CN118304438A - 一种SCOF-Ru生物酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种SCOF‑Ru生物酶及其制备方法和应用，属于生物催化剂领域。SCOF‑Ru是由SCOF与钌盐加入甲醇溶液中反应得到一种纳米仿酶催化剂，具有六角形的蜂窝结构，其核心为具有Ru‑N2O2活性中心，中心具有卟啉样结构，Ru元素均匀分散其中。本发明还公开了所述SCOF‑Ru生物酶的制备方法，制备方法为：将SCOF与钌盐加入甲醇溶液中反应12~72h得到。本发明所述SCOF‑Ru具有POD、OXD活性和清除ROS的活性，具有放射增敏性和免疫增敏性，可以广泛的应用在肿瘤免疫中。

Description

一种SCOF-Ru生物酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物催化剂领域，特别涉及一种SCOF-Ru生物酶及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是世界范围内导致死亡的主要原因。值得注意的是，放射治疗（RT）是实体瘤的标准治疗策略，它可以通过高能电离辐射和水放射性溶解产生的活性氧（ROS）直接破坏癌细胞的双链DNA。然而，由于辐射能吸附量低、微环境缺氧、肿瘤微环境（TME）。此外，转移预示着癌症患者的不良临床结局。虽然放射治疗在照射范围内可以激活局部免疫反应，但在抑制转移部位生长方面的治疗效果有限。新出现的证据表明，放射治疗与免疫治疗相结合的临床价值将激活全身免疫反应，并有助于杀死循环癌细胞和转移部位。然而，低反应率损害了这些治疗方式在转移性癌症中的治疗效果。因此，有必要合成新型多功能放射免疫增敏剂，在肿瘤中沉积辐射能量，缓解肿瘤缺氧，表现出较强的体外记忆效应，激活较强的全身免疫反应，在毒性作用有限的情况下有效消灭癌细胞。这将为癌症患者的临床治疗决策带来新的见解，特别是对有转移的晚期癌症。
尽管放射动力学治疗（RDT）在肿瘤学中具有转化潜力，但现在的放射增敏材料大多为无机纳米颗粒。它们的放射功能与生物标志物无关，并且一直处于开启状态，因此癌症的检测和治疗效果严重依赖于肿瘤与正常组织之间的浓度差异，导致特异性较差。与无机纳米颗粒相比，有机分子保持明确的结构，可以促进生理特性的精确控制。共价有机框架（COFs）是一类晶体多孔框架纳米材料，具有独特的性质，如层状结构、结构可调节性、合成模块化、永久多孔性和多功能性，适用于癌症治疗。然而，有机分子通常包含轻原子（如氢、碳和氧）和弱自旋轨道耦合。
发明内容
针对上述缺陷，本发明提供了一种SCOF-Ru生物酶，SCOF-Ru是由SCOF与钌盐加入甲醇溶液中反应得到的一种纳米仿酶催化剂，具有六角形的蜂窝结构，SCOF-Ru具有Ru-N2O2活性中心，所述活性中心具有卟啉样结构，Ru元素均匀分散在SCOF-Ru中。其中，SCOF 是具有Salphen配位结构的COF共价有机框架材料，以2,3,6,7,10,11-六氨基三苯六盐酸盐和2-羟基间苯二甲醛(DFP)为原料构建SCOF。本发明所述SCOF-Ru具有POD、OXD活性和清除ROS的活性，具有放射增敏性和免疫增敏性，可以广泛的应用在肿瘤免疫中。
本发明的技术方案：
本发明要解决的第一个技术问题是，提供了一种SCOF-Ru生物酶，所述SCOF-Ru是由SCOF与钌盐加入甲醇溶液中反应得到，所述SCOF以2,3,6,7,10,11-六氨基三苯六盐酸盐和2-羟基间苯二甲醛为原料制备得到。
进一步，所述SCOF-Ru为六角形的蜂窝结构。
进一步，所述SCOF-Ru具有Ru-N2O2活性中心，所述Ru-N2O2活性中心具有卟啉样结构，Ru元素均匀分散在SCOF-Ru中。
进一步，所述SCOF-Ru中，Ru被亚胺和羟基配位，亚胺基的N和O形成的Ru-Nx/Ru-Ox配位，亚胺通过C=N键连接COF。
进一步，SCOF骨架中具有N,N,O,O-四齿双希夫碱结构特征。
进一步，COF骨架上没有明显的金属团簇或纳米颗粒，并发现C、N、O和Ru均匀分布。
进一步，所述SCOF-Ru为纳米级材料。
进一步，所述SCOF-Ru具有POD活性。
进一步，所述SCOF-Ru具有OXD活性。
进一步，所述SCOF-Ru还具备清除ROS的活性。
在SCOF-Ru的二维周期性中，原子序数较高的Ru原子的均匀分散增加了 X射线的沉积，从而促进了电离辐射诱导自由基的产生。四齿双希夫碱基位置协调两个Ru原子作为高效的模拟活性中心，极大地促进活性氧（ROS）的产生，辅助电离辐射促进肿瘤细胞的死亡。其多功能酶样活性可以阻止受损DNA的修复，缓解低氧免疫抑制肿瘤微环境（TME），并产生ROS诱导细胞凋亡，使放疗增敏效应增强。
本发明要解决的第二个技术问题是提供上述SCOF-Ru生物酶的制备方法，所述制备方法为：将SCOF与钌盐加入甲醇溶液中反应得到。
