CN117281831A - 一种钌基人工抗氧化酶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种钌基人工抗氧化酶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种钌基人工抗氧化酶及其制备方法和应用，属于催化剂领域。本发明提供一种人工抗氧化酶的制备方法，所述制备方法为：将钌盐、二氧化硅和苯‑1,2,4,5‑四碳腈在催化剂的作用下，于180～220℃反应制得；其中钌盐、苯‑1,2,4,5‑四碳腈、二氧化硅和催化剂的质量比为（0.01‑2）：(0.01‑2)：(0.05‑1)：(0.01‑2)。本发明所得人工抗氧化酶具有共轭结构，利用这些结构特征，Ru配位的p‑PcRu@SiO2对H2O2和·O2 ‑都表现出突出和稳定的消除速率，具有增强的电子传导性、金属中心的高度暴露、高分散性和高化学稳定性；因此所得催化剂能够有效地、广谱地清除ROS。
Description
技术领域
本发明涉及一种钌基人工抗氧化酶及其制备方法和应用，属于催化剂领域。
背景技术
日光性皮炎是一种急性辐射烧伤，影响皮肤，是由于在强烈阳光下过度暴露于紫外线B(UVB，280-320 nm)造成的。来自阳光的过度UVB辐射还会导致许多其他皮肤问题，如炎症、晒伤和光老化。太阳UV辐射主要是UVA(90%-95%，320-400 nm)和UVB(5%-10%)，其中UVB暴露的危害是UVA的数百倍。一些研究报道，日光性皮炎的主要机制是氧化应激和炎症，这与UVB诱导角质形成细胞线粒体产生活性氧(ROS)有关。产生的ROS主要是过氧化氢(H2O2)，由超氧化物歧化酶(SOD)催化超氧阴离子(·O2 -)转化而来。在过氧化物酶的作用下，过氧化氢很容易转化为更强的氧化剂羟基自由基(·OH)。过量的ROS会导致多种有害的细胞反应，如DNA双链断裂(DSB)和氧化应激。此外，ROS(促炎症介质)和UVB诱导的角质形成细胞凋亡可导致皮肤炎症。对细胞凋亡的广泛研究表明，应激激活的JNK和p38介导促凋亡过程。另一方面，过量的ROS可引起NF-κB介导的炎症途径，从而增加炎症因子的蛋白水平，如IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α和环氧合酶-2(Cox-2)，从而进一步加重皮肤炎症。
含有无机防晒成分的防晒霜被广泛应用于通过物理屏障作用来减轻UVB的伤害。然而，据报道，无机防晒剂中包含的氧化锌和二氧化钛颗粒具有巨大的光催化活性，进而导致ROS的产生。因此，全面抑制UVB引起的皮肤损伤的关键是清除UVB引起的角质形成细胞中的ROS。为了对抗氧化应激，生命系统中存在抗氧化物质和天然抗氧化系统，包括过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)。然而，直接使用CAT和SOD存在稳定性差、储存困难和规模化生产困难等固有局限性。
发明内容
针对上述缺陷，本发明提供了一种新型的人工抗氧化剂纳米生物催化剂，所述生物催化剂为Ru配位的p-PcRu@SiO2，这种新型的人工抗氧化酶具有共轭结构，利用这些结构特征，Ru配位的p-PcRu@SiO2对H2O2和·O2 -都表现出突出和稳定的消除速率，具有增强的电子传导性、金属中心的高度暴露、高分散性和高化学稳定性；因此所得催化剂能够有效地、广谱地清除ROS，超过了大多数最先进的清除ROS的抗氧化剂纳米双催化剂。本发明通过体外和体内实验都证明了所得p-PcRu@SiO2通过调节MAPK信号通路和NF-κB炎症通路，通过清除ROS能够减轻中波紫外线诱导的皮肤炎症。可见，本发明为设计高效的人工抗氧化酶治疗UVB诱导的皮肤炎症有望成为临床应用的一种新策略。
本发明的技术方案：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种人工抗氧化酶的制备方法，所述制备方法为：将钌盐、二氧化硅和苯-1,2,4,5-四碳腈（BTC）在催化剂的作用下，于180～220℃（优选为200℃）反应制得；其中钌盐、苯-1,2,4,5-四碳腈、二氧化硅和催化剂的质量比为（0.01-2）：(0.01-2) ：(0.05-1) ：(0.01-2)。
