CN118401838A - 测定粪便中弹性蛋白酶1的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能够简便地且在短时间内分析存在于人类粪便试样中的弹性蛋白酶1(E1)的弹性蛋白酶1的免疫分析用试剂及免疫分析方法，其能够应对大量的检测样本且无需特殊的设施或器材，能够应对紧急检查，并且能够在自低浓度区域至高浓度区域的广泛范围内进行定量分析，该分析方法包括：(a)向采自被检测者的粪便试样中添加α1‑抗胰蛋白酶(α1AT)的工序；(b)对所述粪便试样进行培养，并使E1与α1AT反应从而形成复合物的工序；(c)对含有载体的溶液与所述粪便试样共同进行培养的工序，该载体上固定了识别所述EI‑α1AT复合物的免疫伴侣；及(d)对因E1‑α1AT复合物与免疫伴侣的反应产生的变化进行分析的工序。

Description

测定粪便中弹性蛋白酶1的方法
技术领域
本发明涉及一种粪便中弹性蛋白酶1的免疫分析用试剂及免疫分析方法以及胰腺疾病的检测方法。
背景技术
即便是各种检查方法较发达的现在，胰腺的疾病仍是一种难以诊断的疾病。其原因在于，胰腺位于腹腔内的最深处，因此仅通过触诊、视诊、听诊等传统诊断方法及X射线检查等，是难以掌握疾病的存在或疾病的性质的，且胰腺疾病的临床症状与其他消化器官类疾病类似，并且没有简便且确实的检查方法等(专利文献1)。特别是，胰腺癌的五年生存率极短，对于预后的改善而言，早期发现是不可或缺的。
作为用于胰腺疾病的诊断的生物标志物，对作为胰酶的弹性蛋白酶1(CELA1；Chymotrypsin-likeelastasefamily，member1(胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶家族成员1)，以下，有时仅称为E1)进行了测定。E1属于丝氨酸蛋白酶家族，在免疫学上区别于存在于白血球、血小板及脾脏等中的弹性蛋白酶。E1与其他消化酶一并自胰腺分泌至十二指肠，但会因胰管狭窄或胰腺炎而漏出至血液中。其在血液中几乎全部与α1-抗胰蛋白酶(以下，有时仅称为α1AT)进行结合，血中浓度的测定在临床上是有用的。特别是，由于其可反映出胰腺癌(特别是胰头部)所导致的胰腺炎，且自较早期高频率地显示出异常的高值，因此对胰腺疾病的诊断指标或观望观察(wait and see observation)是有用的(专利文献2)。然而，由于其为具有侵袭性的检查，并未得以积极实施，关于血中E1的报告并不多。
E1分泌与胰腺的脂肪酶、淀粉酶及胰蛋白酶分泌之间存在线性相关，并且，E1向十二指肠内的分泌与粪便中的E1浓度相关(专利文献3)。认为胰腺外分泌功能障碍与E1的分泌下降相关，作为该分泌下降的结果，粪便中的酶浓度会下降，因此，报告了一种将E1作为用于诊断胰腺外分泌功能障碍、监控真性糖尿病、囊性纤维化及慢性胰腺炎的胰腺外分泌功能的标志物的应用。
在将人类粪便试样中的E1用于诊断用途时，虽然有报告指出其浓度比胰液中的要高5~6倍，但对于其详细的实际状态及与胰腺疾病的关联，现今并不充分了解血中浓度与粪便中浓度中的哪一种是最佳的。
作为未能准确测定粪便试样中的E1而未掌握其实际状态的原因，可列举出夹杂物的影响、粪便试样的处理。粪便试样通常含有水分、食物残渣、肠粘膜细胞、肠内细菌等，其具有以下特有的性质：未被体内吸收而排泄出的成分或固体的夹杂物较多，以及会因排出状态而使得成分、形状、pH等为多样性。因此，对测定结果造成的影响及原因也是多种多样，在使用粪便试样的检查中，对于非特异性反应的抑制等处理，需要不同于常规血液检测样本的劳动力。对于粪便试样的处理，关于人类粪便中的弹性蛋白酶1的测定，例如公开了Kampanis等人的干式提取法，但实际的处理较繁杂，在实施大量的检测样本的检查时，并不适合实际应用(非专利文献1)。此外，在使用湿式提取法时，潮湿的粪便试样或稀松的粪便试样需要在干燥后进行秤量，并在最后使用提取溶液进行稀释等，非常耗费劳力，且还会产生卫生方面的问题。并且，对于提取方法之间的标准浓度的适用，也是难以统一，且难以准确地进行测定也作为原因之一。
在将粪便用作临床检查的试样时，必须考虑大便潜血所带来的影响。大便潜血是指粪便中含有血液，有时会受到肠内出血或肛裂、经血等带来的影响，而无法准确地进行测定。通常，在大便潜血检查中，阳性率为5~10%左右，但除了粪便中的共存物质可能会产生的影响以外，根据被检测者的不同，还需要对大便潜血所产生的血液中的物质所带来的影响进行研究。
基于上述状况，期望开发出一种能够准确地测定人类粪便试样中的E1的方法及试剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭63-73152号公报
