CN118389706A - 一种用于鳜鱼基因分型的标记组合及应用其的全基因组液相芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于鳜鱼基因分型的标记组合及应用其的全基因组液相芯片。该标记组合包括40963个SNP位点和492个Indel位点，40963个SNP位点信息如表1所示，492个Indel位点信息如表2所示。将本发明提供的由40963个SNP位点和492个Indel位点组成的用于鳜鱼基因分型的标记组合应用于鳜鱼全基因组液相芯片的开发中，利用开发得到的鳜鱼全基因组液相芯片对鳜鱼样本进行检测，能够精确识别鳜鱼个体间的遗传差异，更加精确地筛选出具有优良性状的个体，加速鳜鱼的育种进程，提高鳜鱼育种效率，有利于培育出更适应市场需求、更具有竞争力的鳜鱼新品种。
Description
技术领域
本发明涉及基因芯片技术领域，具体涉及一种用于鳜鱼基因分型的标记组合及应用其的全基因组液相芯片。
背景技术
DNA分子标记是重要的生物标志之一，其能够反映生物个体或者种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。分子标记是DNA水平遗传多态性的直接反映，具有不受季节、发育阶段等因素的影响、数量多、多态性高且检测技术简单、快速、易自动化等优点。DNA分子标记可以对目标性状进行精细定位，找到性状相关基因后进行性状的遗传解析，还可以对不同群体的遗传背景进行有效选择，以及对不同品种进行准确分析和鉴定，通过分子标记辅助选择或基因组选择能够加快育种进程，在现代分子育种中扮演着重要的角色。
分子标记的发展经历了三个阶段，也成为了三代DNA分子标记。第一代分子标记主要包括限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD）和扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP），这些标记由于非共显性、扩增不稳定、多态性不高，目前已基本不再被水产生物遗传分析所使用。第二代分子标记主要是微卫星标记（microsatellite marker），也称简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），仍存在难以标准化和分析准确性低等缺点。第三代标记主要是单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphism，SNP），是指由点突变引起的DNA序列多态性，在某一特定的单个核苷酸位点上发生碱基替换、产生不同的等位基因，具有分布性广，稳定性高、易于实现自动化等特点，是目前应用最广泛的分子遗传标记，也是用于开发高通量分子标记的理想基因分型目标。
SNP分型芯片技术是一种基于SNP标记的高通量基因分型技术平台，具有高通量、高效率、高准确性等优点。SNP芯片主要分为固相芯片和液相芯片。固相芯片又叫SNP微阵列，该技术是通过固定在芯片上的DNA标记序列与目标核酸分子发生碱基配对反应，从而达到精准鉴定基因信息的目的。
液相芯片技术，又称悬浮阵列、流式荧光技术，是一种通过聚苯乙烯微球制备得到的液相芯片系统，其主要基材是粒径均匀且直径为5.5～5.6 μm的圆形微球，该微球可以悬浮于液相中构成了一个液相芯片系统。微球上的不同探针分子可以与待测物特异性结合，利用这个系统可以对同一个样品中的多种不同分子同时进行检测。液相系统中的微球通常都具有独特的荧光编码或称为色彩编号，可以通过荧光染料或者其他的方法进行标记，其中荧光编码是一种常见的方法。通过在制造微球时将不同荧光染料混合在一起，使得微球具有不同的荧光信号和颜色，每种颜色的微球可以固定不同的探针分子完成对多种不同物质的同时鉴定和检测。