CN118308238A - 一种枯草芽孢杆菌及其在防腐保鲜中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及其在防腐保鲜中的应用。所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BB68，保藏编号为CCTCC NO:M 2023633，能有效抑制常见的腐败霉菌和致病菌，可添加到发酵饲料中用于防霉脱毒，或用于水果采前采后的防霉保鲜处理，有利于延长保质期，增加经济效益，应用前景广泛。
Description
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其在防腐保鲜中的应用。
背景技术
随着养殖行业的快速发展，饲料原料的紧缺，抗生素残留等问题日益凸显。生物发酵饲料随着饲料工业以及养殖技术的发展应运而生，目前已成为养殖饲喂的主要原料来源之一。同时生物发酵饲料可以减少动物的疾病发生，对饲料减抗替抗以及健康绿色的动物养殖也有着至关重要的位置，越来越受到行业的关注与信赖。随着发酵饲料的使用越来越广泛，也慢慢显现出越来越多的问题。其中发酵饲料其高水分状态下，很容易受到霉菌细菌的滋生，导致发霉发臭的现象，饲喂后严重影响动物的健康。因此解决发酵饲料高水分发酵、贮存、使用过程中容易产生的腐败问题亟需被解决。
饲料通过控制水分、温度等条件添加发酵剂生产发酵饲料，其营养成分、适口性等提高，但是高湿水分及易滋生霉菌细菌，腐败后其营养成分下降，毒素含量超标，适口性变差，一旦饲喂会造成动物不同程度的损伤，甚至还会危害食品安全。因此饲料中会额外添加酸化剂等防霉剂，也取得了很好的防霉效果。张傲然等人提供了一种复合型酸化剂用于饲料防霉，特别是在湿基发酵饲料中具有优秀的防霉效果。但酸化剂增加除了增加成本外也会导致动物消化粘膜损伤。
枯草芽孢杆菌作为一种饲料添加剂，常添加在饲料中用于替代抗生素，改善动物消化利用率等。目前也在发酵饲料中广泛应用。通过筛选出能够广谱抑制饲料中腐败真菌和细菌的有益微生物，添加到饲料发酵或者饲料贮存中，可以有效提高饲料的贮存以及发酵饲料保存时间。因此通过筛选添加防霉抑菌的功能性芽孢杆菌来降低饲料发酵以及贮存的腐败程度具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其在防腐保鲜中的应用。所述枯草芽孢杆菌能够广谱抑制饲料中常见的腐败霉菌、致病菌，以及水果中常见的腐败霉菌，广泛用于饲料和农产品的防腐保鲜，应用前景广泛。
本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌BB68(Bacillussubtilis BB68)，已于2023年4月26日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2023633。
本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在发酵饲料生产中的应用。
本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在防腐保鲜剂生产中的应用。
本发明还提供了一种微生物制剂，包含上述枯草芽孢杆菌BB68。
所述微生物制剂还包含芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌中的任意一种或多种的组合。
所述的芽孢杆菌优选枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌。
所述的乳酸菌优选植物乳杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、布氏乳杆菌或戊糖片球菌。
所述微生物制剂中枯草芽孢杆菌BB68的活菌量不低于109CFU/g。
本发明还提供了所述微生物制剂在发酵饲料生产中的应用。
