CN118383349A - 蛋白nt5c1b在猪精子体外冷冻保存中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供蛋白NT5C1B在猪精子体外冷冻保存中的应用。通过向精液冷冻保存液中添加抗冻蛋白NT5C1B来提高猪精液冷冻保存品质。本发明提供的精液稀释液能够显著提高精液冷冻保存活力和质量，延长精子体外保存时间；同时，解冻后精子活力与对照组相比能提高11％左右。本发明操作简便，效果显著，对猪不产生任何有害影响。可以在猪精液保存及相关的体外胚胎生产、胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于猪冷冻精液技术领域，具体地说，涉及蛋白NT5C1B在猪精子体外冷冻保存中的应用。
背景技术
精液冷冻保存是人工授精技术的一项重大革新。它解决了精液长期保存的问题，使精液不受时间、地域和种畜生命的限制，极大限度的发挥和提高优良种公猪的利用率，加速品种的育成和改良步伐。近年来，猪人工授精在家畜养殖上得到愈来愈普遍的应用，尤其是对于规模化、集约化、专业化养殖，使得优秀畜种得到大范围的推广。
公猪精液的保存一般还是采用常温保存的方式，低温保存时对猪精子所产生的冷冻应激会导致精子的活力和活率都会降低，这样就会造成在商品化生产中受孕母猪的受胎率和产仔数受到显著影响。在过去的50年中冷冻精液技术迅猛发展，不同动物的精液冷冻都获得了较快的进展，牛的冷冻精液已经进入了产业化。猪的精子与其它家畜相比具有一定生理特性，往往需去除大部分精浆的精液稀释后进行冷冻。可见，筛选出高效、无毒的、优良冷冻保护剂以减少精子冷冻过程中的冷冻应激，提高猪精子的抗冻性是目前急需解决的问题。
目前，冷冻保护剂主要分为渗透性冷冻保护剂(如甘油、乙二醇等)和非渗透性冷冻保护剂(如单糖、卵黄、白蛋白等)。一般认为卵黄由于富含卵磷脂，能提高细胞外渗透压，稳定精子细胞膜，防止顶体外膜破裂作用。相关研究表明抗冻蛋白对生活在冰冷海水中的过冷鱼类的生存至关重要，可以抑制冰晶的生长，并且可以保护一些动植物免受低温冻伤。但在精液保存中的应用还不多见。
抗冻蛋白是一类特殊的蛋白质，根据其来源和性质的不同，可以将其分为:生物源抗冻蛋白、合成抗冻蛋白、糖蛋白类抗冻蛋白、多肽类抗冻蛋白。生物源抗冻蛋白主要来源于极地生物。这些生物之所以在极端低温环境下能够存活和繁殖，是因为抗冻蛋白起到了非常重要的保护作用。合成抗冻蛋白是通过基因工程技术合成的，具有较高的抗冻能力。目前已有许多研究对该类抗冻蛋白进行了合成和应用研究。糖蛋白类抗冻蛋白和多肽类抗冻蛋白，都能够在极低的温度下保护细胞膜的完整性，从而有效地保护细胞免受冻害。
而且精液冷冻保存不仅涉及到保存液，还涉及到冷冻的具体步骤、解冻的具体步骤，这些都会直接影响到最终的受精效果。为了提高猪冷冻精液解冻后活力以及存活时间，提升猪冷冻精液品质，亟待开发新的抗冻蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供蛋白NT5C1B在猪精子体外冷冻保存中的应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供蛋白NT5C1B的以下任一应用：
1)用于猪精子或精液体外冷冻保存；
2)用于提高猪精子或精液冷冻保存品质；
3)用于制备猪精液冷冻保存液。
本发明中，蛋白NT5C1B在NCBI中的参考序列编号为XP_005655317.1。
蛋白NT5C1B在猪的高产仔精子中含量丰富，而在猪的低产仔精子中含量较低并且其与雄性生育能力相关，包含线粒体代谢中的三羧酸循环和氧化磷酸化相关。
进一步地，所述应用包括：将蛋白NT5C1B添加至冷冻保存液中，用于精子冷冻；
所述冷冻保存液中蛋白NT5C1B的含量为0.05-1μg/mL。
优选地，所述精子或精液来自猪。
