CN118324937A - 一种多糖基水凝胶及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多糖基水凝胶及其制备方法,所述方法包括:将醛基化改性的胞外多糖riclin与氨基酸在溶液中反应,得到多糖基水凝胶。本发明制备的多糖基水凝胶具有优异的机械性能、抗菌特性、止血特性以及良好的生物相容性,能够在组织创伤止血、组织创伤修复或组织创伤抑菌制品中的应用,可以更快地促进伤口愈合,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域,尤其涉及一种多糖基水凝胶及其制备方法、应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官,具有复杂的结构,作为人体与外界环境接触的第一道防线,皮肤容易受到外界环境的破坏而产生伤口,伤口的快速愈合是皮肤和其他组织修复的一个重要过程。在伤口愈合过程中,环境中的细菌很容易侵入伤口,进而发生感染,导致伤口愈合缓慢甚至更严重的组织损伤。皮肤伤口的延迟愈合或难以愈合严重地威胁着患者的生命健康,并成为社会医疗系统的一个重要挑战。
为了解决伤口敷料抗菌抗醛基化性不强、促愈合作用不佳、制作成本高且难降解等问题,基于多糖和蛋白质等高分子聚合物的伤口敷料普遍被开发。市面上常见的多糖如纤维素虽然具备很强的生物活性,却存在抗菌性差、降解缓慢等问题;而透明质酸虽具有很好的生物相容性,却昂贵、难以移除;海藻酸盐机械强度低,化学稳定性差;蛋白如胶原蛋白和明胶不仅抗降解差而且存在免疫原性风险,绝大多数以前开发的水凝胶仅被用作封装各种生物产品的载体。理想情况下,水凝胶将包含促进创面愈合的内在免疫调节特性。因此,寻找到一种既具备出色的物理特性又具备优异的生物特性,且制备成本低、可批量生产的多糖原料来创面愈合迫在眉睫。
微生物类胞外多糖,因其具有来源丰富、价格低廉、稳定性好、免疫原性低和良好的生物相容性/生物降解性等显著优势,引起了人们的广泛关注。Riclin是一种来自土壤杆菌的胞外多糖,表现出抗氧化抗炎特性,抗肿瘤活性和免疫调节作用。(Y.Yang,X.Sun,Y.Zhao,etal.,Antitumor activity and immunogenicity of a succinoglycanriclin,Carbohydr.Polym.2021Mar 1;255:117370.;R.Cheng,L.Wang,J.Li.,et al.,In vitroand invivo anti-inflammatory activity of a succinoglycan Riclin fromAgrobacterium sp.ZCC3656,J.Appl.Micro-biol.2019Dec;127(6):17161726.)。此外该菌株表现出较高的胞外多糖产量,发酵成本较低,具有巨大的商业价值和应用前景。然而,目前针对该胞外多糖的产品开发尚在起步阶段,如何利用该胞外多糖开发出既具备出色的物理特性,又具备优异的生物特性的产品具有现实意义。
发明内容
基于上述技术问题,本发明将醛基化改性的胞外多糖riclin与氨基酸通过化学交联制备得到多糖基水凝胶。由此得到的多糖基水凝胶具有优异的机械性能、抗菌特性、止血特性以及良好的生物相容性,可以用作伤口敷料,更快的促进伤口愈合。
本发明具体方案如下:
本发明目的之一在于,提供了一种多糖基水凝胶的制备方法,包括:将醛基化改性的胞外多糖riclin与氨基酸在溶液中反应,得到多糖基水凝胶。
优选地,氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸中至少一种。
优选地,氨基酸与醛基化改性的胞外多糖riclin的摩尔比为1:2~2:1。
优选地,在水溶液中反应,醛基化改性的胞外多糖riclin浓度为0.1-5%。
优选地,将醛基化改性的胞外多糖riclin与氨基酸在水溶液中搅拌反应,反应温度为0-60℃,搅拌速度为0-1000rpm。更优选地,将醛基化改性的胞外多糖riclin与氨基酸在水溶液于室温下,搅拌均匀。
优选地,将胞外多糖riclin溶于水中,加入氧化剂进行氧化反应,得到醛基化改性的胞外多糖riclin;更优选地,氧化剂选自高碘酸盐、次氯酸盐、过氧化氢中的至少一种。
优选地,氧化反应是在pH为7-9、避光、15-30℃的条件下搅拌反应2-12h。
优选地,氧化反应后加入还原剂终止反应;更优选地,还原剂为乙二醇或丙三醇。