本发明还提供了所述微生物制剂在饲料或农产品防腐保鲜中的应用。
本发明筛选的枯草芽孢杆菌BB68能有效抑制霉变饲料中常见的卷枝毛霉、禾谷镰刀菌、米根霉、白地霉、红曲霉、烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉等8种腐败霉菌，其中对黄曲霉、黑曲霉、禾谷镰刀菌、卷枝毛霉的抑制效果最强，抑制带宽度均超过20mm；并能显著抑制饲料中常见的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病原菌，抑菌圈直径达到20mm。将该菌接种到发酵饲料中可延长发酵饲料保质期10-20天，具有很好的防腐抑菌保鲜效果，还可以有效提高发酵饲料的营养价值，其中乳酸和小肽的含量比对照组分别提高了12.5-23.5％和77.8-96.4％，效果显著。
枯草芽孢杆菌BB68具有较高的产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶、酸溶蛋白酶能力，尤其是产蛋白酶和纤维素酶能力最强，其水解圈直径分别为35mm和32mm，另外其能够产生丰富的植酸酶和醇溶蛋白降解酶，可用于降解饲料中常见的抗营养因子。丰富的产酶能力有利于该菌株对饲料原料中的蛋白及植物纤维进行有效分解利用，同时也能够降解饲料中植酸、醇溶蛋白等抗营养因子，提高发酵饲料的消化吸收利用率。
枯草芽孢杆菌BB68能够广谱抑制水果中16种常见腐败霉菌，并且抑霉效果显著，其中对胶孢刺盘孢、链格孢、指状青霉、腐霉、灰葡萄孢霉等具有很强的抑制效果，抑制率达到65-97％，抑菌圈直径达到抑菌圈直径达到26-35mm，同时具有较强的产生物膜的能力，能够很好的定植在果面叶面发挥作用。该菌株对水果的防腐保鲜效果显著，能有效延长水果货架期，降低腐烂率和失重率，提高硬度，取得了意料不到的效果。
此外，枯草芽孢杆菌BB68安全性好，不具备细胞毒性，对养殖常用抗生素均敏感，不存在耐药性。还可以与其他芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌组合，添加到饲料中用于防霉脱毒，或用于水果采前采后的防霉保鲜处理，应用前景广泛。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌BB68菌株菌落图；
图2为枯草芽孢杆菌BB68菌株蛋白质谱峰图；
图3为枯草芽孢杆菌BB68基因指纹图谱。
具体实施方式
对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1菌株的分离与筛选
1、样品来源：山东省青岛市即墨区猪养殖现场粪便、饲料原料等。
2、菌株分离与初筛
称取10g粪便或饲料样品装入有无菌玻璃珠和90mL无菌水的250mL锥形瓶中，充分摇匀进行梯度稀释，得到10-4、10-5 2个梯度的稀释液，各取100μL涂布于营养琼脂平板上。置于37℃培养箱中培养，24h后观察生长情况，根据菌落大小、形状和颜色等特征进行分类，挑取芽孢杆菌单菌落进行纯化培养直至获得纯菌落，将其编号并进行液体甘油保种。
3、抑菌菌株复筛
3.1分别将初筛得到的芽孢杆菌接种一环到NB液体培养基，37℃、200r/min摇床中培养24h，获得菌液。
3.2.病原菌的制备
将卷枝毛霉、禾谷镰刀菌、米根霉、白地霉、红曲霉、烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉共8种饲料腐败真菌(分别从腐败饲料中分离纯化鉴定保藏)分别接种于PDA培养基上纯化培养，26℃培养5天后备用。
3.3平板抑菌试验
分别将初筛得到的芽孢杆菌接种一环到NB液体培养基，37℃、200r/min摇床中培养24h获取芽孢杆菌菌液.采用滤纸片法，在培养基中央接种直径为8mm的病原菌菌饼，将已经灭菌的滤纸片放于菌饼两侧距离培养皿中心30mm处，吸取5uL菌液点到滤纸片上；然后将培养皿放于26℃培养箱中培养，培养4天后观察记录抑菌带的宽度，每种病原菌做三个重复。