进一步，上述制备方法为：先将钌盐、二氧化硅和苯-1,2,4,5-四碳腈溶解在溶剂中，再加入催化剂混匀得混合物；然后将混合物加热反应1～10h；随后收集产物，最后经洗涤干燥制得所述人工抗氧化酶。
进一步，所述溶剂为：乙二醇、丁二醇或正丙醇；溶剂的添加量使得各原料混合均匀即可。
进一步，所述钌盐为RuCl3。
进一步，所述催化剂为1,8 -二氮杂环(5,4,0)十一-7-烯(DBU)。
进一步，所述洗涤指依次使用乙二醇、盐酸、去离子水和乙醇进行洗涤。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种人工抗氧化酶，所述抗氧化酶采用上述方法制得。
进一步，所述人工抗氧化酶能够清除ROS，包括清除H2O2和·O2 -。
进一步，所述人工抗氧化酶具有CAT和SOD活性。
本发明要解决的第三个技术问题是指出上述人工抗氧化酶在制备治疗日光性皮炎、关节炎或干细胞保护材料中的用途。
本发明的有益效果：
本发明所得人工抗氧化酶具有活性的Ru团簇和π共轭网络，模拟了CAT和SOD中的配位环境；p-PcRu被包裹在SiO2纳米基质上，使p-PcRu@SiO2具有更好的表面分布和更高的生物催化活性，从而降低其工作浓度。此外，由于p-PcRu共轭网络和配位结构的结构优势，p-PcRu@SiO2显示出高效、多方面和强大的清除ROS的活性，包括清除H2O2和·O2 -，超过了迄今报道的清除ROS的人工抗氧化酶。所得p-PcRu@SiO2通过降低UVB引起的ROS来减轻日光性皮炎。p-PcRu@SiO2具有良好的体内外催化活性和良好的生物相容性，有望成为一种治疗ROS相关皮肤炎症的纳米治疗剂。
附图说明
图1为实施例1所得p-PcRu@SiO2的HAADF-TEM图。
图2为实施例和各对比例所得材料的SEM图：a) p-PcRu@SiO2；b) 聚酞菁铜；c) p-Pc@SiO2；d) p-PcRu；e) PcRu。
图3为实施例1所得材料p-PcRu@SiO2的EDS图。
图4为实施例1所得p-PcRu@SiO2的STEM图：a) HE-STEM图；b） C-HAADF-STEM图。
图5为实施例1所得p-PcRu@SiO2的PXRD图。
图6为实施例1所得p-PcRu@SiO2的EDS线扫图。
图7为实施例1所得p-PcRu@SiO2的AC-STEM图：a) 低放大倍数；b) 高放大倍数。
图8为实施例1、对比例3和对比例5所得材料的紫外可见光谱图。
图9为实施例1、对比例3和对比例5所得材料的红外光谱图。
图10为实施例1所得材料p-PcRu@SiO2的高分辨率XPS图：a) Ru 3p；b) N 1s和c)C 1s。
图11为实施例1所得材料p-PcRu@SiO2和各对比例所得材料的ROS清除活性结果图：a) 80分钟时的H2O2的剩余量；b)·O2 -清除率；c)Ru含量归一化的类CAT和SOD活性结果图。
图12为对比例1所得材料的类POD活性结果图：a) 以TMB为底物的类POD活性的吸光度光谱图；b) 不同浓度Cu-PcCP的POD活性图；c) 不同浓度的Cu-PcCP的POD活性的时间依赖性结果图。
图13为实施例1所得p-PcRu@SiO2类酶活性的稳定性结果图。
图14为实施例1、对比例4和对比例5所得材料的催化中心毒化实验结果图。
图15为实施例1和各对比例所得材料的生物相容性和ROS清除能力结果图：a) 与不同浓度的p-PcRu@SiO2孵育后的人永生化角质形成细胞的细胞活力；b) 细胞内MDA浓度；c)，d) 细胞内ROS水平的DCFH-DA 染色和流式分析结果图；e) 人永生化角质形成细胞的γH2AX染色结果图。
图16为实施例1和各对比例所得材料处理UVB照射人永生化角质形成细胞的蛋白印迹图：a）为磷酸化p38；b）为磷酸化JNK。
