-61610588(奥瓦利单抗；Janssen Biotech)和小分子抑制剂CA-170(抗PD-L1/L2和抗VISTA小分子；CAS#：1673534-76-3)。

Siglec抑制剂包括但不限于：US 2019/023786和WO 2018/027203中公开的抗Siglec-7抗体(例如，包括根据SEQ ID NO:1的可变重链区域和根据SEQ ID NO:15的可变轻链区域的抗体)，抗Siglec-2抗体奥英妥珠单抗(Besponsa；参见US 8,153,768和US 9,642,918)，抗Siglec-3抗体吉妥珠单抗奥唑米星(Mylotarg；参见US 9,359,442)或抗Siglec-9抗体，如US 2019/062427、US 2019/023786、WO 2019/011855、WO 2019/011852(例如，包括根据SEQ ID NO:171至SEQ ID NO:176，或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，或SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12，或SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，或SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，或SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，或SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，或SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24，或SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的CDR的抗体)、US 2017/306014和EP 3 146 979中公开的。

CD20抑制剂包括但不限于：抗CD20抗体，例如利妥昔单抗(RITUXAN；IDEC-102；IDEC-C2B8；参见US 5,843,439)、ABP 798(利妥昔单抗生物类似物)、奥法木单抗(2F2；参见WO 2004/035607)、奥妥珠单抗、奥瑞珠单抗(2h7；参见WO 2004/056312)、替伊莫单抗(Zevalin)、托西莫单抗、乌利妥昔单抗(LFB-R603；LFB Biotechnologies)和US 2018/0036306中公开的抗体(例如，包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4至SEQ IDNO:6，或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的轻链和重链的抗体)。

GARP抑制剂包括但不限于：抗GARP抗体，例如ARGX-115(arGEN-X)以及抗体及其生产方法，如在US 2019/127483、US 2019/016811、US 2018/327511、US 2016/251438、EP 3253 796中公开的。

CD47抑制剂包括但不限于：抗CD47抗体，例如HuF9-G4(Stanford University/Forty Seven)、CC-90002/INBRX-103(Celgene/Inhibrx)、SRF231(Surface Oncology)、IB1188(Innovent Biologics)、AO-176(Arch Oncology)，靶向CD47的双特异性抗体，包括TG-1801(N1-1701；靶向CD47和CD19的双特异性单克隆抗体；Novimmune/TG Therapeutics)和N1-1801(靶向CD47和间皮素的双特异性单克隆抗体；Novimmune)，以及CD47融合蛋白，例如ALX148(ALX Oncology；参见Kauder et al.,2019,PLoS One,doi:10.1371/journal.pone.0201832).

SIRPA抑制剂包括但不限于：抗SIRPA抗体，例如OSE-172(Boehringer Ingelheim/OSE)、FSL-189(Forty Seven)、抗SIRPA融合蛋白，例如TT1-621和TT1-662(TrilliumTherapeutics；参见WO 2014/094122)。

PVRIG抑制剂包括但不限于：抗PVRIG抗体，例如COM701(CGEN-15029)以及抗体及其生产方法，如例如WO 2018/033798(例如CHA.7.518.1H4(S241p)、CHA.7.538.1.2.H4(S241p)、CPA.9.086H4(S241p)、CPA.9.083H4(S241p)、CHA.9.547.7.H4(S241p)、CHA.9.547.13.H4(S241P)中公开的，以及抗体，其包括根据SEQ ID NO:5的可变重链结构域和根据WO 2018/033798的SEQ ID NO:10的可变轻链结构域，或抗体，其包括根据SEQ IDNO:9的重链和根据SEQ ID NO:14的轻链；WO 2018/033798进一步公开了抗TIGIT抗体和与抗TIGIT和抗PVRIG抗体的组合疗法)、WO2016134333、WO2018017864(例如，抗体，其包括与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的根据SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:7的重链和/或与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的根据SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:10的轻链，或抗体，其由SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:29编码，或WO2018/017864中公开的另一种抗体)，以及WO 2016/134335中公开的抗PVRIG抗体和融合肽。

CSF1R抑制剂包括但不限于：抗CSF1R抗体卡比利珠单抗(FPA008；FivePrime；参见WO 2011/140249、WO 2013/169264和WO 2014/036357)、IMC-CS4(EiiLilly)、依米妥珠单抗(R05509554；Roche)、RG7155(WO 2011/70024，WO 2011/107553、WO 2011/131407、WO 2013/87699、WO 2013/119716、WO 2013/132044)和小分子抑制剂BLZ945(CAS#：953769-46-5)以及培西达替尼(PLX3397；Selleckchem；CAS#：1029044-16-3)。

CSF1抑制剂包括但不限于：抗CSF1抗体，其在EP 1 223 980和Weir et al.,1996(J Bone Mineral Res 11:1474-1481)、WO 2014/132072中公开，和如WO 2001/030381中公开的反义DNA和RNA。

示例性的NOx抑制剂包括但不限于：NOX1抑制剂，例如小分子ML171(Gianni etal.,2010,ACS Chem Biol 5(10):981-93,NOS31(Yamamoto et al.,2018,Biol PharmBull.41(3):419-426)，NOX2抑制剂，例如小分子组胺二盐酸盐(ceplene)(组胺二盐酸盐(histamine dihydrochloride)；CAS#：56-92-8)、BJ-1301(Gautam et al.,2017,MolCancer Ther 16(10):2144-2156；CAS#：1287234-48-3)和由Lu et al.,2017,BiochemPharmacol 143:25-38描述的抑制剂，NOX4抑制剂，例如小分子抑制剂VAS2870(Altenhoferet al.,2012,Cell Mol Life Sciences 69(14):2327-2343)、二亚苯基碘(CAS#：244-54-2)和GKT137831(CAS#：1218942-37-0；参见Tang et al.,2018,19(10):578-585)。

TDO抑制剂包括但不限于：4-(吲哚-3-基)-吡唑衍生物(参见US 9,126,984和US2016/0263087)、3-吲哚取代的衍生物(参见WO 2015/140717、WO 2017/025868、WO 2016/147144)、3-(吲哚-3-基)-吡啶衍生物(参见US 2015/0225367和WO 2015/121812)、双IDO/TDO拮抗剂，例如在WO 2015/150097、WO 2015/082499、WO 2016/026772、WO 2016/071283、WO 2016/071293、WO 2017/007700中公开的小分子双IDO/TDO抑制剂，和小分子抑制剂CB548(Kim,C,et al.,2018,Annals Oneel 29(suppl_8):viii400-viii441)。

根据本公开，免疫检查点抑制剂是抑制性检查点蛋白的抑制剂，但优选不是刺激性检查点蛋白的抑制剂。如本文所述，CTLA-4、PD-1、TIGIT、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG-3、TIM-3、CD94/NKG2A、IDO、A2AR、A2BR、VISTA、Siglec、CD20、CD39、CD73、GARP、CD47、PVRIG、CSF1R、NOX和TDO抑制剂以及相应配体的抑制剂是已知的，并且其中的几种已经在临床试验中或甚至被批准。基于这些已知的免疫检查点抑制剂，可开发替代的免疫检查点抑制剂。特别地，可以使用优选的免疫检查点蛋白的已知抑制剂，其本身或其类似物，特别是嵌合的、人源化或人形式的抗体和与本文所述的任何抗体交叉竞争的抗体。

本领域普通技术人员将理解，其它免疫检查点靶点也可被拮抗剂或抗体靶向，条件是靶向导致免疫应答如抗肿瘤免疫应答的刺激，如反映在T细胞增殖的增加、T细胞激活的增强和/或细胞因子产生(例如IFN-γ、IL2)的增加。

检查点抑制剂可以以任何方式和通过本领域已知的任何途径施用。施用方式和途径将取决于所使用的检查点抑制剂的类型。

检查点抑制剂可以以如本文所述的任何合适的药物组合物的形式施用。

检查点抑制剂可以以编码免疫检查点抑制剂(例如抑制性核酸分子或抗体或其片段)的核酸(例如DNA或RNA分子)的形式施用。例如，抗体可以在表达载体中编码递送，如本文所述。核酸分子可以这样递送，例如以质粒或mRNA分子的形式，或与递送载体(例如脂质体、脂质体复合物或核酸脂质颗粒)复合。检查点抑制剂也可以通过包括编码检查点抑制剂的表达盒的溶瘤病毒施用。检查点抑制剂还可以通过施用能够表达检查点抑制剂的内源或同种异体细胞来施用，例如以基于细胞的治疗的形式。术语“基于细胞的治疗”是指将表达免疫检查点抑制剂的细胞(例如，T淋巴细胞、树突细胞或干细胞)移植至受试者中以治疗疾病或病症(例如，癌症疾病)。在一个实施方案中，基于细胞的治疗包括基因工程改造的细胞。在一个实施方案中，基因工程细胞表达免疫检查点抑制剂，如本文所述。在一个实施方案中，基因工程细胞表达免疫检查点抑制剂，其是抑制性核酸分子，例如siRNA、shRNA、寡核苷酸、反义DNA或RNA、适配体、抗体或其片段或可溶性免疫检查点蛋白或融合物。基因工程细胞也可以表达增强T细胞功能的进一步的试剂。这样的试剂是本领域已知的。用于抑制免疫检查点信号传导的基于细胞的疗法公开于例如WO 2018/222711中，其全文以引用的方式并入本文中。

如本文所用的术语“溶瘤病毒”是指病毒，其能够选选择性地在体外或体内的癌变或增生过度的细胞中复制，并减缓其生长或诱导其死亡，同时对正常细胞无影响或影响极小。用于递送免疫检查点抑制剂的溶瘤病毒包括表达盒，其可以编码抑制性核酸分子免疫检查点抑制剂，例如siRNA、shRNA、寡核苷酸、反义DNA或RNA、适配体、抗体或其片段或可溶性免疫检查点蛋白或融合物。溶瘤病毒优选是具有复制能力的，并且表达盒在病毒启动子(例如，合成的早期/晚期痘病毒启动子)的控制下。示例性溶瘤病毒包括水疱性口炎病毒(VSV)、弹状病毒(例如小核糖核酸病毒，例如塞内加谷病毒；SVV-001)、柯萨奇病毒、细小病毒、新城疫病毒(NDV)、单纯疱疹病毒(HSV；OncoVEX GMCSF)、反转录病毒(例如，流感病毒)、麻疹病毒、呼肠孤病毒、Sinbis病毒、牛痘病毒，如WO 2017/209053(包括Copenhagen,Western Reserve,Wyeth株)中示例性描述的，以及腺病毒(例如，Delta-24、Delta-24-RGD、ICOVIR-5、ICOVIR-7、Onyx-015、ColoAd1、H101、ADS/3-D24-GMCSF)。在WO 2018/022831中公开了包括可溶性形式的免疫检查点抑制剂的重组溶瘤病毒的生产及其使用方法，在此将其全文引入作为参考。溶瘤病毒可用作减毒病毒。

如本文所述，在一个实施方案中，疫苗RNA与检查点抑制剂一起施用，即共同施用于受试者，例如患者。在某些实施方案中，检查点抑制剂和疫苗RNA作为单一组合物施用于受试者。在某些实施方案中，检查点抑制剂和疫苗RNA同时(同时作为单独的组合物)施用于受试者。在某些实施方案中，检查点抑制剂和疫苗RNA分别施用于受试者。在某些实施方案中，检查点抑制剂在疫苗RNA之前施用于受试者。在某些实施方案中，检查点抑制剂在疫苗RNA之后施用于受试者。在某些实施方案中，检查点抑制剂和疫苗RNA在同一天施用于受试者。在某些实施方案中，检查点抑制剂和疫苗RNA在不同天施用于受试者。

化疗

化疗是使用一种或多种抗癌药物(化疗剂)的癌症治疗类型，通常作为标准化化疗方案的一部分。术语化疗已经意味着细胞内毒物的非特异性使用以抑制有丝分裂。该含义排除了更多的阻断细胞外信号(信号转导)的选择性试剂。具有抑制来自经典内分泌激素(主要是用于乳腺癌的雌激素和用于前列腺癌的雄激素)的生长促进信号的特异性分子或基因靶标的疗法的发展现在被称为激素治疗。相反，生长信号的其它抑制，例如与受体酪氨酸激酶相关的抑制，被称为靶向治疗。

重要的是，药物(无论是化疗、激素治疗还是靶向治疗)的使用构成了癌症的系统治疗，因为它们被引入血流中，因此原则上能够解决体内任何解剖位置的癌症。系统治疗通常与其它方式组合使用，构成局部治疗(即，其功效限于应用它们的解剖区域的治疗)癌症，例如放射治疗、手术或高温治疗。

传统的化疗剂通过干扰细胞分裂(有丝分裂)来展现细胞毒性，但是癌细胞对这些药剂的敏感性变化很大。在很大程度上，化疗可以被认为是损伤或应激细胞的方式，如果启动凋亡，则可以随后导致细胞死亡。

化疗剂包括烷化剂、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂和细胞毒性抗生素。

烷化剂具有烷基化许多分子的能力，包括蛋白质、RNA和DNA。烷化剂的亚型是氮芥、亚硝基脲、四嗪、氮丙啶、顺铂和衍生物，以及非经典的烷化剂。氮芥包括二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和白消安。亚硝基脲包括N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(MeCCNU)、福莫司汀和链脲佐菌素。四嗪包括达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺。氮丙啶包括噻替派、霉素和亚丝醌(AZQ)。顺铂和衍生物包括顺铂、卡铂和奥沙利铂。它们通过与生物学上重要的分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基团形成共价键而损害细胞功能。非经典烷化剂包括甲基苄肼和六甲蜜胺。在一个特别优选的实施方案中，烷化剂是环磷酰胺。