申请人经过初筛、复筛，最终获得一株对饲料中常见的8种腐败真菌均具有明显抑制效果的芽孢杆菌，命名为BB68菌株，其对腐败真菌的抑制效果如表1所示。
表1BB68对饲料中8种腐败霉菌的抑制效果
| 腐败病原菌 | 抑菌带平均宽度mm |
| 卷枝毛霉 | 20 |
| 禾谷镰刀菌 | 25 |
| 米根霉 | 15 |
| 白地霉 | 15 |
| 红曲霉 | 14 |
| 黑曲霉 | 20 |
| 烟曲霉 | 18 |
| 黄曲霉 | 20 |
从表1的数据可知，本发明筛选获得的BB68菌株对卷枝毛霉、禾谷镰刀菌、米根霉、白地霉、红曲霉、烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉共8种饲料腐败真菌均有明显的抑制效果，其中对黄曲霉、黑曲霉、禾谷镰刀菌、卷枝毛霉的抑制效果最强，抑制带宽度均超过20mm，取得了意料不到的效果。
实施例2菌株BB68的鉴定
2.1菌落形态鉴定
如图1所示，菌株BB68在营养琼脂培养基上菌落呈圆形，表面隆起有褶皱，边缘整齐，无粘液，不透明，菌落颜色为灰白色；可产生芽孢；芽孢局部呈圆形或近似圆形，革兰氏染色镜检观察为革兰氏阳性。
2.2 16SrRNA分子鉴定
采用试剂盒提取菌株BB68的基因组。然后以该基因组为模板，利用特异性引物对其16S rRNA进行扩增。将扩增得到的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示PCR产物大小为1500bp左右，符合要求。将该PCR扩增产物送测序公司进行测序。测序结果显示，PCR扩增产物的序列为SEQ ID NO:1。将该序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，其与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的相似性达99％。因此，初步确定菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
2.3MALDI-TOF-MS蛋白质谱鉴定
取少量BB68单菌落以薄膜的形式涂布于靶板上；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的裂解液，室温下自然晾干；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干；将样品靶放入质谱仪进行鉴定。鉴定结果显示，BB68菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其蛋白质谱峰图如图2所示。
2.4RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定
根据全自动微生物基因指纹鉴定系统操作说明对菌株BBB68进行了上机鉴定，得到其rRNA基因指纹图，如图3所示。通过与已知标准菌株库指纹图进行比对发现，菌株BB68与枯草芽孢杆菌的相似度高达90％以上，因此，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
综上，申请人利用16S rRNA鉴定、MALDI-TOF-MS蛋白质谱鉴定、RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定三种分子生物学方法对菌株BB68进行鉴定，鉴定结果一致。再结合菌株BB68的菌落形态特征，申请人确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌BB68(Bacillus subtilis BB68)。
