CN118325841A - 一种腺病毒包装细胞及腺病毒制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稳定过表达人GAPDH基因的293G或293GP细胞株及其制备方法，用于高效包装和扩增腺病毒。本发明还提供了一种腺病毒系统和腺病毒制备方法，转染293G细胞7天或293GP细胞5天即可完成病毒包装过程，包装时间短，病毒包装效率高，获得的腺病毒滴度高，对目的细胞感染效果更好。腺病毒在293G细胞或293GP细胞中的扩增效率显著高于亲代细胞。其中GAPDH和Ad5 pTP双过表达的293GP细胞是重组腺病毒生产系统中最有效的腺病毒包装细胞和扩增细胞，在腺病毒的制备和纯化工艺中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种腺病毒包装细胞及腺病毒制备方法。
背景技术
腺病毒载体是基因转移和基因治疗中的常用工具，也是溶瘤病毒治疗、癌症免疫治疗和基于DNA/RNA的疫苗接种的热门选择。 重组复制缺陷型腺病毒（rAdV）是最常用的病毒载体之一，可在体外和体内基因传递，且较其他的病毒载体具有大容量，易于制备高滴度的病毒，高水平的转基因表达和能够导入广泛的哺乳动物组织和分裂/非分裂细胞的优势.此外，腺病毒介导的基因传递是短暂的，不涉及DNA整合到宿主基因组，很少发生插入突变，安全性好。例如：人血清型5型腺病毒（Adenovirus serotype 5，Ad5）是一种线形的36 kb双链无包膜DNA病毒，大小为70～90 nm的二十面体颗粒。腺病毒基因大致区分为早期（E1-4）和晚期转录单位（L1-5），并进一步分为更小的转录单位，发挥不同的作用。E1A蛋白可调节细胞代谢，使病毒DNA更易于在细胞中复制；早期基因转录单位末端蛋白前体（pTP,precursor terminal protein）与多种细胞蛋白作用，启动病毒基因组的复制。
由于rAdV缺乏关键的E1病毒基因，导致rAdV复制缺陷，需要产生包装能力的基因，因此rAdV的产生需要包装细胞，最常用的是HEK293细胞。HEK293细胞是人胚胎肾细胞中转化插入部分人5型腺病毒（Ad5）基因组DNA所得，其中Ad5序列介于1-4137nt 之间。在过去的几十年中，随着技术的进步，使我们能够很容易地引入转基因片段到腺病毒基因组。发明人团队也做了大量的工作，建立了促进rAdV生产更有效的包装细胞，由HEK293衍生的293pTP（过表达pTP基因，Gene Ther. 2014;21（7）: 629-637）和RAPA细胞（过表达pTP 及E1A基因，Cell Physiol Biochem. 2017;41（6）: 2383-2398），293pTP 细胞能有效用于腺病毒的包装和扩增，RAPA细胞能快速包装病毒，但是这两种方法获得的病毒滴度仍然低，缺陷病毒占比高，导致感染目的细胞效率较低。目前，获得高滴度rAdV的初始包装时间需要10-14天，因此仍然是一个耗时的劳动密集型过程。
腺病毒的产生是一个高度动态变化和周密协调组织的细胞过程，包括病毒基因的表达协同、有效的腺病毒DNA复制和病毒衣壳蛋白的充分合成。新产生的rAdV对宿主细胞产生病变效应，也是影响病毒包装和扩增的重要因素。甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH），分子量37 kDa，广泛分布各组织中，在糖酵解和氧化还原调节中起重要作用，可催化葡萄糖分解的第六步，提供能量和碳源。除此之外，GAPDH还在许多其他细胞生理过程中发挥着重要作用，包括内质网到高尔基体的蛋白转运、转录激活、参与蛋白质与蛋白质的相互作用、细胞外基质的粘附以及神经变性和肿瘤发生发展等。
发明内容
针对现有技术中腺病毒初始包装和病毒扩增时间长，效率低下的问题。我们在293细胞中表达外源性GAPDH，能加快腺病毒的生产，获得高滴度腺病毒。过表达GAPDH和Ad5pTP的293GP细胞，是目前HEK293细胞系中最快的rAdV生产系统，可应用于基于腺病毒的基因转移和基因治疗。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种293细胞株，能稳定过表达人GAPDH基因。