专利文献2：WO2002/079782号公报
专利文献3：日本特开2017-516088号公报
非专利文献
非专利文献1：Ann.Clin.Biochem46; 33-7,2009
发明内容
（一）要解决的技术问题
本发明的技术问题在于提供一种能够简便地且在短时间内分析存在于人类粪便试样中的E1的E1的免疫分析用试剂及免疫分析方法，其能够应对大量的检测样本且无需特殊的设施或器材，能够应对紧急检查，并且能够在自低浓度区域至高浓度区域的广泛范围内对存在于人类粪便试样中的E1进行定量分析。
（二）技术方案
为了解决所述技术问题，本发明的发明人进行了深入研究。结果发现，在使用α1AT并使其与E1形成了复合物的状态下，能够准确测定人类粪便试样中的E1，从而完成了本发明。
本发明涉及一种免疫分析方法，其在使人类粪便试样中的E1与作为其抑制剂的α1AT形成复合物从而使其稳定的状态下，利用抗原抗体反应进行分析，该抗原抗体反应中使用了对E1-α1AT复合物具有特异性的单克隆抗体。进一步，本发明涉及一种通过所述免疫分析方法对E1进行分析的胰腺疾病的检测方法。
即，本发明提供以下发明：
[1]一种存在于粪便试样中的胰弹性蛋白酶1的测定方法，其包括以下工序：
(a)向采自被检测者的粪便试样中添加α1-抗胰蛋白酶的工序；
(b)对所述粪便试样进行培养，使胰弹性蛋白酶1与α1-抗胰蛋白酶进行反应从而形成复合物的工序；
(c)将含有载体的溶液与所述粪便试样共同进行培养的工序，其中，所述载体上固定了识别所述胰弹性蛋白酶1-α1-抗胰蛋白酶复合物的免疫伴侣；及
(d)对因胰弹性蛋白酶1-α1-抗胰蛋白酶复合物与免疫伴侣的反应产生的变化进行分析的工序。
[2] 根据[1]所述的方法，其中，在提取粪便试样的预处理工序中实施所述工序(a)。
[3] 根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述工序(a)中包括：在向粪便试样中添加α1-抗胰蛋白酶之前，对粪便试样进行稀释的工序。
[4] 根据[1]~[3]中任一项所述的方法，其中，在所述工序(a)中，向粪便试样中添加的α1-抗胰蛋白酶为20μg以上。
[5] 根据[1]~[4]中任一项所述的方法，其中，在所述工序(b)中，提供至反应工序的反应液中所含有的α1-抗胰蛋白酶量为100ng以上。
[6] 一种辅助检测胰腺疾病的方法，其中，通过[1]~[5]中任一项所述的测定方法对胰弹性蛋白酶1进行分析。
[7] 根据[1]~[6]中任一项所述的方法，其中，所述工序(d)中实施的分析为化学发光免疫测定法、电化学发光免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法、免疫色谱法、蛋白质印迹法、乳胶凝集法、免疫比浊法中的任意一种。
[8] 一种免疫学测定用试剂，其含有固相载体和α1-抗胰蛋白酶，所述固相载体担载有识别胰弹性蛋白酶1-α1-抗胰蛋白酶复合物的免疫伴侣。
[9] 根据[8]所述的免疫学测定用试剂，其中，提供至反应工序的反应液中所含有的α1-抗胰蛋白酶为100ng。
[10] 一种含有α1-抗胰蛋白酶的预处理用提取液，其用于粪便试样的预处理工序，所述粪便试样为待提供至胰弹性蛋白酶1或胰弹性蛋白酶1-α1-抗胰蛋白酶测定用试剂的粪便试样。
[11] 根据[10]所述的预处理用提取液，其含有41~975ng的所述α1-抗胰蛋白酶。
（三）有益效果
本发明的方法通过对存在于人类粪便试样中的E1进行测定，能够简便地对胰腺疾病的检测进行辅助。通过准确地对人类粪便试样中的E1进行测定，能够用作用以监控胰腺外分泌功能的标志物，可期待确定治疗方针等的有用性。
附图说明
图1为表示相对于α1AT溶液添加浓度的E1浓度测定结果的图。
图2为表示相对于E1样本的制备理论值的、各α1AT溶液浓度的回收率的图。
图3为使用多种测定试剂，对添加了α1AT时的测定值进行比较的图。
具体实施方式
本发明涉及一种在使存在于人类粪便试样中的E1与α1AT形成复合物的状态下进行测定的免疫分析方法。此外，本发明涉及一种对存在于人类粪便试样中的E1-α1AT复合物进行测定的免疫学分析试剂。
以下，对测定存在于人类粪便试样中的E1的方法的实施方案进行详细说明，但利用方法的形态不受其限定。例如，本发明中包括以下方法：
对存在于粪便试样中的胰弹性蛋白酶1进行测定的胰腺疾病的检测方法；
对存在于粪便试样中的胰弹性蛋白酶1进行测定的辅助检测胰腺疾病的方法；
对存在于粪便试样中的胰弹性蛋白酶1进行测定，以检测胰腺疾病的方法；
