CN118355104A - 发酵系统、进料控制器和相关方法 - Google Patents

发酵系统、进料控制器和相关方法 Download PDF

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T·约翰松
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Abstract

公开了用于异源产物例如人乳寡糖发酵系统的进料控制系统和相关方法。进料控制系统包括进料控制器。进料控制器包括处理器和接口。处理器被配置为获得发酵液中的生物质含量。处理器被配置为基于生物质含量确定碳输入参数。处理器被配置为根据碳输入参数控制到发酵液的碳输入。

Description

发酵系统、进料控制器和相关方法
技术领域
本公开涉及具有进料控制系统的发酵系统、进料控制器和相关方法。具体地，公开了在发酵系统中生产寡糖例如人乳寡糖(HMO)的方法。
背景技术
在发酵罐或发酵系统中生物质的发酵过程中，碳输入和细胞培养物的呼吸能力之间的平衡的变化严重抑制细胞培养物，这最终可能导致批次损失。平衡的变化可能是因碳输入导致细胞的喂养过度或喂养不足引起的，这继而导致次优的发酵及其结果。在降低批次损失风险和总体上提高发酵系统收率方面仍然存在挑战，特别是在人乳寡糖(HMO)的生产中。
发明内容
因此，需要用于提高生产异源化合物的发酵系统的收率的进料控制系统、进料控制器和方法。
本公开提供一种用于发酵系统例如异源化合物发酵系统或人乳寡糖发酵系统的进料控制系统。进料控制系统包括进料控制器。进料控制器包括处理器和接口(interface)。处理器被配置为获得发酵液中的生物质含量。处理器被配置为基于生物质含量确定碳输入参数。处理器被配置为根据碳输入参数控制到发酵液的碳输入。
此外，本公开提供在发酵系统中生产异源产物例如人乳寡糖(HMO)的方法。该方法包括获得包含能够产生异源产物的宿主细胞的发酵液中的生物质含量。该方法包括基于生物质含量确定碳输入参数。该方法包括根据碳输入参数控制到发酵液的碳输入。
本公开允许优化到发酵系统的碳输入，这进而可以优化异源产物例如HMO的收率。
本公开的一个重要优点是降低了批次损失的风险和/或提高了HMO生产的收率。这在大规模发酵系统中尤其重要，其中批次损失和/或甚至HMO收率的小幅增加都会产生显著的经济影响。
利用原位实时在线监测生物质，例如使用FTIR光谱，可以非常精确地测定大规模发酵系统发酵液中的生物质浓度或含量。
此外，将生物质含量监测与碳和氨输入的流率测量相结合，可以保护大肠杆菌发酵免于喂养过度，同时能够基于碳流的优化来优化HMO/碳收率。
附图说明
参照附图，通过下面对本发明示例性实施方式的详细描述，本发明的上述和其他特征和优点对于本领域技术人员来说将变得显而易见，其中：
图1示意性地示出了根据本公开的示例性发酵系统，
图2示意性地示出了根据本公开的示例性进料控制器/进料控制系统，
图3是生产人乳寡糖的示例性方法的流程图，
图4示出了预定标准进料(110)和利用先进进料控制系统进料(112)的碳进料曲线，
图5示出了使用IRmadilloTM FTIR光谱仪(黑色实心点)对生物质的实时在线测量与600处光密度(OD)的离线测量(空心白点)的关系，
图6示出了产物占所利用碳源的累积收率％，其中收率被归一化，最大收率设置为100％，
图7示出了进料排料发酵罐设置，显示了发酵罐的入口流和排出流。水平箭头表示从进料分批模式到进料排料模式的转变，
图8示出了进料分批模式和进料排料模式下产生的2’-FL总量与发酵时间的关系，其中所有数字都归一化至最高生产率，并且
图9示出了2’-FL的生产率与发酵时间的关系，包括进料分批模式和进料排料模式的停机时间，其中所有数字均归一化至最高生产率。
具体实施方式
下文中在相关时参考附图描述各种示例性实施方式和细节。应当注意，附图可以或可以不按比例绘制，并且在所有附图中相似结构或功能的要素由相似的附图标记表示。还应当注意的是，附图仅旨在便于描述实施方式。它们并不旨在作为本发明的详尽描述或作为对本发明范围的限制。另外，所示实施方式不需要具有所示的所有方面或优点。结合特定实施方式描述的方面或优点不一定限于该实施方式，并且可以在任何其他实施方式中实践，即使没有如此示出或者如果没有如此明确地描述。
公开了一种用于生产异源化合物的发酵系统的进料控制系统。
所述发酵系统包括进料控制系统、发酵罐、传感器系统和碳源。当发酵系统运行时，发酵罐将含有发酵液，所述发酵液包含生长培养基和一种或多种能够产生目的异源产物的生物体，例如宿主细胞。生物体构成发酵液的生物质含量。
发酵系统可以用于生产异源产物，例如一种或多种人乳寡糖。
在发酵系统中，将碳，例如以糖溶液、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、或其组合的形式，通过来自碳源的碳输入以一流率连续地或分散地进料到发酵罐中。添加的碳可以与发酵液混合，任选地通过强制混合。碳进入发酵罐的流率可以基于碳输入参数(也表示为CIP)和/或由碳输入参数指示/给出。换言之，碳输入参数可以是流率或指示流率，例如在1kg/小时至5000kg/小时范围内的流率。因此，碳输入参数任选地用作从进料控制系统到碳源供应系统的控制参数。
发酵罐容纳发酵液并包括一个或多个输入，包括通过适当的管道组件连接至碳源的碳输入。发酵罐可具有大于0.05m3的体积，例如大于0.1m3，例如大于10m3。在一个或多个示例性系统/方法中，发酵罐可具有20m3至500m3范围内的体积。发酵液可具有初始重量，该初始重量在发酵过程中增加至发酵液的最终重量。在一个或多个示例性发酵系统中，发酵液具有大于10吨的初始重量，例如在20吨至70吨的范围内。在一个或多个示例性发酵系统中，发酵液的最终重量大于100吨，例如大于200吨并且任选地甚至大于300吨。
发酵系统包括传感器系统。传感器系统无线地和/或有线地连接至进料控制系统，用于向进料控制系统/进料控制器提供传感器数据。传感器系统包括一个或多个传感器，包括无线和/或有线连接到进料控制系统的第一传感器或第一传感器装置，用于向进料控制系统/进料控制器提供第一传感器数据。传感器系统任选地包括第二传感器或第二传感器装置，第二传感器或第二传感器装置无线地和/或有线地连接至进料控制系统，用于向进料控制系统/进料控制器提供第二传感器数据。
第一传感器装置和/或第二传感器装置可以包括或者是光密度计，例如光密度探头。
第一传感器装置可以是或包括光谱仪，例如傅立叶变换红外(FTIR)光谱仪和/或拉曼光谱仪。换句话说，进料控制系统任选地包括连接到进料控制器的傅里叶变换红外(FTIR)光谱仪和/或拉曼光谱仪，用于向进料控制器提供光谱仪数据(第一传感器数据)。光谱仪数据(第一传感器数据)可以指示发酵液中的生物质含量。FTIR光谱仪和/或拉曼光谱仪有利地提供发酵罐中生物质含量的准确且基本上连续的(例如至少每5分钟)测量，从而允许改进且更精确地监测发酵液，这进而允许改进对发酵的控制，从而提高HMO收率。
第一传感器装置可以是或包括浊度探头和/或IR传感器，例如近IR和/或中IR传感器，用于向进料控制器提供指示发酵液中的生物质含量的第一传感器数据。
第一传感器装置可以是或包括NMR传感器装置，用于向进料控制器提供指示发酵液中的生物质含量的第一传感器数据。
第一传感器装置可以是或包括流式细胞术传感器装置，用于向进料控制器提供指示发酵液中的生物质含量的第一传感器数据。
第一传感器装置可以是或包括显微镜传感器装置，用于向进料控制器提供指示发酵液中的生物质含量的第一传感器数据。
在一个或多个示例性发酵系统中，第一传感器装置和/或第二传感器装置包括被配置为测量/确定发酵液的一种或多种电特性的一个或多个传感器，所述电特性例如电阻抗(impedance)，如电阻(resistance)和/或电容(capacitance)。换句话说，第一传感器数据和/或第二传感器数据可以指示发酵液的一个或多个电特性。
在一个或多个示例性发酵系统中，第一传感器装置和/或第二传感器装置包括被配置为测量/确定发酵液的体积和/或重量的一个或多个传感器。换句话说，第一传感器数据和/或第二传感器数据可以指示发酵液的体积和/或重量。
发酵系统包括被配置为将碳/碳源输入发酵罐的碳源供应系统或装置。碳源供应系统连接至进料控制系统/处理器，以允许根据碳输入参数控制到发酵液/发酵罐的碳输入。碳源供应系统包括容器、管道、阀门和泵中的一种或多种。
