CN118284417A

CN118284417A - Nurr1激动剂与醛固酮拮抗剂、胰岛素调节剂和磺酰脲中的至少一种的组合

Info

Publication number: CN118284417A
Application number: CN202280071517.2A
Authority: CN
Inventors: 乔治·沃吉特兹斯
Original assignee: Genesis Pharma Sa
Current assignee: Genesis Pharma Sa
Priority date: 2021-08-27
Filing date: 2022-08-26
Publication date: 2024-07-02
Also published as: WO2023026247A1; US20240366729A1; JP2024534156A; EP4392033A1

Abstract

本发明提供一种组合，其包括：(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和(b)至少一种另外的组分，其选自：(i)醛固酮拮抗剂；(ii)胰岛素调节剂；和(iii)磺酰脲。所述组合适合用于治疗卒中和其他神经退行性和神经炎症性病症，并且适合用于治疗和/或预防包括脑部和心脏在内的各种重要器官的缺血和/或再灌注损伤。本发明的其他方面涉及包括根据本发明的所述组合的药物产品和药物组合物，以及使用所述药物产品和所述药物组合物的治疗方法。

Description

Nurr1激动剂与醛固酮拮抗剂、胰岛素调节剂和磺酰脲中的至少一种的组合

技术领域

本发明提供了适用于治疗卒中、神经退行性病症、神经炎症、神经炎症性病症中的一种或以上，以及用于治疗和/或预防包括大脑和心脏在内的各种重要器官的缺血和/或再灌注损伤的组合。更具体地，本发明的组合包括Nurr1激动剂。

本发明的其他方面涉及包括所述组合的药物产品和药物组合物，以及使用所述组合进行治疗的方法。

背景技术

卒中是导致严重长期残疾的一个重要原因，也是美国第三大死亡原因。卒中是由大脑中缺乏血液流动(缺血性卒中)或大脑中的出血(出血性卒中)引起的，这两种情况均会导致脑细胞死亡。缺血性卒中占所有卒中的88％以上，是最常见的脑血管损伤类型。大脑中的缺血情况会致使神经元死亡，导致永久性的感觉运动缺陷。除了导致严重的身体残疾外，卒中还与记忆力丧失和抑郁有关。

根据世界卫生组织的统计，卒中是全球第二大死亡原因，2016年约有600万人因卒中死亡。全世界卒中的高重负表明，初级预防策略要么没有得到广泛实施，要么不够有效。已有指南可用于急性缺血性卒中的管理(Powers WJ,et al.Stroke.2019；50:e344–e418)。有趣的是，该指南得出的结论是，目前没有任何具有假定神经保护作用的药物或非药物治疗在改善缺血性卒中后的预后方面显示出疗效，因此不推荐使用其他神经保护剂。对于出血性卒中的管理也有相关指南；然而，除了复健之外，他们不建议对出血性卒中的神经退行性后果进行治疗(Hemphill JC 3rd,et al.Stroke.2015；46:2032–2060)。

上述数据清楚地表明，目前缺乏缺血性或出血性卒中的有效药物治疗，并且需要对卒中患者具有神经保护作用的治疗方法。有效治疗与卒中相关的再灌注损伤有可能提供神经保护。然而，到目前为止，基于减少再灌注损伤的、为卒中患者开发有效的神经保护治疗方法的尝试尚未成功(Savitz SI,et al.Stroke.2017；48:3413-3419；Patel RAG,etal.Prog Cardiovasc Dis.2017；59:542-548)。先前在心脏保护和再灌注损伤领域的研究揭示了一个令人惊讶的发现，即对于未曾用于治疗心血管病症的联合疗法，如果以低于这些联合疗法用于其他疾病的规定剂量水平的剂量水平使用，可以产生保护心肌免受再灌注损伤的显著协同效应(WO 2017/077378；US10,172,914；Genesis Pharma SA)。申请人的早期研究表明，使用磺酰脲和第二活性组分的联合疗法在治疗缺血和/或再灌注损伤、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞，或用于提供对心脏毒性药物的心脏保护，或用于提供对神经毒性药物的神经保护中具有潜在的治疗应用(WO2021/005147；Genesis Pharma SA)。特别是，申请人的研究表明，格列本脲与艾塞那肽和/或坎利酸钾的组合可以减轻脑梗塞的程度和/或改善神经功能损伤严重程度评分和/或改善运动表现。