申请人已于2023年4月26日将上述枯草芽孢杆菌BB68(Bacillus subtilis BB68)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023633。
实施例3枯草芽孢杆菌BB68的安全性评价
3.1细胞毒性
3.1.1将枯草芽孢杆菌BB688接种于脑心浸液肉汤(BHI)培养基中，30℃培养6h～12h，测定菌量为108CFU/mL以上，13000r/min离心5min，吸取上清液作为供试品备用。
3.1.2检测菌液上清细胞毒性
1)将Vero细胞接种至添加10％胎牛血清的高糖培养基(DMEM)，在24孔板每孔加入500uL 250000个细胞，在培养箱中孵育24小时。
2)将孔内细胞换液，洗涤两次，每孔加入1mL培养基(无血清无双抗)，每孔分别加入100uL、200uL、300uL供试品(菌量为108，每个样品重复3～5个孔)，在培养箱中孵育24～72h，观察孔内细胞状态。
表2枯草芽孢杆菌BB68上清液样品对细胞毒性评价
| 100uL | 200uL | 300uL | |
| BB68上清液 | 无毒性 | 无毒性 | 无毒性 |
由表2可知，枯草芽孢杆菌BB68上清液样品较为安全；以《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株评价指南》标准的三倍浓度加入细胞仍不具备细胞毒性。
3.2耐药性
菌株的耐药性可能会导致生产应用过程中的安全隐患。为防止枯草芽孢杆菌BB68存在耐药性，对其抗生素敏感性进行研究。根据CLSI抗生素敏感试验梯度稀释法确定枯草芽孢杆菌BB68在8种常见抗生素中的最小抑菌浓度(MIC值)，所用抗生素为Sigma标准品，参照EFSA(2012)标准评估BB68对抗生素的敏感程度。具体结果参见表3。
表3 8种抗生素对枯草芽孢杆菌BB68的最小抑菌浓度(MIC值)
注：根据菌株对抗生素敏感性评价标准EFSA(2012)，S表示敏感；R表示耐药。
从表3的结果可知，枯草芽孢杆菌BB68对8种规定抗生素均敏感，不存在耐药性，可以安全应用于饲料及发酵饲料中。
实施例4枯草芽孢杆菌BB68的抑菌能力
4.1枯草芽孢杆菌BB68菌液制备
将枯草芽孢杆菌BB68取1接种环接种到营养肉汤培养基中，37℃，200r/min培养16h，制备成供试菌液，菌量为108-109CFU/ml备用。
4.2枯草芽孢杆菌BB68对饲料腐败病原菌的抑制能力
将饲料中常见的腐败致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等病原菌甘油管接种于营养肉汤培养基中，37℃，200r/min培养16h后备用。然后利用麦氏比浊仪将其浓度控制菌量为107CFU/ml备用。
取无菌平皿，倾注无菌营养琼脂培养基25mL使凝固，取100ul各病原菌菌液均匀涂至营养琼脂平板上。采用打孔法，每个营养琼脂平板上保留4个直径0.9mm的圆孔，将100ul同等浓度的枯草芽孢杆菌BB68菌液接种至圆孔内，于37℃生化培养箱中培养24h，通过测定抑菌圈直径大小(mm)评价枯草芽孢杆菌BB68对上述致病菌的抑菌能力。每种病原菌做三个重复。结果见表4。
表4枯草芽孢杆菌BB68对多种腐败致病菌的抑制效果
| 病原菌 | 抑菌圈直径(mm) |
| 大肠杆菌O1 | 18 |
| 大肠杆菌O2 | 18 |
| 大肠杆菌O5 | 19 |
| 沙门氏菌S.N | 19 |
| 沙门氏菌6553 | 19 |
| 沙门氏菌ATCC | 16 |
| 金黄色葡萄球菌 | 21 |
从表4的结果可以看出，本发明筛选到的枯草芽孢杆菌BB68对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等多种病原菌均具有显著的抑菌效果，尤其是对大肠杆菌O5、沙门氏菌6553、金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径达到21mm，效果非常显著。4.3枯草芽孢杆菌BB68对水果腐败病原菌的抑制能力