所述进料控制系统包括进料控制器，所述进料控制器包括处理器和接口。所述接口可以是被配置用于与传感器系统、碳源供应系统和任选的发酵系统的其他实体连接的有线和/或无线接口。进料控制系统可以包括分别连接到接口的显示器和/或输入装置。进料控制系统可以是远程控制系统。
处理器被配置为获得发酵液中生物质的生物质含量。生物质含量以重量或浓度来测量。在一些实例中，生物质含量以kg/vol或kg测量。生物质含量可以基于来自第一传感器/第一传感器装置的第一传感器数据和/或来自第二传感器/第二传感器装置的第二传感器数据。生物质含量可以是归一化的生物质含量，例如如下式(1)所示。
在一个或多个实例中，生物质含量可以基于作为光谱仪数据(第一传感器数据)提供的光密度(OD)乘以发酵液的重量FB_W，并且任选地归一化以提供生物质含量(也表示为BC)。生物质含量BC可由下式给出
BC＝α·OD·FB_W， (1)
其中α是归一化因子并且FB_W任选地用传感器(例如第二传感器/第二传感器装置)测量，和/或基于在发酵过程期间应用的进料速率来确定。
处理器被配置为根据碳输入参数控制到发酵液的碳输入(例如糖溶液、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、或其组合)。控制碳输入任选地包括经由接口将碳输入参数输出到碳源供应系统。碳源供应系统通过碳输入将碳进料到发酵罐，例如根据碳输入参数控制碳源供应系统的阀门和/或泵。
在一个或多个示例性进料控制系统中，确定碳输入参数，例如确定碳输入参数的配置或动作，包括确定进料速率(也表示为FR)。进料速率可以指示单位生物质的碳进料速率，例如单位生物质的碳源进料速率。碳输入参数可以基于进料速率。进料速率可以基于生物质含量。换言之，处理器可被配置为确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率；以及根据进料速率和生物质含量确定碳输入参数。
处理器任选地被配置为基于进料速率和/或生物质含量确定碳输入参数。在一个或多个示例性进料控制系统中，碳输入参数CIP由下式给出
CIP＝BC·FR， (2)
其中BC是生物质含量，FR是表示单位生物质的碳进料速率的进料速率。
可能需要实施碳输入参数的最小和/或最大值，例如为了确保最小增长和/或实施系统容量限制。因此，在一个或多个示例性进料控制系统中，基于进料速率和生物质含量确定碳输入参数，例如用于基于进料速率和生物质含量确定碳输入参数的配置或动作，可以包括确定初步碳输入参数(也表示为PCIP)并且任选地由下式给出
PCIP＝BC·FR. (3)
换言之，处理器可被配置成基于进料速率和生物质含量确定初步碳输入参数。碳输入参数可以基于初步碳输入参数。如果在最小值和最大值之内，则初步碳输入参数可以用作碳输入参数。如果初步碳输入参数不在合适/期望的范围内，则可以应用碳输入参数的可接受范围的下限值或上限值。
在一个或多个示例性进料控制系统中，确定碳输入参数，例如确定碳输入参数的配置或动作，包括：根据初步碳输入参数满足碳输入标准的情况，将初步碳输入参数设置为碳输入参数。碳输入标准可以基于碳的最小流率和/或碳的最大流率。换句话说，处理器可以被配置为根据初步碳输入参数满足碳输入标准的情况，将初步碳输入参数设置为碳输入参数。
在一个或多个示例性进料控制系统中，确定碳输入参数包括：根据初步碳输入参数不满足碳输入标准的情况，将默认碳输入参数(例如碳的最大流率)设置为碳输入参数。
换句话说，碳输入参数CIP可以由下式给出
其中CIP_MAX是进入发酵罐的碳的最大流率，PCIP＜CIP_MAX是碳输入标准。
在一些实例中，当初步碳输入参数低于碳的最小流率时，可以将碳的最小流率设置为碳输入参数。换句话说，碳输入参数CIP可以由下式给出
其中CIP_MIN是碳的最小流率，CIP_MAX是进入发酵罐的碳的最大流率，CIP_MIN＜PCIP＜CIP_MAX是碳输入标准。
碳的最大流率CIP_MAX和碳的最小流率CIP_MIN可以指示发酵期间的碳的流率范围。在一个或多个示例性进料控制系统中，碳的最大流率和/或碳的最小流率是适应性的，即可以随时间改变，例如，作为时间的函数。
在一个或多个示例性进料控制系统中，碳的最大流率是时间的函数并且任选地由下式给出
CIP_MAX＝f_max(t)＝K_CIP_2·t^2+K_CIP_1·t+K_CIP_0， (6)
其中K_CIP_0、K_CIP_1和K_CIP_2是多项式系数，并且时间t可以是自发酵开始或进料开始以来的时间。
在一个或多个示例性进料控制系统中，碳的最大流率是时间的多项式函数，例如一阶或二阶多项式函数。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中碳的最大流率是时间的一阶多项式函数，系数K_CIP_1<0。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中碳的最大流率是时间的二阶多项式函数，系数K_CIP_2<0。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中碳的最大流率(kg/小时)是时间(以分钟/60给出)的二阶多项式函数，系数K_CIP_2<0，例如在-2至-0.001的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中碳的最大流率(kg/小时)是时间(以分钟/60给出)的二阶多项式函数，系数K_CIP_1>0，例如在10至1000的范围内，例如在20至100的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中碳或碳源的最大流率(kg/小时)是时间(以分钟/60给出)的二阶多项式函数，系数K_CIP_0>0，例如在10至1000的范围内，例如在50至500的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，为确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率FR，例如确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率FR的配置或动作，包括应用收率模型，例如，HMO收率模型，用于提供进料速率FR或初步进料速率PFR。收率模型可以采用一种或多种生物质含量和发酵系统的一种或多种操作参数作为输入。进料速率可以基于初步进料速率。收率模型可以是查找表(look-up table)，例如，将给定的生物质含量映射到进料速率FR或初步进料速率PFR。收率模型可以是一个或多个变量(例如生物质含量和/或时间)的函数。换句话说，处理器可以被配置为应用收率模型，例如HMO收率模型，用于提供进料速率FR或初步进料速率PFR。
在一个或多个示例性进料控制系统中，为确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率，例如确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率的配置或动作，包括确定初步进料速率PFR。初步进料速率PFR可以基于时间和/或生物质含量或者是时间和/或生物质含量的函数，并且任选地由下式给出
PFR＝g(BC)＝K_FR_2·BC^2+K_FR_1·BC+K_FR_0， (7)
其中K_FR_0、K_FR_1和K_FR_2是多项式系数，BC是生物质含量。因此，收率模型可以是生物质含量的多项式函数，例如一阶或二阶多项式函数。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中初步进料速率PFR是时间的一阶多项式函数，系数K_FR_1<0。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中初步进料速率PFR是时间的二阶多项式函数，初步进料速率PFR可以是至少在发酵时间范围内或从发酵的时间范围内的某个时间点开始的递减函数。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中初步进料速率PFR是二阶多项式函数，系数K_FR_2可以大于0，例如在0.01至5的范围内，并且K_FR_1可以小于0，例如在-5至-0.01的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中初步进料速率PFR是二阶多项式函数，系数K_FR_2可以小于0并且K_FR_1可以大于0。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中初步进料速率PFR是二阶多项式函数，系数K_FR_0可以大于0，例如在10至1000的范围内，例如50至500的范围内。