图17 为实施例1和各对比例所得材料的体外抗炎效果图：a) 磷酸化JNK免疫荧光图像；b) UVB照射并与不同纳米粒子共培养48 h后人永生化角质形成细胞细胞的流式细胞术凋亡图；c)代表性免疫荧光图像和d) NF-κB的Western印迹检测图；e)不同处理细胞培养基中IL-6、IL-8、TNF-α水平。
图18 为实施例1和各对比例所得材料的体内抗氧化效果图：a)第7天各组皮肤的代表性照片结果图； b)各组皮肤DHE荧光染色结果图； c)各组表皮组织切片的H&E和d)Masson染色图像。
图19为实施例1和各对比例所得材料的体内抗炎图：不同组表皮组织切片的a) p-p38和b) p-JNK染色图像(比例尺= 100µm)； c) TUNEL； d) Cox-2；e) IL-6； f) TNF-α免疫荧光染色(比例尺= 50µm)。
具体实施方式
本发明提供了一种新型的人工抗氧化剂纳米生物催化剂Ru配位的p-PcRu@SiO2，这种新型的人工抗氧化酶具有共轭结构，利用这些结构特征，Ru配位的p-PcRu@SiO2对H2O2和·O2 -都表现出突出和稳定的消除速率，具有增强的电子传导性、金属中心的高度暴露、高分散性和高化学稳定性；因此所得催化剂能够有效地、广谱地清除ROS，超过了大多数最先进的清除ROS的抗氧化剂纳米双催化剂。本发明的p-PcRu@SiO2纳米粒子(NPs)通过简单的热聚合和进一步构建共轭网络制备。体外和体内实验都证明了所得p-PcRu@SiO2通过调节MAPK信号通路和NF-κB炎症通路，通过清除ROS能够减轻中波紫外线诱导的皮肤炎症。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。
材料与试剂
苯-1,2,4,5-四碳腈(BTC)购自Alfa化学有限公司，1,8 -二氮杂环(5,4,0)十一-7-烯(DBU)、乙二醇、RuCl3、酞菁(Pc)、二氧化锰、18- k -6、二甲基亚砜、FeSO4·7H2O和1,10菲罗啉购自Aladdin化学有限公司，实验中使用的去离子纯净水(18.2 MΩ·cm)产自milliq Academic系统(Millipore Corp.， Billerica, MA, USA)。所有化学品均按收到的原样使用，无需进一步净化。
实施例1 p-PcRu@SiO2人工抗氧化酶的合成
采用加热法制备了p-PcRu@SiO2：首先将BTC 0.05g、RuCl3 0.0208 g和SiO2 0.075g溶解在20毫升乙二醇中得混合物，再将混合物超声分散10min，然后加入37.5μL的DBU作为催化剂，之后在200℃反应4h，随后尽快收集产物；并依次用乙二醇、3%盐酸、去离子水和乙醇洗涤；最后将所得产品在真空中干燥一夜制得本发明的抗氧化酶，记作p-PcRu@SiO2。
对比例1 聚酞菁铜Cu-PcCP NPs的制备
其他制备均与实施例1相同，区别在于：将RuCl3替换为0.0135g的CuCl2，制得了聚酞菁铜：首先将BTC0.05g、CuCl2 0.0135 g溶解在20毫升乙二醇中，将混合物超声分散10min，然后加入37.5μL的DBU作为催化剂，然后在180℃反应15 min，随后尽快收集产物；并依次用乙二醇、3%盐酸、去离子水和乙醇洗涤。
对比例2
将实施例1中的二氧化硅替换为氧化锌或二氧化钛，结果发现：实验过程无法将p-PcRu负载在氧化锌或者二氧化钛上，无法分散为清晰的颗粒，整体呈较大的块状。
对比例3 p-Pc@SiO2的制备
首先将BTC0.05g、SiO2 0.075 g溶解在20毫升乙二醇中，将混合物超声分散10min，然后加入37.5μL的DBU作为催化剂，后在200℃反应4h，随后尽快收集产物；并依次用乙二醇、3%盐酸、去离子水和乙醇洗涤；最后干燥制得产物记作p-Pc@SiO2。
对比例4 p-PcRu的制备
首先将BTC0.05g、RuCl3 0.0208 g溶解在20毫升乙二醇中，将混合物超声分散10min，然后加入37.5μL的DBU作为催化剂，然后在200℃反应4h，随后尽快收集产物；并依次用乙二醇、3%盐酸、去离子水和乙醇洗涤；最后干燥制得产物记作p-PcRu。