将镰刀菌、腐霉菌、灰葡萄孢霉、指状青霉、意大利青霉、链格孢霉、胶孢刺盘孢、扩展青霉、产黄青霉、尖孢枝孢霉、桃吉尔霉、桃褐腐病菌等多种水果腐败病原菌(分别从各类腐败水果中分离纯化鉴定保藏)分别接种于PDA培养基上纯化培养，25℃培养5天后备用。
1、平板对峙法：
以各病原菌为指示菌，菌饼用打孔器取病原菌菌饼，置于平板中间，同一平板只接种一种病原菌，距离菌饼2cm等距离接种5ul处理液，处理组为清水组，处理组为接种枯草芽孢杆菌BB68培养液，测定病原菌菌落半径；
抑菌率＝(对照组病原菌菌落半径-处理组病原菌菌落半径)/(对照组病原菌菌落半径-初始病原菌菌饼半径)。
2、涂布打孔法：
取150ul 10倍稀释的病原菌均匀涂至营养琼脂平板上，每个营养琼脂平板上保留4个直径0.9mm的圆孔，将100ul同等浓度的枯草芽孢杆菌BB68菌液接种至圆孔内，28℃培养3天后测定抑菌圈直径大小。每种病原菌做三个重复。
抑菌结果见表5和表6。
表5枯草芽孢杆菌BB68对水果腐败霉菌的抑菌率
| 病原菌 | 抑菌率 |
| 腐霉菌 | 77％ |
| 尖孢枝孢霉 | 44％ |
| 桃褐腐病菌 | 65％ |
| 层生镰刀菌 | 58％ |
| 互交链格孢菌 | 67％ |
| 灰葡萄孢霉 | 67％ |
| 桃吉尔霉 | 59％ |
| 桃层生镰刀菌 | 53％ |
| 芒果胶孢刺孢盘 | 97％ |
表6枯草芽孢杆菌BB68对水果腐败霉菌的抑菌效果
从表5和6的结果可以看出，本发明筛选到的枯草芽孢杆菌BB68对多种水果腐败病原菌均具有显著的抑菌效果，尤其是对胶孢刺盘孢、链格孢霉、指状青霉、腐霉菌、灰葡萄孢霉、柑橘互交链格孢菌、指状青霉、番茄尖孢枝胞的抑菌效果最强，抑制率达到65-97％，抑菌圈直径达到26-35mm，效果非常显著。
实施例5枯草芽孢杆菌BB68产生物膜能力
在无菌24孔细胞培养板中，每孔加入2ml过夜培养的枯草芽孢杆菌BB68菌液，空白对照为未加菌液的液体培养基，置于37℃恒温培养箱中静置培养66h，利用结晶紫法定量测定生物膜的形成。
将静置培养66h的细胞培养板小心吸去枯草芽孢杆菌BB68后，用2mL无菌生理盐水漂洗2次，吸出生理盐水，用2mL体积分数99％甲醇冲洗，15min后吸去甲醇，使培养板自然干燥，再用1ml 0.1％结晶紫染液染色5min，吸去多余染液，小心吸出多余结晶紫，蒸馏水多次漂洗生物膜至孔壁和漂洗液不呈现紫色。培养板干燥后，用2mL体积分数33％冰醋酸溶解结合于生物膜的结晶紫染液，稀释10倍，在OD600条件下测定生物膜的吸光度，进而测量枯草芽孢杆菌BB68生物膜的产量。每个处理重复3次。
结果显示，枯草芽孢杆菌BB68具有较强的产生物膜能力，产生的生物膜量OD值达到2.1以上，更有利于枯草芽孢杆菌BB68在叶面果面定植聚集发挥作用。
实施例6枯草芽孢杆菌BB68产酶能力评价
6.1供试菌液的制备
将枯草芽孢杆菌BB68取1接种环接种到NB培养基中37℃，200r/min培养16h，制备成供试菌液备用。
6.2枯草芽孢杆菌BB68产酶能力评价
将培养好的枯草芽孢杆菌BB68的菌液采用打孔法，每个产酶琼脂平板上(含有淀粉的琼脂培养基、含有脱脂奶粉的琼脂培养基、纤维素酶筛选培养基、含有醇溶蛋白琼脂培养基、含有植酸钙琼脂培养基)保留4个直径0.9mm的圆孔，将100ul同等浓度的枯草芽孢杆菌BB68菌液接种至圆孔内，37℃培养48h，可以看到枯草芽孢杆菌BB68周围有透明圈产生，测量透明圈直径，每个重复三次。具体结果见表7。
表7枯草芽孢杆菌BB68多种产酶能力评价
| 酶种 | 透明圈直径(mm) |
| 淀粉酶 | 27 |
| 蛋白酶 | 35 |
| 纤维素酶 | 32 |
| 植酸酶 | 15 |
| 酸溶蛋白酶 | 15 |