抗代谢物是一组阻碍DNA和RNA合成的分子。它们中的许多具有与DNA和RNA的组成部分相似的结构。抗代谢物类似于核碱基或核苷，但具有改变的化学基团。这些药物通过阻断DNA合成所需的酶或掺入DNA或RNA来发挥它们的作用。抗代谢物的亚型是抗叶酸剂、氟嘧啶、脱氧核苷类似物和硫代嘌呤。抗叶酸剂包括甲氨蝶呤和培美曲塞。氟嘧啶包括氟尿嘧啶和卡培他滨。脱氧核苷类似物包括阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、阿扎胞苷、氟达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨和喷司他丁。硫代嘌呤包括硫鸟嘌呤和巯嘌呤。

抗微管剂通过阻止微管功能来阻断细胞分裂。长春花生物碱阻止微管形成，而紫杉烷阻止微管分解。长春花生物碱包括长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁。紫杉烷包括多西他赛(Taxotere)和紫杉醇(Taxol)。

拓扑异构酶抑制剂是影响两种酶的活性的药物：拓扑异构酶I和拓扑异构酶II，包括伊立替康、拓扑替康、喜树碱、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、美巴龙和阿柔比星。

细胞毒性抗生素是具有多种作用机制的多种药物组。它们在其化疗适应症中共享的共同主题是它们中断细胞分裂。最重要的亚组是蒽环类(例如，多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星和阿柔比星)和博来霉素；其它显著的实例包括丝裂霉素C、米托蒽醌和放线菌素。

在某些实施方案中，用于本文的化疗剂包括紫杉烷(例如多西他赛和/或紫杉醇)、叶酸抗代谢物(例如培美曲塞)、脱氧核苷类似物(例如吉西他滨)、长春花生物碱(例如长春瑞滨)、铂化合物(例如顺铂和/或卡铂)或其组合。在某些实施方案中，用于本文的化疗剂包括紫杉烷(例如多西他赛和/或紫杉醇)、叶酸抗代谢物(例如培美曲塞)、铂化合物(例如顺铂和/或卡铂)或其组合。

紫杉烷

紫杉烷是一类二萜化合物，其首先来源自天然来源，例如红豆杉属植物，但一些已经人工合成。紫杉烷药物的主要作用机制是干扰微管功能，从而抑制细胞分裂过程。紫杉烷包括多西他赛(Taxotere)和紫杉醇(Taxol)。

在某些实施方案中，术语“多西他赛”是指具有下式的化合物：

在某些实施方案中，术语“紫杉醇”是指具有下式的化合物：

叶酸抗代谢物

叶酸抗代谢物(抗叶酸剂)是一类抗代谢物，其拮抗叶酸(维生素B9)作用。叶酸在体内的主要功能是作为参与丝氨酸、甲硫氨酸、胸苷和嘌呤生物合成的各种甲基转移酶的辅因子。因此，抗叶酸剂抑制细胞分裂、DNA/RNA合成和修复以及蛋白质合成。大多数抗叶酸剂通过抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)起作用。

培美曲塞是叶酸抗代谢物，其抑制嘌呤和嘧啶合成中使用的三种酶，胸苷酸合成酶(TS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和甘氨酰胺核苷酸甲酰基转移酶(GARFT)。通过抑制前体嘌呤和嘧啶核苷酸的形成，培美曲塞阻止了正常细胞和癌细胞生长和存活所需的DNA和RNA的形成。

在某些实施方案中，术语“培美曲塞”是指下式的化合物N-[4-(2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基)-l-谷氨酸(例如，作为二钠盐)：

铂化合物

如本文所用的，术语“铂化合物”是指在其结构中包括铂的化合物，例如铂络合物。在一些实施方案中，该术语指用于铂基化疗的化合物。在一些实施方案中，该术语包括化合物例如顺铂、卡铂和奥沙利铂。在一些实施方案中，铂化合物是顺铂和/或卡铂。

在某些实施方案中，术语“顺铂(cisplatin)”或“顺铂(cisplatinum)”是指下式的化合物顺-二胺二氯铂(II)(CDDP)：

在某些实施方案中，术语“卡铂”是指下式的化合物顺式-二氨(1，1-环丁烷二羧酸)铂(II)：

在某些实施方案中，术语“奥沙利铂”是指为下式的与二氨基环己烷载体配体络合的铂化合物的化合物：

在某些实施方案中，术语“奥沙利铂”是指化合物[(1R,2R)-环己烷-1,2-二胺](乙二酸-O,O’)铂(II)。注射用奥沙利铂也以商品名Eloxatine销售。

组合疗法的实施方案

在某些实施方案中，如本文所述的疫苗RNA与一种或多种化疗剂组合(例如，在如本文所述的医疗制剂和/或治疗中)。

在某些实施方案中，化疗剂包括紫杉烷(例如多西他赛和/或紫杉醇)、叶酸抗代谢物(例如培美曲塞)、铂化合物(例如顺铂和/或卡铂)或其组合。

在某些实施方案中，化疗剂包括多西他赛。在这些实施方案中，肺癌可以是第二线或更高非小细胞肺癌(NSCLC)。

在某些实施方案中，化疗剂包括多西他赛并且与雷莫芦单抗组合使用。在这些实施方案中，肺癌可以是任何组织学亚型。

在某些实施方案中，化疗剂包括多西他赛并且与尼达尼布组合使用。在这些实施方案中，肺癌可以是腺癌。

在某些实施方案中，化疗剂包括紫杉醇。

在某些实施方案中，化疗剂包括紫杉醇并且与铂化合物(例如顺铂和/或卡铂)组合使用。

在某些实施方案中，化疗剂包括培美曲塞。

在某些实施方案中，化疗剂包括培美曲塞，并且与铂化合物(例如顺铂和/或卡铂)组合使用。

在某些实施方案中，化疗剂包括顺铂。

在某些实施方案中，化疗剂包括卡铂。

在某些实施方案中，本文所述的疫苗RNA与一种或多种免疫检查点抑制剂组合(例如，在如本文所述的医疗制剂和/或治疗中)。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗体，所述抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及其组合。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体。在某些实施方案中，抗PD-1抗体包括西米普利单抗(LIBTAYO，REGN2810)、纳武单抗(OPDIVO；BMS-936558)、派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475)、匹地利珠单抗(CT-011)、斯巴达珠单抗(PDR001)、MED10680(AMP-514)、多塔利单抗(TSR-042)、西利单抗(JNJ 63723283)、特瑞普利单抗(JSO01)、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、替雷利珠单抗(BGB-A317)、ABBV-181、B1754091或SHR-1210。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括西米普利单抗。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗体，所述抗体包括重链和轻链序列，其中：

(a)重链，其包括氨基酸序列：

和

(b)轻链，其包括氨基酸序列：

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗体，所述抗体包括来自SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63的六个CDR序列(例如，来自SEQ ID NO:62的三个重链CDR和来自SEQ IDNO:63的三个轻链CDR)。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗体，所述抗体包括SEQID NO:62的重链可变区和SEQ ID NO:63的轻链可变区。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗体，所述抗体包括：

(a)重链可变区(VH)，其包括CDR-1、CDR-2和CDR-3，所述CDR-1包括氨基酸序列FTFSNFG，所述CDR-2包括氨基酸序列ISGGGRDT并且所述CDR-3包括氨基酸序列VKWGNIYFDY，和(b)轻链可变区(VL)，其包括CDR-1、CDR-2和CDR-3，所述CDR-1包括氨基酸序列LSINTF，所述CDR-2包括氨基酸序列AAS，并且所述CDR-3包括氨基酸序列QQSSNTPFT。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括抗PD-L1抗体。

在某些实施方案中，抗PD-L1抗体包括阿特珠单抗(TECENTRIQ；RG7446；MPDL3280A；R05541267)、度伐利尤单抗(MEDI4736)、BMS-936559、阿维鲁单抗(bavencio)、洛达利单抗(LY3300054)、CX-072(Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035或MDX-1105。

在某些实施方案中，本文所述的疫苗RNA与一种或多种化疗剂和一种或多种免疫检查点抑制剂组合(例如，在如本文所述的医疗制剂和/或治疗中)。

在某些实施方案中，化疗剂包括如上所述的用于疫苗RNA/化疗剂组合的化疗剂。

在某些实施方案中，化疗剂包括顺铂。

在某些实施方案中，化疗剂包括卡铂。

在某些实施方案中，化疗剂包括紫杉醇和顺铂和/或卡铂的组合(例如，紫杉醇和顺铂的组合、紫杉醇和卡铂的组合、或紫杉醇、顺铂和卡铂的组合)。在这些实施方案中，肺癌可以是鳞状细胞癌。

在某些实施方案中，化疗剂包括培美曲塞和顺铂和/或卡铂的组合(例如，培美曲塞和顺铂的组合、培美曲塞和卡铂的组合，或培美曲塞、顺铂和卡铂的组合)。在这些实施方案中，肺癌可以是非鳞状细胞癌。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包括如上文用于疫苗RNA/免疫检查点抑制剂组合的免疫检查点抑制剂。

在某些实施方案中，(A)化疗剂包括顺铂，和(B)免疫检查点抑制剂，其包括选自以下的抗体：

(i)西米普利单抗；

(ii)抗体，其包括重链和轻链序列，其中：

(a)重链，其包括氨基酸序列：

和

(b)轻链，其包括氨基酸序列：

在某些实施方案中，(A)化疗剂包括卡铂，和(B)免疫检查点抑制剂，其包括选自以下的抗体：

(i)西米普利单抗；

(ii)抗体，其包括重链和轻链序列，其中：

(a)重链，其包括氨基酸序列：

和

(b)轻链，其包括氨基酸序列：

在某些实施方案中，(A)化疗剂包括紫杉醇和顺铂和/或卡铂的组合，和(B)免疫检查点抑制剂，其包括选自以下的抗体：

(i)西米普利单抗；

(ii)抗体，其包括重链和轻链序列，其中：

(a)重链，其包括氨基酸序列：

和

(b)轻链，其包括氨基酸序列：

在这些实施方案中，肺癌可以是鳞状细胞癌。

在某些实施方案中，(A)化疗剂包括培美曲塞和顺铂和/或卡铂的组合，和(B)免疫检查点抑制剂，其包括选自以下的抗体：

(i)西米普利单抗；

(ii)抗体，其包括重链和轻链序列，其中：

(a)重链，其包括氨基酸序列：

和

(b)轻链，其包括氨基酸序列：

(vi)抗体，其包括：(a)重链可变区(VH)，其包括CDR-1、CDR-2和CDR-3，所述CDR-1包括氨基酸序列FTFSNFG，所述CDR-2包括氨基酸序列ISGGGRDT，并且所述CDR-3包括氨基酸序列VKWGNIYFDY，和(b)轻链可变区(VL)，其包括CDR-1、CDR-2和CDR-3，所述CDR-1包括氨基酸序列LSINTF，所述CDR-2包括氨基酸序列AAS，并且所述CDR-3包括氨基酸序列QQSSNTPFT。

在这些实施方案中，肺癌可以是非鳞状细胞癌。

其它药剂

在某些实施方案中，本文所述的疫苗RNA，任选地与一种或多种化疗剂和/或一种或多种如本文所述的免疫检查点抑制剂组合，与如本文所述的其它药剂，特别是其它抗癌剂组合(例如，在如本文所述的医疗制剂和/或治疗中)。

雷莫芦单抗(LY3009806，IMC-1121B，商品名Cyramza)是完全人单克隆抗体(IgG1)，其被开发用于实体瘤的治疗。雷莫芦单抗是一种直接的VEGFR2拮抗剂，其以高亲和力结合VEGFR2的细胞外结构域并阻断天然VEGFR配体(VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D)的结合。雷莫芦单抗与VEGFR2的结合导致VEGF介导的肿瘤血管生成的抑制。

在某些实施方案中，雷莫芦单抗包括抗体，所述抗体包括重链和轻链序列，其中：

(a)重链，其包括氨基酸序列：

和

(b)轻链，其包括氨基酸序列：

在某些实施方案中，雷莫芦单抗包括抗体，所述抗体包括来自SEQ ID NO:70和SEQID NO:71的六个CDR序列(例如，来自SEQ ID NO:70的三个重链CDR和来自SEQ ID NO:71的三个轻链CDR)。在某些实施方案中，雷莫芦单抗包括抗体，所述抗体包括来自SEQ ID NO:70的重链可变区和来自SEQ ID NO:71的轻链可变区。

尼达尼布以Ofev和Vargatef的商品名销售，是用于治疗特发性肺纤维化的口服药物，并且与其它药物一起用于治疗一些类型的非小细胞肺癌。尼达尼布竞争性抑制非受体酪氨酸激酶(nRTKs)和受体酪氨酸激酶(RTKs)。尼达尼布的NRTK靶包括Lck、Lyn和Src。尼达尼布的RTK靶包括血小板来源生长因子受体(PDGFR)α和血小板来源生长因子受体β；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1、成纤维细胞生长因子受体2和成纤维细胞生长因子受体3；血管内皮生长因子受体(VEGFR)1、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；以及FLT3。