进一步，所述SCOF与钌盐的重量比为1:10~2:1，优选1:4。
进一步，所述钌盐为三氯化钌、三氯化钌水合物、二氯化钌、氧化钌、水合氧化钌、氯钌酸钠或氯钌酸铵中的至少一种；优选为三氯化钌或三氯化钌水合物中的至少一种。
进一步，所述反应在室温条件下进行，反应时间为12~72h，优选72h。
进一步，所述制备方法为：室温下，将SCOF加入到钌盐的甲醇溶液中，搅拌3天。将深棕色沉淀物离心后收集，用甲醇洗涤12 h，确保完全去除残留的钌盐，然后在真空下干燥，即得。
进一步，所述SCOF采用下述制备方法制得：将三乙胺加入2,3,6,7,10,11-六氨基三苯六盐酸盐的甲醇溶液中，在惰性气氛中加入2-羟基间苯二甲醛溶液，反应后冷却、过滤、沉淀、洗涤、干燥即得。
作为优选方案，SCOF的制备方法为：将三乙胺（Et3N）（25%，1 mL）加入HATP·6HCl（50 mg, 0.095 mmol）的甲醇溶液中，在氩气中80℃搅拌20 min，然后加入2-羟基间苯二甲醛 （DFP） （145 mg 0.95 mmol）溶液。反应24h，冷却至室温后，过滤沉淀，用N、N-二甲基甲酰胺、丙酮和四氢呋喃洗涤。该固体在60°C的真空烘箱中干燥，得到深棕色粉末的SCOF。
本发明要解决的第三个技术问题是提供所述SCOF-Ru生物酶用于制备清除ROS材料的用途。
本发明要解决的第四个技术问题是提供所述SCOF-Ru生物酶用于制备放射性增敏剂的用途。
本发明要解决的第五个技术问题是提供所述SCOF-Ru生物酶用于制备免疫佐剂的用途。
RNA-seq分析表明，SCOF-Ru可以下调钙信号通路，抑制放疗诱导的癌细胞增殖并增强其凋亡。此外，SCOF-Ru为基础的RT通过募集不同的细胞毒性免疫细胞，诱导巨噬细胞的促炎M1极化，减少CD8+ PD-1+细胞的比例协同免疫治疗，可以强烈抑制远处肿瘤的生长，诱导转移性癌细胞的ICD。多功能新型放射增敏剂SCOF-Ru可能在未来的临床转化中具有很大的潜力，实现可激活的多维放射免疫动态肿瘤治疗。
本发明具有如下有益效果：
本发明生物酶制备方法简单，得到的SCOF-Ru，元素Ru均匀分散的在SCOF-Ru周期框架中，具有POD和OXD活性，还具备清除ROS的活性。SCOF-Ru可以有效地吸收辐射产生•OH，并且由于其高度共轭的结构，辐射诱导光动力治疗不仅有效地增加了光生电荷进入表面氧化还原反应中心的通道，阻止了光激子的重组。辐射产生的光电子的非弹性散射将能量转移到COF共轭框架中Ru-N2O2的活性中心，可以有效地产生高毒性自由基1O2，因此，SCOF-Ru可以有效减少RT-PDT引起免疫原性细胞死亡（ICD）和局部炎症，促进肿瘤抗原呈递，当与PD-1抑制剂联合使用时，触发T细胞扩增和浸润，触发全身抗肿瘤免疫。具备广泛的应用场景。
附图说明
图1 a）SCOF-Ru 的合成方案图；b）AA堆叠的SCOF-Ru 的PXRD图；c）AB堆叠的SCOF-Ru 的PXRD图；d）SCOF-Ru 的HRTEM图；e）对应的放大HRTEM及虚线边界区域；f ）AC-HAADF-STEM图像下SCOF-Ru 的13C核磁共振（NMR）光谱图；g）AC-HAADF-STEM图像下SCOF-Ru 的傅立叶变换红外光谱（FTIR）图。
图2 a）SCOF-Ru 的HAADF STEM图像和对应的EDS图谱；b）SCOF和SCOF-Ru 的N1sXPS光谱； c）SCOF和SCOF-Ru 的O 1s光谱；d）Ru的 3p光谱。
图3 a）在SCOF-Ru 和H2O2存在下，通过基于TMB的紫外-可见光谱分析得出POD模拟活性（***p<0.001）；b）SCOF-Ru 的OXD模拟活性（***p<0.001）； c）ESR光谱显示DMPO捕获的•OH ；d）ESR光谱显示DMPO捕获的•O2 -；e）ESR光谱显示TEMP捕获的1O2；f）SCOF-Ru的Km和Vmax；g）SCOF-Ru的Vmax和其他最近报道的催化剂的Vmax的比较；h）SCOF-Ru的TON值与其他最近报道的催化剂的TON值的比较；i）NIST中Ru和H2O的质量衰减系数；j）X射线下模拟POD活性与SCOF、RuCl3和SCOF-Ru的比较；k）X射线下标准化的OXD模拟活性，SCOF、RuCl3和SCOF-Ru的比较；l）2'，7'-二氯二氢荧光素双醋酸酯X射线照射下ROS的产生。
图4为SCOF-Ru体外 X射线照射的治疗效果图，其中：a）不同处理SCC-7细胞中活性氧（ROS）生成的荧光图像；b）不同处理的SCC-7活细胞和死细胞的荧光图像；c）不同处理SCC-7细胞中γ-H2A X表达水平的荧光图像；d）不同X射线照射剂量下SCC-7细胞的集落形成; e）不同处理下SCC-7细胞的伤口健康（0 h， 24 h， 36 h）；f）transwell试验相应的细胞迁移；g）不同处理下线粒体活性的荧光图像，比例尺= 100 µm；h）实验示意图；其中，G1：空白，G2：SCOF，G3：SCOF-Ru，G4：X-ray，G5：SCOF-X-ray，G6：SCOF-Ru-X-ray。