对存在于粪便试样中的胰弹性蛋白酶1进行测定的胰腺疾病的体外(invitro)检测方法；
识别胰弹性蛋白酶1-α1-抗胰蛋白酶复合物的免疫伴侣在制造胰腺疾病的检测用试剂盒中的应用；
对存在于粪便试样中的胰弹性蛋白酶1进行测定，以对胰腺疾病的检测提供所需信息的方法。
另外，对于本说明书中的“测定”(广义)，除了定量或半定量地确定分析对象物的量的“测定”(狭义)以外，还包括判定是否存在分析对象物的“检测”的意义。
作为本发明的测定中所使用的试样，能够使用来自人类的粪便试样、肠灌液等。只要是来自粪便的试样，则粪便试样的具体形态没有特别限制。不论例如硬度(硬便、普通便、软便、下痢便、水样便等)等形状或水分的含量等如何，均可进行使用。肠灌液是指经过肠管内腔所回收的试样，经口摄取的肠灌剂还包括经由肠管内腔所回收的经口肠灌液。对于肠灌液，可以回收由对象排泄出的清洗液，也可以回收滞留在对象的直肠中的即将排泄的清洗液。另外，在本说明书中，在用于测定的“试样”的含义下使用术语“粪便试样”时(例如，权利要求1)，不仅包括粪便试样，还包括肠灌液等。
粪便试样能够采用实施E1的提取操作或不溶性部分的去除作为预处理的常规方法进行使用。提取操作所使用的提取液能够使用生理盐水，也可以使用Good’s缓冲液或磷酸盐等缓冲剂、含有BSA(牛血清白蛋白)等蛋白质或表面活性剂的溶液，对于此时的缓冲液的浓度及pH、表面活性剂或BSA的浓度等提取液的各种条件，本领域技术人员能够适当设定并进行使用。
提取操作中，添加所述提取液，并使粪便试样充分进行分散，从而使E1溶出至提取液。此时，可以根据需要使用均质机或漩涡混合器。为了使E1进一步溶出，在将粪便试样分散在提取液中之后，可以静置30分钟~1小时左右。
对于不溶性部分的去除，能够采用离心分离或过滤器过滤。离心分离条件或过滤所使用的滤膜等只要能够用于预处理，则能够没有特别限制地进行使用。例如，作为构成过滤器的载体，例如，能够含有聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、玻璃纤维(GF)、聚醚砜(PES)、尼龙(NY)、聚四氟乙烯(PTFE)、再生纤维素(RC)、乙酸纤维素(CA)、甲基丙烯酸酯-丁二烯-苯乙烯(MBS)。此外，还可以是组合了多个这些构成要素而构成的混合型。
以上的操作能够使用常规的采便试剂盒实施。作为采便试剂盒的实例，可以使用用于大便潜血的采便试剂盒OC-Hemocatch(注册商标)S(Eiken Chemical Co., Ltd.制造)。此外，预处理后的粪便试样优选保存于阴凉处或冷冻下。更优选使用超低温冷冻柜(-85~-40℃)进行保存，在测定时，能够将冻结的粪便试样融化进行使用。
也可以在上述这些提取操作中所使用的提取液中添加后述的α1AT。
用于测定本发明的E1的方法没有特别限制，可使用能够测定E1的免疫伴侣。作为免疫学上进行蛋白质检测的方法，只要为例如酶免疫测定法(ELISA法)、化学发光免疫测定法、电化学发光免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法、免疫色谱法等使用了标记抗体的免疫测定法、或蛋白质印迹法、乳胶凝集法、免疫比浊法等其本身公知的通常所使用的方法，则能够使用任何方法。
本发明中所使用的术语“免疫伴侣”是指，与测定对象物质进行免疫学特异性结合的伴侣，例如是指，能够与各种蛋白质、多糖类、脂质、核酸、半抗原及它们的复合物或片段等进行特异性结合的免疫学物质(即，抗原或抗体)。免疫伴侣为抗体时，所使用的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，还可以是用酶等进行了处理的片段。抗体的片段优选为包含抗体的抗原结合区域或其可变区的功能性片段，例如可列举出F(ab’)2、Fab’、Fab等。F(ab’)2、Fab’是指通过蛋白分解酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)对免疫球蛋白进行处理而制备的片段，其为存在于铰链区中的2条H链间的二硫键的前后被消化而生成的抗体片段。此外，免疫伴侣可以组合多种进行使用。