在一些实例中，收率模型可以是PD调节、查找表和/或HMO收率模型。收率模型可以是函数。可以应用其他收率模型。
在一个或多个示例性进料控制系统中，确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率，例如确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率的配置或动作，包括确定最大进料速率。换句话说，处理器可以被配置为确定最大进料速率。最大进料速率FR_MAX可以基于时间和/或生物质含量或者是时间和/或生物质含量的函数，并且任选地由下式给出
FR_MAX＝gmax(BC)＝K_FRM_2·BC^2+K_FRM_1·BC+K_FRM_0 (8)
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中最大进料速率FR_MAX是时间的一阶多项式函数，系数K_FRM_1<0。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中最大进料速率FR_MAX是时间的二阶多项式函数，最大进料速率FR_MAX可以是递减函数，至少在发酵的时间范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，最大进料速率FR_MAX可以是递减函数，至少在初始发酵期之后。初始发酵时间可以在5小时至60小时的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中最大进料速率FR_MAX是二阶多项式函数，系数K_FRM_2可以大于0，例如在0.01至5的范围内，并且K_FRM_1可以小于0，例如在-5至0.01的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中最大进料速率FR_MAX是二阶多项式函数，系数K_FRM_2可以小于0并且K_FRM_1可以大于0。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中最大进料速率FR_MAX是二阶多项式函数，系数K_FRM_0可以大于0，例如在10至1000的范围内，例如在50至500的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，进料速率基于最大进料速率。
在一个或多个示例性进料控制系统中，确定进料速率，诸如确定进料速率的配置或动作，包括：根据初步进料速率满足进料速率标准的情况，将初步进料速率设置为进料速率，和/或例如根据初步进料速率不满足进料速率标准的情况，将默认进料速率设置为进料速率。换言之，处理器可以被配置为：根据初步进料速率满足进料速率标准的情况，将初步进料速率设置为进料速率，和/或例如根据初步进料速率不满足进料速率标准的情况，将默认进料速率设置为进料速率。
例如，进料速率可以由下式给出
其中PFR是从收率模型获得的初步进料速率，FR_MAX是基于生物质含量的最大进料速率。因此，FR_MAX可以被视为默认进料速率并且PFR<FR_MAX可以被视为进料速率标准。
在一个或多个示例性进料控制系统中，处理器可以被配置为获得发酵系统的第一操作参数，例如氨/碳参数(也表示为ACP)。第一操作参数可以以每千克糖的氨克数给出。第一操作参数可以是碳/氨参数，也表示为碳/氨比率。进料速率可以基于第一操作参数(氨/碳参数)。氨/碳参数指示氨/碳比率，例如进入发酵罐/发酵液的氨进料速率与糖(碳源)进料速率之间的比率或在一定时间内添加到发酵中的氨与糖(碳源)的量之间的比率。在一些实例中，氨/糖比率可以测量为每千克碳源/糖的氨的克数。换句话说，处理器可以被配置为获得一个或多个操作参数，包括发酵系统的第一操作参数，其中碳输入参数任选地基于第一操作参数和/或另外的操作参数。氨/碳参数可以是进入发酵罐的氨的流率和碳的流率之间的比率。传感器系统可以包括第一流率传感器，用于提供任选地指示进入发酵罐的碳/碳源的流率的第一流率数据。传感器系统可以包括第二流率传感器，用于提供任选地指示氨进入发酵罐的流率的第二流率数据。因此，氨/碳参数表示添加到发酵罐中的氨和碳源之间的比率，例如进入发酵罐的氨流率和碳源流率之间的比率。氨/碳参数可以被给定或确定为进入发酵罐的氨的流率和碳源的流率之间的比率，或者被给定或确定为在一定时间内添加到发酵罐中的氨的量和碳源的量之间的比率。
在一个或多个示例性进料控制系统中，处理器可被配置为确定最大第一操作参数，例如最大氨/碳参数。最大氨/碳参数可以指示发酵液中最大可接受的氨/碳比率。处理器可被配置为确定最小第一操作参数，例如最小氨/碳参数。最小第一操作参数和/或最大第一操作参数任选地基于指示发酵开始的时间参数。
在一个或多个示例性进料控制系统中，进料速率基于第一操作参数以及最大第一操作参数和最小第一操作参数中的一个或两者。
在一个或多个示例性进料控制系统中，进料速率基于氨/碳参数和最大氨/碳参数。在一些实例中，最大氨/碳比率可以小于90克氨/1kg糖。最大氨/碳参数任选地基于指示发酵开始的时间参数。最大氨/碳参数指示添加到发酵中的氨和碳源之间的最大比率。最大氨/碳参数的实施允许系统检测并降低系统过量进料的风险。最大氨/碳参数ACP_MAX可以基于时间和/或生物质含量或者是时间和/或生物质含量的函数，并且任选地由下式给出：
ACP-MAX＝hmax(t)＝K_ACM_2t^2+K_ACM_1t+K_ACM_0 (10)
其中t是表示发酵开始的时间参数，K_ACM_2、K_ACM_1和K_ACM_0是函数参数/系数。
在一个或多个示例性进料控制系统中，最大氨/碳参数ACP_MAX是时间的多项式函数，例如一阶或二阶多项式函数。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中最大氨/碳参数ACP_MAX是时间的一阶多项式函数或时间的二阶多项式函数，系数K_ACM_1<0。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中最大氨/碳参数ACP_MAX是时间的二阶多项式函数，系数K_ACM_2>0，例如在0.001至2的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中最大氨/碳参数ACP_MAX是时间的二阶多项式函数，系数K_ACM_2<0，例如在-2至-0.001的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中最大氨/碳参数ACP_MAX是时间(例如以分钟/60给出)的二阶多项式函数，系数K_ACM_1<0，例如在-10至-0.001的范围内，例如在-2至-0.01的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，其中最大氨/碳参数ACP_MAX是时间(以分钟/60给出)的二阶多项式函数，系数K_ACM_0>0，例如在10至1000的范围内，例如在50至200的范围内。
在一个或多个示例性进料控制系统中，确定进料速率包括：根据第一操作参数(例如ACP)满足操作标准的情况，将初步进料速率设置为进料速率，和/或例如根据第一操作参数(例如ACP)不满足操作标准的情况，将默认进料速率或降低的进料速率设置为进料速率。
例如，进料速率FR可以由下式给出：
其中PFR是从收率模型获得的或基于最大进料速率调整的初步进料速率，ACP是第一操作参数(氨/碳比率)，ACP_MAX是最大氨/碳参数，PFR_RED是降低的初步进料速率，例如基于初步进料速率或默认进料速率。由此，可以避免系统的过量进料，进而降低批次失败的风险和/或提高收率。
如果第一操作参数是碳/氨参数CAP(碳/氨速率)，则进料速率FR可以由下式给出：