图5为低剂量 X射线照射SCOF-Ru的体内抗肿瘤作用图，其中a）各组携带CT26肿瘤小鼠的肿瘤生长曲线（n = 5）；b）各组携带CT26肿瘤小鼠的肿瘤生长曲线；c）治疗后第12天各组肿瘤的代表性照片；d）各组治疗后第12天的平均肿瘤重量；e）各组经不同处理后的生存模式；f）不同处理后对应肿瘤的代表性H&E染色及免疫组化图像，比例尺= 100µm；g）不同处理后对应肿瘤的TUNEL和HIF-1α免疫荧光图像，比例尺为 50µm。
图6 为X射线照射SCOF-Ru 诱导的免疫应答和记忆效应图，其中：a）活的和死的肿瘤间淋巴细胞的流式细胞术；b）CD4+和CD8+肿瘤间淋巴细胞的流式细胞术；c） CD206+和CD86+肿瘤间淋巴细胞的流式细胞术；其中，G1：空白，G2：SCOF-Ru，G3：X-ray，G4：SCOF-Ru-X-ray。
图7为 SCOF-Ru X射线照射诱导的免疫协同效应图，其中：a）实验时间表显示了实验的设计；CT26肿瘤模型建立及瘤间给药后的治疗方案示意图；b）治疗后第10天各组原发及远处肿瘤的代表性照片；其中，G1：空白，G2：SCOF-Ru-αPD-1，G3-X-ray，G4：αPD-1-X-ray，G5：SCOF-Ru-X-ray，G6：SCOF-Ru-αPD-1-X-ray。
图8为 SCOF-Ru X射线照射诱导肿瘤免疫微环境的体外效应图，其中：a） CD4+和CD8+肿瘤间淋巴细胞的流式细胞术；b） CD69+瘤间淋巴细胞流式细胞术；c） CD206+和CD86+肿瘤间淋巴细胞的流式细胞术；d） CD8+PD-1+肿瘤间淋巴细胞。
图9 a）为SCOF的SEM图（比例尺10μm）；b）为SCOF的SEM图（比例尺5μm）；c）为SCOF-Ru的SEM图（比例尺10μm）。
图10a）为SCOF的BET图；b）为SCOF-Ru的BET图。
图11为SCOF-Ru（N）的EDX映射图。
图12 a) 为SCOF-Ru和 SCOF-Ru+X-ray 的羟基自由基ESR测试性能图；b）为SCOF-Ru和 SCOF-Ru+X-ray的超氧阴离子ESR测试性能图；c) 为SCOF-Ru和SCOF-Ru+X-ray的单线态氧ESR测试性能图。
图13 a）为SCOF-Ru 在HUVEC细胞中的24小时后细胞毒性图；b）为 SCOF-Ru 在HUVEC细胞中的48小时后细胞毒性图；实验独立重复了三次，结果相似，结果以均数±SD表示，统计学显著性采用学生t检验计算；*: p<0.05，**: p<0.01;* * *: p<0.001。
图14为 Annexin V-FITC/PI分析SCC-7和CT26细胞与1640培养基RuCl3或COF-Ru在X射线照射（6 Gy）下孵育后细胞凋亡。
图15不同处理CT26细胞活性氧（ROS）生成的荧光图。
图16 a）不同处理CT26细胞在不同时间点（0 h、18 h、24 h）的创面健康测试；b）不同处理CT26细胞的Tranwell试验；c）相应的细胞迁移比例，结果以均数±SD表示，实验独立重复了三次，结果相似，统计学显著性采用学生t检验计算；*: p<0.05, **: p<0.01; ***:p<0.001。
图17不同处理的SCC-7和CT26细胞线粒体膜电位的流式细胞术。
图18肿瘤间注射SCOF-Ru后，观察结束时处死小鼠的心、肝、脾、肺、肾的H&E染色,标尺尺寸为50 μm。
具体实施方式
本发明通过将SCOF加入到钌盐的甲醇溶液中，制备得到SCOF-Ru生物酶（SCOF-Ru），SCOF-Ru是一种纳米仿酶催化剂，具有六角形的蜂窝结构，其核心为具有Ru-N2O2活性中心，中心具有卟啉样结构，Ru元素均匀分散，Ru被亚胺和羟基配位，亚胺基的硝基N和羟基O形成的Ru-Nx/Ru-Ox配位。本发明所述SCOF-Ru具有POD、OXD活性和清除ROS的活性，可以广泛的应用在肿瘤免疫中。
进一步，本发明还提供上述SCOF-Ru生物酶的制备方法，所述制备方法为：将SCOF与钌盐加入甲醇溶液中反应得到。
进一步，所述制备方法为：室温下，将SCOF加入到钌盐的甲醇溶液中，搅拌3天。将深棕色沉淀物离心后收集，用甲醇洗涤12 h，确保完全去除残留的钌盐，然后在真空下干燥，即得。
进一步，所述SCOF制备方法为：将三乙胺（Et3N） （25%，1 mL）加入HATP·6HCl （50mg, 0.095 mmol）的MeOH溶液中，在Ar中80℃搅拌20 min，然后加入2-羟基间苯二甲醛（DFP） （145 mg 0.95 mmol）溶液。反应24h，冷却至室温后，过滤沉淀，用N、N-二甲基甲酰胺、丙酮和四氢呋喃洗涤。该固体在60°C的真空烘箱中干燥，得到深棕色粉末的SCOF。