显示出神经保护作用的治疗也有望用于治疗神经退行性病症。神经退行性病症是由于神经元的结构或功能的逐渐丧失，最终导致神经元死亡。这包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和血管性痴呆等目前无法治愈的疾病。神经炎症路径也被认为在神经退行性疾病中发挥着重要作用(Chen et al 2016；Liddelow et al2017)。

血管性痴呆是由脑供血问题引起的痴呆，通常是一系列轻微的卒中，导致加剧认知能力逐步下降。该术语是指由脑血管疾病和危险因素的复杂相互作用组成的综合征，这会产生由于卒中和病变导致的大脑结构的变化，并导致认知能力的变化。目前，没有任何药物被批准专门用于预防或治疗血管性痴呆。目前批准的阿尔茨海默病疗法只提供了些微益处(Atri A.Med Clin North Am.2019；103:263-293)并且缺乏强有力的证据证明其疗效。许多药物治疗可用于治疗帕金森病的运动和非运动症状，但它们本质上是对症治疗，并最终会诱发运动障碍，而它们均无法提供神经保护(Chaudhuri KR,et al.ParkinsonismRelat Disord.2016；33(Suppl 1):S2-S8)。目前只有两种获批的药物(利鲁唑和依达拉奉)可以减缓肌萎缩侧索硬化症的进展，尽管作用不大，同时对于亨廷顿病并没有获批的疗法。

因此，显然需要其他更好的治疗来提供神经保护，特别是在治疗卒中和神经退行性疾病、和/或在能够抑制神经炎症的治疗情境中。

发明内容

本发明提供了适用于预防或治疗缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上、或用于提供针对心脏毒性药物的心脏保护、或用于提供神经保护的组合。

有利地，本发明的本发明要求保护的组合和其他方面提供了一种治疗，与使用单一活性药剂的疗法相比，该治疗更有效并且具有优异的临床结果。特别地，与WO 2017/07378和WO 2021/005147中描述的组合相比，Nurr1激动剂的存在发挥了另外的和独特的作用机制，该作用机制被认为与神经退行性变高度相关。此外，在某些实施方案中，本发明要求保护的组合使得组成成分能够以比文献中教导的更低的剂量使用。

本发明的第一方面涉及一种组合，包括：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂；和

(iii)磺酰脲。

本发明的第二方面涉及药物组合物，其包括如上所述的组合和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的第三方面涉及一种药物产品，该药物产品包括：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂；和

(iii)磺酰脲。

本发明的第四方面涉及如上所述的组合或药物组合物或药物产品，用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或用于提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或用于提供神经保护的用途。

本发明的第五方面涉及一种治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的方法，所述方法包括对有需要的受试者同时、按顺序或单独施用：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂，和

(iii)磺酰脲。

本发明的第六方面涉及以下物质在制备用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的药物中的用途：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂，和

(iii)磺酰脲。

本发明的第七方面涉及一种组合的用途，其用于在移植之前或移植期间治疗和/或预防离体器官中的缺血和/或再灌注损伤，所述组合包括：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂，和

(iii)磺酰脲。

详细描述

以下列出的优选的实施方案视情况可适用于本发明的任何上述方面。

如本文所用，结构类似物，也称为化学类似物，是具有与另一种化合物相似的结构，但在某些组成方面与该另一种化合物不同的化合物。不同之处可以是一个或以上原子、官能团或亚结构被其他原子、基团或亚结构替代。至少理论上，可以想象由其他化合物形成的结构类似物。结构类似物通常是等电子的。