对比例5 PcRu的制备
将酞菁（Pc）0.103g、RuCl3 0.042 g溶解在10毫升去离子水中，将混合物在常温下搅拌12h，并依次用去离子水、3%盐酸、去离子水和乙醇洗涤；最后干燥制得产物记作PcRu。
性能测试
1、结构表征
用TALOS F200x透射电子显微镜(美国FEI有限公司)在200千伏电压下进行了透射电子显微镜(TEM)和能谱分析(EDS)，并对其进行了无GMS分析。激光共聚焦拉曼光谱使用ThermoFisher Science Dxr2xi进行。用X射线衍射仪(−，DX-2700BH，浩源仪，中国)对p-PcRu@SiO2的晶体结构进行了分析。X射线光电子能谱测量在K-Alpha™+X射线光电子能谱系统(Thermo Science)上进行。用XploRA plus(HORIBA)测量了样品的拉曼光谱，激发波长为532 nm，样品用50倍随钻可见物镜(NA=0.50；WD=10.6 mm)观察。
2、生物催化剂的仿酶活性
H2O2 分解实验：在室温下，将10 mM的过氧化氢加入10μg/mL p-PcRu@SiO2加入1.97mL磷酸盐缓冲盐水中。然后，将50μL溶液加入100μL的硫酸钛溶液中，其中包括1.33mL24%硫酸钛溶液和8.33mLH2SO4溶液，加入50mL去离子水中，每10min一次，直到80min。反应完成后，测量溶液在405 nm处的吸光度，以评估过氧化氢的浓度。
氧生成分析：在室温下，将10 mM的过氧化氢加入1.97mLPBS中，加入10μg/mL p-PcRu@SiO2，每隔10分钟用溶氧仪(JPSJ-605F，LEICI仪)测量氧浓度，监测至3min。
通过将反应速度值和底物浓度与Michaelis-Menten方程进行拟合，计算了动力学常数(Vmax和Km)：V0=Vmax∙[S]Km+[S]式中，V0为初始反应速度，Vmax为最大反应速度。Vmax是在饱和底物条件下获得的。[S]是底物浓度。当初始反应速度达到最大反应速度的一半时，米氏常数Km等于底物浓度。
人工抗氧化酶的质量活性定义如下：
TON=Vmax/[E0]其中，周转数(TON)是每个活性催化中心转化的底物的最大量，也是指反应常数(Kcat)，E0是金属活性中心的摩尔浓度。
超氧化物歧化酶样活性： 将p-PcRu@SiO2 (5μL，10 mg/mL)加入含有KO2/18-冠-6/二甲基亚砜(60μL，1 mg/mL)的0.92mL18-冠-6/二甲基亚砜(3 mg/mL)中混合均匀。孵育20min后，向反应液中加入N-四氮唑蓝(15μL，10 mg/L)，用紫外-可见分光光度计在680 nm处记录吸收光谱。
3、细胞实验
永生化人角质形成（HaCaT）细胞购自美国典型培养库，保存于含10%胎牛血清和1%青霉素的DMEM(Gibco)中，37℃，5%CO2。
4、体外细胞毒性
HaCaT细胞在24孔板和96孔板中以2×10 5 个/mL的密度培养24小时。用含不同浓度pPcRu@SiO2的完全培养液孵育细胞24 h，采用CCK-8试剂盒(Beyotime，中国)检测细胞活力。
5、生物催化剂清除细胞内ROS
用2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA，Sigma，America)检测残留ROS水平，以测试p-PcRu@SiO2清除ROS的能力。HaCaT细胞置于30mJ/cm2的UVB(Sigma，美国)照射下。然后将细胞与不同的纳米材料(4μg/mL)孵育12h，然后在37℃的条件下与DCFH-DA孵育30min。用日本奥林巴斯IX83全自动倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内荧光。
6、免疫荧光染色
经UVB照射和材料孵育后，用PBS洗涤细胞，用4%多聚甲醛(BioSharp，中国)固定15min，37℃。然后用0.5%Triton-X 100(Solarbio，中国)在PBS中室温通透10min，在PBS中用10Vol%山羊血清(Solarbio，中国)通透30min。然后将细胞与一抗在4℃下孵育过夜。然后用二抗在室温下孵育1h，再用10μg/mL DAPI(Beyotime，中国)复染。使用倒置共焦显微镜(尼康，日本)捕捉图像。