在液相芯片技术中，测试样品和报告分子被添加到96孔板的培养基中与标记的微球反应，靶分子（如待检测的抗原或抗体、生物素标记的靶核酸片段和酶等）会与探针和微球上的报告分子特异性结合，使交联探针的微球携带报告分子生物素和荧光素。通过这种标记，在液相芯片技术中既能快速地对生物分子进行分析，还能进行多帧实时动态图像的记录。液相芯片技术具有操作简单、快速，数据质量高，灵活性强，准确性高，检测范围广等优点，对水产动物遗传背景分析、品种鉴定与纯度评估、分子标记辅助选择和基因组选择育种等均具有重要的应用意义。
鳜鱼（Siniperca chuatsi）又称桂鱼、桂花鱼，属于鲈形目、鳜亚科。当前鳜鱼的人工繁殖、苗种培育和池塘养殖成鱼技术极大促进了鳜鱼的规模化养殖，但仍面临一系列难题，例如饲料驯化困难，病害防控难度大，繁殖能力低，规模化育苗难度高。作为我国重要的淡水优质鱼类，鳜鱼的种质改良和优良品种培育对于养殖业的高质量发展具有重要意义。因此，开发一种针对鳜鱼的全基因组SNP液相芯片，对于提高鳜鱼育种效率具有迫切的现实需求。
发明内容
为了解决目前鳜鱼育种中存在的问题，提高鳜鱼育种效率，本发明提供一种用于鳜鱼基因分型的标记组合及应用其的全基因组液相芯片。
根据本发明的第一个方面，提供一种用于鳜鱼基因分型的标记组合，该标记组合包括40963个SNP位点和492个Indel位点，40963个SNP位点信息如表1所示，492个Indel位点信息如表2所示。
本发明通过对多个来自不同地域的鳜鱼样本进行全基因组重测序，根据全基因组重测序结果并结合发明人在先的研究成果，筛选得到如表1所示的40963个SNP位点和如表2所示的492个Indel位点，上述位点可作为标记组合用于鳜鱼基因分型，将本发明提供的用于鳜鱼基因分型的标记组合应用于鳜鱼全基因组液相芯片的开发中，利用开发得到的鳜鱼全基因组液相芯片对鳜鱼样本进行检测，能够精确识别鳜鱼个体间的遗传差异，更加精确地筛选出具有优良性状的个体，加速鳜鱼的育种进程，提高鳜鱼育种效率，有利于培育出更适应市场需求、更具有竞争力的鳜鱼新品种。
优选地，上述标记组合通过以下步骤筛选得到：
S1.获取不同地域的鳜鱼样本，进行全基因组重测序，根据全基因组重测序的结果获得若干个SNP位点；
S2.通过对获得的若干个SNP位点进行筛选，得到用于鳜鱼基因分型的标记组合。
优选地，在S2中，对若干个SNP位点进行筛选的原则如下：Maf≥0.05，LD R2<0.2，检出率≥90%，depth≥5，且各个SNP位点在鳜鱼的染色体上均匀分布。
根据本发明的第二个方面，提供上述用于鳜鱼基因分型的标记组合在鳜鱼全基因组液相芯片的制备中的应用。
根据本发明的第三个方面，提供一种鳜鱼全基因组液相芯片，该鳜鱼全基因组液相芯片包括探针组合，探针组合用于鉴定上述用于鳜鱼基因分型的标记组合中各SNP位点和Indel位点的基因型。
基于本发明提供的用于鳜鱼基因分型的标记组合，本发明开发得到一种鳜鱼全基因组液相芯片，该鳜鱼全基因组液相芯片，不仅可以实现低成本鳜鱼基因分型，且对鳜鱼具有专属性，还可以实现鳜鱼遗传多样性评估、种质资源和亲缘关系鉴定、分子设计育种、遗传图谱构建及基因定位、全基因组关联分析和性别鉴定，在鳜鱼育种的多个领域具有较高的应用价值。
优选地，上述探针组合中含有的各个探针的长度均为100 bp。
优选地，上述探针组合中含有的各个探针中的CG含量为20~80%。
优选地，上述探针组合包括42333条探针，针对各个Indel位点的探针数量为2～3条。
根据本发明的第四个方面，提供上述鳜鱼全基因组液相芯片在鳜鱼基因分型检测、全基因组关联分析、育种选择、种质资源鉴定、亲缘关系鉴定、遗传多样性评估、遗传图谱构建、基因定位中的应用。