SCOF-Ru可以有效减少RT-PDT引起免疫原性细胞死亡（ICD）和局部炎症，促进肿瘤抗原呈递，当与PD-1抑制剂联合使用时，触发T细胞扩增和浸润，触发全身抗肿瘤免疫。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
材料和试剂：
合成用于ROS生物催化的仿血红素人工酶所用溶剂均为分析试剂（AR），无需进一步纯化。这项工作中使用的水是用milliq净化系统净化的。水合物氯化钌（III）和三乙胺购自Aladdin公司。在此基础上，从郑州阿尔法化工有限公司得到了2,3,6,7,10,11-六氨基三苯六盐酸盐（HATP·6HCl）。
实施例1 SCOF和SCOF-Ru的制备
SCOF的合成：
将三乙胺（Et3N）（25%，1 mL）加入HATP·6HCl （50 mg, 0.095 mmol）的MeOH溶液中，在Ar中80℃搅拌20 min，然后加入2-羟基间苯二甲醛 （DFP）（145 mg 0.95 mmol）溶液。反应24 h，冷却至室温后，过滤沉淀，用N、N-二甲基甲酰胺、丙酮和四氢呋喃洗涤。该固体在60°C的真空烘箱中干燥，得到深棕色粉末的SCOF。
SCOF-Ru 的合成：
室温下，将SCOF （50 mg）加入到RuCl3·xH2O（200 mg）的MeOH （100 mL）溶液中，搅拌3天。将深棕色沉淀物离心后收集，用MeOH洗涤12 h，确保完全去除残留的RuCl3，然后在真空下干燥，得到SCOF-Ru。合成路线图见图1a。
试验例1 材料形态与结构表征
方法：
固态核磁共振光谱在布鲁克AV400光谱仪上测量，工作频率为75.5 MHz，温度为13ºC。对SCOF-Ru的13C交叉极化魔角自旋光谱进行了研究。采用Nicolet-560分光光度计（Nicol, US）对样品在4000 ~ 500 cm-1范围内进行傅里叶变换红外（FT-IR）光谱分析，分辨率为2 cm-1。在激发波长为633 nm的Horiba Jobin Yvon LabRam HR800上记录了拉曼光谱。对波长为300 ~ 900 nm的岛津V-2450进行了紫外-可见吸收光谱分析。采用He I （21.2eV）辐射采集紫外光电子能谱（UPS），测定其电子结构。采用X射线光电子能谱仪（XPS,escal250）对其成分进行了检测。扫描电镜（SEM）图像由Apreo S HiVoc （Thermo FisherScientific, FEI）获得。使用JEM-ARM200F透射电子显微镜，在200 keV下工作，配备探针球差校正器，获得样品的HAADF-STEM图像。透射电子显微镜（TEM）图像和能谱图通过200 kV的Talos F200X TEM显微镜（FEI Ltd, USA）获得。在电压为40 kV的Cu辐射下，用BRuker D8Focus X射线衍射仪对晶体进行了XRD分析。样品在5°~ 80°的2θ范围内扫描。在荧光模式下，在澳大利亚同步加速器（ANSTO）的X射线吸收光谱束线上记录了X射线吸收光谱（XAS）测量结果。用Si（111）双晶单色仪对辐射进行单色处理。获得的XAFS数据在Athena（版本0.9.26）中处理，用于背景、前边缘线和后边缘线校准。然后在Artemis（0.9.26版本）中进行傅里叶变换拟合。对于小波变换分析，从软件导出的χ（k）被导入到Hama Fortran代码中。参数说明如下：R范围，1-6 Å；K范围，0 - 14 Å-1； K权值，3;采用κ=10， σ=1的Morlet函数作为母小波提供总体分布。在JEOL-FA200型ESR分光光度计上进行ESR实验。荧光测量在日立F-4600荧光分光光度计上进行。
结果：
采用PXRD测量结合计算机模拟对COF的晶体结构进行了表征。如图1b和图1c所示，SCOF在3.95°、4.21°、12.70°、16.30°和25.78°处有明显的衍射峰，对应的hlk值为（100）、（010）、（030）、（400）和（211）。Pawley细化法对AA-堆叠的 SCOF结构进行的精细分析，它提供的晶胞参数a = b = 26.17 Å， c = 6.95 Å， α=β= 90°，γ= 120°。AA-堆叠的 SCOF的（Rwp, Rp）值为（2.71%, 2.15%），证明与实验数据吻合良好。AB-堆叠的 SCOF的（Rwp, Rp）值结构提供的晶胞参数= 26.17 Å， b = 6.78 Å， c = 26.12 Å，α=β= 90°，和γ = 120°。AB-堆叠 SCOF的（Rwp，Rp）值分别为（2.69%, 3.63%）证明与实验数据吻合良好。