在某些实施方案中，术语“尼达尼布”是指下式的化合物：

本公开的药物组合物

本文所述的药剂可以在药物组合物或药物中施用，并且可以以任何合适的药物组合物的形式施用。在一个实施方案中，本文所述的药物组合物是用于在受试者中诱导针对肺癌的免疫应答的免疫原性组合物。例如，在一个实施方案中，免疫原性组合物是疫苗。

在本发明所有方面的一个实施方案中，本文所述的组分(例如编码疫苗抗原的RNA)可以在药物组合物中施用，所述药物组合物可以包括药学上可接受的载体并且可以任选地包括一种或多种佐剂、稳定剂等。在一个实施方案中，药物组合物用于治疗性或预防性治疗，例如用于治疗或预防肺癌。

本文所述的RNA(例如配制为RNA脂质体复合物颗粒)可用作或用于制备用于治疗性或预防性治疗的药物组合物或药物。

本公开的组合物可以以任何合适的药物组合物的形式施用。

术语“药物组合物”涉及制剂，所述制剂包括具有治疗作用的药剂，优选连同药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。所述药物组合物可通过向受试者施用所述药物组合物来用于治疗、预防或降低疾病或病症的严重性。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。在本公开的上下文中，药物组合物包括本文所述的RNA，例如配制为RNA脂质体复合物颗粒。本公开的药物组合物优选包括一种或多种佐剂或可以与一种或多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括一组异质的化合物，例如油乳剂(例如弗氏佐剂)、矿物化合物(例如明矾)、细菌产物(例如百日咳杆菌(Bordetellapertussis)毒素)或免疫刺激复合物。佐剂的实例包括但不限于LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素、趋化因子。趋化因子可以是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFa、INF-γ、GM-CSF、LT-a。进一步已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油，例如ISA51。用于本公开的其它合适的佐剂包括脂肽，例如Pam3Cys。

根据本公开的药物组合物通常以“药学有效量”和“药学上可接受的制剂”施用。术语“药学上可接受的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的材料的非毒性。

术语“药学有效量”是指单独或与其它剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选涉及疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，特别是中断或逆转疾病的进展。在疾病的治疗中期望的反应也可以是延迟所述疾病或所述病症的发作或预防所述疾病或所述状况的发作。本文所述的组合物的有效量将取决于待治疗的状况、疾病的严重程度、患者的个人参数，包括年龄、生理状况、大小和体重、治疗的持续时间、伴随疗法的类型(如果存在)、具体施用途径和类似因素。因此，本文所述的组合物的施用剂量可以是取决于各种这样的参数。在初始剂量对患者的反应不充分的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现的有效更高的剂量)。

在一些实施方案中，有效量包括足以引起肿瘤/病变收缩的量。在一些实施方案中，有效量是足以降低肿瘤生长速率(例如抑制肿瘤生长)的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟肿瘤发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟肿瘤复发的量。在一些实施方案中，有效量是足以增加受试者对肿瘤的免疫应答的量，使得肿瘤生长和/或大小和/或转移减少、延迟、改善和/或预防。有效量可以在一次或多次施用中施用。在一些实施方案中，施用有效量(例如，包括mRNA的组合物)可以：(i)减少癌细胞的数目；(ii)减小肿瘤大小；(iii)抑制、延缓、减慢至一定程度，并可阻止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(例如，减慢至一定程度和/或阻断或预防)转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在某种程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。

本公开的药物组合物可以含有盐、缓冲剂、防腐剂和任选的其它治疗剂。在一个实施方案中，本公开的药物组合物包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

用于本公开的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

如本文所用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于：载体、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂或着色剂。

术语“稀释剂”涉及稀释剂和/或冲淡剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一种或多种。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。

术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，其中活性组分被组合以便促进、增强或能够施用药物组合物。如本文所用的载体可以是一种或多种适合施用于受试者的相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：无菌水、林格氏液、乳酸林格氏液、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开的药物组合物包括等渗盐水。

用于治疗用途的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂是制药领域熟知的，并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)。

药物载体、赋形剂或稀释剂可以根据预期的施用途径和标准药学实践来选择。

本公开的药物组合物的施用途径

在一个实施方案中，本文所述的药物组合物可以静脉内、动脉内、皮下、皮内、脊髓内或肌内施用。在某些实施方案中，药物组合物被配制用于局部施用或系统施用。系统施用可以包括肠内施用，其涉及通过胃肠道的吸收，或肠胃外施用。如本文所用的，“肠胃外施用”是指以除胃肠道以外的任何方式施用，例如通过静脉内注射。在一个优选的实施方案中，药物组合物被配制用于系统施用。在另一个优选的实施方案中，系统施用是通过静脉内施用。

本公开的药物组合物的用途

本文所述的RNA(例如配制为RNA脂质体复合物颗粒)可用于治疗性或预防性治疗疾病，其中向受试者提供由RNA编码的氨基酸序列产生治疗或预防效果。

术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学状况。疾病可以由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者它可以由内部功能障碍引起，例如自身免疫性疾病。在人类中，“疾病”通常被更广泛地用于指任何导致患病个体疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡的状况，或与该个体接触的个体的类似问题。在这种更广泛的意义上，它有时包括损伤、残疾、障碍、综合征、感染、孤立症状、偏差行为，以及结构和功能的非典型变化，而在其它环境和其它目的中，这些可以被认为是可区别的类别。疾病通常不仅在身体上影响个体，而且在情绪上影响个体，因为感染和生活在许多疾病中可以改变人生的观点和人的个性。

在本文中，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗干预(therapeutic intervention)”涉及出于对抗状况(例如疾病或病症)的目的而管理和护理受试者。该术语旨在包括针对受试者所患有的给定状况的全方位治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延迟疾病、病症或状况的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、病症或状况以及预防状况，其中预防应理解为为了对抗疾病、状况或病症而对个体进行的管理和护理，并包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发生。

术语“治疗性治疗”涉及改善健康状态和/或延长(增加)个体的寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体中的疾病，阻止或减缓个体中的疾病的发展，抑制或减缓个体中的疾病的发展，降低个体中的症状的频率或严重性，和/或降低当前患有或先前患有疾病的个体中的复发。

术语“预防性治疗(prophylactic treatment)”或“预防性治疗(preventivetreatment)”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗(prophylactic treatment)”或“预防性治疗(preventive treatment)”在本文中可互换使用。

术语“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。它们是指人或另一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)，其可以患有疾病或病症(例如，癌症)或易受疾病或病症影响，但可以患有或不患有该疾病或病症。在许多实施方案中，个体是人类。除非另有说明，术语“个体”和“受试者”不表示特定的年龄，因此包括成人、老年人、儿童和新生儿。在本公开的实施方案中，“个体”或“受试者”是“患者”。

术语“患者”意指用于治疗的个体或受试者，特别是患病的个体或受试者。

在本公开的一个实施方案中，目的是提供针对表达一种或多种肿瘤抗原的癌细胞的免疫应答，并治疗涉及表达一种或多种肿瘤抗原的细胞的癌症疾病。在一个实施方案中，癌症是肺癌。在一个实施方案中，癌症是非小细胞肺癌，例如晚期或转移性非小细胞肺癌，例如非鳞状细胞癌和鳞状细胞癌。在一个实施方案中，癌症是不可切除的III期NSCLC或转移性IV期NSCLC。在一个实施方案中，肿瘤抗原是CLDN6、KK-LC-1、MAGE-A3、MAGE-A4、PRAME，以及任选的MAGE-C1和NY-ESO-1中的一种或两种。

可以将包括RNA的药物组合物施用于受试者以引发针对受试者中的一种或多种抗原或RNA编码的一种或多种表位的免疫应答，所述抗原或表位可以是治疗性的或部分或完全保护性的。本领域技术人员将会知道，免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位免疫受试者来产生对疾病的免疫保护反应，所述抗原或表位与待治疗的疾病在免疫学上相关。因此，本文所述的药物组合物可用于诱导或增强免疫应答。因此，本文所述的药物组合物在预防和/或治疗涉及抗原或表位的疾病中非常有用，特别是肺癌。

如本文所用的，“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的综合身体反应，并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。细胞免疫应答包括但不限于针对表达抗原的细胞的细胞应答，其特征在于用I类或II类MHC分子呈递抗原。细胞应答涉及T淋巴细胞，可以将其分类为辅助T细胞(也称为CD4+ T细胞)或杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞，CD8+ T细胞或CTL)，所述辅助T细胞通过调节免疫应答起核心作用，所述杀伤细胞诱导感染细胞或癌细胞中的细胞凋亡。在一个实施方案中，本公开的药物组合物的施用涉及针对表达一种或多种肿瘤抗原的癌细胞刺激抗肿瘤CD8+ T细胞应答。在一个具体的实施方案中，肿瘤抗原与I类MHC分子一起呈递。

本公开考虑了可以是保护性的、预防性的、预防性的和/或治疗性的免疫应答。如本文所用的，“诱导(induces)[或诱导(inducing)]免疫应答”可以指示在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答，或其可以指示在诱导之前存在针对特定抗原的基础水平的免疫应答，所述免疫应答在诱导之后增强。因此，“诱导(induces)[或诱导(inducing)]免疫应答”包括“增强(enhances)[或增强(enhancing)]免疫应答”。术语“免疫疗法”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或状况。术语“免疫疗法”包括抗原免疫或抗原疫苗接种。

术语“免疫”或“接种疫苗”描述了向个体施用抗原的过程，目的是诱导免疫应答，例如，出于治疗或预防的原因。

在一个实施方案中，本公开内容设想了实施方案，其中施用本文所述的靶向脾组织的RNA脂质体复合物颗粒。RNA编码包括例如本文所述抗原或表位的肽或蛋白质。RNA被脾中的抗原呈递细胞(例如树突细胞)吸收以表达肽或蛋白质。在抗原呈递细胞任选加工和呈递后，可以产生针对抗原或表位的免疫应答，导致涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。在一个实施方案中，由本文所述的RNA脂质体复合物颗粒诱导的免疫应答包括通过抗原呈递细胞(例如树突细胞和/或巨噬细胞)呈递抗原或其片段(例如表位)，并由于该呈递而激活细胞毒性T细胞。例如，由RNA或其加工产物编码的肽或蛋白质可以由在抗原呈递细胞上表达的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白呈递。然后，MHC肽复合物可以被免疫细胞(例如T细胞或B细胞)识别，导致它们的激活。

因此，在一个实施方案中，本文所述的RNA脂质体复合物颗粒中的RNA在施用后被递送至脾和/或在脾中表达。在一个实施方案中，将RNA脂质体复合物颗粒递送至脾以激活脾抗原呈递细胞。因此，在一个实施方案中，在施用RNA脂质体复合物颗粒后，在抗原呈递细胞中发生RNA递送和/或RNA表达。抗原呈递细胞可以是专业抗原呈递细胞或非专业抗原呈递细胞。专业抗原呈递细胞可以是树突细胞和/或巨噬细胞，甚至更优选脾树突细胞和/或脾巨噬细胞。

因此，本公开涉及用于诱导或增强免疫应答，优选抗肺癌的免疫应答的如本文所述的RNA脂质体复合物颗粒或包括RNA脂质体复合物颗粒的药物组合物。

在一个实施方案中，系统施用如本文所述的RNA脂质体复合物颗粒或包括RNA脂质体复合物颗粒的药物组合物导致RNA脂质体复合物颗粒或RNA在脾中而不是在肺和/或肝中的靶向和/或累积。在一个实施方案中，RNA脂质体复合物颗粒在脾中释放RNA和/或进入脾中的细胞。在一个实施方案中，系统施用如本文所述的RNA脂质体复合物颗粒或包括RNA脂质体复合物颗粒的药物组合物将RNA递送至脾中的抗原呈递细胞。在一个具体的实施方案中，脾中的抗原呈递细胞是树突细胞或巨噬细胞。

术语“巨噬细胞”是指通过单核细胞分化产生的吞噬细胞亚群。由炎症、免疫细胞因子或微生物产物激活的巨噬细胞通过水解和氧化攻击导致病原体降解，非特异性地吞噬并杀死巨噬细胞内的外来病原体。来自降解蛋白质的肽展示在巨噬细胞表面上，在那里它们可以被T细胞识别，并且它们可以直接与B细胞表面上的抗体相互作用，导致T细胞和B细胞激活和免疫应答的进一步刺激。巨噬细胞属于抗原呈递细胞类。在一个实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。

术语“树突细胞”(DC)是指属于抗原呈递细胞类的吞噬细胞的另一种亚型。在一个实施方案中，树突细胞来源自造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征在于高吞噬活性和低T细胞激活潜能。未成熟的树突细胞不断地采样周围环境中的病原体，例如病毒和细菌。一旦它们已经与可呈递抗原接触，它们就被激活成成熟的树突细胞并开始迁移到脾或淋巴结。未成熟树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解成小片段，并且在成熟时使用MHC分子在其细胞表面呈现那些片段。同时，它们上调在T细胞激活中充当共受体的细胞表面受体，例如CD80、CD86和CD40，大大增强了它们激活T细胞的能力。它们还上调CCR7，所述CCR7是一种趋化受体，其诱导树突细胞通过血流到达脾或通过淋巴系统到达淋巴结。这里，它们作为抗原呈递细胞并通过呈递抗原以及非抗原特异性共刺激信号激活辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。因此，树突状细胞可主动诱导T细胞或B细胞相关免疫应答。在一个实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。