其中PFR是从收率模型获得的或基于最大进料速率调整的初步进料速率，CAP是第一操作参数(碳/氨比率)，CAP_MIN是最小碳/氨参数，PFR_RED是降低的初步进料速率，例如基于初步进料速率或默认进料速率。由此，可以避免系统的过量进料，进而降低批次失败的风险和/或提高收率。
在一个或多个示例性进料控制系统中，处理器可以被配置为至少每4小时一次，例如至少每小时两次，获得发酵液中的生物质的生物质含量(利用第一传感器)。例如，处理器可以被配置为至少每15分钟一次，例如每10分钟一次、每5分钟一次、每4分钟一次、每3分钟一次、每2分钟一次或每1分钟一次，获得发酵液中生物质的生物质含量。
公开了一种在发酵系统中生产异源产物例如人乳寡糖的方法，该方法包括任选地至少每15分钟获得包含能够产生异源产物的生物体的发酵液中的生物质含量，例如用包括FTIR传感器或是FTIR传感器的第一传感器装置。该方法包括基于生物质含量确定碳输入参数。碳输入参数可以指示进入发酵系统的发酵罐的碳的流率，例如，以kg/小时指示。该方法包括根据碳输入参数控制到发酵液的碳输入。应当注意，进料控制器/处理器的描述也适用于本文所公开的生产异源产品的方法的相应操作、步骤或动作。
在本发明的发酵系统中监测的生物质源自所需生物体的生长。生产异源产物的这种生物体也称为宿主细胞。用于生产异源产物的合适宿主细胞是本领域已知的。这些可以是细菌或真菌宿主细胞或哺乳动物细胞系，它们可以经过基因工程改造以产生所需的异源产物。
对于细菌宿主细胞，原则上没有限制；它们可以是真细菌(革兰氏阳性或革兰氏阴性)或古细菌，只要它们允许进行基因操作以插入目的基因或调控元件并且可以大规模培养即可。优选地，宿主细胞具有允许培养至高细胞密度的特性。
适合重组工业生产异源产物的细菌宿主细胞的非限制性实例可以是草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)(成团泛菌(Pantoea agglomerans))、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、柠檬泛菌(Pantoea citrea)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)或野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。也可以使用芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermophilus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。类似地，可以使用本发明的方法工程化乳杆菌(Lactobacillus)属和乳球菌(Lactococcus)属的细菌，包括但不限于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、唾液酸基乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)和费氏丙酸杆菌(Proprionibacterium freudenreichii)也是本文所述发明的合适细菌种类。作为本发明的一部分，还包括如本文所述工程化的菌株，其来自肠球菌(Enterococcus)属(例如，屎肠球菌(Enterococcus faecium)和嗜热肠球菌(Enterococcus thermophiles))、双歧杆菌(Bifidobacterium)属(例如，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)和两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum))、芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus spp.)、小单孢菌(Micromomospora spp.)、微球菌(Micrococcusspp.)、红球菌(Rhodococcus spp.)和假单胞菌(Pseudomonas)属(例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))。
适合重组工业生产异源产物的真菌宿主细胞的非限制性实例可以是酵母细胞，例如法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)或丝状真菌，例如曲霉属(Aspargillus sp)、镰刀菌属(Fusarium sp)或木霉属(Thricoderma sp)，示例性物种为黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、茄病镰刀菌(F.solani)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)和里氏木霉(T.reesei)。
哺乳动物细胞系的非限制性实例是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和鼠骨髓瘤细胞(NS0、Sp2/0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、鼠C127、人类细胞系例如PER.C6、HKB-11、CAP和HuH-7、HEK293、HT-1080和HeLa细胞(参见例如Dumont等人2016Crit Rev Biotechnol 36(6):1110-1122)。
在一个或多个示例性实施方式中，宿主细胞选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、变铅青链霉菌(S.lividans)、巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母。
在一个或多个示例性实施方式中，宿主细胞选自枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和大肠杆菌。
在一个或多个示例性实施方式中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
在一个或多个示例性实施方式中，宿主细胞是酿酒酵母。
在一个或多个示例性实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌。
本发明上下文中的异源产物是由插入宿主细胞中的一个或多个异源基因直接表达的化合物，或其中所述细胞的一个或多个代谢途径和/或细胞中的酶活性已经被改造以产生目的化合物。异源产物可以是例如蛋白质、肽、脂质、脂肪酸、寡糖、多糖、聚酯或维生素。
异源产生的蛋白质或多肽例如是生物药物化合物，例如抗体、疫苗、细胞因子、血液因子、酶、激素和生长因子，或工业化合物例如酶。这些通常是通过将编码所需蛋白质或多肽的重组基因插入宿主细胞来产生的。
异源寡糖和多糖是例如人乳寡糖(HMO)或生物聚合物。这些通常是通过插入编码酶的基因来产生的，这些酶可以基于提供给细胞或通过宿主细胞(也可以是经过基因工程改造的)中的合成途径产生的前体分子而产生所需的化合物。
在本发明的一个优选实施方式中，异源产物是一种或多种人乳寡糖(HMO)。HMO是人类母乳中发现的复杂碳水化合物。HMO具有在还原端包含乳糖单元的核心结构，其可以被一个或多个β-N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个β-乳糖-N-二糖基单元延长，并且该核心结构可以是被α-L-吡喃岩藻糖基和/或α-N-乙酰基-神经氨酰基(唾液酸基)部分取代。