本发明提供的鳜鱼全基因组液相芯片，可应用于鳜鱼种质资源和亲缘关系鉴定、遗传多样性评估、遗传图谱构建及基因定位、全基因组关联分析等，为鳜鱼分子设计育种提供了重要的工具，在鳜鱼育种的研究中发挥重要作用。
根据本发明的第五个方面，提供一种用于鳜鱼基因分型的检测方法，包括以下步骤：
S1.获取待测鳜鱼样本的基因组DNA；
S2.利用上述鳜鱼全基因组液相芯片对基因组DNA进行检测，获得原始数据；
S3.对原始数据进行数据分析，得到鳜鱼的基因分型结果。
优选地，S2的具体操作步骤如下：利用基因组DNA构建基因组文库，将基因组文库与上述鳜鱼全基因组液相芯片于50~60℃下杂交孵育16~24小时，捕获杂交产物并进行测序，获得的测序数据即为原始数据。
附图说明
图1为实施例2提供的鳜鱼40K全基因组液相芯片中各位点分布信息统计图。
图2为实施例3提供的cGPS液相芯片检测流程示意图。
图3为实施例4利用鳜鱼40K全基因组液相芯片对110分鳜鱼组织样本位点检出率结果图。
图4为实施例4利用鳜鱼40K全基因组液相芯片对8份鳜鱼重复样本的基因型检测结果对比图。
图5为实施例5利用鳜鱼40K全基因组液相芯片对150份已知来源的鳜鱼样本进行基因型鉴定后的聚类分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 用于鳜鱼基因分型的标记组合的筛选
本实施例旨在对来自不同地域的鳜鱼样本进行全基因组重测序，根据全基因组重测序结果，同时结合发明人的在先研究，筛选出可用于鳜鱼基因分型的标记组合，具体操作步骤如下：
1.获取全基因组重测序数据来源的SNP候选位点集
（1）为了获得丰富多样的鳜鱼全基因组位点，收集了湖南、池州、宇顺、同乐等不同地域的鳜鱼样本150份，对这150份鳜鱼样本进行进行全基因组重测序，采用MGI的DNBSEQ-T7高通量测序平台对鳜鱼全基因组文库进行上机测序。
（2）SNP calling按照流程依次使用fastp（v0.20.0）过滤，Burrows-WheelerAligner（0.7.12-r1039）比对到鳜鱼参考组(GCF_020085105.1），利用picard1.107软件（http://www.psc.edu/index.php/user-resources/softwar e/picard）对sam文件进行排序并转换为bam文件，以及去除PCR duplicates，采用GATK软件来进行SNP的检测和过滤，根据全基因组重测组数据情况，所采用的过滤标准如下：QD<2.0||FS>60.0||MQ<35.0||MQRankSum<-12.5||Read PosRankSum<-8.0||DP>6950，经过滤后，获得包含所有鳜鱼样本SNP变异信息的.vcf文件，共计1210933个SNP位点，即为本实施例的SNP候选位点集。
2.位点筛选
基于Maf≥0.05、LD R2（连锁不平衡指数）<0.2、检出率≥90%、depth≥5和SNP位点在鳜鱼的染色体上均匀分布的原则对包含1210933个SNP位点的SNP候选位点集进行筛选到40447个SNP位点和492个Indel位点（NC_058042.1、NC_058043.1、NC_058044.1、NC_058045.1、NC_058046.1、NC_058047.1、NC_058048.1、NC_058049.1、NC_058050.1、NC_058051.1、NC_058052.1、NC_058053.1、NC_058054.1、NC_058055.1、NC_058056.1、NC_058057.1、NC_058058.1、NC_058059.1、NC_058060.1、NC_058061.1、