术语“抗原呈递细胞”(APC)是能够在其细胞表面上(或在其细胞表面处)显示、获取和/或提呈至少一种抗原或抗原片段的多种细胞的细胞。抗原呈递细胞可以区分为专业抗原呈递细胞和非专业抗原呈递细胞。

术语“专业抗原呈递细胞”涉及抗原呈递细胞，其组成性表达与幼稚T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合体II类(MHC II类)分子。如果T细胞与抗原呈递细胞膜上的MHC II类分子复合体相互作用，则抗原呈递细胞产生诱导T细胞激活的共刺激分子。专业抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。

术语“非专业抗原呈递细胞”涉及抗原呈递细胞，其不组成性表达MHC II类分子，而是在被某些细胞因子(例如干扰素-γ)刺激时表达这些分子。示例性的非专业抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。

“抗原加工”是指抗原降解成加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白质降解成肽)，并且这些片段中的一个或多个(例如，通过结合)与MHC分子结合，以便由细胞呈递，例如抗原呈递细胞呈递给特异性T细胞。

术语“涉及抗原的疾病”或“涉及表位的疾病”是指涉及抗原或表位的任何疾病，例如特征在于存在抗原或表位的疾病。涉及抗原或表位的疾病可以是癌症疾病或简单的癌症。如上所述，抗原可以是与疾病相关的抗原，例如与肿瘤相关的抗原，并且表位可以来源自这样的抗原。

术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述通常以不受调节的细胞生长为特征的个体的生理状况。癌症的实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体地，这样的癌症的实例包括骨癌，血癌，肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经外胚层癌、脊柱肿瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。可以通过本文所述的组合物和方法治疗的癌症的一种具体形式是肺癌。在一个实施方案中，癌症是非小细胞肺癌，例如晚期非小细胞肺癌或转移性非小细胞肺癌，例如非鳞状细胞癌和鳞状细胞癌。在一个实施方案中，癌症是不可切除的III期NSCLC或转移性IV期NSCLC。根据本公开的术语“癌症”还包括癌症转移。

在癌症治疗中的组合策略可能是合乎需要的，这是由于所产生的协同作用，其效果可以显著强于单一治疗方法的影响。在一个实施方案中，药物组合物与免疫治疗剂一起施用。如本文所用的“免疫治疗剂”涉及可以参与激活特异性免疫应答和/或免疫效应子功能的任何试剂。本公开考虑了抗体作为免疫治疗剂的用途。不希望受理论束缚，抗体能够通过各种机制实现针对癌细胞的治疗效果，包括诱导细胞凋亡、阻断信号转导通路的组分或抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或结合补体蛋白质诱导细胞死亡，导致直接细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(CDC)。可与本公开组合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶点(括号中)的非限制性实例包括：阿巴伏单抗(CA-125)、阿昔单抗(CD41)、阿德木单抗(EpCAM)、阿托珠单抗(CD20)、培戈-阿拉赛珠单抗(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(CEA)、阿麦妥单抗(MORAb-009)、马安那莫单抗(TAG-72)、阿泊珠单抗(HLA-DR)、阿西莫单抗(CEA)、阿特珠单抗(PD-L1)、巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(CD22)、贝利尤单抗(BAFF)、贝伐珠单抗(VEGF-A)、比伐珠单抗美登素(CD44v6)、博纳吐单抗(CD19)、维布妥昔单抗(CD30TNFRSF8)、莫坎妥珠单抗(粘蛋白CanAg)、雷坎妥组单抗(MUC1、卡罗单抗喷地肽(前列腺癌细胞)、卡芦单抗(CNT0888)、卡妥索单抗(EpCAM，CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、泊西他组单抗(EpCAM)、西妥木单抗(IGF-1受体)，Claudiximab(Claudin)、泰坦-克利妥珠单抗(MUC1)、可那木单抗(TRAIL-R2)、达西组单抗(CD40)、达罗托组单抗(胰岛素样生长因子I受体)、地诺单抗(RANKL)、地莫单抗(B淋巴瘤细胞)、曲齐妥单抗(DRS)、依美昔单抗(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(SLAMF7)、依那妥组单抗(PDL192)、恩妥昔单抗(NPC-1C)、依帕珠单抗(CD22)、厄妥索单抗(HER2/neu，CD3)、埃达组单抗(整联蛋白质αvβ3)、法妥组单抗(叶酸受体1)、FBTA0S(CD20)、非拉妥组单抗(SCH900105)、芬妥木单抗(IGF-1受体)、法兰妥单抗(糖蛋白75)、非苏木单抗(TGF-β)、加利昔单抗(CD80)、加尼妥单抗(IGF-1)、吉妥珠单抗奥唑米星(CD33)、吉伏组单抗(IL-1β)、吉妥昔单抗(碳酸酐酶9(CA-IX))、Glembatumumab vedotin(GPNMB)、替伊莫单抗(CD20)、艾芦库单抗(VEGFR-1)、Igovoma(CA-125)、英达妥昔单抗(SDC1)、英妥木单抗(CD51)、奥英妥珠单抗(CD22)、伊匹单抗(CD152)、伊妥木单抗(CD30)、拉贝珠单抗(CEA)、来沙木单抗(TRAIL-R2)、利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(CD33)、莫星-洛沃妥珠单抗(CD56)、卢卡木单抗(CD40)、鲁昔单抗(CD23)、马帕木单抗(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(EGFR)、美泊利单抗(IL-5)、米拉组单抗(CD74)，米妥莫单抗(GD3神经节苷脂)、莫格利珠单抗(CCR4)、莫赛妥莫单抗(CD22)、他那可洛单抗(C242抗原)、埃托-那普妥莫单抗(5T4)、Namatumab(RON)、耐昔妥珠单抗(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、纳武单抗(IgG4)、奥法木单抗(CD20)、奥拉单抗(PDGF-Ra)、奥那妥组单抗(人散射因子受体激酶)、莫妥组单抗(EpCAM)、奥戈伏单抗(CA-125)、奥塞芦单抗(OX-40)、帕尼单抗(EGFR)、帕曲妥单抗(HER3)、Pemtumoma(MUC1)、Pertuzuma(HER2/neu)、平妥莫单抗(腺癌抗原)、普林木单抗(波形蛋白)、雷妥莫单抗(N-乙二醇基神经氨酸)、雷曲妥单抗(纤连蛋白质额外结构域-B)、雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(VEGFR2)、利妥木单抗(HGF)、利妥昔单抗(CD20)、罗妥木单抗(IGF-1受体)、沙马组单抗(CD200)、西罗珠单抗(FAP)、司妥昔单抗(IL-6)、他贝芦单抗(BAFF)、Tacatuzumab tetraxetan(甲胎蛋白)、帕他莫单抗(CD19)、替妥莫单抗(腱糖蛋白C)、替妥木单抗(CD221)、替西木单抗(CTLA-4)、替加组单抗(TRAIL-R2)、TNX-650(IL-13)、托西莫单抗(CD20)、曲妥珠单抗(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、曲美木单抗(CTLA-4)、西莫白介素单抗(EpCAM)、乌利妥昔单抗(MS4A1)、乌瑞芦单抗(4-1BB)、伏洛昔单抗(整联蛋白α5β1)、伏妥莫单抗(肿瘤抗原CTAA 16.88)、扎芦木单抗(EGFR)和扎木单抗(CD4)。

在一个实施方案中，免疫治疗剂是PD-1轴结合拮抗剂。PD-1轴结合拮抗剂包括但不限于：PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PD-L1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PD-L2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体的方面，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体的实施方案中，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体的实施方案中，PD-L2结合配偶体是PD-1。PD-1结合拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。抗PD-1抗体的实例包括但不限于MDX-1106(纳武单抗，OPDIVO)、Merck 3475(MK-3475，派姆单抗，KEYTRUDA)、MEDL-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、BGB-108和BGB-A317。

在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素，其包括与恒定区融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224(也称为B7-DCIg，是PD-L2-Fc)，其是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的融合可溶性受体。

在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体，包括但不限于：YW243.55.S70、MPDL3280A(阿特珠单抗)、MEDI4736(度伐利尤单抗)、MDX-1105和MSB0010718C(阿维鲁单抗)。

在一个实施方案中，免疫治疗剂是PD-1结合拮抗剂。在另一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个示例性实施方案中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。

本公开的治疗的具体实施方案

在一个实施方案中，本文所述的RNA(例如配制为RNA脂质体复合物颗粒)通过静脉内(IV)注射施用。

在一个实施方案中，本文所述的RNA(例如配制为RNA脂质体复合物颗粒)以20μg至200μg，例如30μg至100μg，例如60μg至90μg的剂量施用。例如，本文所述的RNA可以以约30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg或90μg的剂量施用。

在一个实施方案中，本文所述的RNA(例如配制为RNA脂质体复合物颗粒)，其包括等摩尔量的编码MAGEA3的RNA、编码CLDN6的RNA、编码KK-LC-1的RNA、编码PRAME的RNA、编码MAGE-A4的RNA和编码MAGE-C1的RNA。

在一个实施方案中，本文所述的治疗包括一个或多个周期。在一个实施方案中，本文所述的治疗包括多个周期，例如3个或更多个周期、4个或更多个周期、5个或更多个周期、6个或更多个周期、7个或更多个周期、8个或更多个周期、9个或更多个周期、10个或更多个周期、11个或更多个周期、12个或更多个周期、13个或更多个周期、14个或更多个周期、或15个或更多个周期。在一个实施方案中，周期的长度为14天至28天，例如约21天。

在一个实施方案中，本文所述的治疗包括一个或多个周期(例如2个周期)，其中在周期的不同天施用本文所述的RNA(例如配制为RNA脂质体复合物颗粒)。例如，周期的长度可以是21天，RNA可以在周期的第1天、第8天和第15天施用。

在一个实施方案中，本文所述的治疗包括一个或多个周期(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或甚至更多个周期)，其中本文所述的RNA(例如配制为RNA脂质体复合物颗粒)仅在周期的单独一天施用。例如，一个周期的长度可以是21天，RNA可以在一个周期的第1天施用。

在一个实施方案中，本文所述的治疗包括多个周期，所述多个周期包括一个或多个周期(例如2个周期)，其中在周期的不同天(例如，例如，周期的长度为21天，RNA在周期的第1天、第8天和第15天施用)施用本文所述的RNA(例如配制为RNA脂质体复合物颗粒)，随后是一个或多个周期，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或甚至更多个周期，其中本文所述的RNA(例如配制为RNA脂质体复合物颗粒)仅在周期的单独一天施用(例如，周期的长度可以是21天，并且可以在周期的第1天施用RNA。).

在一个实施方案中，患者在周期1和周期2的第1天、第8天和第15天接受RNA，并且从周期3开始，仅在第1天施用RNA。在该实施方案中，周期1的第1天的RNA量可以是60μg，并且所有后续应用(周期1第8天和第15天，周期2第1天、第8天和第15天以及从周期3开始)的RNA量可以是90μg。

与抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或其组合的组合。

在一个实施方案中，本文所述的RNA与抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或其组合(例如，西米普利单抗)组合施用。在一个实施方案中，待治疗的患者是PD-1/PD-L1抑制剂难治/复发患者。在一个实施方案中，患者在用PD-1/PD-L1抑制剂预先治疗NSCLC的转移阶段后是难治的或复发的。在一个实施方案中，患者是患有晚期/转移性NSCLC的患者，其不适合疾病的晚期/转移性阶段的化疗和初治。

在一个实施方案中，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或其组合(例如西米普利单抗)在每3周(Q3W)的第1天按批准的剂量施用，例如在RNA后约30分钟。在一个实施方案中，西米普利单抗按批准剂量350mg IV，每3周(Q3W)的第1天给药，例如，在RNA给药后大约30分钟。

与紫杉烷组合。

在一个实施方案中，本文所述的RNA与紫杉烷(例如多西他赛)组合施用。在一个实施方案中，如果符合条件，则先前疗法包括至少一种PD 1/PD-L1抑制剂和一种基于铂的化疗方案。

在一个实施方案中，紫杉烷(例如多西他赛)，在Q3W的第2天以批准的剂量施用。在一个实施方案中，多西他赛在Q3W的第2天以75mg/m2 IV的批准剂量施用。在一个实施方案中，推荐预防性类固醇预用药在第1天施用RNA后最早18小时的第2天开始。在一个实施方案中，在多西他赛之前的一天不允许预先施用类固醇。

本文所引用的文件和研究的引用不是为了承认前述任何一个都是相关的现有技术。关于这些文件的内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成关于这些文件的内容的正确性的任何认可。

提供以下描述是为了使本领域普通技术人员能够制造和使用各种实施方案。具体设备、技术和应用的描述仅作为实例提供。对于本领域的普通技术人员来说，对这里描述的实例的各种修改将是显而易见的，并且在不脱离各种实施方案的精神和范围的情况下，可以将这里定义的一般原理应用于其它实例和应用。因此，各种实施方案并非旨在限于本文所述和所示的实例，而是要符合与权利要求书相一致的范围。