如本文所用，功能类似物是具有与另一种化合物相似的物理、化学、生物化学或药理学性质的化合物。功能类似物不一定是具有相似化学结构的结构类似物。

Nurr1激动剂

本文所述的组合、药物组合物和药物产品包括Nurr1激动剂与至少一种第二活性剂的组合。

Nurr1受体，也称为核受体4A2(NR4A2；核受体亚家族4组A成员2)是一种在人类中由NR4A2基因编码的蛋白质。NR4A2是细胞内转录因子核受体家族的成员，在维持大脑的多巴胺能系统中发挥关键作用(Sacchetti P,et al,2006)。该基因的突变与包括帕金森病和精神分裂症等多巴胺能功能障碍相关的病症有关。Nurr1也被认为在与某些神经退行性病症相关的神经炎症通路中发挥作用，所述神经退行性病症例如为ALS和阿尔茨海默病(Valsecchi et al.Dis.Model Mech.2020；13(5):dmm043513；Jeon et al.Aging Dis.,2020；11(3):705-724)。

在中枢神经系统中，炎症可由活化的小胶质细胞和其他促炎因子(如细菌脂多糖(LPS))引起。LPS与Toll样受体(TLR)结合，通过促进信号依赖性转录因子诱导炎症基因表达。已证明NR4A2通过减少小胶质细胞和星形胶质细胞中的炎症基因表达从而保护多巴胺能神经元以免出现LPS诱导的炎症。当NR4A2的短发夹在小胶质细胞和星形胶质细胞中表达时，这些细胞产生炎症介质如TNFα、NO合成酶和IL-1β，从而支持了减少的NR4A2促进了炎症发展并导致多巴胺能神经元细胞死亡的结论。NR4A2与炎症基因启动子上的转录因子复合体NF-κB-p65相互作用。然而，NR4A2依赖于其他因子才能参与这些相互作用。NR4A2需要被类泛素化(sumoylated)，且其共调节因子糖原合成酶激酶3需要被磷酸化才能发生这些相互作用。类泛素化的NR4A2募集CoREST，一种组装染色质修饰酶的由几种蛋白质组成的复合体。NR4A2/CoREST复合体抑制炎症基因的转录(Saijo K.et al；2009)。

Nurr1激动剂已被证明可以改善帕金森病动物模型中的行为缺陷(Kim etal.2015)。尸检研究表明，Nurr1在老年人和帕金森病(PD)患者死后的大脑中的表达均减少(Chu Y et al.2002；Chu Y,et al.2006)。此外，已在晚发家族性帕金森病的罕见病例中证实了Nurr1的功能性突变/多态性(Le WD,et al.2003)。此外，Nurr1杂合缺陷(heterozygous null)小鼠的表现类似于PD动物模型，因为它们表现出与纹状体中多巴胺(DA)水平降低和A9 DA神经元数量减少相关的旋转棒性能测试和自主活动的显著降低(Jiang C,et al.2005)。总之，这些发现有力地表明，Nurr1的功能/表达紊乱与DA神经元的神经退行性变有关，其激活可能改善PD的发病机制(Glass CK et al.2010)。

Kim等人(同上)成功鉴定出共享相同化学骨架4-氨基-7-氯喹啉的Nurr1激动剂，表明了关键的构效关系。特别是，发现阿莫地喹和氯喹通过与其配体结合结构域(LBD)的物理相互作用来刺激Nurr1的转录功能。值得注意的是，这些化合物能够通过进一步增加mDA特异性基因的转录激活和进一步增强小胶质细胞中的神经毒性促炎基因表达的反式阻遏来增强Nurr1的对比双重功能。重要的是，这些化合物显著改善了6-羟基多巴胺损伤的PD大鼠模型中的行为缺陷，并且没有任何可检测到的运动障碍类行为迹象。这些发现为靶向Nurr1 LBD的小分子可以用作PD的基于机制的神经保护策略提供了理论依据。

可以使用已知的测定方法鉴定合适的Nurr1激动剂(例如参见Kim 2015中所述)。在一个优选的实施方案中，本发明组合中的Nurr1激动剂选自阿莫地喹、氯喹、羟氯喹和格拉非宁及其可药用的盐：