优选地,氧化反应终止后,进行透析、冷冻干燥,然后加热溶解。
优选地,所述透析是采用截留分子量为500-14000Da的透析袋透析0.5-2天,透析时每3-8h换一次水;所述冷冻干燥包括先降温至-(60-80)℃,再降压至0-0.1kPa,在该温度和压强下冻干24-48h;更优选地,所述降温速率为10-15℃/min,所述降压速率为150-200kPa/min。
优选地,加热溶解的温度为40-80℃;优选地,加热溶解温度为60℃。
本发明目的之二在于,提供了一种多糖基水凝胶,采用以上任一项方法制备得到。
本发明目的之三在于,提供了以上任一项方法制备得到的多糖基水凝胶在组织创伤止血、组织创伤修复或组织创伤抑菌制品中的应用。
本发明所述胞外多糖Riclin是从土壤杆菌ZCC3656中提取的天然胞外多糖。其分子链中含有大量的羟基,具有良好的生物相容性和生物降解性。已经研究发现riclin具有抑制肿瘤生长、抗氧化、改善高胆固醇血症等生物功能活性。
上述胞外多糖riclin的结构如式(I)所示,其中,R为-OCCH2CH2COOH或H,n为大于0的整数。
所述胞外多糖riclin分子量范围为2.0×106-3.0×106Da。
对于本发明所述胞外多糖riclin的提取方法不作具体限定,包括但不限于以下方法:取土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656,保藏编号为CCTCC NO:M2018797,依次经活化、种子培养、发酵培养;向发酵液中加入异丙醇进行醇沉,取沉淀干燥得到粗糖riclin;采用碱纯法提纯:取粗糖riclin的水溶液,与无机碱进行水解反应,然后取反应后的上清液,用乙醇进行醇沉,取沉淀干燥得到胞外多糖riclin。
上述提取方法中,发酵培养的温度为28-32℃,发酵培养的时间≥3天;发酵液与异丙醇的体积比1:2.5-5;反应后的上清液与乙醇的体积比为1:2.5-5;水解反应的温度为100-110℃,水解反应的时间为15-30min,水解反应的pH为8.0-9.5,水解反应的压力为5-45kPa。上述提取方法可以快速提取获得胞外多糖riclin,适合应用于工业化生产。
本发明有益效果为:
本发明通过对胞外多糖riclin进行醛基化改性,进一步与氨基酸化学交联制备得到多糖基水凝胶,整个制备过程易于规模化生成,制备的多糖基水凝胶价格低廉,摒弃了大量有毒化学交联剂。
本发明制备得到的多糖基水凝胶具有优异的机械性能、抗菌特性、止血特性和良好的生物相容性,可在制备成本低、可压缩、可止血的医用伤口敷料、可负载药物以及其他生物活性物质的医用材料中应用。具体如下:
(1)良好的机械性能:可压缩、粘附和形状恢复,使得该多糖基水凝胶可应用于不规则的伤口,有利于水凝胶在实际应用中不易损坏,实际应用价值高;
(2)优异的抗菌性:醛基化改性的胞外多糖riclin中由于游离醛基团的存在,可有效针对细菌外膜及细胞壁进行损伤,抑制以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌和以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌的生长发育过程和生存能力;
(3)良好的止血性能:相较于各种商品化多糖水凝胶止血材料,本发明所述多糖基水凝胶在相对低用量的情况下将大鼠肝出血的止血时间基本控制在200s左右,失血量降低至1g以下,具有良好的止血性能;
(4)良好的生物相容性:能够将溶血率保持在10%以下,体外细胞共培养实验表明多糖基水凝胶材料对细胞无破坏性,具有优良的生物相容性;
(5)高效的伤口修复作用:在大鼠全层皮肤伤口模型实验中,本发明所述多糖基水凝胶组大鼠的伤口在第9天已基本愈合,第13天完全愈合,具有高效的修复效果和实际应用价值。
附图说明
图1分别为实施例1-3形成的多糖基水凝胶形成结构图;
图2为实施例1形成的多糖基水凝胶抗压强度测试结果;
图3为实施例1得到的水凝胶的物理性质表征;
图4为实施例1得到的水凝胶的抗菌性数据图;
图5为实施例1得到的水凝胶在大鼠肝出血模型中的应用图;
图6为实施例1得到的水凝胶的生物相容性实验数据图;
图7为实施例1得到的水凝胶在大鼠全层皮肤伤口模型中的应用图;
具体实施方式
以下实施例所用的高碘酸钠,乙二醇,甘氨酸,精氨酸,谷氨酰胺,水合氯醛均来自中国上海试剂有限公司;以下所用水均为去离子水。
以下所用胞外多糖riclin,其提取方法包括如下步骤:
取土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656,保藏编号为CCTCC NO:M2018797,将其菌落活化,然后接种在种子培养基(LB液体培养基)中进行种子培养;再将种子培养物转入至发酵液(M9培养基,其中,碳源为3%蔗糖)中,于30℃发酵2天;取发酵液,加入3倍体积的预冷的95%(v/v)异丙醇进行醇沉,离心(6000g,5min)收集沉淀,于40℃烘干得到riclin多糖粗品;将riclin多糖粗品配制成浓度为0.01g/mL的水溶液,用NaOH水溶液调节pH=9.0,于105℃高压灭菌20min,然后离心(10000g,10min)得到上清液,加入3倍体积的预冷的95%(v/v)乙醇水溶液进行醇沉,离心(6000g,10min)取沉淀,干燥得到胞外多糖riclin。以下所用胞外多糖riclin,其按照以下方法对胞外多糖riclin粗品进行去蛋白纯化处理得到的胞外多糖riclin。
Yang Y,Sun X,Zhao Y,Ge W,Ding Z,Liu J,Wang L,Xu X,Zhang J.Anti-tumoractivity and immunogenicity ofa succinoglycan riclin.Carbohydr Polym.2021Mar1;255:117370.doi:10.1016/j.carbpol.2020.117370.Epub 2020Nov 12.PMID:33436203.
下面,通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明,但是应该明确提出这些实施例用于举例说明,但是不解释为限制本发明的范围。
实施例1
一种多糖基水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)将胞外多糖riclin加入去离子水中溶解,按照1:3.25(胞外多糖Riclin与NaIO4摩尔比)加入高碘酸钠溶液反应,氧化反应条件为:pH为8、避光、25℃的条件下搅拌反应6h,然后加入乙二醇终止反应;将形成的产物水溶液进行透析采用截留分子量为10000Da的透析袋透析24h,透析时每4h换一次水,得到纯化后单体的产物水溶液;将得到的产物水溶液进行冻干,所述冻干条件为以10℃/min的降温速率,150kPa/min降压速率,先降温至-70℃,再降压至0kPa,在该温度和压强下冻干48h,得到醛基化改性的胞外多糖riclin,然后于60℃加热溶解,得到醛基化改性的胞外多糖riclin水溶液;
(2)将甘氨酸按照(甘氨酸与醛基化改性的胞外多糖riclin摩尔比为1:1)比例加入浓度为2%(w/v)醛基化改性的胞外多糖riclin水溶液中,在室温下搅拌均匀,倒模静置后得到多糖基水凝胶,记为ARG。
实施例2
一种多糖基水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)与实施例1相同;
(2)将精氨酸按照(精氨酸与醛基化改性的胞外多糖riclin摩尔比为1:1)比例加入浓度为2%(w/v)醛基化改性的胞外多糖riclin水溶液中,在室温下搅拌均匀,倒模静置后得到多糖基水凝胶,记为Arg-G。
实施例3
一种多糖基水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)与实施例1相同;
(2)将谷氨酰胺按照(谷氨酰胺与醛基化改性的胞外多糖riclin摩尔比为1:1)比例加入浓度为2%(w/v)醛基化改性的胞外多糖riclin水溶液中,在室温下搅拌均匀,倒模静置后得到多糖基水凝胶,记为Gln-G。
以上实施例1-3制备得到的多糖基水凝胶ARG、Arg-G、Gln-G的形成结构图如图1所示,其中Riclin/Glycline为胞外多糖riclin和甘氨酸的混合溶液,可以看出,直接将胞外多糖riclin和甘氨酸在溶液中混合,无法成胶。
对以上实施例得到的水凝胶的性能进行测试,具体方法以及测试结果如下:
1、抗压性能
取直径8mm,高度10mm的圆柱形水凝胶样品,将不同的水凝胶样品放在带有100N称重传感器(Instron4202,Instron,USA)的万能试验机的样品台上,并在极限应变下进行压缩测试,固定在80%。在压缩载荷下,万能试验机结果如图2所示。