实施例

实施例1：用于治疗非小细胞肺癌的一组免疫原性靶点的识别

我们的临床前研究的范围集中于两个目的：(1)识别非小细胞肺癌中一组有价值的免疫原性靶点；(2)选择具有高概率对特定靶点产生免疫反应并在接种疫苗后获益的癌症患者。

在最初的靶点发现方法中，探索非小细胞肺癌和健康组织的RNA测序数据，以便选择最频繁和肿瘤特异性表达的靶基因。这些靶点应该在大量肿瘤中表达，在必需器官如脑和心脏中弱表达或不表达，并且与肿瘤相比，在除生殖组织或妇科组织外的其它人体组织中表达较低或缺失。基于上述标准的基因的选择和过滤旨在扩大靶点可以诱导免疫原性(不被认为是自身抗原)的可能性，从而降低毒性(不在必需器官中表现)。针对非小细胞肺癌的两种主要亚型：肺腺癌和鳞状细胞癌，评估靶点，并最终选择用以解决这两种疾病亚型。

所有生物信息学分析使用可公开获得的(GTEx，Genotype-Tissue Expression项目(Nature Genetics 45,580-585(2013))和TCGA，The Cancer Genome Atlas(Nature489,519-525(2012)；Campbell,J.D.et al.,Nat.Genet.48,607-616(2016)；Nature 511,543-550(2014))和专有的RNA-Seq基因表达数据。将RNA读数与hg19参考基因组和转录组比齐，并通过与UCSC已知基因转录本和外显子坐标比较，然后归一化为RPKM单位来确定基因表达(Mortazavi,A.et al.,Nature methods 5,621-628(2008)；Langmead,B.et al.,Genome biology 10,R25；(2009))。通过比较肿瘤和正常组织中的表达来选择靶点，并实现肿瘤群组的高覆盖。表达靶点的肿瘤定义为表达值>1rpkm。

在Fluidigm Biomark^TM平台上进行qRT-PCR分析时，使用了164个新鲜冷冻的原发性肺癌组织样品。总共91个来自43种不同组织类型的新鲜冷冻正常组织样品用于qRT-PCR分析。根据制造商的说明书，使用Qiagen RNeasy Lipid Tissue Mini试剂盒从组织中分离RNA。根据制造商的说明书，使用具有gDNA Eraser的TAKARA-PrimeScript^TM RT试剂试剂盒通过第一链cDNA合成将RNA转化成cDNA。使用Fluidigm检测系统的qRT-PCR分析根据制造商的说明书进行。在对管家基因HPRT1、HMBS和TBP标准化后，使用ΔΔCt计算定量相对RNA表达。在该分析中使用对应于30(PCR中使用的最大循环数)减去正常组织样品的HPRT1管家基因值的平均值的18.2的校准值。分析中使用的引物在表1中列出。技术重复，包括不同的cDNA合成，通过使用中值表达值进行总结。如果分析同一组织类型的多个组织样品，则正常组织中感兴趣基因的相对表达量显示中值表达值。通过在关键正常组织中的特异性表达强度来定义表达靶点的肿瘤(表1)。

表1：用于qRT-PCR分析的寡核苷酸

*MAGEA3的引物也检测MAGEA5和MAGEA6转录本，因为序列同源性非常高。

使用RNA-Seq数据对NSCLC靶基因在肿瘤和正常组织中的表达分析。

使用公共和内部生成的RNA-Seq基因表达数据，从3809个正常组织样品，881个非小细胞肺癌(NSCLC)样品(包括466个肺腺癌(LUAD)和415个鳞状细胞肺癌(LUSC)样品)生成表达热图(图1)。对于大多数靶点，在大部分NSCLC组织中检测到强RNA表达，但仅在少数正常组织(如睾丸和胎盘)中检测到强RNA表达。除睾丸和胎盘外，还检测到肾上腺、肾、卵巢和垂体中的PRAME RNA表达，其在将来的临床研究中应仔细监测。

为了计算可通过疫苗方法潜在地解决的NSCLC患者的百分比，计算各个靶点的肿瘤百分比，以及靶点组合的累积覆盖率(图2)。例如，单独的MAGEA3在66％的肿瘤中表达。随着额外的四个靶点的增加，表达一个或多个靶点的覆盖率增加至84％。为了测试靶点MAGEC1和NY-ESO-1的增加值，计算表达至少两个、三个或更多个靶点的肿瘤比例(图3)。肿瘤比例在具有较高数量的靶点的组中增加，例如约10％以上的肿瘤表达四个或更多的靶点，其指示靶点如MAGEC1、NY-ESO-1或两者的附加值。

使用qRT-PCR数据对NSCLC靶基因在肿瘤和正常组织中的表达分析。

为了使用独立的方法和患者群组确认靶点在NSCLC和正常组织中的表达，使用Fluidigm Biomark^TM平台进行qRT-PCR分析。使用164个NSCLC和其它肺部肿瘤以及43个正常组织位点的RNA表达强度，生成表达热图(图4)。在许多肺部肿瘤组织中检测到强RNA表达，但仅在少数正常组织(如睾丸和胎盘、附睾和子宫)中检测到强RNA表达。

为了计算可通过疫苗方法潜在地解决的NSCLC患者的百分比，计算各个靶点肿瘤百分比，以及靶点组合的累积覆盖率(图5)。例如，单独的MAGEA3在56％的肿瘤中表达。随着额外四个靶点的增加，表达一个或多个靶点的覆盖率增加至80％。为了测试靶点MAGEC1和NY-ESO-1的增加值，计算表达至少两个、三个或更多个靶的肿瘤比例(图6)。肿瘤比例在具有较高数量的靶点的组中增加，例如约10％以上的肿瘤表达四个或更多的靶点，其指示靶点如MAGEC1、NY-ESO-1或两者的附加值。

结论

本研究的目的是研究和选择免疫治疗靶点。通过比较正常和肿瘤组织的转录组数据，选择抗原KK-LC-1、MAGEA3、PRAME、MAGEA4、CLDN6、MAGEC1和NY-ESO-1作为开发针对非小细胞肺癌的重组RNA疫苗的靶点。

RNA-Seq数据和qRT-PCR数据表明在肺腺癌和鳞状细胞癌两种亚型中七个靶点的大量表达。基于至少表达七种靶点之一的肿瘤部分，多达五分之四的非小细胞肺癌患者可能受益于疫苗接种方法。在肿瘤中较不频繁表达的MAGEC1和NY-ESO-1的靶点的接种在表达两个或多个靶点的患者的增加的比例的情况下并且由于先前观察到的免疫原性，可能具有益处。大多数靶点在正常组织中的转录谱不表明在接种后严重器官毒性的风险。

实施例2：体内诱导抗原特异性T细胞

本研究的目的是证实在上述GMP条件下产生的编码MAGEA3、KK-LC-1、CLDN6、NY-ESO-1、MAGEA4和PRAME的RNA批次对抗原特异性T细胞的体内诱导，以及评价在R&D条件下产生的编码MAGEC1的体外转录RNA的免疫原性。RNA在小鼠中通过静脉注射(i.v.)注射了脂质体配方的RNA-LPX进行了体内测试。抗原序列被嵌入到加工和呈递增强结构域中。在所得蛋白质的N端，公司构建分泌结构域以促进转运到核糖体中，而在C端，跨膜结构域和人MHC分子的细胞质部分以框内融合以增强MHC-II类呈递。对于本实验，将转基因A2/DR1小鼠经工程改造以表达人HLA-A*0201和人HLA-DRB1*01分子，但不是内源性，即鼠源性，I类MHC和II类分子被用于检测与HLA-A*0201和HLA-DRB1*01限制表位反应的T细胞的诱导。A2/DR1小鼠类似于显示T细胞免疫原性和最常见的人MHC等位基因的模型。

人MHC转基因小鼠(A2/DR1小鼠)用于检测体内与HLA限制性表位反应的T细胞的产生。在第1天、第8天、第15天和第22天，通过静脉内注射编码上述抗原的RNA-LPX，使用如下所示的脂质体，将七组三至五只小鼠免疫接种三次或四次。在第20天或第27天再5天后对动物实施安乐死，取出脾以制备脾细胞的单细胞悬浮液。使用用相应肽库再次刺激的脾细胞测试所用RNA-LPX的免疫原性。在MAGEC1 RNA的情况下，使用用体外转录的MAGEC1 RNA电穿孔的骨髓来源的树突细胞(BMDC)再刺激的脾细胞来测试免疫原性。特异性T细胞的IFN-γ分泌通过ELISPOT分析测定。ConA用作阳性对照以测试测定的功能性。作为阴性对照，使用仅培养基和不相关的肽或体外转录的编码不相关抗原的RNA，所述不相关抗原不被T细胞识别。

测试物

用于RNA-LPX制剂的脂质体

名称:L1

内容物:1.8mg/mL DOTMA和1.0mg/mL DOPE

名称:L2

内容物:1.8mg/mL DOTMA和1.0mg/mL DOPE

名称:L3

内容物:0.4mg/mL DOTMA和0.23mg/mL DOPE

体外转录RNA

名称:MAGEA3

浓度:0.04mg RNA/mL

名称:KK-LC-1

浓度:0.5mg RNA/mL

名称:CLDN6

浓度:0.5mg RNA/mL

名称:NY-ESO-1

浓度:0.5mg RNA/mL

名称:MAGEA4

浓度:0.5mg RNA/mL

名称:PRAME

浓度:0.5mg RNA/mL

名称:MAGEC1

为了制备RNA-LPX，将测试物解冻，并使所有试剂达到环境温度(15℃至25℃)。所有材料都是无RNA酶的。RNA储备液、水、1.5mMNaCl和脂质体注射至多五只小鼠(200μl/小鼠)，包括一只多余的小鼠。准备含有RNA的小瓶，加入水并涡旋稀释的RNA，之后加入1.5MNaCl，然后再涡旋。将脂质体添加到所得混合物中以获得相应量的RNA-LPX的等渗溶液，电荷比为1.3:2(脂质体：RNA)，并且将管倒置二至四次并且在环境温度下孵育10分钟。所得溶液是略微不透明的RNA-LPX分散体。通过光子相关光谱研究所得RNA-LPX分散体中的粒径。

测试系统

物种：小鼠

品系：HLA-A2.1+/+/HLA-DR1+/+双转基因，H-2I类(β2m0)-/II类(IAβb0)-KO小鼠

饲养员：动物设施，BioNTech SE

性别：雄性/雌性

年龄：6周至41周

动物数：33

动物照料

一般信息

小鼠在BioNTech SE的动物设施中饲养，如第0节所述。所有实验和方案都由地方当局批准(动物福利测试授权-莱茵兰-普法尔茨州管理机构号23177-07/G 14-12-088)，根据FELASA建议并符合EC指令2010/63/EU进行。只有健康状况良好的动物才被选中进行测试程序。借助于实验动物群体管理系统PyRAT(Scionics Computer Innovation GmbH，德雷斯顿，德国)，每只动物在到达或出生时登记并跟踪直至安乐死。用笼卡标记每个笼，所述笼卡指示小鼠品系、性别、出生日期和每个笼的动物数目。在实验开始时，增加了额外的信息，包括项目和许可证号、实验开始以及关于干预的细节。当需要鉴定时，用耳标任意编号动物。

居住条件和饲养

小鼠在BioNTech SE的动物设施中于无菌且无特定病原体免疫的条件下饲养，在单独通风笼中(Sealsafe GM500 IVC Green Line,Tecniplast，Hohenpeiβenberg，德国；500cm²)，每笼最多3只动物。将笼和动物单元中的温度和相对湿度分别保持在20℃至24℃和45％至55％，并且笼中的空气以每小时75次的速率变化。每周更换的无尘垫料由去皮切碎的白桦木制成(Abedd LAB&VET Service GmbH,Vienna,Austria，产品代码：LTE E-001)。高压灭菌的ssniff M-Z食品(Snoiff Spezialdiaten GmbH，Soest，德国；产品代码：V1124)和高压灭菌的自来水随意提供并至少每周更换一次。所有材料在使用前都进行高压灭菌。

动物监测和观察

每天进行常规动物监测，包括对死亡动物的检查以及对食物和水供给的控制。每只动物的健康至少每周被密切评估一次，包括体重、毛皮状况、活动、体温、行为、临床体征，自残，对抗迹象和呼吸。

实验终点/终止标准

根据德国动物福利法案的§4和GV-SOLAS的推荐，通过颈椎脱位将动物安乐死。在实验的第21天或第27天终止研究。

治疗方案、施用途径和剂量

表2：实验设置。

在200μL的固定体积下，在异氟烷麻醉下眼眶后注射相应的测试物制剂。

样品采集与处理

脾细胞

在安乐死后除去脾，并且如下制备单细胞悬浮液：使用注射器的柱塞将除去的器官压过70μm细胞网，以将细胞从器官释放到试管中。用PBS洗涤后，将细胞沉淀用红细胞溶解缓冲液孵育，在PBS中洗涤并再次通过70μm细胞网。最后将细胞重悬于培养基中并计数。

IFN-γELISPOT测定

IFN-γELISPOT测定用于测定体外再刺激T细胞的IFN-γ释放，作为抗原特异性T细胞诱导的指标。

肽的制备

递送后，将所有的肽溶解在细胞培养级DMSO中至终浓度为1mg/ml至2mg/ml。从该肽溶液中，将2μL或4μL(4μg)转移到1.5ml试管中，并用培养基填充至1,000μL，得到4μL/mL的最终浓度。将100μL肽溶液吸至含有100μL单脾细胞单细胞悬浮液的每个孔中(肽/孔的最终浓度：2μg/mL)。