随后，通过扫描电镜（SEM）和高分辨率透射电镜（HRTEM）研究了SCOF和SCOF-Ru 的形貌。SEM图像显示，SCOF和SCOF-Ru 具有直径约为250 nm的颗粒状形貌（图9a-9c）。HRTEM图像显示出高度有序的层状结构，对应于PXRD结果中观察到的（100）和（010）平面（图1d）。如图1e所示，HRTEM图像进一步证实了SCOF良好的结晶度和二维周期性。此外，在SCOF中观察到六角形的蜂窝结构，这与PXRD分析和理论模拟结果一致。利用13C固体核磁共振波谱（NMR）（图1f）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）（图1g）表征了SCOF骨架的N,N,O,O-四齿双希夫碱结构特征。13C核磁共振谱在181.3 ppm时显示了C=N键的特征碳信号，证明了亚胺连接COF的成功生成。SCOF的FT-IR光谱显示，醛类的C=O （1682.6 cm-1）伸展带和胺类的N-H（3338.1和3231.1 cm-1）伸展带减弱，表明原料消耗。在1636.3 cm-1处观察到典型的C=N拉伸振动带，表明Ru物质引入COF Salphen结构后，C=N带明显减少，C-O伸缩振动从1253 cm-1转移到1263 cm-1，表明Ru被亚胺和羟基配位。在77 K条件下，通过N2吸附分辨率测量评价了SCOF的多孔结构。SCOF和SCOF-Ru的Brunauer-Emmet- Teller （BET）表面积分别为~334.473和~325.289 m2g-1，孔径分别为~1.69和~1.78 nm（图10a和图10b）。
能量色散 X射线（EDX）作图和扫描电镜作图分析显示，COF骨架上没有明显的金属团簇或纳米颗粒，并发现C、N、O和Ru均匀分布（图2a）。同时获得的电子能量损失谱（EELS）和能量色散 X射线谱（EDS）清晰地显示了C、N和Ru的存在（图2a、图11）。随后，利用 X射线光电子能谱（XPS）研究了Fe的原子比和价态。如图2b所示，SCOF-Ru中Ru（1.2 at%）、N（10.4at%）、O（13 at%）和C（75.4 at%）的原子比表明Ru、O和N的存在（表1 生物催化剂的原子比和原子质量比表），与相应的EDX作图结果一致（表1）。与SCOF相比，SCOF-Ru的高分辨率N 1s和O 1s光谱（图2c）显示，C=N/C-O-H从398.9到399.1 eV/531.7到531.9 eV明显峰移。表明Ru-3p的光谱可以划分为3p1/2和3p3/2区域，是由亚胺基的硝基N和羟基O形成的Ru-Nx/Ru-Ox配位。以3p3/2区域为例，它与位于484.5 eV和462.2 eV的两个主要组分吻合良好，对应Run+（图2d），这表明不存在金属或纳米颗粒物质。研究表明，充分暴露的原子活性金属位点将有利于其生物催化治疗。
表1 生物催化剂的原子比和原子质量比表
试验例2体外性能表征
TMB测定过氧化物酶模拟活性
将SCOF-Ru 溶液（4 mg·mL- 1，25 μL）加入到含有H2O2（0.1 M, 25 μL）和TMB （10mg·ml - 1,24 μL）的NaOAc−HOAc缓冲液（100 mM, pH 4.5）中。用NaOAc - HOAc缓冲液调节混合液最终体积至2 ml;终样品浓度为25 μg/mL。然后，一部分混合物用于紫外可见光谱测量，吸光度为652 nm。
用TMB测定氧化酶（OXD）模拟活性
生物催化剂的OXD样活性测定与POD样活性测定相似，但不添加H2O2作为底物。
试管中ROS的产生
采用2 '，7 ' -二氯二氢荧光素（DCFH）法检测辐照下总ROS生成。将DMSO中的1mlDCFH- da （1mM）用4ml NaOH （0.01 M）溶液在黑暗中水解30分钟，加入20ml PBS （25 mM,pH 7.4）停止。然后将新鲜制备的DCFH加入相同Ru浓度的SCOF-Ru 或RuCl3的PBS悬浮液（pH7, 10 mM）中。最终混合物中，DCFH浓度为10 μM, Ru浓度为40 μM。以相同DCFH浓度的PBS溶液作为空白对照。将每种混悬液各取100 μL加入96孔板（n = 6），分别用0、1、2、3、5、10 Gy的X射线照射。荧光信号（em. 520/20 nm）用Synergy HTX微孔板阅读器（eX. 485/20 nm）收集。
酶动力学参数
根据Michaelis-Menten饱和度曲线计算Michaelis-Menten常数。对于每个H2O2或TMB浓度，使用比尔-朗伯定律（式（1））根据吸光度变化计算初始反应速率（V0）（式（2））（oxTMB的ε为39,000 M−1cm−1，其中c表示oXTMB浓度，l cm表示溶液在光路中的长度）。根据相应的H2O2或TMB浓度绘制反应速率，并拟合Michaelis-Menten曲线。此外，采用线性双倒数图（Lineweaver-Burk图，式（3））确定了最大反应速度（Vmax）和Michaelis常数（Km）。进而，根据式（4）计算周转数（TON）。