第二方面，本发明提供一种猪精液冷冻保存液，配方如下：葡萄糖2-5g、EDTA0.05-0.3g、柠檬酸钠0.5-1g、碳酸氢钠0.05-0.3g、氯化钾0.05-0.2g、100IU/mL的青链霉素混合液10mL、乳糖2-5g、海藻糖2-5g、卵黄(鸡蛋蛋黄液)20mL、甘油6mL和蛋白NT5C1B 5-100μg，用超纯水定容至100mL。
优选地，配方如下：葡萄糖3.7g、EDTA0.125g、柠檬酸钠0.6g、碳酸氢钠0.125g、氯化钾0.075g、100IU/mL的青链霉素混合液10mL、乳糖4.25g、海藻糖4.25g、卵黄20mL、甘油6mL和蛋白NT5C1B 5-100μg，用超纯水定容至100mL。
第三方面，本发明提供一种精液冷冻方法，包括以下步骤：
(1)按照如下方法分别配制基础液、Ⅰ液和Ⅱ液；
所述基础液以100mL计，含有如下成分：葡萄糖2-5g、EDTA0.05-0.3g、柠檬酸钠0.5-1g、碳酸氢钠0.05-0.3g、氯化钾0.05-0.2g和青链霉素10000IU；
所述Ⅰ液使用所述基础液配制，以100mL计，含有如下成分：乳糖2-5g、海藻糖2-5g、卵黄20mL和蛋白NT5C1B 5-100μg；
所述Ⅱ液使用I液配制，具体为：向6mL甘油中加入所述Ⅰ液，并定容至100mL；
(2)将精液与预热至37℃的基础液按照体积比1:1混合，在室温静置1-2h，得到稀释精液；
(3)将稀释精液与Ⅰ液同时放入17℃恒温箱中平衡0.5-1h；然后将平衡后的稀释精液置于离心管中，17℃800g离心12-20min，弃上清，用平衡后的Ⅰ液对精子进行重悬，得到精子悬液5.0×108个/mL，并从17℃缓慢降至4℃，从17℃降至4℃所需时间为1.5-2h；
(4)将(3)的精子悬液与Ⅱ液一并在4℃平衡0.5-1h；平衡结束后，将精子悬液与II液等体积混合，然后投入液氮中进行冷冻。
优选地，步骤(1)按照如下方法分别配制基础液、Ⅰ液和Ⅱ液；
所述基础液以100mL计，含有如下成分：葡萄糖3.7g、EDTA 0.125g、柠檬酸钠0.6g、碳酸氢钠0.125g和氯化钾0.075g；
所述Ⅰ液使用所述基础液配制，以100mL计，含有如下成分：乳糖4.25g、海藻糖4.25g、卵黄20mL和蛋白NT5C1B 100μg。
进一步地，所述方法还包括解冻的步骤，具体为：取出冷冻精液，于水浴锅中进行解冻，解冻条件为：37℃30s。
本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
本发明提供一种猪精子抗冻蛋白的筛选方法及其应用，所筛选的抗冻蛋白为NT5C1B。
进一步地，所述应用为制备能提高猪精子低温耐受力，提升猪冷冻精液解冻后的活率，使用简便的猪精液冷冻稀释液。
本发明还提供一种猪精液冷冻保存液，包含猪精子抗冻蛋白NT5C1B、基础液、抑菌物质(青链霉素)；
所述基础液以100mL计，优选含有如下成分：葡萄糖3.7g，EDTA0.125g，柠檬酸钠0.6g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g和抑菌物质；超纯水50mL；
所述抑菌物质为100IU/mL的青链霉素混合液10mL。
进一步地，上述原料用超纯水溶解定容至100mL。
进一步地，本发明的冷冻保存稀释液包含基础液、I液和II液；
优选地，所述冷冻保存稀释液为；葡萄糖3.7g，EDTA0.125g，柠檬酸钠0.6g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，100IU/mL的青链霉素混合液10mL，乳糖4.25g，海藻糖4.25g，卵黄20mL，甘油6mL，蛋白NT5C1B 5-100μg，用超纯水定容至100mL。