脾细胞

分离的脾细胞在200μL中以5×10⁵细胞/孔的浓度在96孔板中使用涵盖相应的人蛋白的肽池(15个聚合物，重叠11个氨基酸；2μg/mL)在37℃下刺激约20h。作为肽对照，将脾细胞与2μg/mL破伤风类毒素衍生肽(P2、P16和P17)以及不相关的CMV肽一起孵育。在MAGEC1RNA的情况下，使用从骨髓分离的电穿孔培养的小鼠BMDC进行脾细胞刺激。培养的小鼠BMDC用MAGEC1的抗原编码RNA电穿孔，并用编码GAGEC2的RNA作为阴性对照。总共5×10⁴个电穿孔的BMDC/孔在100μL中与5×10⁵个脾细胞在37℃孵育20h。对于所有组，脾细胞与单独作为阴性对照的培养基孵育，或用2μg/ml ConA作为内部阳性对照测试孵育，说明测定的功能性。使用S5Versa ELISPOT分析器、ImmunoCapture^TM图像获取软件以及分析软件版本5(C.T.L.；Cellular Technologies Ltd.)计数并分析斑点数。

结果

在最终RNA-LPX注射后五天从免疫的A2/DR1小鼠获得的脾细胞中，通过ELISPOT分析确定抗原特异性T细胞的体内诱导。为了测试免疫原性RNA，用涵盖相应人蛋白的肽池(15聚体，重叠11个氨基酸)或电穿孔的BMDC再次刺激脾细胞。

用肽池或电穿孔的BMDC再次刺激免疫的小鼠的脾细胞产生特异性免疫原性(图7)。与相应对照的再刺激相比，由MAGEA3-、KK-LC-1-、CLDN6-、NY-ESO-1-、MAGEA4-、PRAME-和MAGEC1-编码RNA-LPX诱导的IFN-γ+斑点计数显著增高。在所有ELISPOT板上，无论脾细胞来自何种动物，单独的阴性对照培养基仅诱导最小的斑点计数；ConA作为阳性对照在ELISPOT测定中诱导了大量的斑点，证实了分离的脾细胞中功能性T细胞的存在，如所预期的。

结论

设计该研究以证实制备用于临床试验的肺癌抗原MAGEA3、KK-LC-1、CLDN6、NY-ESO-1、MAGEA4和PRAME以及在R&D条件下产生的MAGEC1 RNA的免疫原性。获得的数据证明所有生产批次在A2/DR1小鼠中的人HLA-A02背景中都是免疫原性的。总而言之，这些数据表明，所有七种RNA都可以用于免疫治疗方法中，以诱导患者体内的抗原特异性T细胞。

实施例3：体内诱导抗原特异性T细胞

为了确定RNA编码的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫原性，我们使用IFNγ-ELISPOT测定分析了患者接种前和接种后血液样品中的T细胞应答。

IFNγELISpot

用PBS洗涤预先用IFNγ特异性抗体(ELISpotPro试剂盒Mabtech)包被的多筛滤板(Merck Millipore)，并用含有2％人血清白蛋白(CSL-Behring)的X-VIVO 15(Lonza)封闭1小时至5小时。为了分析离体T细胞应答，分别使用3×10⁵细胞/孔的CD4缺失或CD8缺失的PBMC加3×10⁴CD8⁺或CD4⁺ T细胞/孔作为CD8和CD4效应物。试验一式三份或一式两份进行，包括阳性对照和阴性对照，即分别与抗CD3和单独与培养基孵育的PBMC。用直接与Extravidin碱性磷酸酶ALP和BCIP/NBT底物(ELISpotPro试剂盒，Mabtech)缀合的第二抗体可视化斑点。使用AID Classic Robot ELISPOT Reader扫描板并通过AID ELISPOT 7.0软件分析。

对于用疫苗治疗的患者WO5YAH，通过离体ELISPOT分析在治疗后样品中检测到从头疫苗诱导的针对KKLC1和CLDN6的CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答(图8的A)。对于用疫苗治疗的患者AWSVMT，通过离体ELISPOT分析在治疗后样品中检测到从头疫苗诱导的针对PRAME的CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答(图8的B)。

实施例4：在患有非小细胞肺癌的患者的临床肿瘤样品的回顾性群组中使用RT-qPCR结合使用免疫组织化学染色的PD-L1表达分析的肿瘤相关抗原(TAA)的调查

背景、目标、研究设计

基于使用不同方法来评估基因表达的若干来源来选择肺癌项目的靶标。虽然TCGA(癌症基因组图谱)整合了高通量NGS产生的RNAseq数据，RT-qPCR(反转录-定量实时聚合酶链反应)被用于较小的群组中，以更敏感和特异性的检测。数据集在评估的亚型中显示不同的TAA(肿瘤相关抗原)频率分布和覆盖，它们在数据集的可预期的变异范围内。这些数据集不包括超出所选择的TAA的表达的数据。为了加强我们的数据，从临床常规获得约200个样品的群组并分析TAA以及PD-L1表达。从临床数据收集突变数据。

本研究的目的是产生一组肺腺癌、肺鳞状细胞癌和大细胞神经内分泌癌样品中TAA和PD-L1表达的数据。关键问题是用一般选择的TAA(至少一种表达)以及与PD-L1表达和/或驱动突变组合分析的样品的覆盖率百分比。

研究旨在最初收集200个样品，其尽可能多的收集大细胞神经内分泌癌(LCNEC)样品和相等数量的肺腺癌(LUAD)以及肺鳞状细胞癌(LUSC)样品。在可能的情况下，分析与原发肿瘤样品配对的转移瘤，以评估TAA表达的差异。对于所有样品，使用IHC IVD评估PD-L1表达。样品用于覆盖由亚型和/或生物标志物图谱定义的组中所选择的TAA。

材料和方法

反转录-定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)

在一步法RT-qPCR中，反转录和qPCR组合在一个反应中。使用特异性反向引物发生特异性反转录，随后使用DNA聚合酶进行PCR扩增。为了分析，制备含有测定混合物、酶混合物(包括反转录酶、DNA聚合酶、缓冲液和dNTP)和水的主混合物。将主混合物分配到96孔板的孔中，并加入RNA样品和适当的对照(PC和NC)。测试包括含有三种单独测定/靶点的三种三重测定混合物。对于检测，采用水解探针技术，使用不同的荧光染料(FAM、HEX、ATTO647N)来区分三重反应的测定。RT-qPCR在BioRad的CFX96仪器上进行。患者分析的RT-qPCR运行将仅使用一个试剂盒批次的试剂(并且不混合不同试剂盒批次的试剂)。

PD-L1免疫组织化学

在该过程中，在切片上提供患者的肿瘤样品并用于PD-L1分析。用包括患者ID和生物取样ID的Benchmark符合标签标记切片以进行PD-L1染色(PD-L1(SP263)测定(Ventana))。在染色过程完成后，所有的玻片将用打印的Datamatrix代码标签来标记切片。

使用SOP-010-165_Axio Scan.Z1-slidescanner或类似装置中详述的切片扫描仪将染色的切片数字化(全切片成像)储存。此外，切片标签的图像被保存为数字化玻片文件的一部分。被数字化的切片图像被自动分配对应于切片ID的文件名

基于染色的切片，由病理学家确定样品的PD-L1评分。在半定量分析中，肿瘤比例得分(TPS：肿瘤细胞数/活肿瘤细胞数)、免疫细胞得分(IC+：具有PD-L1染色的肿瘤相关免疫细胞)和组合阳性得分(CPS：阳性肿瘤细胞数，淋巴细胞和巨噬细胞数/活细胞数×100)的百分比应被估计染色的患者切片。

测试物

对福尔马林固定的和石蜡包埋的(FFPE)组织样品进行切片。将3μm的切片安装在玻璃玻片上用于IHC分析，并将10μm切片(“卷”)置于微升管中用于随后的核酸分离。

群组合组大小针对200个样本。LCNEC和转移瘤以及它们的原发肿瘤(如果可获得的话)优先考虑。用相等数量的LUSC和LUAD样品填充群组。最后的群组由170个原发肿瘤标本和18个转移标本组成。由于可扩增的RNA量不足，总共4个样品返回无效的测量(2个原发样品，2个转移样品)。一些亚型不在我们的范围内，并且被排除在单独的分析之外。因此，相关的群组由74个肺腺癌(LUAD)原发样本和13个LUAD转移样本，59个肺鳞状细胞癌(LUSC)标本和26个大细胞神经内分泌癌(LCNEC)标本组成。未考虑小于10个样本的组(按亚型区分原发/转移)的结论。

使用以下材料和装置：

RT-qPCR分析基因表达

分析从患者FFPE肿瘤样品中提取的RNA的肿瘤相关抗原CLDN6、CT83、MAGEA3、MAGEA4、MAGEC1和PRAME的mRNA表达。为此目的，已经开发了基因特异性RT-qPCR试验，并将用于R&D分析。

RNA提取

所建立的预分析过程开始于使用RNA提取试剂盒(BioNTechDiagnostics GmbH)根据IFU从1x 10μm FFPE组织切片提取总RNA。简言之，通过在水性缓冲液中加热至80℃进行脱蜡，随后使用蛋白酶K进行裂解。然后在促进缓冲条件下将RNA结合到磁珠上，在每个步骤中，通过磁力固定磁珠，然后移除上清液，在三次洗涤步骤中以及最终洗脱时也是如此。

RT-qPCR

通过一步法RT-qPCR分析提取的RNA，其中首先将mRNA反转录成互补DNA(cDNA)，然后使用基因特异性和异构体特异性引物和探针通过qPCR扩增。在CFX96仪器(Bio-Rad)上进行RT-qPCR。在每次RT-qPCR运行中分析确定的阳性和阴性对照(PC和NC)以确定运行的有效性，并且在PC的情况下在分析中用作校准器。仅分析有效的运行。RT-qPCR分析建立为三重分析，允许每个反应分析三个靶标。通过探针的不同荧光染料(FAM、HEX和ATT0647N，参见下表)来区分一个反应内的测定。初级分析输出是每个靶标的量化周期(Cq)值，其是信号越过背景信号以上的限定阈值的点。Cq是PCR扩增前样品中靶分子的量的量度。对每个样品的每个测定进行三次重复测量，并使用中值Cq进行计算。对于每个样品，必须确定是否存在足够的分析物(＝可扩增的RNA)用于分析。为此，使用三个参考基因(RG)：CALM2、HUWE1和MRPL19的表达水平作为RNA量的替代物。三个RG的中值Cq的平均值从这里命名为“组合参考”(CombRef)计算，其也用于靶基因表达相对于不同RNA输入量的归一化。为此，从靶标的中值Cq中减去CombRef以获得每个靶标的归一化的相对表达式＝ΔCq(dCq)。为了补偿运行间和仪器间的变化，通过从dCQ_样品中减去dCQ _PC以获得最终测试结果，将样品的dCQ进一步相对于PC的dCQ归一化作为校准器，作为ΔΔCq(ddCq)。根据预定的截止值，靶标的(半)定量ddCq值可以额外被分类为阳性或阴性。ddCq的截止值是基于与正常肺和其它正常组织的基因表达相比的肺癌样品的表达分析确定的。

已建立的测定混合物：

ddCq结果计算

CombRef＝(中值Cq[CALM2]+中值Cq[HUWE1]+中值Cq[MRPL19])/3

dCq_样品＝(中值Cq[靶标_样品]-[CombRef_样品])

dCQ_PC＝(中值Cq[靶标_PC]-[CombRef_PC])

ddCq＝dCq_样品-dCq_PC

方法流程

图9示出了该方法的概述。

结果

通过RT-qPCR测定的TAA表达在188个样本中的184个样本中被测量。由于一些样本的亚型不在我们的范围内或数量太小以至于不能得出关于该特定亚型的结论，因此分析集中于靶向亚型肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)和大细胞神经内分泌癌(LCNEC)。仅在LUAD中获得了足够数量的转移。

特定TAA的表达频率根据肿瘤的亚型以及原发肿瘤和转移之间而变化。尽管CLDN6仅在大约20个LUSC或LCNEC肿瘤中的一个中显示表达，它仍然有助于最大限度地覆盖所有肿瘤。一些TAA在LUAD的转移中比在它们的原发肿瘤(即MAGEA4和CT83)中更频繁。这允许在没有进一步选择的情况下处理转移。

神经内分泌癌，尽管是相当不同的组织，但也被覆盖。

表3：肿瘤类型的TAA的频率

表4：所研究的六个TAA对肿瘤的覆盖。描绘了同时表达1个、2个和多至6个TA的肿瘤的百分比。

所选择的六个TAA显示出肺癌肿瘤的广泛覆盖。在该群组中，82％的LUAD原发被我们的集覆盖，相应的转移的覆盖率为100％。LUSC和LCNEC显示92％或甚至98％的覆盖率。重要的是，所有亚组都显示>60％的肿瘤具有2个靶标的覆盖率，约50％的肿瘤具有3个靶标的覆盖率。

表5：PD-L1表达分析

一个额外的问题是可以允许最大化样本中的TAA覆盖的进一步限制参数的可用性。为此目的，分析所有样品的PD-L1表达。PD-L1数据或突变数据(如果可从临床常规获得)用于分析所得子集的TAA表达。