就这一点而言，非酸性(或中性)HMO不含唾液酸残基，而酸性HMO在其结构中具有至少一个唾液酸残基。非酸性(或中性)HMO可以是岩藻糖基化的或非岩藻糖基化的。此类中性非岩藻糖基化HMO的实例包括乳-N-三糖2(LNT-2)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-新六糖(LNnH)、对-乳-N-新六糖(pLNnH)、对-乳-N-六糖(pLNH)和乳-N-六糖(LNH)。中性岩藻糖基化HMO的实例包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I)、乳-N-二岩藻六糖I(LNDFH-I)、3-岩藻糖基乳糖(3’-FL)、二岩藻糖基乳糖(DFL)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III)、乳-N-二岩藻六糖III(LNDFH-III)、岩藻糖基-乳-N-六糖II(FLNH-II)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V)、乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH-II)、岩藻糖基-乳-N-六糖I(FLNH-I)、岩藻糖基-对-乳-N-六糖I(FpLNH-I)、岩藻糖基-对-乳-N-新六糖II(F-pLNnH II)和岩藻糖基-乳-N-新六糖(FLNnH)。酸性HMO的实例包括3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖(FSL)、3’-O-唾液酸乳-N-四糖a(LST a)、岩藻糖基-LST a(FLST a)、6’-O-唾液酸乳-N-四糖b(LST b)、岩藻糖基-LST b(FLST b)、6’-O-唾液酸乳-N-新四糖(LST c)、岩藻糖基-LST c(FLST c)、3’-O-唾液酸乳-N-新四糖(LST d)、岩藻糖基-LST d(FLST d)、唾液酸-乳-N-六糖(SLNH)、唾液酸-乳-N-新六糖I(SLNH-I)、唾液酸-乳-N-新六糖II(SLNH-II)和二唾液酸-乳-N-四糖(DSLNT)。关于HMO生产的综述，参见例如Bych等人2019Current Opinion inBiotechnology 56:130-137。
脂质、脂肪酸、聚酯和维生素就像通过操纵宿主细胞的酶促表达和甲醇途径产生的糖类一样。
在一个或多个示例方法中，使用本文公开的进料控制系统来确定参数：发酵液中的生物质含量和基于生物质含量的碳输入参数。
在一个或多个示例方法中，使用本文公开的进料控制系统控制根据碳输入参数的向发酵液的碳输入。
在一个或多个示例方法中，异源产物是一种或多种人乳寡糖。在一个或多个示例方法中，宿主细胞是大肠杆菌。
本公开还涉及发酵系统，其是连续和/或半连续发酵系统，例如进料排料系统。即，以连续模式培养产生异源产物的微生物。本公开特别涉及用于生产HMO的连续和/或半连续发酵系统。
在一个或多个示例方法中，本公开涉及具有本文所述的进料控制系统的发酵系统，其是连续和/或半连续发酵系统。即，以连续和/或半连续模式培养产生异源产物的微生物，例如产生HMO的微生物。
如实施例2所示，当主发酵容器达到其最大容量时，通过从进料分批发酵转变为连续和/或半连续发酵系统(例如转变为进料排料发酵)以延长发酵时间，可以进一步提高大规模发酵过程的效率。
在本文中，短语“连续发酵方法/系统/工艺”或“半连续发酵方法/系统/工艺”用于描述其中反应器的内容物连续或半连续地流过生物反应器的发酵方法/系统/工艺。连续发酵工艺的特征在于将新鲜培养基以限定的、恒定的和连续的速率进料到生物反应器中，其中培养液同时以相同的限定的、恒定的和连续的速率从生物反应器中去除。在一些示例性方法中，碳源的进料与至少一部分寡糖制剂的去除的组合同时进行。
通常，根据本发明的连续和/或半连续发酵方法包括，
a.提供包含液体营养培养基的第一初级生物反应器，
b.用一种或多种产生异源产物的微生物接种第一初级生物反应器，
c.向所述第一初级生物反应器中添加碳源，
d.发酵添加的碳源以产生包含至少一种或多种产生异源产物的微生物和一种或多种异源产物的发酵液，
e.将来自第一初级生物反应器的至少一部分发酵液经由中央排出管线通入至少一个其他生物反应器和/或储存罐中，
f.进一步向第一初级生物反应器中添加至少一部分额外的液体营养培养基和/或碳源，
g.在促进微生物生长并促进所述微生物的异源产物生产的条件下运行第一初级生物反应器，并且任选地，
h.从发酵液中收获和/或纯化一种或多种异源产物。
在上述过程中，步骤b.和c.的顺序可以反转。除了碳源之外，异源产物形成所需的底物可以任选地与上述步骤c和f中的碳源一起添加，其或是作为单独的进料或是与碳源加在一起。
通常，发酵液从第一初级生物反应器进入至少一个其他生物反应器和/或储存罐以及添加另外的液体和/或碳源是连续的。添加的液体培养基和/或碳源的体积低于、高于或等于从第一初级生物反应器通入至少一个其他生物反应器和/或储存罐的发酵液的量。
在一个或多个示例方法中，根据本公开的连续发酵方法包括，
a.提供包含液体营养培养基的第一初级生物反应器，
b.用一种或多种产生异源产物的微生物接种第一初级生物反应器，
c.向所述第一初级生物反应器连续添加碳源，
d.发酵添加的碳源以产生包含至少一种或多种产生异源产物的微生物和一种或多种异源产物的发酵液，
e.当第一初级生物反应器中的体积达到预定体积时，来自第一初级生物反应器的发酵液的一部分经由中央排出管线连续地通入至少一个其他生物反应器和/或储存罐中，
f.向第一初级生物反应器中连续添加额外的液体营养培养基和/或碳源以维持步骤e.中的预定体积，
g.在促进微生物生长并促进所述微生物的异源产物生产同时维持预定体积的条件下运行第一初级生物反应器，并且任选地，
h.从第一初级生物反应器和/或其他生物反应器和/或储存罐中的发酵液收获和/或纯化一种或多种异源产物。
除了碳源之外，异源产物形成所需的底物可以任选地与上述步骤c和f中的碳源一起添加，其或是作为单独的进料或是与碳源加在一起。
第一初级生物反应器中的预定体积可以是在第一初级生物反应器的最大容量和比第一初级生物反应器的最大容量低20％(例如10％、例如5％)之间的体积范围。
额外液体和/或碳源的添加以及发酵液从第一初级生物反应器通入入至少一个其他生物反应器和/或储存罐中可以经由中央排出管线进行，并且可以通过根据本发明的控制单元来控制，将添加液体和碳源的流率与发酵液从第一初级生物反应器经由中央排出管线通入至少一个其他生物反应器和/或储存罐的流率连接起来。
通常，第一初级生物反应器中液体培养基的初始水平(步骤a.)为总生物反应器体积的10-25％、26-50％、51-75％或76-100％，当发酵液占总生物反应器体积的10-25％、26-50％、51-75％或76-95％时开始添加额外的液体和/或碳源到第一初级生物反应器(步骤c.)，并且当发酵液占总生物反应器体积的10-25％、26-50％、51-75％或76-100％时开始将发酵液从第一初级生物反应器经中央排出管线通入至少一个其他生物反应器和/或第一初级生物反应器中液体培养基的储存罐(步骤e.)。
在本发明的一个或多个实施例中，液体培养基的初始水平低于总生物反应器体积的50％或75％，并且向第一初级生物反应器添加额外的液体和/或碳源是(步骤c.)持续直至达到总生物反应器体积的约80％至100％，然后开始将发酵液从第一初级生物反应器(步骤e.)经由中央排出管线通入至少一个其他生物反应器和/或储存罐中。
在本发明的一个或多个实施例中，液体培养基的初始水平低于总生物反应器体积的75％至95％，并且向第一初级生物反应器中添加额外的液体和/或碳源(步骤c.)与发酵液从第一初级生物反应器(步骤e.)经由中央排出管线通入到至少一个其他生物反应器和/或储存罐中是同时进行的。
图1示出了实施根据本公开的进料控制系统的示例性发酵系统。发酵系统2包括进料控制系统4、发酵罐6、传感器系统8和碳源供应系统10。
传感器系统8包括第一传感器12，例如FTIR光谱仪，用于提供第一传感器数据12A，例如光谱仪数据。光密度探头12B或其他传感器，例如电容传感器，可以用作第一传感器12。传感器系统8任选地包括用于提供第二传感器数据14A的第二传感器14。第二传感器14，例如实施为压力和/或液位传感器，可被配置为测量、感测或检测发酵罐6中的发酵液16的量。传感器12、14有线或无线连接到进料控制系统4，例如经由网络，用于向进料控制系统4提供传感器数据12A、14A。因此，进料控制系统4被配置为获得生物质含量，例如基于发酵罐6的发酵液16中的生物质的第一传感器数据12A和任选的第二传感器数据14A。