NC_058062.1、NC_058063.1、NC_058064.1、NC_058065.1），同时整合发明人前期的研究成果——性别鉴定标记（基于雄鱼参考基因组，sinchu.chr14，共516个SNP位点，参考基因组链接为：http://genomes.igb-berlin.de/cgi-bin/hgGateway?hgsid=22094），将这些位点和标记用于后续的鳜鱼全基因组液相芯片中的探针设计，其中，本实施例筛选得到的40447个SNP位点和在先研究成果得到的516个SNP位点（共40963个SNP位点）在鳜鱼的基因组中的位置信息如表1所示，492个Indel位点在鳜鱼的基因组中的位置信息如表2所示，将筛选得到的40963个SNP位点和492个Indel位点作为本发明提供的用于鳜鱼基因分型的标记组合。另外，为了更加清晰地展现SNP位点，对表1中的SNP位点信息进行了统计，结果如表3所示。
表1 SNP位点信息
表2 Indel位点信息
表3 SNP位点信息统计
实施例2 鳜鱼40K全基因组液相芯片
本实施例旨将实施例1筛选得到的40963个SNP位点和492个Indel位点（用于鳜鱼基因分型的标记组合）应用于探针设计，探针的设计原理如下：针对所有的目标位点在其左右100bp范围内设计探针，探针长度一般为100 bp，GC含量在20~80%之间。
基于上述探针的设计原理，通过华智生物技术有限公司合成液相捕获探针，共合成得到42333条捕获探针（针对长片段的Indel位点设计的探针会叠加，根据Indel的长度不同，Indel位点的探针数量为2~3条，针对SNP位点设计的探针一般不叠加，且临近的位点会共用一条探针），采用基于目标区域基因组序列液相捕获的精准定位测序分型技术（cGPS）形成鳜鱼液相芯片的体系，其中，cGPS基于优化的热力学稳定性算法模型，对不同目标区域的基因组序列进行探针设计，利用合成的特异性探针对位于不同基因组位置的多个不同目标序列进行液相杂交捕获富集，然后对捕获富集的目标基因组序列进行测序文库构建和高通量测序，从而获得目标区域内的所有SNP/Indel位点的基因型。根据探针设计结果，去除在基因组上无法唯一比对、侧翼序列中包含重复序列的探针，将设计得到的探针应用于液相新芯片的制备中，最终获得鳜鱼40K全基因组液相芯片，该芯片中各位点分布信息统计如图1所示。
实施例3 鳜鱼40K全基因组液相芯片在鳜鱼DNA样本的检测中的应用
本实施例旨在利用实施例2获得的鳜鱼40K全基因组液相芯片对鳜鱼DNA样本进行检测，具体操作步骤如下：
1.鳜鱼基因组DNA（gDNA）的提取和检测
选择102份鳜鱼作为SNP液相芯片开发体系的验证样本，采集102份鳜鱼的新鲜组织，利用磁珠法从组织中提取gDNA，并通过1%琼脂糖凝胶电泳方法分析gDNA的完整性和纯度，使用Qubit对gDNA的浓度进行准确定量。
2.cGPS实验流程
参照如图2所示的cGPS液相芯片检测流程，利用实施例2获得的鳜鱼40K全基因组液相芯片对上述鳜鱼gDNA进行检测：
（1）取定量质检合格的gDNA 200ng，利用酶切试剂将gDNA酶切成长度为100~500bp的片段后，加入Taq酶进行末端修复；
（2）使用T4连接酶，将接头片段连接至DNA两端，使用片段分选磁珠对连接产物进行纯化和文库扩增，完成文库构建；
（3）将质检合格的文库与封阻试剂、RNA酶抑制剂（Rnase Block）、含有多个探针的鳜鱼40K全基因组液相芯片置于PCR仪上于55℃下进行杂交孵育反应过夜16~24小时；
（4）利用链霉亲和素将杂交产物进行捕获，将捕获后的文库进行扩增富集，采用华大测序平台进行PE150测序；