实施例5：在人源化MHC小鼠模型中由BNT116诱导的体内抗原特异性T细胞扩增

用BNT116在人源化MHC小鼠模型中证实RNA-LPX在体内从头诱导肿瘤抗原特异性T细胞。BNT116包括六个RNA-LPX，其中每一个RNA-LPX中的RNA都是单链的，含5’帽的非核苷修饰的含尿苷的mRNA。RNA包括RBL003.3(SEQ ID NO:12，编码MAGEA3)、RBL005.3(SEQ IDNO:4，编码CLDN6)、RBL007.2(SEQ ID NO:8，编码KK-LC-1)、RBL012.2(SEQ ID NO:20，编码PRAME)、RBL027.2(SEQ ID NO:16，编码MAGE-A4)和RBL035.2(SEQ ID NO:24，编码MAGE-CL)。

HLA-A*0201和-DRB1*01转基因并缺乏内源I类和II类MHC的A2/DR1小鼠用作研究T细胞对最常见的人HLA等位基因(即HLA-A2.1和HLA-DR1)的免疫原性的模型。

在第1天、第8天和第15天，A2/DR1小鼠经IV接种三次编码MAGE-A3、CLDN6、KK-LC-1、PRAME、MAGE-A4或MAGE-C1(分别为RBL003.3、RBL005.3、RBL007.2、RBL012.2、RBL027.2或RBL035.2[RBL003.3：研究级材料；所有其它RNA：临床试验材料])的RNA-LPX。在第20天，用覆盖每种BNT116抗原的整个长度的肽混合物，或用P2P16P17肽(涵盖辅助表位P2P16)，对脾细胞进行体外再刺激。在酶联免疫吸附斑点(ELISpot)测定中测定IFN-γ的产生。对照用无关的人巨细胞病毒(hCMV)pp65_495-504肽再次刺激。通过仔细观察活动、身体状况和身体异常来监测小鼠的一般健康和健康状况。在实验的第1天、第8天、第15天和第20天对所有小鼠取个体体重。

没有与测试物相关的死亡，并且对体重没有不利影响。用KK-LC-1RNA-LPX处理的一只小鼠在不良的身体状况下被发现并且必须在第7天被处死。这被认为与测试物无关，而与笼内同伴的攻击性咬伤相关，这导致了多处炎症性伤口。尸检未发现任何问题。

针对所有六个BNT116抗原的疫苗接种导致抗原特异性T细胞免疫。由MAGE-A3、PRAME和CLDN6 RNA-LPX诱导并用同源肽混合物再刺激的T细胞产生的IFN-γ斑点数在统计学上显著高于当用无关对照肽再刺激时由来自相同小鼠的T细胞产生的IFN-γ斑点数。与对照相比，对KK-LC-1、MAGE-A4和MAGE-C1 RNA-LPX应答分泌IFN-γ的T细胞的数目明显增加，但没有达到统计学意义。

与来自用对照肽再刺激的相同小鼠的脾细胞相比，由用P2P16P17肽混合物免疫BNT116的小鼠的脾细胞再刺激诱导的IFN-γ分泌明显更高，表明针对这些辅助表位的抗原特异性CD4⁺ T细胞应答被诱导(图10)。

在体内细胞毒性测定中进一步证实了用RNA-LPX接种诱导的T细胞功能，其中以已知的HLA-A*0201特异性MAGE A3肽作为靶标的标记脾细胞被诱导的抗原特异性CD8+ T细胞有效地裂解。

这些结果表明，用临床级BNT116接种可有效地从头诱导针对BNT116编码抗原的抗原特异性和细胞毒性T细胞。

实施例6：临床试验评估BNT116单独和在患有晚期非小细胞肺癌的患者中的组合的安全性、耐受性和初步功效

进行BNT116的首次人体(FIH)研究，旨在建立BNT116单一疗法以及BNT116与西米普利单抗组合或与多西他赛组合在患有晚期或转移的非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的安全性评估和安全剂量。该试验包括用于在单一疗法中以及在组合中的剂量确认的数个群组。

配置和干预措施如下:

结果测量如下：

主要结果测量：

1.在周期1期间发生剂量限制毒性(DLT)[时间范围：在第一周期(21天)期间评估]。

2.根据国家癌症研究所-不良事件通用术语标准(NCI-CTCAE)v5.0，请求的治疗出现不良事件(TEAE)的发生，按关联性、严重性和等级报告[时间范围：多至27个月]。

次级结果测量：

1.总体反应率(ORR)定义为根据实体瘤反应评估标准(RECIST)v1.1的最佳总体反应(BOR)中完全反应(CR)或部分反应(PR)的患者数量除以有效性分析集中的患者数量[时间范围：多至27个月]。

2.反应持续时间(DoR)定义为从初始反应至根据RECIST v1.1的第一客观肿瘤进展的时间[时间范围：多至27个月]。

3.疾病控制率(DCR)定义为根据RECIST v1.1的BOR中CR、PR或稳定病情(SD)的患者数量除以有效性分析集中的患者数量[时间范围：多至27个月]。

4.疾病控制的持续时间定义为从稳定疾病或应答的最初检测到根据RECIST v1.1的第一客观肿瘤进展的时间[时间范围：多至27个月]。

5.无进展生存期(PFS)定义为从第一试验治疗到根据RECIST v1.1的第一客观肿瘤进展或任何原因死亡的时间，以先到者为准[时间范围：多至48个月]。

6.总生存期(OS)定义为第一试验治疗直到因任何原因死亡的时间[时间范围：多至48个月]。

标准如下：

关键入选标准：

·患者必须具有组织学证实的不可切除的III期或转移性IV期NSCLC和RECISTv1.1可测量的疾病。注意：群组1中的患者不必患有可测量的疾病。

·群组2和群组4中的患者必须能够耐受额外的抗PD-1治疗(即，由于毒性而不永久地中断抗程序性死亡蛋白1(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)治疗)，并且必须从任何先前的PD-1/PD-L1相关毒性中恢复到1期或0期，正在进行稳定的激素替代治疗。

·群组2和群组3中的患者必须具有东部肿瘤协作组体能状态(ECOG-PS)≤1。ECOG-PS为0至2的群组1和群组4中的患者是合格的。

群组特异性包括标准：

群组1:

·患者的既往治疗必须包括至少PD-1/PD-L1抑制剂和基于铂的化疗方案以及一种其它系列的系统治疗(除非患者不是基于铂的化疗和/或PD-1/PD-L1抑制剂和/或另一系列的系统治疗的候选者)。

群组2:

·患者必须在肿瘤细胞中存在50％的肿瘤比例评分(TPS)的PD-L1表达(如在纳入本试验前局部测定的)。

·患者必须表现出以下情况之一的进行性疾病，

1.在NSCLC的晚期或转移阶段：当进行PD-1/PD-L1抑制剂治疗时，或在该治疗终止的6个月内作为第一线治疗。或

2.对至少连续3个月单一疗法的辅助治疗(即，在最初的组合治疗后)的PD-1/PD-L1抑制剂是难治的，并在加入本试验前仍在接受此疗法。

群组3:

·患者的既往治疗必须包括至少PD-1/PD-L1抑制剂和基于铂的化疗方案(除了患者不是基于铂的化疗和/或PD-1/PD-L1抑制剂的候选者)。

群组4：

·如果在肿瘤细胞中存在PD-L1表达：TPS≥1％，则不是作为NSCLC晚期或转移阶段的一线治疗的化疗候选者的患者可以被加入。

关键排除标准：

·正在接受针对NSCLC的活跃的系统性治疗。

·存在可用于批准的靶治疗的驱动突变。

·正在进行的或最近的证据(在最近5年内)表明需要用系统免疫抑制治疗来治疗的显著自身免疫疾病，这可能暗示了免疫相关不良事件的风险。注意：可以包括患有自身免疫性疾病相关的甲状腺机能亢进、自身免疫性疾病相关的甲状腺机能减退的患者，其处于缓解状态，或处于稳定剂量的甲状腺替代激素、白癜风或银屑病。

·筛查期间新的或正在生长的脑或脊柱转移的当前证据。排除患有软脑膜疾病的患者。如果具有已知的脑或脊锥转移瘤的患者是合格的：

·已对脑或脊椎骨转移进行了放射疗法或其它适当治疗，和

·没有可归因于当前脑损伤的神经症状，和

·在签署知情同意书之前的4周内(由至少相隔4周的两次扫描的稳定病变证实)，在计算机断层摄影(CT)或磁共振成像(MRI)上具有稳定的脑或脊锥疾病，和

·在第一剂量的试验治疗之前的14天内不需要用于治疗脑或脊柱转移的类固醇疗法。注意：允许脊椎骨转移(即椎骨转移)，除非预期即将发生的骨折或脊髓压迫。

·系统免疫抑制：

·目前使用慢性系统性类固醇药物(允许泼尼松龙当量5mg/天)；使用生理替代剂量的强的松治疗肾上腺或垂体功能不全的患者是合格的。

·在试验登记前的最后3个月内其它临床相关的系统免疫抑制。

·已知的具有CD4+ T细胞(CD4+)计数<350细胞/μL的人类免疫缺陷病毒(HIV)的血清阳性病史和具有限定机会性感染的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病史。

·既往脾切除术。

实施例7：通过单次注射施用BNT116在人HLA转基因A2/DR1小鼠中从头诱导抗原特异性T细胞。

为了临床开发的目的，与顺序注射或输注相比，在一次注射或输注内施用所有六种BNT116产品将是有利的。减少注射或输注的次数将减少患者的身体和心理负担，并减少应用所需的时间。在实施例5中，我们证明在人HLA转基因小鼠(每个小鼠接受由编码一种特异性BNT116抗原的RNA组成的疫苗)中分别施用每个BNT116 RNA-LPX疫苗促进了对编码的BNT116抗原特异性的T细胞的从头诱导。为了测试在一次注射中所有BNT116产物的组合是否仍然能够诱导针对所有六种抗原的可测量的免疫，根据两种方法之一制备用于注射的两种BNT116混合物：首先将RNA配制为RNA-LPX，然后混合(方法1)，或者首先将RNA混合，然后配制为RNA-LPX(方法2)。

在第1天、第8天和第15天，用所有六种根据方法1或方法2制备的BNT11G RNA(PRAME[RBL012.2]、CLDN6[RBL005.3]、KK-LC-1[RBL007.2]、MAGE-3[RBL003.3]、MAGE-A4[RBL027.2]和MAGE-C1[RBL035.2])的混合物对C57BL/6A2/DR1小鼠(每组n＝6)进行三次IV接种。在第20天，使用ELISpot通过IFN-γ产生分析疫苗接种后的脾细胞对BNT116肽混合物或P2P16P17肽混合物(涵盖辅助表位P2P16)的离体再刺激的抗原特异性T细胞的诱导。用无关的人巨细胞病毒(hCMV)pp65495-504肽再次刺激对照孔。

通过仔细观察活动、身体状况和身体异常来监测小鼠的一般健康和健康状况。在实验的第1天、第8天、第13天、第15天和第20天，对所有小鼠取个体体重。没有与测试物相关的死亡。在接受根据方法2的BNT116混合物的组中的一只小鼠在第8天表现出体重降低(治疗开始时初始体重的84％)，但是在随后的两天内迅速恢复。

用两种BNT116混合物中的任一种接种导致针对所有六个抗原的抗原特异性T细胞免疫(图11的A)。类似于实施例5中所述的结果，针对PRAME、CLDN6和MAGE-A4的应答比针对MAGE-A3、MAGE-C1和KK-LC-1的应答更显性。尽管BNT116混合物制备的两种不同方法之间的总体免疫应答非常相似，但是当用根据方法1产生的BNT116混合物诱导时，靶向单个抗原的免疫应答更强(图11的B)。由于施用剂量(尽管在两组之间略有不同)可以被认为是完全相同的，根据方法1制备的BNT116混合物在该小鼠模型中诱导BNT116特异性T细胞的效力可以略有优越。

这些结果表明，在一次注射中用所有BNT116产物的组合进行疫苗接种非常适于从头诱导抗原特异性T细胞，所述T细胞在识别BNT116编码的抗原时产生IFN-γ。

Claims

1.组合物或药物制剂，其包括：

(a)至少一种RNA，其中所述至少一种RNA编码以下氨基酸序列：

(i)氨基酸序列，其包括claudin 6(CLDN6)、其免疫原性变体，或者CLDN6或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(ii)氨基酸序列，其包括Kita-kyushu肺癌抗原1(KK-LC-1)、其免疫原性变体，或者KK-LC-1或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(iii)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)、其免疫原性变体，或者MAGE-A3或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(iv)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)、其免疫原性变体，或者MAGE-A4或其免疫原性变体的免疫原性片段；

(v)氨基酸序列，其包括黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、其免疫原性变体，或者PRAME或其免疫原性变体的免疫原性片段；和

(vi)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)、其免疫原性变体，或者MAGE-C1或其免疫原性变体的免疫原性片段；和

2.根据权利要求1所述的组合物或药物制剂，其包括：

(i)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括claudin 6(CLDN6)、其免疫原性变体，或者所述CLDN6或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；

(ii)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括Kita-kyushu肺癌抗原1(KK-1LC-1)、其免疫原性变体，或者所述KK-LC-1或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；

(iii)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)、其免疫原性变体，或者所述MAGE-A3或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；

(iv)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)、其免疫原性变体，或者所述MAGE-A4或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；

(v)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、其免疫原性变体，或者所述PRAME或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；和

(vi)编码氨基酸序列的RNA，所述氨基酸序列包括黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)、其免疫原性变体，或者所述MAGE-C1或所述其免疫原性变体的免疫原性片段。

3.根据权利要求1或2所述的组合物或药物制剂，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的所述氨基酸序列的每一个由单独的RNA编码。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物或药物制剂，其中