以下，作为实例，对将抗体用作免疫伴侣的情况进行记载。在本发明的方法中，由于将E1-α1AT的复合物作为测定对象物质实施测定，所使用的抗体只要为能够对E1-α1AT复合物进行识别的抗体即可，其可以为对E1进行特异性识别的抗E1抗体，也可以为对与E1-α1AT的复合物进行特异性识别的抗E1-α1AT复合物抗体。若抗E1抗体不为不识别E1-α1AT复合物的抗体，则能够适当选择进行使用。对于所使用的抗体的数量，可以仅为一种对E1进行特异性识别的抗体，也可以为对E1进行特异性识别的第一抗体、和与第一抗体不同的对E1进行识别的第二抗体的组合。此外，可以仅为一种对E1-α1AT复合物进行特异性识别的抗体，也可以为对E1-α1AT复合物进行特异性识别的第一抗体、和与第一抗体不同的对E1-α1AT复合物进行识别的第二抗体的组合。此外，还可以将这些抗体进行组合使用(以下，有时将这些抗体统称为“抗E1抗体”)。只要为特异性结合的部位不同的抗E1抗体，则没有特别限定。
抗E1抗体例如能够将含有E1或E1-α1AT复合物的氨基酸序列的一部分或全部的多肽作为免疫原而制成。抗原多肽可以为按照公知的方法进行化学合成的合成多肽，也可以为通过基因重组等所产生的多肽。
本发明中所使用的抗体能够用作担载于固相载体等不溶性载体上的固定化抗体、或用作用标记物质进行了标记的标记抗体。
固定化抗体是指，处于通过物理吸附或者化学结合等担载在不溶性载体上的状态的抗体。这些固定化抗体能够用于对试样中所含有的测定对象物质进行检测或定量。作为能够用于抗体的担载的不溶性载体，例如可列举出乳胶、橡胶、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚偏氟乙烯(PVDF)、有机硅等聚合物材料、琼脂糖、明胶、红血球、硅胶、玻璃、惰性氧化铝、磁性体等无机材料等。可以组合这些载体中的一种或两种以上。
在本发明的方法中，例如能够在乳胶颗粒上担载抗E1抗体进行实施。能够在该情况下使用的乳胶颗粒只要为能够在常规的免疫分析用试剂中使用的乳胶颗粒，则没有特别限定，例如能够列举出聚苯乙烯、或苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物等。乳胶颗粒的平均粒径能够根据测定对象物的检测浓度或测定仪器进行适当选择，例如能够使用具有0.05~0.5μm的粒径的颗粒。通过使用不同粒径的乳胶颗粒，能够准确地从低值至高值进行分析，因此特别优选。特别是在高值侧，即使为高浓度弹性蛋白酶1，仍能够防止凝集能下降所造成的误认(凝集能由于过高的浓度而下降，表观上凝集减少，导致测定结果少于实际值的所谓前带现象)，因此优选。另外，本发明中的乳胶颗粒的平均粒径是指通过电子显微镜测得的值。
在将抗E1抗体固定在乳胶颗粒上时，例如，可以含有粒径不同的两种乳胶颗粒，所述两种乳胶颗粒担载了对E1或E1-α1AT复合物具有不同特异性的两种抗E1抗体，优选至少含有(1)第一乳胶颗粒和(2)粒径与所述第一乳胶颗粒不同的第二乳胶颗粒，所述第一乳胶颗粒担载了针对E1或E1-α1AT复合物的第一抗E1抗体，所述第二乳胶颗粒担载了针对E1或E1-α1AT复合物的第二抗E1抗体，且所述第二抗E1抗体具有与所述第一抗E1抗体不同的特异性。
在为酶免疫测定法(ELISA法)、化学发光免疫测定法、电化学发光免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法、免疫色谱法等使用了标记抗体的免疫测定法时，优选使用标记物质。标记物质只要为能够在常规的免疫学测定法中使用的标记物质，则没有特别限定，例如可列举出酶、荧光物质、放射性同位素、不溶性粒状物质等。作为该用于标记的酶，可列举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、葡糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶等。作为荧光物质，可列举出异硫氰酸荧光素(FITC)、绿色荧光蛋白质(GFP)、虫荧光素(luciferin)等。作为放射性同位素，可列举出125I、14C、32P等。
此外，当标记物质为酶时，通过使用针对该酶的底物并进行发光、荧光或显色反应，能够对标记物质进行测定。例如，当酶为碱性磷酸酶时，作为底物，能够使用CDP-star(注册商标)(2-氯-5-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2’-(5’-氯)-三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)-1-苯基磷酸酯二钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5’-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠)、AMPPD(注册商标)(金刚烷基甲氧基苯基磷酰基二氧杂环丁烷)、APS-5等化学发光底物；4-甲基伞形酮磷酸酯(4-methylumbelliferyl phosphate)等荧光底物；对硝基苯基磷酸酯、BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐)、NBT(氯化硝基四氮唑蓝)、INT(碘硝基四唑紫)等显色底物。