从表7可以看出，枯草芽孢杆菌BB68具有较高的产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶、酸溶蛋白酶能力，尤其是产蛋白酶和纤维素酶能力最强，其水解圈直径分别为35mm和32mm，同时其能够产生植酸酶和醇溶蛋白降解酶。丰富的产酶能力有利于该菌株对饲料原料中的蛋白及植物纤维的有效分解利用，同时也能够降解饲料中植酸、醇溶蛋白等抗营养因子。
实施例7枯草芽孢杆菌BB68在发酵豆粕中的应用效果评价
香驰豆粕中添加清水，将水分含量调节至40％水分。
对照组为添加乳酸菌菌粉发酵；处理组为在乳酸菌的基础上添加枯草芽孢杆菌BB68菌粉进行发酵。其中，乳酸菌菌粉和枯草芽孢杆菌BB68接种量均为5×106CFU/g。
将菌粉与豆粕混合均匀后，置于30℃保温发酵3天后结束发酵，并取样测定发酵pH值、乳酸、小肽含量。打开发酵豆粕饲料口开口存放，定期观察发酵豆粕发霉情况，并取样测定。每个处理和对照做三个重复。具体结果见表8和表9。
表8枯草芽孢杆菌BB68对发酵豆粕的有氧稳定性防腐效果
| 存放时间 | 对照组 | 处理组 |
| 0d | — | — |
| 10d | ++ | — |
| 20d | +++ | — |
| 25d | +++ | — |
| 29d | ++++ | — |
| 30d | ++++ | — |
注：—为无霉变、气味正常；+为出现霉变，无霉味；++中度霉变，无霉味；+++中度霉变，有霉味；++++重度霉变，有霉味。
由表8可知，添加枯草芽孢杆菌BB68可以有效提高发酵豆粕的开口稳定性，防止饲料腐败。对照组发酵豆粕第10天即开始发霉腐败，而处理组发酵豆粕存放一个月后仍没有发霉现象。而且，处理组发酵豆粕中大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均未检出。因此，添加枯草芽孢杆菌BB68发酵豆粕，能够有效提高发酵饲料的保质期，对防腐保鲜有非常显著的效果。
表9枯草芽孢杆菌BB68对发酵豆粕营养指标变化
| pH | 乳酸 | 小肽 | |
| 对照组 | 4.7 | 3.4％ | 2.8％ |
| 处理组 | 4.6 | 4.2％ | 5.5％ |
由表9可知，添加枯草芽孢杆菌BB68可以有效提高发酵豆粕的营养价值，其中乳酸和小肽的含量比对照组分别提高了23.5％和96.4％，取得了意料不到的技术效果。
实施例8枯草芽孢杆菌BB68在发酵麸皮中的应用效果评价
麸皮中添加清水，将水分含量调节至40％水分。
对照组为添加乳酸菌菌粉发酵；处理组为在乳酸菌的基础上添加枯草芽孢杆菌BB68菌粉进行发酵。其中，乳酸菌菌粉和枯草芽孢杆菌BB68接种量均为5×106CFU/g。
将菌粉与麸皮混合均匀后，置于30℃保温发酵3天后结束发酵，并取样测定发酵PH值、乳酸、小肽含量、中性洗涤纤维含量。打开发酵麸皮饲料口开口存放，定期观察发酵麸皮发霉情况，并取样测定指标。每个处理和对照做三个重复。具体结果见表10和表11。
表10枯草芽孢杆菌BB68对发酵麸皮的有氧稳定性防腐效果
注：—为无霉变、气味正常；+为出现霉变，无霉味；++中度霉变，无霉味；+++中度霉变，有霉味；++++重度霉变，有霉味。
由表10可知，添加枯草芽孢杆菌BB68可以有效提高发酵麸皮的开口稳定性，防止饲料腐败。对照组发酵麸皮第4天即开始出现发霉腐败，而处理组发酵麸皮在存放10天时仍没有发霉现象，在第14天开始出现轻微腐败现象。同时，处理组发酵麸皮中大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均未检出。因此，添加枯草芽孢杆菌BB68发酵麸皮，能够有效提高发酵饲料的保质期，对防腐保鲜有显著的效果。
表11枯草芽孢杆菌BB68对发酵麸皮营养指标变化
| pH | 乳酸 | 小肽 | 中性洗涤纤维 | |
| 对照组 | 4.4 | 3.2％ | 1.8％ | 39％ |
| 处理组 | 4.2 | 3.6％ | 3.2％ | 32％ |