可以看出,实施例1得到的水凝胶ARG最大承受压力也可达200千帕,而Arg-G和Gln-G分别为4和6千帕,由于数值太小,未在图中显示。ARG水凝胶与已报道的其他多种水凝胶相比,具有良好的抗大变形韧性和较高的抗压强度,符合作为水凝胶敷料的韧性要求。实施例2和实施例3分别采用精氨酸和谷氨酰胺虽然也能与醛基化改性的胞外多糖riclin成胶,但是得到的水凝胶的抗压性能与实施例1得到的ARG水凝胶相差甚远,无法满足水凝胶敷料的韧性要求。
2、机械性能和粘附性能
图3(a)展示了实施例1得到的水凝胶ARG具有良好的可按压性能。
在流变水平上检测水凝胶其自愈合特性,其结果如图3(b)所示,可以看出,当应变达到676%时,水凝胶的G′等于G″,说明在该应变下,水凝胶处于固体和液态之间;随后,通过使用连续的阶梯式应变试验,进行了水凝胶的自恢复能力测试,结果如图3(c)所示,可以看出在1000%的应变下,G′从15.85Pa显著降低到4.46Pa,水凝胶网络被证明会崩溃。在第二个1%的小应变时,G′恢复到13.18Pa,表明水凝胶的大部分交联网络已经恢复。经过4次高应变和低应变循环测试,愈合后的水凝胶显示出与第一个循环相似的G′和G″值,证实了水凝胶的良好自愈合性能。
同时我们还做了猪皮粘附实验如图3(d)所示,通过弯曲、折叠和垂直实验,水凝胶ARG不脱落,表明水凝胶ARG对猪皮有很好的粘附性,符合粘附性要求。
3、抗菌性能
对实施例1得到的水凝胶ARG对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌功能进行测试,观察抑菌圈的产生和稀释涂布后菌落平板生长情况。
采用抑菌环试验法中,将初始浓度为1×107CFU·mL-1的革兰氏阴性大肠杆菌,革兰氏阳性金黄色葡萄球菌悬液分别涂在培养皿中的Luria-Bertani(LB)琼脂培养基上。取直径为1cm的20mg的圆柱状水凝胶ARG,然后分别放置在含有大肠杆菌,金黄色葡萄球菌的LB琼脂培养基上,37℃孵育24h后,观察抑菌环的的生成。
使用稀释涂布平板法,采用LB液体培养基,将冷冻干燥的圆柱状水凝胶与浓度为1×106CFU·mL-1的革兰氏阴性大肠杆菌,革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的菌悬液(5mg/ml)37℃孵育12h,抽取100ul共混菌悬液,将共混菌悬液稀释1000倍,取100ul稀释菌液涂在培养皿中的Luria-Bertani(LB)琼脂培养基上,在37℃下孵育24h后,观察菌落生长情况。
结果如图4所示,在抑菌环实验中观察到水凝胶组较blank组和阳性对照组出现明显抑菌圈,图4所示在使用稀释涂布平板实验中,观察到水凝胶共培养之后产生的菌落数量明显低于blank组和阳性对照组。表明水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都发挥出明显的抑制作用,在实际应用中具有良好的抗菌性能。
4、止血功能
对实施例1得到的水凝胶ARG在大鼠肝出血模型中止血能力进行测试。
将雄性SD大鼠(250g左右),用水合氯醛(10%浓度,1mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠,完全麻醉,在胸部区域切开上覆肌层暴露肝脏,肝脏做十字切口造成出血,将水凝胶手动按压在伤口上,止血成功后,结束压迫,这段按压期为材料的止血时间,移除手部压力再观察,记录时间观察伤口情况。出血5-10min后将材料从伤口上移除,观察肝脏切口处情况,同时记录失血量,止血过程由相机记录,其余用市面上止血水凝胶处理进行对比。
结果如图5(b)、5(c)所示,可以看出,该水凝胶在相对低用量的情况下的失血量维持在1g以下,压迫止血时间降低至200s左右。
5、生物相容性
对实施例1得到的水凝胶ARG生物相容性进行测试,具体为:
收集500μl大鼠血液并在4℃,3500rpm下离心5分钟。将下部红细胞再离心3次,并用5mL PBS重悬。然后,将250mg水凝胶样品与1mL红细胞在室温下在管中混合4小时。实验中还包括阴性对照(PBS)和阳性对照(水),以计算溶血程度。将所有样品以3500rpm离心5分钟,取上溶液以通过酶标仪检测545nm处的吸光度。根据不同浓度的溶血率,绘制水凝胶的溶血示意图,如图6(a)所示,可以看出,水凝胶ARG有着良好的血液相容性,溶血率低于10%,几乎不会对红细胞产生有害作用。
使用HUVEC细胞进行活/死染色,将其接种到6孔板中。简而言之,细胞粘附在板上12小时后,将细胞与水凝胶提取物孵育48小时。接下来,用Calcein-AM/PI染料染色细胞25分钟,并在荧光显微镜(Olympus IX71,日本)下观察PI和Calcein-AM的激发/发射波长分别为530/580nm和490/515nm。所有实验一式三份进行。体外细胞共培养实验如图6(b)所示,可以看出水凝胶ARG对细胞无害,具有优良的生物相容性。