本发明的免疫学的测定方法能够使用由一种液体或两种以上的液体构成的免疫学测定试剂进行实施。
当用于实施本发明的试剂由一种液体构成时，例如，能够由含有至少担载了用于形成免疫学复合物的免疫伴侣的不溶性载体的反应试剂构成。按照公知的方法，使试样与试剂进行反应，检测信号。
由于难以直接准确地测定存在于粪便试样中的E1，在本发明的测定中，以使E1与α1AT形成复合物的状态进行测定。
本发明中所使用的α1AT只要最终为与试样混和的形态即可，可以包含于预处理工序中所使用的预处理试剂中，也可以包含于稳定化试剂中，还可以包含于前述含有不溶性载体的试剂中。本发明发现，对于准确地测定存在于粪便试样中的E1而言，在试样中或试剂中添加一定浓度范围的α1AT是重要的。
本发明中所使用的α1AT可以在试样与试剂进行反应之前，添加在试样中，也可以以添加在试剂中的状态进行供给。包含在与作为测定对象物质的E1-α1AT复合物进行免疫反应的反应液中即可，例如，可以添加于以下试剂中的任意一种或以下的各个试剂中：预先稀释测定试样的稀释液；将结合在不溶性载体上的经过固相化的抗E1抗体与测定试样进行混合，使作为测定对象物质的E1-α1AT复合物与经过固相化的抗E1抗体进行反应的试剂；将标记抗体与测定样本进行混合反应，使标记抗体与作为测定对象物质的E1-α1AT复合物进行反应的试剂。
所使用的α1AT为与来自人类胰腺的弹性蛋白酶1形成复合物的α1AT即可，优选使用来自人类的α1AT。来自人类的α1AT可以为对存在于血液中的α1AT进行纯化而成的α1AT，也可以为使用培养细胞等使其进行重组表达而成的α1AT，本领域技术人员能够适当进行选用。
对于为了与E1形成复合物而添加的α1AT的量，优选添加能够与E1形成复合物的充分的量。所添加的量的下限值为20μg以上即可，该量的上限值可以根据试样中所含有的E1的量适当进行设定。例如，下限值优选为41μg以上，更优选为49μg以上。上限值优选为975μg以下。另外，所述下限值及上限值能够适当进行组合。
对于反应液中所含有的α1AT量的下限值，可以在存在能够与E1形成复合物的充分的量且相较于未添加α1AT时能够确认到反应性的浓度中适当进行设定，为100ng以上即可。例如，优选为514ng以上，更优选为609ng以上。此外，反应液中所含有的α1AT量的上限值优选为12188ng以下，更优选为6094ng以下，进一步优选为5143ng以下。本领域技术人员在考虑到设想包含于粪便试样中的E1浓度后，能够确定各测定试剂中的最适添加量。另外，所述下限值及上限值能够进行适当组合。
此外，可以根据测定所使用的试剂的可测定范围，根据E1与α1AT的重量比来确定添加量。此时，例如通过添加相对于E1重量为6~2400倍的重量的α1AT，能够充分地形成E1与α1AT的复合物，能够准确地实施粪便试样中的E1测定。
当本发明的试剂由两种以上的液体构成时，例如能够由稳定化试剂、与至少含有担载了用于形成免疫学复合物的抗体或者抗原的不溶性载体的反应试剂构成。稳定化试剂能够利用将试样稀释为适当浓度或进行预处理的试剂按照公知的方法进行制备。按照公知的方法，使试样与稳定化试剂进行反应，然后与反应试剂进行反应，检测信号。本发明中所使用的α1AT可以在试样与反应试剂进行反应之前，添加在稳定化试剂和/或反应试剂中，能够优选以添加在该稳定化试剂和/或该反应试剂中的状态进行供给。
已知存在于血液中的近90%的E1与α1AT形成了复合物，通过对E1-α1AT复合物进行测定来视作E1的测定，从而用于临床检查中。α1AT所属的丝酶抑制蛋白超家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂通过共价键与蛋白酶分子的活性中心的丝氨酸残基连接，伴随着环插入(loopinsertion)而被强力地拉拽至丝酶抑制蛋白分子上，由此破坏了活性中心附近的结构，变得不会引起水解造成的蛋白酶解离。由此认为E1与α1AT通过共价键连接而不易解离。考虑到E1与α1AT在粪便试样中也处于形成了复合物的状态，通过在粪便试样中添加α1AT变得能够测定E1，这是意料之外的效果。