进一步的，上述293细胞为HEK293或293 pTP细胞。
进一步的，上述稳定过表达人GAPDH基因的细胞中，人GAPDH基因表达水平为亲代细胞的2-3倍。
本发明还提供了上述293细胞株的制备方法，包含以下步骤:
步骤1，PCR扩增获得人GAPDH的编码区，并在BamHI /MluI位点亚克隆到逆转录病毒表达载体pSEPI中，得到pSEPI-GAPDH（图1），DNA测序验证与Gene Bank序列100%匹配；
步骤2，pSEPI-GAPDH、PCL-Ampho和pCMV-VSVG共转染HEK293细胞，分别于转染后36h、48h、60h和72h收集包装好的逆转录病毒上清，混合不同时间收集的病毒上清，过滤后获得逆转录病毒RV-GAPDH，在4°C或-80°C下保存。
步骤3，指数生长的HEK293和293 pTP细胞被包装的RV-GAPDH感染，进行三轮嘌呤霉素选择（终浓度为0.5μg/mL），TqPCR分析验证外源GAPDH在细胞中的表达水平，获得稳定过表达GAPDH基因的细胞株 293G和293GP；
进一步的，上述制备方法中PCR扩增人GAPDH的引物为如SEQ No1所示的上游引物和如SEQ No2所示的下游引物。
本发明还提供了一种腺病毒制备方法，包含以下步骤：
步骤1，PCR扩增外源基因编码区IG（interested gene），克隆到腺病毒穿梭载体中，获得腺病毒穿梭表达载体；
步骤2，PmeІ 酶切腺病毒穿梭表达载体将其线性化，与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183大肠杆菌细胞中进行同源重组，获得重组腺病毒载体pAd-IG;
步骤3，PacІ 酶切腺病毒载体，脂质体或聚乙烯亚胺转染上述293细胞株，5天收集细胞，反复冻融获得初始腺病毒；
步骤4，包装后的初始腺病毒在HEK293或293pTP或RAPA或293G或293GP细胞中进行高滴度扩增。
进一步的，上述腺病毒穿梭载体为pAdTrack-CMV或pShuttle-CMV。
进一步的，步骤3转染和/或步骤4扩增时，在细胞培养基中加入终浓度为6µg/mL的聚凝胺。
本发明还提供了一种腺病毒包装系统，包含腺病毒穿梭载体，腺病毒骨架载体，上述稳定过表达人GAPDH基因的293细胞。
有益效果
1.本发明提供了一种稳定过表达人GAPDH基因的HEK293G或293GP细胞株，可快速高效制备腺病毒。GAPDH和Ad5 pTP双过表达的293GP细胞是重组腺病毒生产系统中最有效的腺病毒包装细胞和扩增细胞，在腺病毒的制备和纯化工艺中具有很好的应用前景。
2.本发明提供了一种稳定过表达人GAPDH基因的293G或293GP细胞株的制备方法，可制备快速高效地包装和扩增腺病毒的细胞。
3.本发明提供了一种腺病毒系统和腺病毒制备方法，转染293G细胞7天或293GP细胞5天即可完成病毒包装过程，包装时间短，病毒包装效率高，获得的腺病毒滴度高，对目的细胞感染效果更好； 腺病毒后续扩增，采用293G细胞或293GP细胞，其扩增效率显著高于亲代细胞。
附图说明
图1. 稳定过表达GAPDH基因的293G和293GP细胞系构建过程（A. pSEPI-GAPDH质粒图谱；B. 293G和293GP细胞系构建流程图；C. PCR检测不同细胞中GAPDH的表达水平，**p < 0.01）；
图2. RV-GAPDH，Ad-G2Luc，Ad-RFP的基因表达结构示意图；
图3. 在HEK293和293G细胞中包装Ad-G2Luc（A. 细胞中GFP表达；B.定量 GLuc 活性分析，* p < 0.05, ** p < 0.01）
图4. 在293pTP和293GP细胞中包装Ad-G2Luc（A. 细胞中GFP表达；B.定量 GLuc活性分析，* p < 0.05,** p < 0.01）
图5. 比较HEK293和293G细胞包装腺病毒的效率 （A.包装腺病毒裂解液感染HEK293细胞的GFP表达；B. 定量 GLuc 活性分析；C.包装腺病毒裂解液感染三种非包装细胞，iMEFs，USC和T24的定量GLuc活性分析，* p < 0.05,** p < 0.01）
图6. 比较293pTP和293GP细胞中包装腺病毒的效率（A. 包装腺病毒裂解液感染HEK293细胞的GFP表达；B. 定量 GLuc 活性分析；C.包装腺病毒裂解液感染三种非包装细胞，iMEFs，USC和T24的定量GLuc活性分析，* p < 0.05,** p < 0.01）