阿莫地喹

在一个特别优选的实施方案中，本发明组合中的Nurr1激动剂是阿莫地喹或其可药用的盐。在一个优选的实施方案中，Nurr1激动剂是盐酸阿莫地喹。更优选地，Nurr1激动剂是阿莫地喹。

阿莫地喹是具有上述结构的化合物4-[(7-氯喹啉-4-基)氨基]-2[(二乙基氨基)甲基]-苯酚。阿莫地喹是治疗轻度疟疾的替代一线药物，已被证明可诱导大鼠肠系膜上动脉的血管舒张(Oluwatosin et al.2010)。研究还表明，阿莫地喹可以减轻脑出血(ICH)小鼠模型中的炎症事件和神经功能缺陷(Kinoshita et al.2019)。

特别是，Kinoshita证明了Nurr1(NR4A2)在ICH后小鼠纹状体血肿周围区域的小胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞中显著表达。ICH诱导后3小时开始每日施用阿莫地喹(40mg/kg，i.p.)可减少血肿周围的小胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞的活化。阿莫地喹还抑制了ICH诱导的IL-1β、CCL2和CXCL2的mRNA表达，并改善了小鼠的运动功能障碍，这表明Nurr1可作为ICH治疗的新靶点。

有利地，用于本发明组合的阿莫地喹的剂量显著低于文献中报道的剂量(例如，在Kinoshita et al.2019中的剂量)。

磺酰脲类药物

在某些实施方案中，本发明的组合或药物产品或药物组合物包括磺酰脲。

磺酰脲类药物是一类口服降糖药，主要用于控制2型糖尿病和某些形式的单基因糖尿病。磺酰脲类药物通过刺激胰腺β细胞分泌胰岛素来降低血糖水平。它们的主要靶标是β细胞质膜中的ATP敏感型钾(K_ATP)通道的磺酰脲受体(SUR1)亚基(Proks P,etal.Diabetes.2002；51(Suppl 3):S368-76；Gribble FM and ReimannF.Diabetologia.2003；46:875-891)。

磺酰脲类药物传统上分为两代，与它们进入临床中的时间一致，两代药物主要在它们的处置上存在差异，属于第二代的药物施用频率更低(Sola D，et al.Arch MedSci.2015；11:840-8)：

·第一代包括氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、醋磺己脲、氨磺丁脲、格列环脲、甲磺环己脲、美他己脲和妥拉磺脲；然而，这些不再用于临床实践；

·第二代包括格列本脲(glibenclamide或glyburide)、格列波脲、格列齐特、格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列派特和格列吡脲。一些第二代磺酰脲类药物(格列齐特、格列吡嗪)存在改性/缓释制剂。

优选地，本发明组合中的磺酰脲是第二代磺酰脲。目前的指南建议，当单独使用二甲双胍不能充分控制血糖时，将第二代磺酰脲类药物作为二线治疗与二甲双胍联用，如果两种药物联用仍不能充分控制血糖，则第二代磺酰脲类药物也可用于三种药物联合疗法(Garber AJ,et al.Endocr Pract.2019；25:69-100；Inzucchi SE,et al.DiabetesCare.2015；38:140-9)。决定是否使用磺酰脲时应考虑到患者的特点和与磺酰脲类药物相关的潜在不良事件(Cordiner RLM,Pearson ER.Diabetes Obes Metab.2019；21:761-771)。

在一个特别优选的实施方案中，磺酰脲是Sur-1受体拮抗剂。可以使用已知的测定方法鉴定合适的Sur-1受体拮抗剂。

在一个特别优选的实施方案中，磺酰脲是SUR1–TRPM4通道拮抗剂。可以使用已知的测定方法鉴定合适的SUR1–TRPM4通道拮抗剂。

本发明还包括磺酰脲类药物的结构或功能类似物，特别是那些经修饰以延长药剂半衰期的类似物，例如磺酰脲类药物的缀合物。

在一个优选的实施方案中，磺酰脲选自格列本脲(glibenclamide或glyburide)、格列波脲、格列齐特、格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列派特和格列吡脲。