发酵系统2包括碳源供应系统10。碳源供应系统10有线或无线地连接到进料控制系统4，例如经由网络，用于与进料控制系统通信，包括接收碳输入参数4A以控制碳流18(例如糖溶液、甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖或其组合)经由发酵罐6的碳输入20进入发酵罐6中。传感器系统任选地包括第一流率传感器22，用于测量碳流18并提供指示进入发酵罐6的碳流率的第一流率数据22A。第一流率传感器22可以是集成到碳源10中，然后其经由数据连接24A向进料控制系统4提供第一流率数据22A。
发酵系统2任选地包括氨源26或被配置用于调节发酵液16中的pH的其他源。氨源26可以有线或无线连接至进料控制系统4，例如经由网络，用于与进料控制系统通信，包括接收氨输入参数26A，用于控制氨的氨流28经由发酵罐6的氨输入30进入发酵罐6。传感器系统任选地包括第二流率传感器32用于测量氨流28并提供指示进入发酵罐6的碳流率的第二流率数据32A。第二流率传感器32任选地如图所示集成到氨源26中，然后其经由数据连接24B向进料控制系统4提供第二流率数据32A。
发酵罐6可以在发酵过程期间和/或之后经由罐输出34排空。
图2示出了根据本公开的示例性进料控制系统。进料控制系统4包括进料控制器40，该进料控制器40包括处理器42和接口44。
进料控制系统4与诸如传感器系统、碳源和任选的氨源之类的实体通信，并经由接口44从传感器系统/发酵系统的传感器接收传感器数据12A、14A、22A、32A。
处理器42在BC模块46中，其被配置为基于来自作为FTIR传感器的第一传感器12的第一传感器数据12A和任选的指示发酵罐6中发酵液的量的第二传感器数据14A获得发酵罐6中的发酵液16中生物质的生物质含量BC。
处理器42在CIP模块48中，其被配置为基于来自BC模块46的生物质含量BC和进料速率FR来确定碳输入参数CIP,4A。
进料速率FR在FR模块50中确定，FR模块50被配置为基于生物质含量BC和任选地最大进料速率FR_MAX、最大氨/碳参数ACP_MAX，以及氨/碳参数ACP中的一个或多个来确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率FR。处理器42任选地被配置为基于生物质含量BC确定FR_MAX模块52中的最大进料速率。最大进料速率可以是存储在进料控制系统的存储器中并且从进料控制系统的存储器中检索的默认参数。处理器42任选地被配置为任选地基于自发酵开始以来的时间来确定ACP_MAX模块54中的最大氨/碳参数。最大氨/碳参数可以是存储在进料控制系统的存储器中并且从进料控制系统的存储器中检索的默认参数。处理器42任选地被配置为确定ACP模块56中的氨/碳参数，例如基于流率数据22A、22B。氨/碳参数可以作为氨流率和碳流率之间的比率给出。
处理器42在CIP_MAX模块58中，其被配置为确定最大碳输入参数，例如由上面的方程式(6)作为自发酵开始以来的时间的函数给出。最大碳输入参数被输出到CIP模块48，CIP模块48被配置为基于来自BC模块46的生物质含量BC、来自FR模块50的进料速率FR和来自CIP_MAX模块58的最大碳输入参数CIP_MAX，确定并输出碳输入参数CIP,4A，例如，如方程式(4)或任选的方程式(5)给出的，其中CIP_MIN是默认值或者在处理器42的CIP_MIN模块(未示出)中确定。
处理器42将碳输入参数CIP,4A输出至输入源10，以根据碳输入参数4A控制到发酵罐6中的发酵液16的碳输入(来自输入源10的碳流18)。
图3示出了用于在发酵系统中生产人乳寡糖的由进料控制系统执行的示例性方法100的流程图。方法100包括S102获得发酵液中的生物质的生物质含量，例如基于来自第一传感器12的第一传感器数据12A，S104基于生物质含量确定碳输入参数，和S106根据碳输入参数控制到发酵液的碳输入，例如本文参考进料控制系统所描述的。
图4示出了根据本公开优化碳输入参数的结果，其中110示出了最大碳流率，112示出了根据本公开优化的发酵批次的碳流率(碳输入参数)，其在30-70小时的时间段内与流率曲线110具有明显偏差。
图5说明了使用IRmadilloTM FTIR光谱仪(黑色实心点)对生物质的实时在线测量以及600处光密度(OD)的离线测量(空心白点)。
图6示出了2个发酵批次的累积收率，其中收率曲线114是使用图4的固定进料曲线110的收率，并且收率曲线116是使用图4的碳输入曲线112的收率，其根据本公开经过调整和优化。可以看出，根据本公开的进料控制系统和方法提供了约10％的收率增加。
实施例
材料和方法
除非另有说明，否则分子生物学领域已知的标准技术、载体、控制序列元件和其他表达系统元件用于核酸操纵、转化和表达。此类标准技术、载体和元件可以在例如：Ausubel等人(著),Current Protocols in Molecular Biology(1995)(John Wiley&Sons)；Sambrook,Fritsch,&Maniatis(著),Molecular Cloning(1989)(Cold Spring HarborLaboratory Press,NY)；Berger&Kimmel,Methods in Enzymology 152:Guide toMolecular Cloning Techniques(1987)(Academic Press)；Bukhari等人(著),DNAInsertion Elements,Plasmids and Episomes(1977)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY)；Miller,J.H.Experiments in molecular genetics(1972.)(Cold springHarbor Laboratory Press,NY)中找到。
选择下面描述的实施方式是为了说明本发明，而不以任何方式限制本发明。
菌株
使用细菌菌株MDO作为下面实施例中使用的菌株的背景菌株。MDO由大肠杆菌K-12DH1构建。大肠杆菌K-12DH1基因型为：Fˉ、gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44。除大肠杆菌K-12DH1基因型外，MDO还具有以下修饰：lacZ：删除1.5kbp，lacA：删除0.5kbp，nanKETA：删除3.3kbp，melA：删除0.9kbp，wcaJ：删除0.5kbp，mdoH：删除0.5kbp，并在gmd基因上游插入Plac启动子。
将目的基因插入大肠杆菌基因组的方法是本领域技术人员众所周知的。
可以使用具有特定的选择标记基因和筛选方法的Gene gorging(参见例如Herring和Blattner 2004J.Bacteriol.186:2673-81和Warminget等人2005Nucleic AcidsRes.33(4):e36)将基因盒插入大肠杆菌染色体中。
实施例1中使用的2'-FL菌株基于MDO菌株并且进一步含有额外的染色体上整合的基因：在与天然基因座不同的基因座上在PglpF启动子控制下的一个额外的荚膜异多糖酸基因簇(gmd-wcaG-wcaH-wcaI-manC-manB)、在PglpF启动子(WO2019/123324中的SEQ IDNO:12)控制下的来自幽门螺杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶(GenBank ID：WP_080473865.1，但在C末端有两个额外的氨基酸(LG))、和在PglpF_SD7启动子(WO2019/123324中的SEQ IDNO:19)的控制下的来自Rosenbergiella nectarea的主要易化子超家族转运蛋白(GenBankID:WP_092672081.1)。
实施例1-有和没有进料控制的2’-FL发酵工艺
标准2’-FL发酵工艺，没有进料控制