图7. 比较HEK293和293G细胞扩增腺病毒的效率 （A. Ad-G2Luc腺病毒感染HEK293细胞48h和72h的GFP表达及定量 GLuc 活性分析；B. 扩增病毒裂解液感染HEK293细胞12h和24h的GFP表达及定量 GLuc 活性分析；C. 扩增病毒裂解液感染三种非包装细胞，iMEFs，USC和T24的定量GLuc活性分析，* p < 0.05,** p < 0.01）。
图8. 比较293pTP和293GP细胞中扩增腺病毒的效率（A. Ad-G2Luc腺病毒感染HEK293细胞24h和72h的GFP表达及定量 GLuc 活性分析；B. 扩增病毒裂解液感染HEK293细胞24h和48h的GFP表达及定量 GLuc 活性分析；C. 扩增病毒裂解液感染三种非包装细胞，iMEFs，USC和T24的定量GLuc活性分析，* p < 0.05, ** p < 0.01）
具体实施方式
实施例1 构建稳定过表达GAPDH基因的293G和293GP细胞系
获得逆转录病毒RV-GAPDH：采用人源cDNA为模板，将人GAPDH基因的编码区（NM_002046.7）进行PCR扩增，上游引物如SEQ No1所示，下游引物如SEQ No2所示 。PCR产物进BamHI /MluI双酶切，亚克隆至逆转录病毒表达载体pSEPI（图谱见https://boneandcancer.org/cloningvectors/）中，得到pSEPI-GAPDH（图1A）。通过DNA测序验证GAPDH基因与NCBI数据库中100%一致。pSEPI-GAPDH （8μg）、pCL-Ampho（8μg）和pCMV-VSVG（4μg） 共转染HEK293细胞。分别于转染后36h、48h、60h和72h收集包装好的逆转录病毒上清RV-GAPDH，过滤后在4°C或-80°C下保存。
构建GAPDH稳定细胞系：将HEK293或293 pTP细胞接种于100mm培养皿中培养24小时左右，细胞处于指数生长期，加入15ml 病毒上清RV-GAPDH。感染后24小时，加入含有嘌呤霉素的培养基进行筛选（终浓度为0.5μg/mL），传代后嘌呤霉素继续筛选3轮，获得的细胞系分别命名为293G和293GP（图1B）。
TqPCR检测GAPDH表达： 使用NucleoZOL试剂盒（Takara Bio USA，San Jose，CA）裂解HEK293、293G、293pTP和293GP，获得总RNA。使用六聚体和M-MuLV反转录酶（NEB）进行反转录反应，获得cDNA产物，作为PCR模板。使用Primer3Plus设计人GAPDH特异性qPCR引物（上游引物如SEQ No3所示，下游引物如SEQ No4所示 ）。TqPCR在CFX-Connect仪器（Bio-Rad）上进行，使用2×定量PCR master Mix（Biotium）。所有TqPCR反应均一式三份进行。人TBP和HPRT1作为内参，2ΔΔCq法用于基因表达水平的定量分析。证实外源人GAPDH基因在293G和293GP细胞中稳定过表达（图1C，p < 0.01）。
实施例2 不同包装细胞用于包装扩增Ad-G2Luc的效率
腺病毒载体构建：使用AdEasy系统进行腺病毒包装。通过自裂解肽E2A分离的高斯荧光素酶（GLuc）和增强型绿色荧光蛋白（copGFP）的编码区被PCR扩增并克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV或pAd-track-CMV（图谱见https://boneandcancer.org/cloningvectors/）中。PmeІ 酶切线性化的穿梭载体，与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183细胞中进行同源重组，得到重组腺病毒载体pAd-G2Luc（图2）。
腺病毒包装：将指数扩增的HEK293、293G、293pTP 及293GP 分别接种于100mm培养皿中，初始细胞密度为30%，4h左右细胞贴壁，加入10μg经PacІ酶切线性化的重组腺病毒载体pAd-G2Luc，脂质体（Lipfectamine3000， Invitrogen）或聚乙烯亚胺（PEI）转染试剂，无血清培养基，37°C，5% CO2下孵育细胞4h，更换为全培养基。