Ⅰ液：称取乳糖4.25g，海藻糖4.25g；加入50mL基础液，充分溶解后加入容量瓶中，加入20mL卵黄，用基础液定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀，现配现用，然后加入蛋白NT5C1B 5-100μg。
Ⅱ液：向容量瓶中加入甘油6mL，充分混匀后加入Ⅰ液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀，现配现用。
所述抗冻蛋白NT5C1B筛选浓度为0、0.05μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL。
所述冷冻保存稀释液主要分为稀释液A、B、C、D。
Ⅰ液D：称取乳糖4.25g，海藻糖4.25g；加入50mL超纯水，充分溶解后加入容量瓶中，加入20ml卵黄，定容至100ml，并使用微型漩涡混合仪充分混匀，现配现用，然后加入NT5C1B100μg。
Ⅰ液C：称取乳糖4.25g，海藻糖4.25g；加入50mL超纯水，充分溶解后加入容量瓶中，加入20ml卵黄，定容至100ml，并使用微型漩涡混合仪充分混匀，现配现用，然后加入NT5C1B50μg。
Ⅰ液B：称取乳糖4.25g，海藻糖4.25g；加入50mL超纯水，充分溶解后加入容量瓶中，加入20mL卵黄，定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀，现配现用，然后加入NT5C1B5μg。
Ⅰ液A(对照组)：称取乳糖4.25g，海藻糖4.25g；加入50mL超纯水，充分溶解后加入容量瓶中，加入20mL卵黄，定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀，现配现用，然后加入NT5C1B 0μg。
本发明还提供一种精液冷冻方法，按照上述精液稀释液配置的方法配置冷冻缓冲液Ⅰ液和Ⅱ液，将I液A、B、C、D缓缓加入到离心后的精子沉淀，用移液枪吸吐混匀。将用I液稀释好的精液放入17℃恒温箱平衡30min。17℃平衡结束后将精液置入4℃冰箱，从17℃缓缓降温到4℃，使用时间90min左右。等温等量加II液并混匀。精液装入细管(在4℃冰箱中操作)，将细管放在泡沫盒中的细管支架上(泡沫盒中已提前放入液氮，液面稳定后与细管的距离应为2cm左右)，开盖熏蒸4min，关盖熏蒸4min，最后投入液氮。
进一步地，所述方法还包括解冻步骤，具体为：水浴锅里水浴解冻，解冻温度37℃水浴锅30s。
进一步地，所述冷冻保存具体为：精液采集后迅速检测精子活力与密度，活率0.8以上，精子密度2×108个/mL以上方可使用，否则弃去。将稀释后的精液进行冷冻。解冻后先后取出检测各个指标。
本发明还提供所述添加了猪精子抗冻蛋白的精液稀释液在精液冷冻保存方面的应用，所述精液来自猪。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供一种可以提高猪精液冷冻保存品质的精液稀释液，通过添加抗冻蛋白NT5C1B来提高猪精液冷冻保存品质。本发明提供的精液稀释液能够显著提高精液冷冻保存活性，延长精子体外保存时间；同时，冷冻解冻后精子活力与对照组相比能提高11％左右。本发明操作简便，效果显著，对猪不产生任何有害影响。可以在猪精液保存及相关的胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中稀释液中添加不同浓度NT5C1B对解冻后猪精子活率及活力的影响。其中，*表示P<0.05。
图2为本发明较佳实施例中稀释液中添加不同浓度NT5C1B对解冻后猪精子DNA和质膜完整性的影响。其中，*表示P<0.05。
图3为本发明较佳实施例中稀释液中添加不同浓度NT5C1B对解冻后猪精子线粒体活性和顶体完整性的影响。其中，*表示P<0.05。