(i)编码(i)下的所述氨基酸序列的所述RNA，其包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(i)下的所述氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物或药物制剂，其中

(i)编码(ii)下的所述氨基酸序列的所述RNA，其包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(ii)下的所述氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物或药物制剂，其中

(i)编码(iii)下的所述氨基酸序列的所述RNA，其包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(iii)下的所述氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物或药物制剂，其中

(i)编码(iv)下的所述氨基酸序列的所述RNA，其包括SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(iv)下的所述氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物或药物制剂，其中

(i)编码(v)下的所述氨基酸序列的所述RNA，其包括SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(v)下的所述氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物或药物制剂，其中

(i)编码(vi)下的所述氨基酸序列的所述RNA，其包括SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)(vi)下的所述氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物或药物制剂，其包括：

(i)RNA，其包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列；

(ii)RNA，其包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列；

(iii)RNA，其包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列；

(iv)RNA，其包括SEQ ID NO:16的核苷酸序列；

(v)RNA，其包括SEQ ID NO:20的核苷酸序列；和

(vi)RNA，其包括SEQ ID NO:24的核苷酸序列。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物或药物制剂，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的至少一个氨基酸序列包括破坏免疫耐受性的氨基酸序列和/或至少一种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA共同施用。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物或药物制剂，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的每个氨基酸序列包括破坏免疫耐受性的氨基酸序列和/或每种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA共同施用。

13.根据权利要求11或12所述的组合物或药物制剂，其中破坏免疫耐受性的所述氨基酸序列包括辅助表位，优选破伤风类毒素来源的辅助表位。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的组合物或药物制剂，其中

(i)编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的所述RNA，其包括SEQ ID NO:34的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:34的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)破坏免疫耐受性的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:33的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物或药物制剂，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的至少一个氨基酸序列由与野生型编码序列相比密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物或药物制剂，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的每个所述氨基酸序列由与野生型编码序列相比密码子优化和/或其G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选不改变编码的氨基序列的序列。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物或药物制剂，其中至少一种RNA包括5’帽m₂ ^7,2’-OGpp_sp(5’)G。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物或药物制剂，其中每种RNA包括5’帽m₂ ⁷ ^,2’-OGpp_sp(5’)G。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物或药物制剂，其中至少一种RNA包括5’UTR，所述5’UTR包括SEQ ID NO:35的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物或药物制剂，其中每种RNA包括5’UTR，所述5’UTR包括SEQ ID NO:35的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物或药物制剂，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的至少一个氨基酸序列包括增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物或药物制剂，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的每个氨基酸序列包括增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列。

23.根据权利要求21或22所述的组合物或药物制剂，其中增强抗原加工和/或抗原呈递的所述氨基酸序列包括对应于MHC分子、优选MHCI类分子的跨膜结构域和细胞质结构域的氨基酸序列。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的组合物或药物制剂，其中

(i)编码增强抗原加工和/或抗原呈递的所述氨基酸序列的所述RNA，其包括SEQ IDNO:32的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:32的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)增强抗原加工和/或抗原呈递的所述氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物或药物制剂，其中至少一种RNA包括3’UTR，所述3’UTR包括SEQ ID NO:36的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的组合物或药物制剂，其中每种RNA包括3’UTR，所述3’UTR包括SEQ ID NO:36的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物或药物制剂，其中至少一种RNA包括poly-A序列。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物或药物制剂，其中每种RNA包括poly-A序列。

29.根据权利要求27或28所述的组合物或药物制剂，其中所述poly-A序列包括至少100个核苷酸。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述poly-A序列包括SEQ ID NO:37的核苷酸序列或由SEQ ID NO:37的核苷酸序列组成。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA被配制为液体、被配制为固体，或其组合。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA被配制用于注射。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA被配制用于静脉内施用。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA被配制或将被配制为脂质体复合物颗粒。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA脂质体复合物颗粒是通过将所述RNA与脂质体混合可获得的。

36.根据权利要求34或35所述的组合物或药物制剂，其中编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的氨基酸序列的至少一种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制或将被共同配制为脂质体复合物颗粒。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的组合物或药物制剂，其中编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的氨基酸序列的每种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制或将被共同配制为脂质体复合物颗粒。

38.根据权利要求1至37中任一项所述的组合物或药物制剂，其包括一种或多种化疗剂。

39.根据权利要求1至38中任一项所述的组合物或药物制剂，其包括紫杉烷例如多西他赛和/或紫杉醇、叶酸抗代谢物例如培美曲塞、铂化合物例如顺铂和/或卡铂，或以上的组合。

40.根据权利要求1至39中任一项所述的组合物或药物制剂，其包括多西他赛、多西他赛和雷莫芦单抗、多西他赛和尼达尼布、紫杉醇、紫杉醇和铂化合物例如顺铂和/或卡铂、培美曲塞、培美曲塞和铂化合物例如顺铂和/或卡铂、顺铂或卡铂。

41.根据权利要求1至40中任一项所述的组合物或药物制剂，其包括一种或多种免疫检查点抑制剂，例如抗PD-1抗体。

42.根据权利要求1至41中任一项所述的组合物或药物制剂，其包括顺铂和免疫检查点抑制剂、卡铂和免疫检查点抑制剂、紫杉醇和顺铂和/或卡铂的组合(例如紫杉醇和顺铂的组合、紫杉醇和卡铂的组合，或紫杉醇、顺铂和卡铂的组合)和免疫检查点抑制剂，或培美曲塞和顺铂和/或卡铂的组合(例如，培美曲塞和顺铂的组合、培美曲塞和卡铂的组合，或培美曲塞、顺铂和卡铂的组合)和免疫检查点抑制剂。

43.根据权利要求1至42中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述免疫检查点抑制剂包括西米普利单抗。

44.根据权利要求1至43中任一项所述的组合物或药物制剂，其是药物组合物。

45.根据权利要求44所述的组合物或药物制剂，其中所述药物组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

46.根据权利要求1至43中任一项所述的组合物或药物制剂，其中所述药物制剂是试剂盒。

47.根据权利要求46所述的组合物或药物制剂，其中所述RNA和所述进一步的治疗剂在单独的小瓶中。

48.根据权利要求46或47所述的组合物或药物制剂，其进一步包括使用所述组合物或药物制剂治疗或预防肺癌的说明书。

49.根据权利要求1至48中任一项所述的组合物或药物制剂，其用于药物用途。

50.根据权利要求49所述的组合物或药物制剂，其中所述药物用途包括对疾病或病症的治疗性或预防性治疗。

51.根据权利要求50所述的组合物或药物制剂，其中对疾病或病症的治疗性或预防性治疗包括治疗或预防肺癌。

52.根据权利要求1至51中任一项的组合物或药物制剂，其用于对人施用。

53.治疗受试者中肺癌的方法，其包括施用：

(a)至少一种针对所述受试者的RNA，其中所述至少一种RNA编码以下氨基酸序列：

(i)氨基酸序列，其包括claudin 6(CLDN6)、其免疫原性变体，或者所述CLDN6或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；

(ii)氨基酸序列，其包括Kita-kyushu肺癌抗原1(KK-LC-1)、其免疫原性变体，或者所述KK-LC-1或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；

(iii)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)、其免疫原性变体，或者所述MAGE-A3或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；

(iv)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原4(MAGE-A4)、其免疫原性变体，或者所述MAGE-A4或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；和

(v)氨基酸序列，其包括黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)，其免疫原性变体，或者所述PRAME或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；和

(vi)氨基酸序列，其包括黑色素瘤抗原C1(MAGE-C1)，其免疫原性变体，或者所述MAGE-C1或所述其免疫原性变体的免疫原性片段；和

54.根据权利要求53所述的方法，其包括施用：

55.根据权利要求53或54所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的每个所述氨基酸序列由单独的RNA编码。

56.根据权利要求53至55中任一项所述的方法，其中

57.根据权利要求53至56中任一项所述的方法，其中

58.根据权利要求53至57中任一项所述的方法，其中

59.根据权利要求53至58中任一项所述的方法，其中

60.根据权利要求53至59中任一项所述的方法，其中

61.根据权利要求53至60中任一项所述的方法，其中

62.根据权利要求53至61中任一项所述的方法，其包括施用：

(i)RNA，其包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列；

(ii)RNA，其包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列；

(iii)RNA，其包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列；

(iv)RNA，其包括SEQ ID NO:16的核苷酸序列；

(v)RNA，其包括SEQ ID NO:20的核苷酸序列；和

(vi)RNA，其包括SEQ ID NO:24的核苷酸序列。

63.根据权利要求53至62中任一项所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的至少一个氨基酸序列包括破坏免疫耐受性的氨基酸序列和/或至少一种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA共同施用。

64.根据权利要求53至63中任一项所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的每个氨基酸序列包括破坏免疫耐受性的氨基酸序列和/或每种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA共同施用。

65.根据权利要求63或64所述的方法，其中破坏免疫耐受性的所述氨基酸序列包括辅助表位，优选破伤风类毒素来源的辅助表位。

66.根据权利要求63至65中任一项所述的方法，其中

(i)编码破坏免疫耐受性的所述氨基酸序列的所述RNA，其包括SEQ ID NO:34的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:34的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或

(ii)破坏免疫耐受性的所述氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或与SEQID NO:33的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。

67.根据权利要求53至66中任一项所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的至少一个氨基酸序列由与野生型编码序列相比密码子优化和/或其G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。

68.根据权利要求53至67中任一项所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的每个氨基酸序列由与野生型编码序列相比密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中所述密码子优化和/或所述G/C含量增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。

69.根据权利要求53至68中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包括5’帽m₂ ^7,2’-OGpp_sp(5’)G。

70.根据权利要求53至69中任一项所述的方法，其中每种RNA包括5’帽m₂ ^7,2’-OGpp_sp(5’)G。

71.根据权利要求53至70中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包括5’UTR，所述5’UTR包括SEQ ID NO:35的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

72.根据权利要求53至71中任一项所述的方法，其中每种RNA包括5’UTR，所述5’UTR包括SEQ ID NO:35的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

73.根据权利要求53至72中任一项所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的至少一个氨基酸序列包括增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列。

74.根据权利要求53至73中任一项所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的每个氨基酸序列包括增强抗原加工和/或抗原呈递的氨基酸序列。

75.根据权利要求73或74所述的方法，其中增强抗原加工和/或抗原呈递的所述氨基酸序列包括对应于MHC分子、优选MHC I类分子的跨膜结构域和细胞质结构域的氨基酸序列。

76.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中

77.根据权利要求53至76中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包括3’UTR，所述3’UTR包括SEQ ID NO:36的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

78.根据权利要求53至77中任一项所述的方法，其中每种RNA包括3’UTR，所述3’UTR包括SEQ ID NO:36的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。

79.根据权利要求53至78中任一项所述的方法，其中至少一种RNA包括poly-A序列。

80.根据权利要求53至79中任一项所述的方法，其中每种RNA包括poly-A序列。

81.根据权利要求79或80所述的方法，其中所述poly-A序列包括至少100个核苷酸。

82.根据权利要求79至81中任一项所述的方法，其中所述poly-A序列包括SEQ ID NO:37的核苷酸序列或由SEQ ID NO:37的核苷酸序列组成。

83.根据权利要求53至82中任一项所述的方法，其中所述RNA通过注射施用。

84.根据权利要求53至83中任一项所述的方法，其中所述RNA通过静脉内施用来施用。

85.根据权利要求53至84中任一项所述的方法，其中所述RNA被配制为脂质体复合物颗粒。

86.根据权利要求53至85中任一项所述的方法，其中所述RNA脂质体复合物颗粒是通过将所述RNA与脂质体混合可获得的。

87.根据权利要求85或86所述的方法，其中编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的氨基酸序列的至少一种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制为脂质体复合物颗粒。

88.根据权利要求85至87中任一项所述的方法，其中编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)下的氨基酸序列的每种RNA与编码破坏免疫耐受性的氨基酸序列的RNA被共同配制为脂质体复合物颗粒。

89.根据权利要求53至88中任一项所述的方法，其包括施用一种或多种化疗剂。

90.根据权利要求53至89中任一项所述的方法，其包括施用紫杉烷例如多西他赛和/或紫杉醇、叶酸抗代谢物例如培美曲塞、铂化合物例如顺铂和/或卡铂，或以上的组合。

91.根据权利要求53至90中任一项所述的方法，其包括施用多西他赛、多西他赛和雷莫芦单抗、多西他赛和尼达尼布、紫杉醇、紫杉醇和铂化合物例如顺铂和/或卡铂、培美曲塞、培美曲塞和铂化合物例如顺铂和/或卡铂、顺铂或卡铂。

92.根据权利要求53至91中任一项所述的方法，其包括施用一种或多种免疫检查点抑制剂，例如抗PD-1抗体。

93.根据权利要求53至92中任一项所述的方法，其包括施用顺铂和免疫检查点抑制剂、卡铂和免疫检查点抑制剂、紫杉醇和顺铂和/或卡铂的组合(例如，紫杉醇和顺铂的组合、紫杉醇和卡铂的组合，或紫杉醇、顺铂和卡铂的组合)和免疫检查点抑制剂，或培美曲塞和顺铂和/或卡铂的组合(例如，培美曲塞和顺铂的组合、培美曲塞和卡铂的组合，或培美曲塞、顺铂和卡铂的组合)和免疫检查点抑制剂。

94.根据权利要求53至93中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括西米普利单抗。

95.根据权利要求53至94中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。