HEK293和293G细胞转染相同质量的PacI酶切线性化pAd-G2Luc重组腺病毒质粒时，而第1天两种细胞系中的GFP信号检测到相似的水平，第6天293G细胞中的GFP信号明显高于HEK293细胞（图3A）。GLuc活性定量分析显示，除转染后24小时外，293G细胞的GLuc活性在转染后48、72和96小时均显著高于HEK293细胞（图3B，* p<0.05，** p < 0.01），表明293G细胞包装的Ad-G2Luc滴度高于亲代HEK293细胞包装的Ad-G2Luc。
将线性化pAd-G2Luc 重组腺病毒质粒转染到亚汇合的 293pTP 和 293GP 细胞中，我们发现在转染后 48 小时，293GP 细胞中的GFP+细胞显著高于 293pTP 细胞（图4A）。定量 GLuc 活性分析表明，与 293pTP 细胞相比，293GP 细胞在转染后 48 小时、72 小时和 96 小时产生的GLuc活性要高得多（图4B，* p<0.05，** p < 0.01）。表明293GP细胞包装的Ad-G2Luc滴度高于亲代293pTP细胞包装的Ad-G2Luc。
比较四种细胞的腺病毒包装效率：以上四种细胞同时转染相同质量的线性化pAd-G2Luc 重组腺病毒质粒，分别于转染后第3、5、7、10、14日收集细胞，离心去上清，1mlPBS重悬细胞，-80℃／37℃反复冻融4次，离心取上清获得包装腺病毒裂解液，分别用相同剂量再次感染HEK293细胞检测病毒滴度。计算病毒滴度公式：病毒滴度（pfu/ml）＝GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数（pfu）/稀释后体积（ml）。
四组包装细胞转染腺病毒质粒后第1天GPF+细胞为10-15%，随着感染时间延长GPF+细胞占比逐渐增多：
1）HEK293细胞：第3天GPF+细胞为20-30%，第5天40-50%，第7天60-70%，第10天可达90%以上、14天达100%，约1/3～1/2细胞变圆漂浮并出现明显的细胞病变。
2）293G细胞：第3天GPF+细胞50-60%左右，第5天70-80%，第7天95%以上，约1/2细胞变圆漂浮并出现明显的细胞病变。
3）293pTP细胞：第3天GPF+细胞40-50%左右，第5天60-70%，第7天可达80-90%、10天95%以上，约1/3～1/2细胞变圆漂浮并出现明显的细胞病变。
293GP细胞：第3天GPF+细胞占比70-80%，第5天95%以上、1/2细胞变圆漂浮并出现明显的细胞病变，第7天100%、2/3细胞变圆漂浮并出现明显的细胞病变。
包装腺病毒的滴度检测：将四种包装细胞在不同时间获得的腺病毒裂解液，相同剂量（5%）感染HEK293细胞，检测病毒滴度，结果见表1，293G和293GP包装细胞中获得的腺病毒滴度显著高于HEK293和293pTP细胞。
表1 不同包装细胞中的腺病毒裂解液滴度（pfu/ml）
实施例3 腺病毒包装效率
为了进一步验证和比较稳定过表达人GAPDH基因的293细胞与相应的亲代细胞包装产生Ad-G2Luc的滴度差异及感染目的细胞的效率，我们在HEK293或293G转染后7天，293pTP或 293GP转染后5天（因293GP细胞5天和7天病毒滴度数量级差异不大，且7天后细胞状态很差，2/3以上细胞变圆漂浮）收集细胞，-80℃/37℃反复冻融4次以上获得包装腺病毒裂解液（VL），该病毒同时表达功能性GLuc和copGFP。
采用HEK293细胞中提取的病毒裂解液HEK293-VL和293G细胞中提取的病毒裂解液293G-VL，以5%剂量感染HEK293细胞，发现在24小时内，293G-VL感染组GFP信号显著高于HEK293-VL感染组（图5A）。在多个时间点对受感染细胞的GLuc活性进行定量分析也证实了293G-LV较高的GLuc活性（图5B，* p<0.05，** p < 0.01）。