图4为本发明较佳实施例中稀释液中添加不同浓度ADA对解冻后猪精子活率及活力的影响。
具体实施方式
本发明旨在筛选猪精子抗冻蛋白并将其应用于精液冷冻稀释液。
本发明采用如下技术方案：
本发明通过蛋白质组学方法对影响猪精子的抗冻蛋白进行筛选。
所述猪精子抗冻蛋白筛选方法包括：在公猪站首选采集35头种公猪精液作为精液样本，接着对猪精液中的蛋白质进行提取，使用凝胶电泳和质谱分析和鉴定差异蛋白，进行数据过滤、鉴定以及功能注解，以从中筛选与确定与猪精子低温耐受力有关的差异蛋白。
所述差异蛋白：本发明共筛选出22个差异蛋白，其中包括12个上调蛋白和10个下调蛋白，根据下调蛋白功能选取两个与猪精子耐冻相关的蛋白进行试验验证。
本发明经研究发现，添加筛选的一种抗冻蛋白NT5C1B的精液稀释液可有效的提高精液的冷冻保存质量及冷冻保存并解冻后的精液品质，另一种蛋白ADA无明显效果。
本发明提供一种提高精液冷冻保存品质的方法，使用筛选的抗冻蛋白加入到精液稀释液中对精液进行低温保存或冷冻保存。
所述精液稀释液包括：基础液、Ⅰ液、Ⅱ液和抑菌物质；所述基础液以100mL计，含有如下成分：葡萄糖3.7g，EDTA0.125g，柠檬酸钠0.6g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，100IU/mL的青链霉素混合液10mL，以超纯水配制。
所述Ⅰ液使用所述基础液配制，以100mL计，含有如下成分：乳糖4.25g、海藻糖4.25g、卵黄20mL和蛋白NT5C1B 100μg。
所述Ⅱ液以100mL计，含有如下成分：甘油6ml，充分混匀后加入Ⅰ液并定容至100mL。
所述抑菌物质为：100IU/mL的青链霉素混合液10mL。
所述冷冻保存具体为：精液采集后，检测精液的活率、体积、密度后。将合格精液与预热好的基础液按照体积比1:1加入500mL的试剂瓶进行稀释，在室温静置1-2h，然后将精液与Ⅰ液同时放入17℃恒温箱中平衡0.5-1h。将平衡后的精液分装到50mL离心管中，17℃800g离心12-20min。如果上清液中精子多可适当延长时间，测定上清液的体积和密度，计算总精子数，如果超过10亿则需要将上清液再次离心。离心结束后弃掉上清液，用预热好的Ⅰ液对精子进行重悬，将I液缓缓加入到离心后的精子沉淀底部，用吸吐方式混匀。将重悬后的精液(精子悬液中精子含量约为5.0×108个/mL)从17℃缓慢降温到4℃(1.5-2h)，并将精液与Ⅱ液一起在4℃平衡0.5-1h。精液平衡结束后加入4℃的II液等量等温稀释，轻轻混匀后用自动灌装机进行灌装，封口，将封好的细管摆放在托架上，随后将托架放入程序冷冻仪器，对精液进行冷冻。精液冷冻完成后，将细管装入布袋做好标记保存在液氮罐中。
本发明还提供所述精液稀释液在提高精液低冷冻保存品质方面的应用。
本发明所提供的精液稀释液对猪精液的冷冻保存格外适宜，因此，所述精液优选来自猪。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1精子抗冻蛋白的筛选及精液稀释液(冷冻保存用)的制备
1、抗冻蛋白筛选方法：抗冻蛋白的筛选采用蛋白组学的方法。
第一步，采集35头种公猪精液，将中段精液作为蛋白质样本对蛋白质进行提取和预处理。
第二步，蛋白质分离，常采用凝胶电泳或液相色谱技术，用于降低样本复杂性寻找差异蛋白，本次筛选共筛选出22个差异蛋白。
第三步，所述差异蛋白进行质谱分析技术用于鉴定和定量差异蛋白，之后再对所筛选出的差异蛋白进行数据分析用于差异蛋白的鉴定和功能注释。
上述22个差异蛋白中，上调蛋白为12个，下调蛋白为10个，根据下调蛋白各自功能从中选取了两个与猪精子耐冻相关的蛋白NT51CB和ADA，它们在NCBI中的参考序列编号分别为XP_005655317.1和XP_020933637.1。