（5）高通量测序后的原始数据经过质控过滤等处理，使用fastp软件去除含有接头污染的Reads和低质量的Reads，并应用BWA软件与目标基因组进行比对，再利用GATK软件对测序结果进行变异位点分析，获得目的位点的基因型分型结果。
实施例4 鳜鱼40K全基因组液相芯片的基因分型效果评估
本实施例旨在验证鳜鱼40K全基因组液相芯片的基因分型效果，具体操作如下：利用实施例2获得的鳜鱼40K全基因组液相芯片对102份鳜鱼组织样本（包括重复样本8份，共110分鳜鱼组织样本）进行基因分型检测（具体操作方法参照实施例3）；经测序与数据分析，110份样本位点检出率结果如表4和图3所示，同时，对8份重复样本的基因型结果进行比对，结果如表5和图4所示。
表4 鳜鱼样本位点检出率结果
表5 重复样本的基因型比对结果
由表4和图3可知，110份样本位点检出率在95.85~99.50%之间，平均检出率为99.22%；由表5和图4可知，将8个重复样本基因型结果进行比对，发现这8个重复样本基因型一致率在99.31~99.60%之间，平均一致率为99.51%。上述结果说明，实施例2获得的鳜鱼40K全基因组液相芯片在对鳜鱼样本进行基因分型时的检测稳定性好，目标位点检出率高，分型结果准确可靠。
实施例5 鳜鱼40K全基因组液相芯片在鳜鱼群体分析中的应用
本实施例旨在利用实施例2获得的鳜鱼40K全基因组液相芯片对150份已知来源的鳜鱼样本进行基因型鉴定（具体操作方法参见实施例3），利用Plink软件中的IBS方法计算遗传距离矩阵并进行聚类分析和进化树构建，结果如图5所示。
由图5可知，实施例2获得的鳜鱼40K全基因组液相芯片能够有效地对不同地域来源的鳜鱼进行区分。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于鳜鱼基因分型的标记组合，其特征在于：所述标记组合包括40963个SNP位点和492个Indel位点，所述40963个SNP位点信息如表1所示，所述492个Indel位点信息如表2所示。
2.如权利要求1所述用于鳜鱼基因分型的标记组合在鳜鱼全基因组液相芯片的制备中的应用。
3.一种鳜鱼全基因组液相芯片，其特征在于：所述鳜鱼全基因组液相芯片包括探针组合，所述探针组合用于鉴定如权利要求1所述用于鳜鱼基因分型的标记组合中各SNP位点和Indel位点的基因型。
4.如权利要求3所述鳜鱼全基因组液相芯片，其特征在于：所述探针组合中含有的各个探针的长度均为100 bp。
5.如权利要求3所述鳜鱼全基因组液相芯片，其特征在于：所述探针组合中含有的各个所述探针中的CG含量为20~80%。
6.如权利要求3所述鳜鱼全基因组液相芯片，其特征在于：所述探针组合包括42333条探针，针对各个所述Indel位点的探针数量为2~3条。
7.如权利要求3~6任意一项所述鳜鱼全基因组液相芯片在鳜鱼基因分型检测、全基因组关联分析、育种选择、种质资源鉴定、亲缘关系鉴定、遗传多样性评估、遗传图谱构建、基因定位中的应用。
8.一种用于鳜鱼基因分型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.获取待测鳜鱼样本的基因组DNA；
S2.利用如权利要求3~6任意一项所述鳜鱼全基因组液相芯片对所述基因组DNA进行检测，获得原始数据；
S3.对所述原始数据进行数据分析，得到所述鳜鱼的基因分型结果。
9.如权利要求8所述用于鳜鱼基因分型的检测方法，其特征在于，所述S2的具体操作步骤如下：利用所述基因组DNA构建基因组文库，将所述基因组文库与所述鳜鱼全基因组液相芯片于50~60℃下杂交孵育16~24小时，捕获杂交产物并进行测序，获得的测序数据即为原始数据。
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