由表11可知，添加枯草芽孢杆菌BB68可以有效提高发酵麸皮的营养价值，其中乳酸和小肽的含量比对照组分别提高了12.5％和77.8％，中性洗涤纤维含量降低了17.9％，效果显著。
实施例9枯草芽孢杆菌BB68在柑橘果实体内攻毒实验效果评价
柑橘品种为云南皇帝柑，将挑选出无腐烂损伤的柑橘，先用自来水清洗，然后用的0.2％次氯酸钠溶液消毒1分钟后，取出再用自来水冲洗干净，凉干。在果实表面用灭菌后的5mL枪头在赤道处对称打两个5mm宽，3mm深达白皮层的伤口，放置到塑料框中备用室温下放置20min。
9.1病原菌准备
将指状青霉使用血球计数板计数，用无菌水稀释100倍得到105CFU/mL数量级的病原菌孢子悬浮液，其中指状青霉悬浮液孢子数为2×105CFU/mL，意大利青霉孢子数为4×105CFU/mL。
9.2供试样品准备
(1)枯草芽孢杆菌BB68菌液：将枯草芽孢杆菌BB68取1接种环接种到营养肉汤培养基中，37℃，200r/min培养24h，制备成供试菌液，菌液稀释为菌量107～8CFU/ml备用。
(2)咪鲜胺：用于柑橘防腐浸泡化学农药，45％浓度，稀释1000倍备用。
9.3实验设计
实验分别设置清水对照组、枯草芽孢杆菌BB68菌液处理组、咪鲜胺处理组。
各组分别在柑橘伤口处加入20μL供试样品，4h后各注入10μL指状青霉和意大利青霉孢子悬浮液。待水果干后用聚乙烯保鲜袋(0.03mm)密封，在25℃，湿度85％～95％条件下贮藏5d，每组8个柑橘果实，每组三个重复。每天定期观察损伤接种果实的发病情况，用直尺测定发病果实病斑直径，并统计实验结果。
发病率和病情指数根据以下公式计算:
发病率＝(发病果数/检查总果数)×100％。
病情指数＝[Σ(各级病果数×各级代表值)/(调查总果数×最高级代表值)]×100％。
按照果实腐烂部分占总果实的面积将果实分为0～4级，其中，0级果实未腐烂、1级果实腐烂面积比例为1％～25％、2级果实腐烂面积比例为26％～50％、3级果实腐烂面积比例为51％～75％、4级果实腐烂面积比例为76％～100％。
柑橘攻毒实验结果显示，柑橘绿霉病发病率较对照组降低80％以上，病情指数较对照组降低60％以上；青霉病发病率较对照组降低50％以上，病情指数较对照组降低40％以上，并且均显著优于咪鲜胺农药组，取得了意料不到的技术效果。
实施例10枯草芽孢杆菌BB68对平度红灯樱桃的保鲜效果
樱桃品种为平度红灯大樱桃，采摘未经处理、大小一致、9成熟健康樱桃果实，当天采摘运来。
将枯草芽孢杆菌BB68菌粉(活菌量1010CFU/g)加水稀释1000倍后，作为处理组浸泡液；对照组为清水浸泡。
将挑选好的樱桃放入处理组浸泡液中1-2min，放入塑料筐，晾干后外套PE袋扎口，置于25℃常温室内贮存，同时以清水浸泡作为对照。定期统计测定果实腐烂率、失重率指标。每个处理组3个重复，每个重复50果实。
表12枯草芽孢杆菌BB68对平度红灯樱桃的保鲜效果
由表12可知，浸泡枯草芽孢杆菌BB68菌液可有效延长平度红灯大樱桃的保鲜时间，减少贮存过程中的果实腐烂。对照组樱桃在第3天即开始出现腐烂，第7天基本全部腐烂化成水，而浸泡过枯草芽孢杆菌BB68稀释液的处理组樱桃在第7天仍基本没有腐烂，腐烂率较对照组降低了86％以上，防腐保鲜效果非常显著。
实施例11枯草芽孢杆菌BB68对青岛崂山毛桃的保鲜效果
毛桃品种采摘自青岛崂山毛桃采摘未经处理、大小一致、八成熟健康毛桃果实，当天采摘运来。
将枯草芽孢杆菌BB68菌粉(活菌量1011CFU/g)加水稀释1000倍后，作为处理组1浸泡液；对照组为清水浸泡。
将挑选好的毛桃放入处理液浸泡1-3min，放入塑料筐，晾干后外套PE袋扎口，置于25℃常温室内贮存，同时以清水浸泡作为对照。定期统计测定果实腐烂率、失重率、硬度等指标。每个处理组3个重复，每个重复10个果实。
表13枯草芽孢杆菌BB68对青岛毛桃的保鲜效果