使用菌株MP1进行常规生产规模发酵，起始填充量约为75吨(从种子发酵罐接种后)，结束时最终发酵液超过300吨。发酵基础培养基是用磷酸(75％)、KOH溶液(45％)、MgSO4、微量元素、柠檬酸、消泡剂和硫胺素制备的完全限定的最低盐培养基。通过将气态NH3和入口空气一起鼓入将培养基pH控制在6.8。氨也是唯一的氮源。微量元素包括硫酸盐形式的Mn、Cu、Fe、Zn元素，以及钼酸盐和亚硒酸盐。以连续方式单独添加乳糖，并在整个发酵过程中保持约40g/kg发酵液，直到最后，当停止添加并且持续转化为2’-FL导致乳糖降至10g/kg以下的那天。通过通气、搅拌和超压将溶氧控制在空气饱和度的200％，这是通过位于发酵罐高度多个位置的氧气探头测量的。通过从在相似的基础培养基中生长的种子发酵罐预培养物接种来开始发酵，该基础培养基补充有每kg培养基约30g葡萄糖作为碳和能源。在主发酵罐中，按照预定的进料曲线连续进料无菌葡萄糖进料溶液(约60％w/w)作为碳和能量的唯一来源(参见图4，参考号110)。葡萄糖进料曲线最初设计是为了确保整个生产阶段的碳限制条件，以避免溢出代谢和乙酸形成。通过向发酵罐连续进料包含基础培养基的所有成分的单独的共进料溶液来维持矿物盐水平。接种后约30小时，发酵温度设定值从33℃降至32℃。大约70小时时发酵结束。
在整个发酵过程中，取样以使用HPLC测定2’-FL、副产物DFL、乳糖和其他少量副产物的浓度。将总发酵液样品在去离子水中稀释三倍并煮沸20分钟，然后离心，然后通过HPLC分析所得上清液。上述测量用于准确计算2’-FL滴度、DFL/2’-FL比率以及2’-FL在碳源上的累积收率。后者考虑了进料速率的变化，正如在使用进料控制器期间所预期的那样，因此是不同批次之间直接比较的重要参数。
通过进料控制优化的2’-FL发酵工艺
如本公开所述，使用先进的进料控制系统来优化使用菌株MP1的2’-FL发酵过程。如上述标准发酵过程所述开始发酵。然而，在此设置中，进料是根据各种输入参数进行调整的。生物质输入参数(项S102，图3)是通过使用FTIR探头(英国牛津郡Didcot的Keit Ltd.的IRmadilloTM)对生物质进行实时原位测量来确定的。FTIR仪器使用可高压灭菌并位于主发酵罐中的探头。FTIR仪器经过训练，可根据少量校准批次的离线OD测量来测量生物质水平。图5描绘了一个示例性2’-FL生产批次的生物质的实时IRmadilloTM测量结果。
如图3所示，实时生物质数据(S102)随后用于计算相应的碳输入参数(S104)，即生物质特定的糖进料速率，也称为qS。该参数又用于控制到发酵罐的碳输入(S106)。由此产生的优化进料曲线如图4所示(参考号112)。
图6示出了2’-FL的累积收率，以所利用的碳源的％表示，其中曲线116是利用控制器优化的碳进料曲线的收率，曲线114是利用预先计算的标准进料曲线获得的收率。收率被归一化，最高收率设置为100％。这清楚地表明，优化的碳进料曲线可使2’-FL在碳源上的累积收率提高约10％。
实施例2–使用进料排料连续发酵装置和进料控制系统生产2’-FL
本实施例说明，当主发酵容器达到其最大容量时，通过从进料分批发酵转变为进料排料发酵来延长发酵时间，可以进一步提高大规模发酵过程的效率。
菌株MP1的进料排料发酵以开始于初始发酵液质量约为90吨的生产规模进行。发酵基础培养基与实施例1中使用的培养基相同。通过从种子发酵罐预培养物接种开始发酵，使用进料分批方法在类似的基础培养基中生长以获得高细胞浓度。主发酵罐接种后，连续供给无菌葡萄糖进料溶液作为唯一的碳和能量来源。使用在实施例1的优化2’-FL发酵过程中描述的进料控制系统调节进料速率。以连续方式单独添加乳糖，并保持在大约40g/kg发酵液的稳定浓度，直到最后，当停止添加以允许浓度因持续转化为2’-FL而下降的那天。应用通气、搅拌和超压使溶氧保持在足够的水平，以维持充分的呼吸代谢。通过向发酵罐连续进料包含基础培养基的所有成分的单独的共进料溶液来维持矿物盐水平。为了比较的目的，使用相同的方案进行进料分批发酵。当56小时后发酵容器达到约310吨时，停止比较性进料分批发酵。
对于进料排料发酵，当发酵容器中的发酵液水平达到310吨时，启动排出流，将多余的发酵液倒入缓冲罐中，以将主发酵罐中的容器体积保持在310-240吨之间(见图7)。当大约80小时后达到最大生产率时，发酵停止。发酵结束时，发酵罐和缓冲罐中的最终发酵液体积分别为240吨和190吨。
在整个发酵过程中，取样以使用HPLC测定2’-FL、副产物DFL、乳糖和其他少量副产物的浓度。将总发酵液样品在去离子水中稀释三倍并煮沸20分钟，然后离心，然后通过HPLC分析所得上清液。
结果：
进料排料设置允许以高比率延展HMO生产并显著增加批次大小。一个批次中生产的2’-FL总量增加了44％(图8)，而整体生产率(包括重新启动发酵的停机时间)增加了10％(图9)。包括停机时间在内的生产率的计算方法为：生产的2’-FL千克数除以发酵时间加重新开始下一次发酵的24小时停机时间。
术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”，“初级”、“次级”、“三级”等的使用并不暗示任何特定顺序，而是被包括在内以识别各个要素。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”，“初级”、“次级”、“三级”等的使用并不表示任何顺序或重要性，相反，术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”，“初级”、“次级”、“三级”等用于将一个要素与另一个要素区分开。请注意，此处和其他地方使用的词语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”，“初级”、“次级”、“三级”等仅用于标记目的，并不旨在表示任何特定的空间或时间顺序。
存储器可以是缓冲器、闪存、硬盘驱动器、可移动介质、易失性存储器、非易失性存储器、随机存取存储器(RAM)或其他合适的设备中的一个或多个。在典型的布置中，存储器可以包括用于长期数据存储的非易失性存储器和用作处理器用的系统存储器的易失性存储器。存储器可以通过数据总线与处理器交换数据。存储器可以被认为是非暂时性计算机可读介质。
存储器可以被配置为将信息(诸如表示进料控制的参数和/或模型的信息)存储在存储器的一部分中。
此外，第一要素的标记并不意味着第二要素的存在，反之亦然。
可以理解的是，图1-3包括用实线示出的一些模块或操作以及用虚线示出的一些模块或操作。实线中所包括的模块或操作是最广泛的示例实施方式中所包括的模块或操作。虚线中所包括的模块或操作是可以被包括在其中或者其一部分的示例实施方式，或者是除了实线示例实施方式的模块或操作之外可以采取的另外的模块或操作。应当理解，这些操作不需要按照所呈现的顺序来执行。此外，应当理解，并非所有操作都需要执行。示例性操作可以以任何顺序和任何组合来执行。
应当注意，词语“包括”不一定排除所列出的之外的其他要素或步骤的存在。
应当注意，要素前面的词语“一”或“一个”不排除存在多个这样的要素。
还应当注意的是，任何附图标记并不限制权利要求的范围，示例性实施方式可以至少部分地通过硬件和软件两者来实现，并且多个“装置”、“单元”或“设备”可以由同一个硬件项目来表示。
本文描述的各种示例性方法、设备和系统是在方法步骤过程的一般上下文中描述的，其在一方面可以通过计算机程序产品来实现，该计算机程序产品体现在计算机可读介质中，包括计算机可执行指令，例如作为程序代码，由网络环境中的计算机执行。计算机可读介质可以包括可移动和不可移动存储设备，包括但不限于只读存储器(ROM)、随机存取存储器(RAM)、压缩盘(CD)、数字多功能盘(DVD)等。一般而言，程序模块可以包括执行指定任务或实现特定抽象数据类型的例程、程序、对象、组件、数据结构等。计算机可执行指令、相关联的数据结构和程序模块表示用于执行本文所公开的方法的步骤的程序代码的示例。这种可执行指令或相关联的数据结构的特定序列表示用于实现在这种步骤或过程中描述的功能的相应动作的示例。
尽管已经示出和描述了特征，但是应当理解，它们并非旨在限制所要求保护的发明，并且对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离所要求保护的发明的精神和范围的情况下可以做出各种改变和修改。因此，说明书和附图应被视为说明性的而非限制性的。所要求保护的发明旨在覆盖所有替代方案、修改和等同物。
参考号列表
2 发酵系统
4 进料控制系统
4A 碳输入参数
6 发酵罐
8 传感器系统
10 碳源供应系统
12 第一传感器，FTIR光谱仪
12A 第一传感器数据、指示生物质含量的光谱仪数据
12B 光密度探头
14 第二传感器
14A 第二传感器数据
16 发酵液
18 碳流
20 碳输入
22 第一流率传感器
22A 第一流率数据
24A、24B、24C、24D 数据连接
26 氨源、pH调节剂
26A 氨输入参数
28 氨流