2、选取35头种公猪的冷冻精液进行解冻处理，在其中筛选到3头活力较低的种公猪冷冻精液。将筛选出的两个抗冻蛋白分别加入到3头种公猪的精液冷冻稀释液中，冷冻保存、解冻，观察精液活力及活率。
实施例2提高精液冷冻保存品质的方法
1、利用公猪自动采精系统进行精液收集，采集人员佩戴好手套后握持固定假阴道，刺激公猪至其阴茎勃起、射精，将第一段精液弃去，随后将精液收集杯固定并与假阴道连接。假阴道内可维持适宜的温度并提供刺激压力从而保证公猪持续射精。射精结束后，采精人员将精液收集袋的过滤袋部分撕掉弃去，将收集袋内的精液进行保温处理。对采集后的精液进行镜检，活力大于80％、密度达到2×108/mL以上的精液为合格精液，用于后续混池。
2、精液稀释与平衡：采精前将基础液置于37℃水浴锅内进行预热，将合格精液与预热好的基础液按照体积比1:1加入500mL的试剂瓶进行稀释，在室温静置1-2h，然后将精液与Ⅰ液同时放入17℃恒温箱中平衡0.5-1h。将平衡后的精液分装到50mL离心管中(离心前电子天平称量空离心管重量并编号)，17℃800g离心12-20min。如果上清液中精子多可适当延长时间，测定上清液的体积和密度，计算总精子数，如果超过10亿则需要将上清液再次离心。离心结束后弃掉上清液，用预热好的Ⅰ液对精子进行重悬，将I液缓缓加入到离心后的精子沉淀底部，用吸吐方式混匀。将重悬后的精液(精子悬液中精子含量约为5.0×108个/mL个/mL)从17℃缓慢降温到4℃(1.5-2h)，并将精液与Ⅱ液一起在4℃平衡0.5-1h。
3、精液冷冻：精液平衡结束后在低温操作柜中加入4℃的II液等量等温稀释，轻轻混匀后用自动灌装机进行灌装，封口，将封好的细管摆放在托架上，随后将托架放入程序冷冻仪器，对精液进行冷冻。精液冷冻完成后，将细管装入布袋做好标记保存在液氮罐中。
按照如下方法分别配制基础液、Ⅰ液和Ⅱ液；
所述基础液以100mL计，含有如下成分：葡萄糖3.7g、EDTA0.125g、柠檬酸钠0.6g、碳酸氢钠0.125g、氯化钾0.075g和100IU/mL的青链霉素混合液10mL，以超纯水配制；
所述Ⅰ液使用所述基础液配制，以100mL计，含有如下成分：乳糖4.25g、海藻糖4.25g、卵黄20mL和蛋白NT5C1B 100μg。
所述Ⅱ液以100mL计，含有如下成分：甘油6ml，充分混匀后加入Ⅰ液并定容至100mL。
实验例1
本实验例用于说明猪精子抗冻蛋白的筛选及精液稀释液中添加抗冻蛋白对冷冻保存的精液品质的影响。
具体操作如下：
1、精液采集
利用公猪自动采精系统进行精液收集，采集人员佩戴好手套后握持固定假阴道，刺激公猪至其阴茎勃起、射精，将第一段精液弃去，随后将精液收集杯固定并与假阴道连接。假阴道内可维持适宜的温度并提供刺激压力从而保证公猪持续射精。射精结束后，采精人员将精液收集袋的过滤袋部分撕掉弃去，将收集袋内的精液进行保温处理。对采集后的精液进行镜检，活力大于80％、密度达到2×108/mL以上的精液为合格精液，用于后续检验。
2、精液稀释与平衡
采精前将基础液置于37℃水浴锅内进行预热，将合格精液与预热好的基础液按照体积比1:1加入500mL的试剂瓶进行稀释，在室温静置1-2h，然后将精液与Ⅰ液同时放入17℃恒温箱中平衡0.5-1h。将平衡后的精液分装到50mL离心管中(离心前电子天平称量空离心管重量并编号)，17℃800g离心12-20min。如果上清液中精子多可适当延长时间，测定上清液的体积和密度，计算总精子数，如果超过10亿则需要将上清液再次离心。离心结束后弃掉上清液，用预热好的Ⅰ液对精子进行重悬，将I液缓缓加入到离心后的精子沉淀底部，用吸吐方式混匀。将重悬后的精液(精子悬液中精子含量约为5.0×108个/mL个/mL)从17℃缓慢降温到4℃(1.5-2h)，并将精液与不同浓度的Ⅱ液一起在4℃平衡0.5-1h。
3、精液冷冻保存