此外，我们使用10%的HEK293-VL和293G-VL感染三种非包装细胞，iMEFs（永生化小鼠胚胎成纤维细胞），USC（人尿源干细胞）和T24（人膀胱癌细胞株），定量GLuc活性分析表明，在不同的细胞中293G-VL感染组均比HEK293-VL感染组显示出更高的GLuc活性（图5C，**p < 0.01）。结果表明，稳定过表达人GAPDH基因的293G细胞中包装的Ad-G2Luc腺病毒具有较HEK293细胞中包装的Ad-G2Luc腺病毒更高的滴度及感染目的细胞的效率。
采用293GP细胞中提取的病毒裂解液293GP-VL和293pTP细胞中提取的病毒裂解液293pTP-VL，以5%剂量感染HEK293细胞，所有测试时间点293GP-VL感染组较293pTP-VL感染组观察到更多的GFP +细胞（图6A）和更高的GLuc活性（图6B，* p<0.05，** p < 0.01）。
使用10% 的 293pTP-VL 和 293GP-VL 感染 iMEF、USC 和 T24 细胞，定量 GLuc活性分析显示，在不同的细胞中293GP-VL感染组均比 293pTP-VL 感染组显示出更高的GLuc活性（图6C，** p < 0.01）。结果表明，人GAPDH基因稳定过表达的293GP细胞包装的Ad-G2Luc腺病毒具有较293pTP细胞中包装的Ad-G2Luc腺病毒更高的滴度及感染目的细胞的效率。
综上所述，人GAPDH基因稳定过表达可以增强腺病毒在293细胞中的包装效率，腺病毒质粒转染293G细胞7天或转染293GP细胞5天即可获得高滴度腺病毒，对目的细胞具有更好的感染效率。
实施例4 腺病毒扩增效率
为了进一步验证和比较稳定过表达人GAPDH基因的293细胞与相应的亲代细胞用于扩增腺病毒的效率，用Ad-G2Luc（前期纯化的高滴度腺病毒，并非实施例2中包装的腺病毒）感染细胞，3天后收集细胞，-80℃/37℃反复冻融4次以上获得扩增腺病毒裂解液（AVL），用扩增腺病毒裂解液感染HEK293细胞检测病毒滴度值。
比较 HEK293 和293G细胞中的腺病毒扩增效率。用感染复数MOI=20的Ad-G2Luc感染亚汇合HEK293和293G，发现293G细胞中GFP+细胞数明显高于HEK293细胞（图7Aa，7Ab），定量GLuc活性分析结果一致（图7Ac，* p<0.05，** p < 0.01）。
扩增腺病毒的滴度检测：用HEK293和293G细胞中获得的扩增病毒裂解液HEK293-AVL和293G-AVL，以5%剂量分别感染亚汇合的HEK293细胞，发现在感染后12h和24h，293G-AVL感染组GPF+细胞数明显高于HEK293-AVL感染组（图7Ba，7Bb），定量GLuc分析结果也一致（图7Bc，** p < 0.01）。使用5%剂量的病毒裂解液HEK293-AVL和293G-AVL感染iMEF、USC 和T24 细胞，定量GLuc活性分析显示，在不同的细胞中293G-AVL 感染组均比 HEK293-AVL感染组显示出更高的GLuc活性（图7C，* p<0.05，** p < 0.01）。
进一步比较 293pTP 和 293GP 细胞中的腺病毒扩增效率。用感染复数MOI=10的Ad-G2Luc感染亚汇合的 293pTP 和 293GP，发现感染后72小时 293GP 细胞的GFP+细胞数量显著高于 293pTP 细胞（图8Aa），定量 GLuc 活性分析结果一致（图8Ab，8Ac，** p <0.01）。
扩增腺病毒的滴度检测：用293pTP和293GP细胞中扩增获得的病毒裂解液293pTP-AVL和293GP-AVL，以5%剂量感染亚汇合的HEK293细胞，发现在感染后24小时和48小时，293GP-AVL的GFP+细胞数量明显高于293pTP-AVL（图8Ba），定量GLuc分析结果一致（图8Bb，8Bc，** p < 0.01）。使用5%剂量的病毒裂解液293pTP-AVL和293GP-AVL感染 iMEF、USC 和T24 细胞，定量 GLuc 活性分析显示，在不同的细胞中293PG-AVL感染组均比293pTP-AVL感染组显示出更高的GLuc活性（图8C，** p < 0.01）。
同时比较四种细胞的扩增效率：用感染复数MOI=20的腺病毒Ad-G2Luc分别感染四种293细胞扩增腺病毒，用5%剂量的扩增腺病毒裂解液感染HEK293细胞检测病毒滴度值如表2所示，稳定过表达人GAPDH基因的293细胞株中扩增获得的腺病毒滴度更高，扩增效率为亲代细胞的5-10倍，扩增获得的腺病毒对目的细胞的感染效率更高。