（1） A=εlc
（2）
（3）
（4）TON =v maX /[E0]
[S]为H2O2或TMB的浓度，[E0]为纳米酶中金属的摩尔浓度。
电子自旋共振（ESR）识别自由基
在500 μL NaOAc−HOAc缓冲液（pH为4.5）中加入10 μL的SCOF-Ru 溶液（4 mg mL-1）、10 μL的DMPO溶液和10 μL的0.1 M H2O2，通过BRuker ESR EMX Plus（美国BRuker北京科技有限公司）在9.8 GHz频率（微波功率:1 mW）下进行ESR测量。
结果：
通过使用经典的3，3，5，5-四甲基联苯胺（TMB）比色法，SCOF-Ru显示出出色的POD样和OXD样性能（图3a，图3b）。然后用5，5-二甲基-1-吡啶N-氧化物（DMPO）和2，2，6，6-四甲基哌啶（TEMP）作为特异性自旋阱试剂，通过电子自旋共振（ESR）验证自由基产物的类型，结果显示出明显的•OH/•O2 -和1O2信号（图3c-e）。然后，我们计算了最大反应速度（Vmax）、米切里斯常数（Km）和周转数（TON，单位活性催化中心最大转化底物数量）的值。为了揭示稳态催化动力学，我们进一步进行了最大速度（Vmax）和Michaelis-Menten常数（Km）的测试。在室温下，SCOF-Ru的Vmax和Km分别为0.378 × 103 mM s-1和10.442 mM（图3f）。与金属氧化物、金属纳米颗粒、单原子（SA）酶模拟物和金属有机框架（MOF）相比，SCOF-Ru 表现出最高的Vmax值（图3g）。同时，根据 XPS数据，周转数（TON）为4.28 × 10-2s-1（图3h），高于最近建立的类过氧化物酶催化剂，表明其具有显著的类过氧化物酶活性。
Ru在22 keV时具有较高的K边能量，这使得Ru适合用于临床中线性粒子加速器（LINACs）产生的超高电压光子的二次辐射的无线电增强（图3i）。与辐射前的POD和OXD性能相比，辐射后SCOF-Ru 和RuCl3的POD和OXD性能显著提高（图3j、图3k），这证明Ru的引入显著提高了SCOF的辐射敏化性能。同时，与相同Ru原子摩尔含量的RuCl3相比，SCOF-Ru 的POD和OXD性能提高更为显著，这进一步证明SCOF-Ru二元的周期排列有利于与 X射线光子碰撞的概率更高，从而增加了自由基产生。2'，7'-二氯二氢荧光素（DCFH）荧光探针检测的ROS生成实验显示，辐射组的荧光强度强于非辐射组（图3l），这也证明SCOF-Ru具有优异的放射增敏性能。为了进一步证明材料的辐射敏化机制，我们对ESR试验产生的自由基类型进行了表征。如图12a-12c所示，辐射后显著的•OH、•O2 -和1O2信号显著增强，说明SCOF-Ru作为辐射增敏剂有利于三种自由基的产生。此外，我们在体外研究了SCOF-Ru 的细胞毒性。如图15所示，CCK8实验显示，即使在120 μg mL−1的高浓度下，SCOF-Ru 在共孵育24小时（图13a）或48小时（图13b）后也能对HUVEC细胞产生有限的毒性。
试验例3 细胞和动物实验
近年来，越来越多的证据表明，基于COF的酶由于其高结晶度、固有孔隙度、结构规律性、设计灵活性、可定制的孔隙环境、通用性和卓越的稳定性而具有出色的抗肿瘤作用。放射耐药是治疗癌症的关键临床障碍，可导致局部复发甚至远处转移。因此，合成的SCOF-Ru 结合了SCOF的高度结晶多孔结构和SCOF-Ru 的肿瘤微环境响应性的优点，这激发了我们探索SCOF-Ru 作为响应性实现可激活RDT的潜力。为了验证SCOF-Ru和RT联合使用是否能增强对肿瘤细胞的破坏，我们用不同浓度的SCOF和SCOF-Ru孵育CT26和SCC-7细胞4小时，然后用剂量为6 Gy的 X射线照射。如图16a-图16c所示，SCOF-Ru+X射线组的相对细胞活力明显降低，证实SCOF-Ru 确实可以提高RT的治疗效率。与RuCl3相比，等效SCOF-Ru诱导的SCC-7和CT26细胞的凋亡率更高（图14）。然后，我们研究了SCOF-Ru在体外促进RT的能力，并与SCOF进行了比较。
首先，使用荧光染色观察SCOF-Ru 增强的放射动力学效应。采用2，7-二氯双氢荧光素（DCFH‐DA）探针检测SCC-7细胞和CT26细胞内ROS生成水平。氧化DCFH的荧光在 X射线处理组和对照组中较弱。在SCOF-Ru + X射线组中观察到大量荧光，表明SSC-7细胞（图4a）和CT26细胞（图15）中ROS水平升高。探讨SCOF-Ru 的死细胞比例抗肿瘤作用。SCC-7和CT26细胞分别与浓度为100 μg mL−1的SCOF或SCOF-Ru孵育4 h，然后用6 Gy X射线照射。48小时后，SCC-7和CT26细胞被Calcein-AM/PI染色，这是细胞存活和死亡的标记物，并通过倒置荧光成像来评估RT的治疗效果。