30 氨输入
32 第二流率传感器
32A 第二流率数据
34 罐输出
40 进料控制器
42 进料控制器的处理器
44 进料控制器的接口
46 BC模块或电路，用于获得/确定/计算生物质含量
48 CIP模块或电路，用于确定/计算碳输入参数
50 FR模块或电路，用于确定/计算进料速率
52 FR_MAX模块或电路，用于确定/计算最大进料速率
54 ACP_MAX模块或电路，用于确定/计算最大氨/碳参数
56 ACP模块或电路，用于获得/确定/计算氨/碳参数
58 CIP_MAX模块或电路，用于确定/计算最大碳输入参数
100 一种用于在发酵系统中生产人乳寡糖的由进料控制系统执行的方法
110 碳流曲线
112 优化碳流曲线
114 碳流的收率曲线
116 优化碳流曲线的收率曲线
S102 获取发酵液中生物质的生物质含量
S104 基于生物质含量确定碳输入参数
S106 根据碳输入参数控制到发酵液的碳输入

Claims (22)

1.一种用于发酵系统的进料控制系统，所述进料控制系统包括进料控制器，所述进料控制器包括处理器和接口，其中所述处理器被配置为：
获得发酵液中的生物质含量；
基于所述生物质含量确定碳输入参数；和
根据所述碳输入参数控制到所述发酵液的碳输入。
2.根据权利要求1所述的进料控制系统，其中确定碳输入参数包括确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率；并基于所述进料速率和所述生物质含量确定碳输入参数。
3.根据权利要求2所述的进料控制系统，其中基于所述进料速率和所述生物质含量确定碳输入参数包括基于所述进料速率和所述生物质含量确定初步碳输入参数，并且其中所述碳输入参数基于所述初步碳输入参数。
4.根据权利要求3所述的进料控制系统，其中确定碳输入参数包括：根据所述初步碳输入参数满足碳输入标准，将所述初步碳输入参数设置为碳输入参数，以及根据所述初步碳输入参数不满足碳输入标准，将默认碳输入参数设置为碳输入参数。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的进料控制系统，其中确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率包括应用用于提供初步进料速率的收率模型，所述收率模型将所述生物质含量作为输入，并且其中所述进料速率基于所述初步进料速率。
6.根据权利要求5所述的进料控制系统，其中确定指示单位生物质的碳进料速率的进料速率包括确定最大进料速率，并且其中所述进料速率基于所述最大进料速率。
7.根据权利要求6所述的进料控制系统，其中确定进料速率包括：根据所述初步进料速率满足进料速率标准，将所述初步进料速率设置为进料速率，以及根据所述初步进料速率不满足进料速率标准，将默认进料速率设置为进料速率。
8.根据从属于权利要求2的权利要求1-7中任一项所述的进料控制系统，其中所述处理器被配置为获得氨/碳参数，并且其中所述进料速率基于所述氨/碳参数。
9.根据权利要求8所述的进料控制系统，其中所述处理器被配置为确定最大氨/碳参数，并且其中所述进料速率基于所述氨/碳参数和所述最大氨/碳参数。
10.根据权利要求9所述的进料控制系统，其中所述最大氨/碳参数基于指示发酵开始的时间参数。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的进料控制系统，其中所述进料控制系统包括连接到所述进料控制器的用于提供指示生物质含量的光谱仪数据的傅立叶变换红外(FTIR)光谱仪。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的进料控制系统，其中所述处理器被配置为至少每4小时一次获得所述发酵液中的生物质含量，至少每小时两次。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的进料控制系统，其中所述发酵系统用于生产异源产物，例如一种或多种人乳寡糖。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的进料控制系统，其中所述发酵系统用于以连续和/或半连续模式生产异源产物，例如一种或多种人乳寡糖。
15.在发酵系统中生产异源产物的方法，所述方法包括：
1)获得包含能够产生所述异源产物的宿主细胞的发酵液中的生物质含量；
2)基于所述生物质含量确定碳输入参数；和
3)根据所述碳输入参数控制到所述发酵液的碳输入。
16.根据权利要求15所述的方法，其中使用根据权利要求1-13中任一项所述的进料控制系统确定参数：发酵液中的生物质含量和基于所述生物质含量的碳输入参数。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中使用根据权利要求1-14中任一项所述的进料控制系统控制根据所述碳输入参数的到所述发酵液的碳输入。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述异源产物是一种或多种人乳寡糖。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述方法包括，
a)提供包含液体营养培养基的第一初级生物反应器，
b)向所述第一初级生物反应器中添加碳源，
c)用一种或多种产生异源产物的微生物接种所述第一初级生物反应器，
d)发酵添加的碳源以产生包含至少一种或多种产生异源产物的微生物和一种或多种异源产物的发酵液，
e)将来自所述第一初级生物反应器的至少一部分发酵液经由中央排出管线通入至少一个其他生物反应器和/或储存罐中，
f)向所述第一初级生物反应器中添加至少一部分额外的液体营养培养基和/或碳源，
g)在促进微生物生长并促进从所述微生物产生异源产物的条件下运行所述第一初级生物反应器，并且任选地，
h)从发酵液中收获和/或纯化一种或多种异源产物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中将底物与所述碳源一起进料，或是作为单独的进料或是与所述碳源在一起。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的方法，其中当所述第一初级生物反应器的体积在80％至100％之间时开始步骤e)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5878584A (ja) * 1981-11-04 1983-05-12 Hitachi Ltd 培養基質の流加制御方法
CA2651338C (en) * 2006-05-05 2013-04-16 Plasco Energy Group Inc. A control system for the conversion of a carbonaceous feedstock into gas
EP2415807A3 (en) * 2006-10-26 2012-10-31 Xyleco, Inc. Method of making butanol from biomass
GB201416233D0 (en) * 2014-09-15 2014-10-29 Stratophase Ltd Method, system and controller for process control in a bioreactor
CN108085248A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 常州益优新能源有限公司 一种新型厌氧发酵系统及其发酵方法
WO2019123324A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Glycom A/S Nucleic acid construct for in vitro and in vivo gene expression
CN111172329A (zh) * 2019-12-04 2020-05-19 北京化工大学 一种甲醇反馈补料控制方法及系统
CN113403193B (zh) * 2021-06-18 2022-11-25 华东理工大学 一种多级连续发酵系统

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