表2 不同细胞中的腺病毒扩增后腺病毒滴度值（pfu/ml）
目前常用的腺病毒包装系统需要10-14天包装时间获得1.0× 107 pfu/mL腺病毒，采用293pTP作为包装细胞可加快病毒的包装过程，但是仍然需要10天达到109 pfu/mL数量级病毒滴度，获得的病毒对目的细胞感染效率仍然不高。采用本发明的腺病毒包装细胞，在293G细胞中仅需7天、在293GP细胞中仅需5天可获得109 pfu/mL数量级滴度的病毒（表1），对目的细胞感染的效率大大提高。综合以上结果，稳定过表达人GAPDH基因的293G细胞或293GP细胞用于制备腺病毒，大大缩短包装时间，腺病毒滴度高，缺陷病毒占比少。293G细胞或293GP用于腺病毒扩增效率更高，能快速获得高滴度腺病毒（表2）。稳定过表达人GAPDH基因的293G细胞或293GP细胞在腺病毒的制备及纯化工艺具有很好的应用前景。
以上的仅是本发明的实施例，该发明不限于此实施案例涉及的领域，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和本发明的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种293细胞株，其特征在于：稳定过表达人GAPDH基因。
2.如权利要求1所述的293细胞株，其特征还在于：所述293细胞为HEK293或293 pTP细胞。
3.如权利要求1或2所述的293细胞株，其特征还在于：人GAPDH基因表达水平为亲代细胞的2-3倍。
4.一种如权利要求2或3所述的293细胞株的制备方法，包含以下步骤：
步骤1，PCR扩增获得人GAPDH的编码区，并在BamH 1/MluI位点亚克隆到逆转录病毒表达载体pSEPI中，得到pSEPI-GAPDH，DNA测序验证；
步骤2，pSEPI-GAPDH、PCL-Ampho和pCMV-VSVG共转染HEK293细胞，分别于转染后36h、48h、60h和72h收集包装好的逆转录病毒上清，混合不同时间的病毒上清，获得RV-GAPDH，在4°C或-80°C下保存；
步骤3，指数生长的HEK293和293 pTP细胞被包装的RV-GAPDH感染，进行三轮嘌呤霉素选择（终浓度为0.5μg/mL），TqPCR检测外源GAPDH表达水平，获得稳定过表达人GAPDH基因的细胞株 293G和293GP。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征还在于：步骤1中PCR扩增人GAPDH的引物为如SEQ No1所示的上游引物和如SEQ No2所示的下游引物。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征还在于：步骤3中PCR检测人GAPDH的引物为如SEQ No3所示的上游引物和如SEQ No4所示的下游引物。
7.一种腺病毒制备方法，包含以下步骤：
步骤1，PCR扩增外源基因编码区，克隆到腺病毒穿梭载体中，获得腺病毒穿梭表达载体；
步骤2，PmeІ 酶切腺病毒穿梭表达载体将其线性化，与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183大肠杆菌细胞中进行同源重组，获得重组腺病毒载体；
步骤3，PacІ 酶切腺病毒载体，转染如权利要求 1-3所述细胞株，5-7天收集细胞，反复冻融获得初始腺病毒；
步骤4，包装后的初始腺病毒在HEK293或293pTP或RAPA或293G或293GP细胞中进行扩增。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征还在于：所述腺病毒穿梭载体为pAdTrack-CMV或pShuttle-CMV。
9.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征还在于：步骤3 /或步骤4扩增时，在细胞培养基中加入终浓度为6 µg/mL的聚凝胺。
10.一种腺病毒包装系统，包含腺病毒穿梭载体，腺病毒骨架载体，以及如权利要求1-3所述的稳定过表达人GAPDH基因的293细胞。
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