正如预期的那样，与HDCOF或单独RT相比，SCOF-Ru + RT组的细胞死亡比例增加（图4b）。此外，我们还进行了DNA损伤实验，以验证SCOF-Ru可以沉积辐射能量来诱导癌细胞的DNA损伤。已有报道称·OH可通过稳定自由基DNA阻止其自我修复、诱导线粒体损伤、缓解缺氧TME、与超氧离子反应生成ROS等多种途径对RT进行有效敏化。用SCOF/SCOF-Ru孵育类似的癌细胞，1小时后用DNA损伤标志物γ-H2A X染色SCC-7和CT26细胞，并用倒置荧光成像评价SCOF-Ru 的治疗效果。正如预期的那样，与SCOF、SCOF-Ru或单独RT相比，SCOF-Ru + RT组的癌细胞显示出最高的DNA损伤水平，这表明含Ru的SCOF 显示出更高的RT效率（图4c）。此外，我们评估了SCOF-Ru在抑制SCC-7和CT26细胞增殖和迁移方面的治疗作用。克隆生存实验显示，X射线下SCC-7细胞的集落形成率为10.02%（6 Gy）(图4d)。然而，经SCOF-Ru + X射线（6 Gy）治疗后，菌落形成率显著下降至2.60%。接下来，伤口健康和transwell实验揭示了SCOF-Ru在抑制SCC-7细胞（图4e，4f）迁移中的重要作用。辐射效应被认为主要是由于核DNA损伤及其修复机制的管理。然而，基础研究表明，暴露于RT的结果高度依赖于细胞器的其他分子成分的激活和调节，这些细胞器决定了癌细胞的存活和增殖能力（30-32）。线粒体作为典型的表观遗传调控细胞器和细胞的中央发电站，在这些反应中起着重要的关键作用。它们指导细胞代谢、能量供应、体内平衡以及辐射诱导的信号传导、细胞死亡和免疫反应。
然后，我们通过JC-1实验评估了不同处理后SCC-7细胞的线粒体状况，JC-1可以与完整的线粒体相互作用形成聚集体，以单体形式存在（图4g）。相应地，流式细胞术分析JC-1的荧光信号，我们发现 X射线和SCOF-Ru的协同作用可以加强对线粒体的损伤（图17）。这些结果表明，SCOF-Ru 通过TME特异性CAT/ Fenton样催化级联扩增RDT致敏RT，促进多种ROS的产生，导致DNA损伤和线粒体膜电位损伤，从而诱导肿瘤细胞更多的凋亡（图4h）。
受体外RT效率提高的鼓舞，我们随后研究了SCOF-Ru是否可以提高体内RT的治疗效率。首先，我们基于X射线在CT26细胞小鼠中检测了SCOF-Ru的治疗效果。简单地说，将皮下CT26肿瘤（≈100 mm3）的Babl/c雌性小鼠随机分为6组：对照组、SCOF组、SCOF-Ru组、X射线组、SCOF-Ru + X射线组和SCOF-Ru + X射线组。在第0天瘤内注射等量10mg/kg的SCOF或SCOF-Ru。对于X射线照射，小鼠在注射SCOF或SCOF-Ru 4小时后接受6 Gy X射线照射。然后每隔两天计算不同组肿瘤的生长情况。在整个观察期内，各组体重均在19.5 g左右，各组间差异无统计学意义。如图5a所示，单纯瘤内注射SCOF或SCOF-Ru对肿瘤生长的抑制作用较弱。同时，单纯X射线照射下的RT仅能轻微延缓肿瘤的生长，SCOF作为X射线吸收剂可增强RT疗效。值得注意的是，由于X射线照射下的能量沉积增强了协同治疗效果，SCOF-Ru + X射线表现出最有效的抗肿瘤行为（完全抑制CT26肿瘤的生长）（图5b-5d）。此外，SCOF-Ru + X射线组小鼠在70天内的存活率为80%（图5e）。治疗后第12天，处死小鼠，解剖不同组肿瘤，进行苏木精和伊红（H&E）染色，进一步评价RT的疗效（图5f）。不出所料，SCOF-Ru + X射线组肿瘤切片显示肿瘤细胞损伤最显著，肿瘤组织内腔体体积大，胞浆大量溢出。
为了进一步研究X射线照射下SCOF-Ru增强的RDT, Ki‐67和CD31免疫组织化学染色，以及TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）、DCFH‐DA和缺氧诱导因子（HIF）‐1α免疫荧光染色。值得注意的是，Ki‐67和CD31的免疫组化阳性率在SCOF-Ru + X射线组中最低（图5f），进一步证实了其对肿瘤细胞增殖的显著抑制作用。同时，SCOF-Ru + X射线处理导致大量细胞凋亡（TUNEL阳性百分比升高）（图5g）。值得注意的是，缺氧诱导因子- 1α（HIF‐1α）在SCOF-Ru + X射线组的肿瘤组织中表达显著降低，表明X射线照射下SCOF-Ru可以有效改善肿瘤缺氧。研究结果证实了所开发的可激活放射增敏剂SCOF-Ru可以通过增强RDT在X射线照射下获得较高的抗肿瘤疗效。为了评估SCOF-Ru的生物安全性，取处理小鼠的主要器官（心、肝、脾、肺和肾）进行H&E染色。如图18所示，从组织病理学分析来看，注射SCOF-Ru后未见明显的损伤和炎症反应，进一步证明其具有良好的组织相容性。