作为辅助检测胰腺疾病的方法，可以适当使用由作为用于计算判定用阈值(截止值)的原始数据或统计处理数据等的表示粪便试样中的E1浓度与各种疾病的关联的统计数据等计算出的判定用阈值(截止值)，实施本发明的E1测定方法。本领域技术人员能够根据与胰腺疾病的相关性适当设定截止值进行使用。例如，作为用于计算上述截止值的方法，例如，能够根据E1浓度制成ROC曲线(ReceiverOperatingCharacteristicCurve(接受者操作特性曲线))并进行分析，在诊断的灵敏度与特异度有效的范围内设定截止值。
此外，还能够将测得的E1浓度用作用于风险评价的值。能够作为用于判定胰腺的炎症或胰腺癌等是否通过给药等治疗得到了改善的指标。例如，当E1浓度持续为高值或发生增加时，则暗示需要重新讨论治疗方针。
除了抗E1抗体担载乳胶颗粒以外，本发明的试剂还可以进一步含有能够添加在乳胶试剂中的各种添加剂，例如缓冲液、促凝剂(例如，聚乙二醇等水溶性高分子)、非特异性反应抑制剂(例如，碱金属盐或糖类等)或蛋白质[例如，牛血清白蛋白(BSA)]等。
作为所述缓冲液，优选在pH6~8.5时具有缓冲能力的缓冲液。pH6~8.5的缓冲液为以往公知的缓冲液，例如可列举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液或Good’s缓冲液等。
在本发明的试剂中，例如在使用Tris缓冲液时，Tris缓冲液中的Tris浓度只要为在使用该Tris缓冲液时在实施乳胶凝集反应的体系中能够达成以下说明的规定Tris浓度的浓度，则没有特别限定，优选为0.1~0.5mol/L。
实施乳胶凝集反应的体系中的Tris浓度只要为能够抑制乳胶颗粒的自凝反应的浓度，则没有特别限定，能够根据共存的盐、蛋白质和/或糖类等添加物的浓度进行适当选择。实施乳胶凝集反应的体系中的Tris浓度优选为0.1~0.5mol/L，更优选为0.2~0.3mol/L。若小于0.1mol/L，则乳胶颗粒有时会发生自凝反应，若大于0.5mol/L，则有时会抑制抗原抗体反应，导致检测灵敏度变差。另外，Tris浓度的所述下限值及上限值能够适当进行组合，例如0.1~0.3mol/L。
此外，缓冲液的pH优选为6~8.5。若pH在该范围外，则有时乳胶颗粒会发生自凝或在测定精度方面产生不良情况。
当本发明的试剂含有pH6~8.5的缓冲液时，在进行使用该试剂时的乳胶凝集反应时，只要担载了抗体的各个乳胶颗粒、pH6~8.5的缓冲液及待测试样能够进行接触，则试剂中的各抗E1抗体担载乳胶颗粒及pH6~8.5的缓冲液的状态没有特别限定。即，此时，本发明的试剂的形态没有特别限定，例如能够为含有各抗E1抗体担载乳胶颗粒与pH6~8.5的缓冲液这两者的单液系试剂，或者能够为由含有各抗E1抗体担载乳胶颗粒的第一试剂与作为pH6~8.5的缓冲液的第二试剂构成的双液系试剂。
在本发明的测定方法中，优选在pH6~8.5的条件下，使担载了抗体的各个乳胶颗粒与待测试样进行接触，从而进行抗原抗体反应及由此发生的乳胶凝集反应，并分析其凝集程度，由此能够对待测试样中的E1进行分析。
在本发明的测定方法中，在使用pH6~8.5的缓冲液在pH6~8.5的条件下实施乳胶凝集反应时，在使各抗E1抗体担载乳胶颗粒、pH6~8.5的缓冲液及待测试样进行接触时，只要不在不存在pH6~8.5的缓冲液下进行抗原抗体反应(即，不使各抗E1抗体担载乳胶颗粒与待测试样先接触)，则其接触顺序没有特别限定。例如，能够使各抗E1抗体担载乳胶颗粒与pH6~8.5的缓冲液预先接触，再使其混合物与待测试样接触，或者还能够使待测试样与pH6~8.5的缓冲液预先接触，再使其混合物与各抗E1抗体担载乳胶颗粒接触。
本发明的测定方法中的抗原抗体反应的条件能够与常规的免疫学乳胶比浊分析方法的实施条件相同。例如，关于反应的pH，优选在6~8.5下实施。反应温度优选为0~50℃，更优选为20~40℃。反应时间能够适当确定，例如，对于通用自动分析机，能够以10~15分钟结束测定。另外，反应温度的所述下限值及上限值能够适当进行组合，例如0~40℃。
通过抗原抗体反应发生的凝集的程度能够利用公知的分析方法、例如光学分析方法进行分析。作为所述光学分析方法，例如能够列举出对反应液照射光，对散射光或透射光进行分析的方法，更具体而言，能够使用测定散射光强度、吸光度或透射光强度的光学机器进行分析。优选的测定波长为300~800nm。在使用了所述光学机器的分析中，能够按照公知的方法，根据所使用的乳胶颗粒的大小和/或浓度的选择以及反应时间的设定，测定散射光强度、吸光度或透射光强度的增加或减少，从而进行实施。此外，还能够同时使用这些方法。
在基于本发明的胰腺疾病的检测方法中，通过将血清或血浆用作待测试样，并利用本发明的测定方法分析粪便试样中的E1，能够进行胰腺疾病(特别是急性胰腺炎)的检测(诊断)。