精液平衡结束后在低温操作柜中加入4℃的不同浓度II液等量等温稀释，轻轻混匀后用自动灌装机进行灌装，封口，将封好的细管摆放在托架上，随后将托架放入程序冷冻仪器，对精液进行冷冻。精液冷冻完成后，将细管装入布袋做好标记保存在液氮罐中。
4、精液解冻
将布袋里从液氮罐里取出置于装有液氮的泡沫盒内，用长柄镊子夹出细管迅速放入37℃水浴锅内轻轻摇晃30s后取出，用无菌纱布将细管上的水分擦干，随后用专用剪刀剪去封口端，将剪开的一端迅速放入37℃内预热好的离心管中，使其缓缓流入离心管。将预热的基础液加入离心管中，轻轻摇晃混匀，稀释后的精液可用于后续检测。
实验结果如下：
表1利用蛋白质组学筛选的差异蛋白及其相关功能
由表1可知，从35头种公猪精液中共筛选出22种差异蛋白，上调蛋白12种，下调蛋白10种，根据其功能在下调蛋白中选取两种与猪精子耐冻相关的蛋白NT5C1B与ADA。经查阅抗冻蛋白NT5C1B在猪的高产仔精子中含量丰富，而在猪的低产仔精子中含量较低并且与雄性生育能力相关。抗冻蛋白ADA含量与精子DNA损伤呈正相关，与精液质量呈负相关并且可能与雄性不育相关。
稀释液中添加不同浓度NT5C1B对解冻后猪精子活率及活力的影响见图1。由图1可知，在稀释液中添加1μg/ml NT5C1B可以显著提高解冻后精子活力及活率(P<0.05)。1μg/ml的NT5C1B处理组解冻后精子活力及活率显著高于对照组和其他NT5C1B处理组(P<0.05)；对照组与0.05μg/ml、0.5μg/ml处理组间没有显著性差异(P>0.05)。
表2稀释液中添加不同浓度NT5C1B蛋白对解冻后猪精子运动参数的影响
注：VAP、VCL和VSL分别代表精子的路径速度，曲线速度和直线速度。不同小写字母表示差异显著。
由表2可知，冷冻稀释液中添加NT5C1B可显著保护解冻后精子的VAP、VCL和VSL(P<0.05)。NT5C1B处理组解冻后精子VAP、VCL和VSL显著高于对照组(P<0.05)。结果表明，稀释液中添加适宜浓度的NT5C1B可有效缓减冷冻保存时猪精子VAP、VCL和VSL的下降，改善精子的运动能力。
稀释液中添加不同浓度NT5C1B对解冻后猪精子DNA和质膜完整性的影响见图2。由图2可知，冷冻稀释液中添加NT5C1B可显著保护解冻后精子的DNA和质膜完整性(P<0.05)。NT5C1B处理组解冻后精子DNA完整性显著高于对照组(P<0.05)；稀释液中添加NT5C1B的精子解冻后质膜完整性显著高于对照组(P<0.05)。结果表明，稀释液中添加适宜浓度的NT5C1B可有效减少冷冻保存对猪精子质膜和DNA的损伤，保护其结构的完整性。
稀释液中添加不同浓度NT5C1B对解冻后猪精子线粒体活性和顶体完整性的影响见图3。由图3可知，冷冻稀释液中添加NT5C1B可显著保护解冻后精子的线粒体活性和顶体完整性(P<0.05)。NT5C1B处理组解冻后精子线粒体活性显著高于对照组(P<0.05)；稀释液中添加NT5C1B的精子解冻后顶体完整性显著高于对照组(P<0.05)。结果表明，稀释液中添加适宜浓度的NT5C1B，可有效提高冷冻保存的猪精子线粒体活性及顶体完整性，促进其能量代谢。
稀释液中添加不同浓度ADA对解冻后猪精子活率及活力的影响见图4。由图4可知，冷冻稀释液中添加0.05μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mLADA的处理组与对照组相比对解冻后精子活力及活率无显著性差异(P>0.05)。
综上所述，经实验验证可知筛选的两种猪精子抗冻蛋白：浓度为1μg/mL NT5C1B可以显著提高解冻后精子活力及活率，而猪精子抗冻蛋白ADA并不能提升解冻后精子活力及活率，本发明提供的添加抗冻蛋白NT5C1B的精液稀释液，通过对抗冻蛋白NT5C1B的选择和配比的精确控制，实现了更好的精液保存效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.蛋白NT5C1B的以下任一应用：