在SCOF-Ru + X射线对TME具有显著调节作用的RNA转录组学结果的启发下，我们通过流式细胞术揭示了治疗组免疫的变化。如图6a、图6b所示，SCOF-Ru + X射线组CD45 +T细胞和CD8 + T细胞亚群显著升高。此外，巨噬细胞的极化在四组之间也有显著差异。具体来说，在SCOF-Ru + X射线组中，M1极化的比例明显更高（图6c）。与对照组相比，SCOF-Ru +X射线组血清IL-6、IFN-β和IFN-γ水平显著升高，这反映了促炎症状态。这表明免疫系统在促炎症状态和肿瘤ICD中被激活。
免疫疗法已成为癌症治疗的一种既定治疗模式，但其在大多数癌症中的治疗效果仍不理想。通过激活T细胞和相关细胞因子的细胞毒性，鉴定出新的纳米生物材料来协同免疫治疗，对于精确的临床癌症治疗具有巨大的潜在价值。基于SCOF-Ru的最佳原发性抗肿瘤作用和对免疫系统的调节作用，我们进一步研究了SCOF-Ru对远处肿瘤生长的潜在体外抑制作用。在本实验中，在接种原发肿瘤（5 × 105，100 µL）后，在小鼠的相反部位接种第二个CT26肿瘤（2 × 105，100 µL），模拟癌症远处转移。然后瘤内注射SCOF-Ru （2.2 mm，100µL），然后对原发肿瘤进行一次 X线照射（6 Gy）。在照射后0、1、2天时间点，小鼠腹腔注射200 µL αPD-1（20 mg/kg、10 mg/kg、10 mg/kg）（图7a）。我们发现，基于SCOF-Ru的 X射线联合αPD-1在 X射线照射下抑制原发肿瘤生长的可能性最高，但也会延迟远处肿瘤的生长（图7b）。除了肿瘤的生长，我们还进一步测量了治疗肿瘤中免疫细胞的水平。具体而言，与其他组相比，SCOF-Ru + αPD-1 + X射线组远端肿瘤中CD8+的百分比增加（图8a）。同时，SCOF-Ru+ αPD-1 + X-ray组的CD8 + CD69 + T细胞也显著升高（图8b），可诱导癌细胞凋亡。值得注意的是，SCOF-Ru + αPD-1 + X射线组促炎M1极化巨噬细胞比例和M1/M2比值均高于其他各组（图8c）。相比之下，PD-1 + CD8 + T细胞在远处肿瘤中的比例明显低于对照组（图8d）。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种SCOF-Ru生物酶，其特征在于：所述SCOF-Ru由SCOF与钌盐加入甲醇溶液中反应得到，所述SCOF以2,3,6,7,10,11-六氨基三苯六盐酸盐和2-羟基间苯二甲醛为原料制备得到。
2.根据权利要求1所述的一种SCOF-Ru生物酶，其特征在于：所述SCOF-Ru为六角形的蜂窝结构。
3.根据权利要求2所述的一种SCOF-Ru生物酶，其特征在于：所述SCOF-Ru具有Ru-N2O2活性中心，所述Ru-N2O2活性中心具有卟啉样结构，Ru元素均匀分散在SCOF-Ru中。
4.根据权利要求3所述的一种SCOF-Ru生物酶，其特征在于：所述SCOF-Ru中，Ru被亚胺和羟基配位，亚胺基的N和O形成的Ru-Nx/Ru-Ox配位，亚胺通过C=N键连接COF。
5.根据权利要求1~4任一项所述的一种SCOF-Ru生物酶，其特征在于：所述SCOF-Ru为纳米级材料；和/或：
所述SCOF-Ru具有POD活性；和/或：
所述SCOF-Ru具有OXD活性；和/或：
所述SCOF-Ru具备清除ROS的活性。
6.权利要求1~5任一项所述的SCOF-Ru生物酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：将SCOF与钌盐加入甲醇溶液中反应得到。
7.根据权利要求6所述的SCOF-Ru生物酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：室温下，将SCOF加入到钌盐的甲醇溶液中，搅拌12~72h，将沉淀物离心后收集，用甲醇洗涤、干燥，即得；其中，所述SCOF与钌盐的重量比为1:10~2:1；所述钌盐为三氯化钌、三氯化钌水合物、二氯化钌、氧化钌、水合氧化钌、氯钌酸钠或氯钌酸铵中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的SCOF-Ru生物酶的制备方法，其特征在于：所述SCOF与钌盐的重量比为1:4；所述钌盐为三氯化钌或三氯化钌水合物中的至少一种。
9.根据权利要求6所述的SCOF-Ru生物酶的制备方法，其特征在于，所述SCOF采用下述制备方法制得：将三乙胺加入2,3,6,7,10,11-六氨基三苯六盐酸盐的甲醇溶液中，在惰性气氛中加入2-羟基间苯二甲醛溶液，反应后冷却、过滤、沉淀、洗涤、干燥即得。
10.权利要求1~5任一项所述的SCOF-Ru生物酶用于制备清除ROS材料的用途；和/或：
SCOF-Ru生物酶用于制备放射性增敏剂的用途；和/或：
SCOF-Ru生物酶用于制备免疫佐剂的用途。
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