综上所述，使用本发明迅速且准确地测定存在于人类粪便试样中的E1，不仅能够辅助胰腺疾病的诊断，对于治疗过程中的监控，能够提供可靠性更高的测定值，能够提供极有用的信息。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但这些实施例不限定本发明的范围。
[实施例1：向粪便提取溶液中添加α1AT的实验]
将IATRO IRE1II(以下，称为IRE1，LSI Medience Corporation制造)用作粪便试样中的E1测定试剂，并向粪便提取溶液中添加α1抗胰蛋白酶，由此，确认是否可得到IATROIRE1II的测定值。
将来自人类血浆的α1AT的纯化物(Sigma-Aldrich Co. LLC制造)溶解在Tris缓冲液中，制备以基于α1AT的光吸收系数的换算计浓度为0、16、130、325、813、3250、6500μg/mL的α1AT溶液。向150μL的人类粪便的提取溶液(以下，称为粪便提取溶液)中加入150μL所制备的各浓度的α1AT溶液，制备α1AT添加粪便提取溶液，进一步将α1AT添加粪便提取溶液稀释至80倍，以使其在IRE1试剂的测定范围内。稀释时使用了市售的D-D二聚体稀释液(LSIMedience Corporation制造)。使用搭载于7180型日立自动分析装置(以下，称为H7180，Hitachi High-Tech Corporation.制造)中的IRE1试剂，以多重度2对稀释至80倍的α1AT添加粪便提取溶液进行测定。
图1中示出了相对于添加在粪便提取溶液中的α1AT溶液的浓度的IRE1试剂的测定结果。能够确认到通过向粪便提取溶液中添加α1AT，IRE1试剂的测定值增加，且在α1AT溶液的浓度为325~3250μg/mL时表现出最大值。在实验条件中为最大浓度的6500μg/mL的情况下，确认到了虽然相较于测定值为3250μg/mL的情况出现了7.5%的下降，但其对于用于E1测定而言是充分的回收率。此时，虽供于测定工序的试样中所添加的各α1AT量为49、122、488、975μg，但由于在稀释80倍后供于测定，实质上为609、1523、6094、12188ng。由此确认到，通过添加α1AT，可在粪便提取检测样本中得到IRE1试剂的测定值。
[实施例2：α1AT溶液浓度的研究]
对IRE1试剂的测定范围80~4000ng/dL中的、所添加的α1AT的最适浓度进行研究，确定在后续实验中使用的α1AT溶液浓度。
对由人类胰液纯化的弹性蛋白酶1使用磷酸缓冲液，制备以基于E1的光吸收系数的换算计浓度为14、57、142、285、571ng/mL的E1样本。同样地，对α1AT使用磷酸缓冲液，制备以基于α1AT的光吸收系数的换算计浓度为171、875、3429、8571、17143、34268ng/mL的α1AT溶液。向150μL的E1样本中加入150μL的α1AT溶液，制备E1-α1AT混合溶液。
在H7180上搭载IRE1试剂，以多重度3对E1-α1AT混合溶液进行测定。将571ng/mL的E1样本1与34268ng/mL的α1AT溶液1的混合溶液的测定值作为E1样本1的制备理论值(3778ng/dL)。各E1样本的制备理论值根据E1样本1的稀释倍率进行设定。
图2中示出了相对于各E1样本的制备理论值的各α1AT溶液浓度的回收率。对于制备理论值为378~3778ng/dL的E1样本1~4，α1AT浓度为3429~34286ng/mL的α1AT溶液1~4得到了90%以上的回收率。对于制备理论值为94ng/dL的E1样本5，α1AT浓度为3429~17143ng/mL的α1AT溶液2~4表现出最大的87.6%，34286ng/mL的α1AT溶液则为69.7%的回收率，作为E1测定，确认到了充分的回收率。在将成为IRE1试剂的测定范围80~4000ng/dL时的E1浓度作为对象时，α1AT浓度为3429~17143ng/mL时作为相对于制备理论值的回收率良好。具体而言，E1的回收率为70%以上时的α1AT的添加量分别为514、1286、2571、5143ng。因此，在后续实验中暂将α1AT溶液的浓度设为8600ng/mL进行使用，并使1290ng包含在供于测定的试样中。
[实施例3：IRE1试剂与fPELA试剂的比较实验]
使用IRE1试剂，对添加α1AT的评价体系与现有的粪便中弹性蛋白酶1LTX试剂的反应性进行比较。
作为现有粪便中E1测定试剂，使用fPELA turbo(以下，称为fPELA，BUHLMANNGROUP制造)。
使用由人类胰液纯化的E1、磷酸缓冲液，制备以基于E1的光吸收系数的换算计浓度为14、57、142、285、571ng/mL的E1样本。同样地，对α1AT使用磷酸缓冲液，制备以基于α1AT的光吸收系数的换算计浓度为8600ng/mL的α1AT溶液。将制备的200μL的各E1溶液与200μL的α1AT溶液混合，制备E1-α1AT混合溶液。