1)用于猪精子或精液体外冷冻保存；
2)用于提高猪精子或精液冷冻保存品质；
3)用于制备猪精液冷冻保存液；
其中，蛋白NT5C1B在NCBI中的参考序列编号为XP_005655317.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将蛋白NT5C1B添加至冷冻保存液中，用于猪精子冷冻；
所述冷冻保存液中蛋白NT5C1B的含量为0.05-1μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述精子或精液来自猪。
4.猪精液冷冻保存液，其特征在于，配方如下：葡萄糖2-5g、EDTA 0.05-0.3g、柠檬酸钠0.5-1g、碳酸氢钠0.05-0.3g、氯化钾0.05-0.2g、100IU/mL的青链霉素混合液10mL、乳糖2-5g、海藻糖2-5g、卵黄20mL、甘油6mL和蛋白NT5C1B 5-100μg，用超纯水定容至100mL。
5.根据权利要求4所述的冷冻保存液，其特征在于，配方如下：葡萄糖3.7g、EDTA0.125g、柠檬酸钠0.6g、碳酸氢钠0.125g、氯化钾0.075g、100IU/mL的青链霉素混合液10mL、乳糖4.25g、海藻糖4.25g、卵黄20mL、甘油6mL和蛋白NT5C1B 100μg，用超纯水定容至100mL。
6.一种精液冷冻方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按照如下方法分别配制基础液、Ⅰ液和Ⅱ液；
所述基础液以100mL计，含有如下成分：葡萄糖2-5g、EDTA 0.05-0.3g、柠檬酸钠0.5-1g、碳酸氢钠0.05-0.3g、氯化钾0.05-0.2g和青链霉素10000IU；
所述Ⅰ液使用所述基础液配制，以100mL计，含有如下成分：乳糖2-5g、海藻糖2-5g、卵黄20mL和蛋白NT5C1B 5-100μg；
所述Ⅱ液使用I液配制，具体为：向6mL甘油中加入所述Ⅰ液，并定容至100mL；
(2)将精液与预热至37℃的基础液按照体积比1:1混合，在室温静置1-2h，得到稀释精液；
(3)将稀释精液与Ⅰ液同时放入17℃恒温箱中平衡0.5-1h；然后将平衡后的稀释精液置于离心管中，17℃800g离心12-20min，弃上清，用平衡后的Ⅰ液对精子进行重悬，得到精子悬液5.0×108个/mL，并从17℃缓慢降至4℃，从17℃降至4℃所需时间为1.5-2h；
(4)将(3)的精子悬液与Ⅱ液一并在4℃平衡0.5-1h；平衡结束后，将精子悬液与II液等体积混合，然后投入液氮中进行冷冻。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)按照如下方法分别配制基础液、Ⅰ液和Ⅱ液；
所述基础液以100mL计，含有如下成分：葡萄糖3.7g、EDTA 0.125g、柠檬酸钠0.6g、碳酸氢钠0.125g、氯化钾0.075g和青链霉素10000IU；
所述Ⅰ液使用所述基础液配制，以100mL计，含有如下成分：乳糖4.25g、海藻糖4.25g、卵黄20mL和蛋白NT5C1B 100μg。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括解冻的步骤，具体为：取出冷冻精液，于水浴锅中进行解冻，解冻条件为：37℃30s。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述精液来自猪。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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