7、MDA测量
用丙二醛检测试剂盒(NJJCBIO，中国)，按照厂家的操作规程，用分光光度法测定紫外线照射和纳米材料处理的HaCaT细胞中丙二醛的含量。
8、流式细胞术用于细胞凋亡分析
将HaCaT细胞以2×104个/mL的密度接种于24孔板上孵育过夜。细胞暴露于180mJ/cm2的UVB(312 nm)。在无血清培养液中加入不同的纳米材料(4µg/mL)，孵育48h后用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Yeasen，中国)对细胞进行染色，然后进行流式细胞仪分析。
9、蛋白免疫印迹（WB）
HACaT细胞在4℃时用PBS洗涤3次，然后在RIPA裂解缓冲液中裂解3min。细胞裂解产物以1×104g、4℃离心10min，上清液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳层析，蛋白质转移至聚偏氟乙烯膜(美国PALL)。膜在5%脱脂奶粉中于室温下封闭1h，然后与一抗在4℃下孵育过夜。然后用HRP偶联二抗在室温下孵育1h。在信号检测之前，将膜与超级ECL检测试剂(翌圣，中国)孵育。
10、酶联免疫吸附试验(ELISA）
将HaCaT细胞接种于6孔板中，然后用60mJ/cm2的UVB进行预处理，孵育12h后收集上清液进行分析。培养上清液中促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α、白介素6、白介素8的浓度测定采用欣博盛生物科学公司生产的试剂盒(中国)，并按厂家说明书进行。
11、体内实验
6~8周龄雄性BALB/c小鼠购自四川大学实验动物中心。动物实验是在四川大学动物伦理委员会的指导下进行的。将动物随机分为7组，每组5只：1)未照射对照组，2)模型组（UVB照射组），3)80%甘油预处理+UVB照射组，4)PcRu预处理+UVB照射组，5)pPcRu预处理+UVB照射组，6) p-PcRu@SiO2预处理+UVB照射组，7)p-PcRu@SiO2预处理+UVB照射组。紫外线照射前半小时，将2.5 mg纳米材料(溶于500µL 80%甘油中)涂抹于小鼠背部皮肤，将小鼠置于240mJ/cm2紫外线照射下。每两天重复一次，共三次。UVB照射后48h处死小鼠。将处理后的皮肤切下，用3.7%甲醛溶液固定，进行H&E、Masson三色、DHE、γH2AX、p-JNK、p-p38、TUNEL、Cox-2、IL-6、TNF-α染色。
12、数据分析
统计分析在GraphPad Prism软件中进行。数据显示为平均值±标准差(S.D.)。每个实验至少重复三次。两组间比较采用t检验。多组比较采用单因素方差分析(ANOVA)。*P<0.05表示有统计学意义。
测试结果
1结构表征
高角环形暗场透射电子显微镜(HAADF-TEM)图像(图1) 显示p-PcRu@SiO2纳米粒子呈非晶态。扫描电子显微镜(SEM)（图2）显示实施例1所得包覆在SiO2上的聚酞菁钌(p-PcRu@SiO2)呈均匀规则圆球形，而对比例1所得聚酞菁铜（Cu-PcCP NPs）为不规则球形，对比例3所得包覆在SiO2上的聚酞菁（p-Pc@SiO2）也为均匀球形，对比例4所得聚集态聚酞菁钌（p-PcRu）为不规则块状，对比例5所得单体Ru(PcRu)呈不规则聚集形态。能谱(EDS)Mapping测绘结果(图3)显示了实施例1所得p-PcRu@SiO2中Ru、N、C元素的分布。高分辨电子显微镜(HR-TEM)证实了分散在非晶态表面的Ru团簇的晶体结构（图4）。粉末X射线衍射结果(图5)发现只在p-PcRu@SiO2-实施例1的26°附近出现典型的共轭网络结构的峰，表明没有Ru或Ru氧化物的结晶形成。EDS线扫描结果(图6)证明了这种共轭Pc基聚合物中Ru的存在相对较少，球差校正扫描电子显微镜(AC-STEM)显示Ru团簇和Ru单原子共存于二氧化硅表面 (图7a和b)。