使用搭载在自动分析装置cobas c501(以下，称为c501，Roche Diagnostics制造)中的fPELA试剂，以多重度2对各E1样本与E1-α1AT混合溶液、IRE1试剂的标准品、IRE1试剂的对照进行测定。
使用搭载在H7180上的IRE1试剂，以多重度2对E1-α1AT混合溶液进行测定。
图3中，将相对于IRE1的值的各E1样本与E1-α1AT混合溶液、IRE1试剂的标准品、IRE1试剂的对照的fPELA试剂的测定值进行了制图。IRE1试剂中的E1-α1AT混合溶液的测定值、与用fPELA试剂对E1样本进行测定时的值得到了良好的依赖于浓度的线形。对于fPELA试剂，对E1-α1AT混合溶液进行测定时，其测定值低于直接对E1溶液进行测定的情况。fPELA试剂的E1-α1AT混合溶液的测定值接近于IRE1试剂的标准品及对照的测定值。可知在IRE1试剂的标准品及对照中，E1作为与α1AT的复合物而含有，fPELA试剂受到α1AT的影响。当为粪便试样时，有时样本会出现大便潜血，可能会导致血液中的α1AT混入而对测定值造成影响，但若使用识别E1-α1AT复合物的试剂，则即便是出现大便潜血的检测样本，其测定值也不会受到影响。
识别E1-α1AT复合物的IRE1试剂的测定值与识别并测定E1的fPELA试剂的测定值相关，由此可确认到向粪便试样中添加α1AT测得的结果为具有可靠性的数据。
工业实用性
通过使用本发明的测定试剂及测定方法，能够测定粪便试样中的E1的浓度且不受测定妨碍物质的影响，能够用于辅助诊断胰腺疾病。
此外，由于能够准确地掌握健康人粪便试样中的E1浓度，不仅是胰腺疾病的诊断，还能够通过用于适当治疗方法的选择或治疗效果的监控、预后预测，提供可靠性高的测定值，能够对诊疗提供极有用的信息。

Claims (11)

1.一种存在于粪便试样中的胰弹性蛋白酶1的测定方法，其包括以下工序：
(a)向采自被检测者的粪便试样中添加α1-抗胰蛋白酶的工序；
(b)对所述粪便试样进行培养，使胰弹性蛋白酶1与α1-抗胰蛋白酶进行反应从而形成复合物的工序；
(c)将含有载体的溶液与所述粪便试样共同进行培养的工序，其中，所述载体上固定了识别所述胰弹性蛋白酶1-α1-抗胰蛋白酶复合物的免疫伴侣；及
(d)对因胰弹性蛋白酶1-α1-抗胰蛋白酶复合物与免疫伴侣的反应产生的变化进行分析的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在提取粪便试样的预处理工序中实施所述工序(a)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述工序(a)中包括：在向粪便试样中添加α1-抗胰蛋白酶之前，对粪便试样进行稀释的工序。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法，其中，在所述工序(a)中，向粪便试样中添加的α1-抗胰蛋白酶为20μg以上。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，在所述工序(b)中，提供至反应工序的反应液中所含有的α1-抗胰蛋白酶量为100ng以上。
6.一种辅助检测胰腺疾病的方法，其中，通过权利要求1~5中任一项所述的测定方法对胰弹性蛋白酶1进行分析。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的方法，其中，所述工序(d)中实施的分析为化学发光免疫测定法、电化学发光免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法、免疫色谱法、蛋白质印迹法、乳胶凝集法、免疫比浊法中的任意一种。
8.一种免疫学测定用试剂，其含有固相载体和α1-抗胰蛋白酶，所述固相载体担载有识别胰弹性蛋白酶1-α1-抗胰蛋白酶复合物的免疫伴侣。
9.根据权利要求8所述的免疫学测定用试剂，其中，提供至反应工序的反应液中所含有的α1-抗胰蛋白酶为100ng。
10.一种含有α1-抗胰蛋白酶的预处理用提取液，其用于粪便试样的预处理工序，所述粪便试样为待提供至胰弹性蛋白酶1或胰弹性蛋白酶1-α1-抗胰蛋白酶测定用试剂的粪便试样。
11.根据权利要求10所述的预处理用提取液，其含有41~975ng的所述α1-抗胰蛋白酶。
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