6、伤口修复功能
对实施例1得到的水凝胶ARG的伤口修复性能进行测试,使用大鼠模型评估伤口敷料的伤口愈合性能,具体为:
使用每只大鼠重约200克的64只雄性SD大鼠进行实验,由江苏省扬州大学动物中心提供。在实验前,动物在标准动物实验室条件下适应环境7天。通过肌内注射10%水合氯醛以300mg kg-1体重的剂量麻醉动物。剃除大鼠背部区域的皮肤并用70%乙醇消毒,然后使用无菌手术剪刀切断皮肤,形成约1cm2的全层伤口。将大鼠随机分为四组。对不同组别分别予以生理盐水、纤维素水凝胶、海藻酸盐水凝胶和水凝胶ARG,然后,用无菌纱布覆盖它们,并用弹性粘性绷带固定,以防止大鼠移位或剥离敷料。所有的动物都被关在空调房的单独笼子里,用商业老鼠的食物和水喂它们,直到它们被处死。每隔两天给大鼠更换新的敷料,并拍摄了伤口的宏观照片。伤口减少的百分比根据以下公式计算:
伤口愈合率(%)=(A0-At)/A0×100%
伤后第0、3、5、7、9、11、13天的典型图像、伤口愈合的动态图示以及伤口闭合情况的数据统计如图7所示。从伤口愈合的照片中可以得出水凝胶ARG促进愈合的效果非常良好,图7(c)也显示水凝胶ARG的伤口愈合效果基本可达100%,同时我们也对市面上已有的多糖水凝胶伤口敷料:CMC(纤维素)水凝胶和Alg(海藻酸银水凝胶)进行了动物实验,结果如图7(a)所示。可以看出,两款水凝胶都有促进伤口愈合的效果,其中海藻酸银水凝胶促进伤口愈合的效果显著,但通过数据定量分析显示海藻酸银水凝胶对伤口愈合的促进作用仍不敌水凝胶ARG。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多糖基水凝胶的制备方法,其特征在于,包括:将醛基化改性的胞外多糖riclin与氨基酸在溶液中反应,得到多糖基水凝胶。
2.根据权利要求1所述的多糖基水凝胶的制备方法,其特征在于,氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸中至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的多糖基水凝胶的制备方法,其特征在于,氨基酸与醛基化改性的胞外多糖riclin的摩尔比为1:2~2:1;优选地,在水溶液中反应,醛基化改性的胞外多糖riclin浓度为0.1-5%。
4.根据权利要求1-3任一项所述的多糖基水凝胶的制备方法,其特征在于,将醛基化改性的胞外多糖riclin与氨基酸在水溶液中搅拌反应,反应温度为0-60℃,搅拌速度为0-1000rpm。
5.根据权利要求1所述的多糖基水凝胶的制备方法,其特征在于,将胞外多糖riclin溶于水中,加入氧化剂进行氧化反应,得到醛基化改性的胞外多糖riclin;优选地,氧化剂选自高碘酸盐、次氯酸盐、过氧化氢中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的多糖基水凝胶的制备方法,其特征在于,氧化反应是在pH为7-9、避光、15-30℃的条件下搅拌反应2-12h;优选地,氧化反应后加入还原剂终止反应;还原剂为乙二醇或丙三醇。
7.根据权利要求5或6所述的多糖基水凝胶的制备方法,其特征在于,氧化反应终止后,进行透析、冷冻干燥,然后加热溶解。
8.根据权利要求7所述的多糖基水凝胶的制备方法,其特征在于,所述透析是采用截留分子量为500-14000Da的透析袋透析0.5-2天,透析时每3-8h换一次水;所述冷冻干燥包括先降温至-(60-80)℃,再降压至0-0.1kPa,在该温度和压强下冻干24-48h。
9.一种多糖基水凝胶,其特征在于,采用权利要求1-8任一项方法制备得到。
10.权利要求1-8任一项方法制备得到的多糖基水凝胶在组织创伤止血、组织创伤修复或组织创伤抑菌制品中的应用。
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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CN118324937A true CN118324937A (zh) | 2024-07-12 |
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