此外，本发明还深入研究了实施例1所得p-PcRu@SiO2的详细化学结构。首先，紫外可见光谱(UV-Vis) (图8)研究了共轭结构，检测到p-PcRu@SiO2纳米粒子的Q带明显红移(与p-Pc@SiO2-对比例3和PcRu-对比例5相比)，证明了扩展共轭结构的形成。傅立叶变换红外光谱表明，1400 cm-1处的强度对应于吡咯环中的C-N伸缩效应(图9)。p-PcRu@SiO2在1104cm-1处的信号表明了苯环外环的平面C-H弯曲振动，验证了Pc单体的成功聚合。p-PcRu@SiO2的796.4 cm-1和p-Pc@SiO2-对比例3的803.2 cm-1 谱带可能对应于PcRu-对比例5的734.3cm-1谱带，属于异吲哚环形变。用X射线光电子能谱(XPS)研究了这些Ru配位结构的详细配位、成键和元素比例(图10)。比较了对照样品的重量比，以计算每重量活性金属中心的相对催化活性。Ru 3p轨道的高分辨XPS谱清楚地证实了Ru(0)在p-PcRu@SiO2-实施例1中的形成(图10a)。此外，如图10b所示，N-1S谱表明存在异吲哚环(398.8 eV处的吡咯烷-N)，以及中心与Ru相邻的氮(397.6 eV处的吡啶-N)，表明每个Pc环空腔与Ru原子之间存在配位。如图10c所示，C1s谱可解卷积成三个峰，分别代表C-N、C=N和C-C/C=C的存在。这些精细结构的详细表征证明了Ru配位的p-Pc聚合物骨架的成功构象。
2 生物催化活性的评价
本发明还对类CAT活性和类SOD活性清除ROS的能力进行了深入的调查和对比。过氧化氢的活性取决于过氧化氢的清除速率，实施例1 所得p-PcRu@SiO2-(85.6%)和对比例4所得p-PcRu表现出相对较高且有效的类CAT活性，而对比例5所得PcRu和对比例3所得p-Pc@SiO2表现出较低的H2O2清除速率(图11a)。通过氯化亚硝基四氮唑蓝方法测量其类SOD活性，即对·O2 -的清除能力，由图11b可知，p-PcRu@SiO2对·O2 -的清除率最高，而PcRu和p-PcRu对·O2 -的清除率较低，包覆在p-Pc@SiO2的清除率最低。根据XPS结果计算了相对类CAT的活性和类SOD活性(图11c)，p-PcRu@SiO2显示出按重量计算的活性金属位置的最高性能，表明高度暴露的Ru团簇以及Ru原子在清除过氧化氢时提供了优异的性能。而如图12a所示，对比例1所得Cu-PcCP NPs则表现出类POD活性，且其活性表现出时间和浓度依赖（图12 b和c）。
为了验证实施例1所得p-PcRu@SiO2的长期清除ROS的能力，还进行了稳定性测试。在6个循环中，p-PcRu@SiO2的催化性能没有明显下降，这表明p-PcRu@SiO2在消除H2O2和·O2 -时具有优异的稳定性(图13)。此外，利用催化活性中心毒化方法通过应用硫氰酸钾(KSCN，它能够与活性金属中心结合并形成惰性络合物)来证明Ru对人工抗氧化酶的重要性。加入KSCN后，p-PcRu@SiO2的CAT和SOD类活性都显著下降(图14)，从而验证了Ru中心在清除ROS时具有催化活性。
3 体外ROS清除和细胞保护作用
由于实施例1所得p-PcRu@SiO2具有良好的清除ROS的能力，本发明评估了其清除UVB诱导的ROS，主要是·O2 -和H2O2，以及保护细胞免受ROS损伤的能力。如图15a所示，p-PcRu@SiO2表现出良好的生物安全性，即使在较高浓度下细胞活力仍能保持在80%以上，用2，7-二氯二乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)探针检测不同纳米粒子对ROS的清除能力，与对照组（正常培养的细胞）相比，PBS组(阳性对照即只接受UVB照射)可观察到明显的绿色荧光信号(ROS水平)，而这种荧光被p-PcRu@SiO2减弱（图15c）。p-PcRu@SiO2的工作浓度为4μg/mL，远低于已报道的人工过氧化物酶的Ru-N配位，这也是为什么p-PcRu在相同浓度下没有表现出抗氧化作用的原因。同样，流式细胞仪的定量分析也表明，相比其他对比例，p-PcRu@SiO2可以显著下调细胞内的ROS(图15d)。这些结果表明，p-PcRu@SiO2可用于减少ROS对细胞的损伤。