从表13结果可以看出，浸泡枯草芽孢杆菌BB68菌液可以有效延长毛桃的常温货架期8-10天。与对照组相比，贮存第14d时，处理组毛桃失重率降低了37.5％,硬度提高了130.8％，腐烂率仅有10％。从而说明，枯草芽孢杆菌BB68对毛桃的防腐保鲜效果非常显著，取得了意料不到的技术效果。
综上所述，本发明所提供的枯草芽孢杆菌BB68可作为饲料防霉菌剂广泛用于饲料贮存以及发酵饲料生产及贮存过程中，能够广谱抑制饲料中常见的卷枝毛霉、禾谷镰刀菌、霉等腐败霉菌以及大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌，同时可产生丰富的分解酶，可有效提高饲料在发酵过程以及开口贮存过程防腐保鲜效果，同时提高发酵饲料的消化利用率。所述枯草芽孢杆菌BB68还可作为微生物保鲜菌剂广泛用于水果的采前和采后贮藏保鲜过程中。该菌能够广谱抑制水果中16种常见腐败霉菌，并且抑霉效果显著，其中对胶孢刺盘孢、链格孢、指状青霉、腐霉、灰葡萄孢霉等具有很强的抑制效果，抑制率超过65％，同时具有较强的产生物膜的能力，能够很好的定植在果面叶面发挥作用。所述枯草芽孢杆菌BB68可以与其他芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌组合，添加到饲料中用于防霉脱毒，或用于水果采前采后的防霉保鲜处理，应用前景广泛。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2023633。
2.权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌在发酵饲料生产中的应用。
3.权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌在防腐保鲜剂生产中的应用。
4.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。
5.如权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂还包含芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌中的任意一种或多种的组合。
6.如权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌中的任意一种或多种的组合。
7.如权利要求6所述的微生物制剂，其特征在于，所述的乳酸菌为植物乳杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、布氏乳杆菌、戊糖片球菌中的任意一种或多种的组合。
8.如权利要求4所述的微生物制，其特征在于，所述微生物制剂中枯草芽孢杆菌活菌量不低于109CFU/g。
9.权利要求4-8任一所述的微生物制剂在发酵饲料生产中的应用。
10.权利要求4-8任一所述的微生物制剂在饲料或农产品防腐保鲜中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202311856558.5A CN118308238A (zh) | 2023-12-29 | 2023-12-29 | 一种枯草芽孢杆菌及其在防腐保鲜中的应用 |
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Publications (1)
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Country Status (1)
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2023
- 2023-12-29 CN CN202311856558.5A patent/CN118308238A/zh active Pending
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