另外，本发明检测了磷酸化组蛋白(γH2AX)，它是DNA双链断裂的标志。图15e中的免疫荧光染色图像显示，与对照组相比，PBS组的γH2AX增加，而实施例1所得p-PcRu@SiO2阻止了这一现象。本发明还测量了不同处理的人永生化角质形成细胞中脂质过氧化产物MDA的浓度，如图15b所示，与PBS组相比，p-PcRu@SiO2+UVB处理的细胞中脂质过氧化的产物丙二醛（MDA）水平显著降低，而p-Pc@SiO2-对比例3组和p-PcRu-对比例4组的MDA没有明显变化。总而言之，本发明的结果表明，p-PcRu@SiO2可以通过清除ROS来减少细胞的氧化损伤，这可能是其抗炎的基础。
4 体外抑制UVB诱导的MAPKs激活和炎症反应
本发明还研究了实施例1所得p-PcRu@SiO2是否可以阻止UVB诱导的人永生化角质形成细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活、细胞凋亡和炎症反应。MAPK可通过中波紫外线(UVB)辐射激活以调节细胞凋亡和炎症。如图16所示，c-Jun氨基末端激酶(JNK) （图16b）和p38（图16a）在UVB照射下显著磷酸化，而p-PcRu@SiO2共孵育可以降低其磷酸化水平。同样，免疫荧光成像表明，p-PcRu@SiO2显著抑制了JNK的激活，从而进一步抑制了细胞凋亡(图17a)。接下来，本发明测量了UVB辐射和不同纳米粒子的共同孵育后细胞凋亡率。正如预期的那样，47.5%的细胞在UVB处理组中凋亡。p-PcRu@SiO2的加入可显著降低细胞凋亡率，而与其他纳米颗粒共同孵育的细胞凋亡率无明显变化甚至增加(图17b)，这进一步证实了其细胞保护特性。p-PcRu@SiO2可抑制中波紫外线诱导的急性炎症的重要组成部分核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(NF-κB)的核转位(图17c)。在UVB照射和与不同纳米粒子共孵育的情况下，人永生化角质形成细胞中的NF-κB的蛋白水平几乎没有变化(图17d)。此外，进一步研究了受NF-κB转录调控的促炎细胞因子的水平。酶联免疫吸附试验结果显示，p-PcRu@SiO2处理可降低白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α的蛋白水平(图 17e)。这种现象可能与p-PcRu@SiO2有效清除ROS，抑制炎症细胞因子的释放有关。综上所述，上述结果表明，本发明所得p-PcRu@SiO2可以作为一种抗氧化剂来降低ROS，抑制MAPK的激活和NF-κB的核转位，从而达到缓解日光性皮炎的目的。
5 保护小鼠皮肤免受日光性皮炎的影响
鉴于实施例1所得p-PcRu@SiO2在氧化环境中对人永生化角质形成细胞细胞的良好作用，本发明利用6周龄的雄性Balb/c小鼠进一步探讨了其体内抗炎作用。在Balb/c雄性小鼠的皮肤上检测了p-PcRu@SiO2的体内保护效果。UVB照射组在240mJ/cm2 UVB照射前30min于背部皮肤涂抹不同纳米颗粒1.5 mg。图18a为第7天时每组小鼠的皮肤照片。对照组（即正常小鼠仅背部脱毛）小鼠皮肤光滑平整，无明显红斑和皱纹。UVB照射后，模型组（小鼠背部脱毛仅接受UVB照射）小鼠皮肤明显受损，质地粗糙，甚至剥落；p-PcRu-对比例4和p-Pc@SiO2-对比例3组小鼠皮肤明显被焦痂覆盖，与模型组相比无明显改善；实施例1组皮肤状况好于其他组。然后进行了ROS-DHE探针染色（图18b），以确认ROS在皮肤中的积累。对照组和p-PcRu@SiO2+UVB组的亮度均显著低于其他组。此外，各组皮肤的苏木精-伊红(H&E)染色显示，p-PcRu@SiO2具有明显的体内修复活性(图18c)。除对照组和p-PcRu@SiO2+UVB组外，均出现明显的表皮肥大、腺体增多、真皮内炎性细胞浸润，有的甚至出现真皮-表皮分离。用Masson三色染色验证缓解UVB损伤(图18d)，模型组胶原纤维密集无序，而p-PcRu@SiO2-实施例1组胶原纤维较为整齐。
无菌炎症是紫外线辐射引起的主要皮肤损伤之一。实施例1所得p-PcRu@SiO2通过减少UVB辐射产生的ROS来抑制皮肤炎症反应。在蛋白质表达水平上，通过免疫组织化学染色，探讨了p-PcRu@SiO2减轻日光性皮炎的可能机制。结果表明，p-PcRu@SiO2处理显著逆转了UVB暴露小鼠的p38和JNK的激活(图19a，b)。据报道，氧化应激激活的JNK和p38促进了细胞的凋亡。因此，TUNEL染色结果表明，p-PcRu@SiO2+UVB处理组显示出微弱的阳性信号(图19c)。在UVB引起的皮肤炎症过程中，Cox-2是一种重要的介质。因此，本发明采用Cox-2染色来研究其在p-PcRu@SiO2处理的小鼠皮肤组织中的表达水平。如图19d，在UVB照射后，Cox-2的表达增加，而在p-PcRu@SiO2存在的情况下，UVB诱导的Cox-2的表达增加被抑制。中波紫外线照射后，受NF-κB转录调控的炎性因子表达也上调。同样，p-PcRu@SiO2 +UVB组的促炎细胞因子包括IL-6和TNF-α的表达也明显低于其他组(图19e，f)，提示了p-PcRu@SiO2可以被认为是一种抗氧化剂，可以保护皮肤免受ROS相关的炎症。因此，本发明证明实施例1所得p-PcRu@SiO2可以作为一种有效的人工抗氧化酶来降低ROS，实现对UVB诱导的急性炎症的缓解。
综上，本发明证明了Ru配位的p-PcRu@SiO2可以作为一种新型的人工抗氧化剂纳米生物催化剂，其能够有效地广谱地清除ROS。这种新型的人工抗氧化酶具有共轭结构，具有增强的电子传导性、金属中心的高度暴露、高分散性和高化学稳定性。因此，利用这些结构特征，Ru配位的p-PcRu@SiO2对H2O2和·O2 -都表现出突出和稳定的消除速率，超过了大多数最先进的清除ROS的抗氧化剂纳米双催化剂。体外和体内实验都表明，p-PcRu@SiO2通过调节MAPK信号通路和NF-κB炎症通路，通过清除ROS来减轻中波紫外线诱导的皮肤炎症。
Claims (10)
1.一种人工抗氧化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将钌盐、二氧化硅和苯-1,2,4,5-四碳腈在催化剂的作用下，于180～220℃反应制得；其中钌盐 、苯-1,2,4,5-四碳腈、二氧化硅和催化剂的质量比为（0.01-2）：(0.01-2) ：(0.05-1) ：(0.01-2)。
2.根据权利要求1所述的一种人工抗氧化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：先将钌盐、二氧化硅和苯-1,2,4,5-四碳腈溶解在溶剂中，再加入催化剂混匀得混合物；然后将混合物加热反应1～10h；随后收集产物，最后经洗涤干燥制得所述人工抗氧化酶。
3.根据权利要求2所述的一种人工抗氧化酶的制备方法，其特征在于，所述溶剂为：乙二醇、丁二醇或正丙醇。
4.根据权利要求1所述的一种人工抗氧化酶的制备方法，其特征在于，所述钌盐为RuCl3。
5.根据权利要求1所述的一种人工抗氧化酶的制备方法，其特征在于，所述催化剂为1,8 -二氮杂环(5,4,0)十一-7-烯。
6.根据权利要求2所述的一种人工抗氧化酶的制备方法，其特征在于，所述洗涤指依次使用乙二醇、盐酸、去离子水和乙醇进行洗涤。
7.一种人工抗氧化酶，其特征在于，所述抗氧化酶采用权利要求1～6任一项所述的方法制得。
8.根据权利要求7所述的一种人工抗氧化酶，其特征在于，所述人工抗氧化酶能够清除ROS，包括清除H2O2和·O2 -。
9.根据权利要求7或8所述的一种人工抗氧化酶，其特征在于，所述人工抗氧化酶具有CAT和SOD活性。
10.权利要求1～6任一项所述的方法制得的人工抗氧化酶在制备治疗日光性皮炎、关节炎或干细胞保护材料中的用途。
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