在一个更优实施方案中，磺酰脲选自格列本脲及其结构和功能类似物。

磺酰脲优选选自格列本脲、格列美脲、格列吡嗪和格列齐特的酰腙、磺酰胺和磺酰硫脲衍生物。

在一个优选的实施方案中，磺酰脲是格列美脲，其具有如下所示的结构：

在一个优选的实施方案中，磺酰脲是格列齐特，其具有如下所示的结构：

在一个优选的实施方案中，磺酰脲是格列吡嗪，其具有如下所示的结构：

在一个特别优选的实施方案中，磺酰脲是格列本脲。

格列本脲的系统(IUPAC)命名为5-氯-N-[2-[4-(环己基氨基甲酰基-氨磺酰基)苯基]乙基]-2-甲氧基苯甲酰胺(化学式为C₂₃H₂₈ClN₃O₅S)，并且分子量为494；其具有以下化学结构：

本发明还包括格列本脲的结构和功能类似物，特别是那些经修饰以延长制剂半衰期的类似物，例如格列本脲的缀合物。

格列本脲(也称为优降糖)是一种磺酰脲受体-1(Sur-1)受体拮抗剂，其用作降血糖药以治疗糖尿病。正在对格列本脲进行开发以作为一种用于减轻脑损伤后的水肿的治疗方法，所述脑损伤例如为缺血性卒中、创伤性脑损伤和蛛网膜下腔出血，但迄今为止的结果并不一致(Wilkinson CM,et al.PLoS One.2019；14:e0215952；Xu F,et al.BrainBehav.2019；9(4):e01254；King ZA,et al.Drug Des Devel Ther.2018；12:2539-2552)。本发明人研究了格列本脲作为旨在减少再灌注损伤并潜在地产生神经保护作用的联合疗法的一部分的作用

格列本脲可作为仿制药获得，以许多商品名按照1.25mg、2.5mg和5mg的剂量出售，包括Gliben-J、Daonil、Diabeta、Euglucin、Gilemal、Glidanil、Glybovin、Glynase、Maninil、Micronase和Semi-Daonil。格列本脲作为口服片剂制剂(成人用)或作为口服混悬剂(儿童用)而用于治疗2型糖尿病。格列本脲治疗2型糖尿病的限定日剂量(DDD)对于具有更高生物利用度的微粉化制剂为7mg，对于常规制剂为10mg。限定日剂量(DDD)是根据WHO药物统计方法合作中心所限定的用于成人主要适应症的药物的假定平均每日维持剂量。DDD是一个计量单位，因此不一定反映推荐或处方日剂量。个体患者和患者组的治疗剂量通常与DDD不同，因为它们将基于个体特征(如年龄、体重、种族差异、疾病的类型和严重程度)和药代动力学考虑。格列本脲的DDD值来自WHO药物统计方法合作中心(见https://www.whocc.no/atc_ddd_index/？code＝A10BB01&show description＝yes)。作为初始治疗，格列本脲(微粉化制剂)的常用起始剂量为每日2.5mg至5mg，常用维持剂量为每日1.25mg至20mg，可单剂量或分剂量给予，与早餐或第一顿主餐一起施用(根据关于格列本脲片剂的FDA标签)。对于70kg的成年人，对应于约18μg/kg至约285μg/kg的维持剂量。

动物模型中的几项研究已经证明了格列本脲在炎症相关损伤中的保护作用，包括减少不良神经炎症和改善中枢神经系统损伤后的行为结果(Zhang G，et al.MediatorsInflamm.2017；2017:3578702)或缺血性和出血性卒中(Caffes N，et al.Int J MolSci.2015；16:4973-84)。在大鼠创伤性脑损伤模型中，格列本脲以10μg/kg的负荷剂量腹膜内施用，然后以200ng/hr的速度输注7天(Patel AD，et al.J Neuropathol ExpNeurol.2010；69:117-90)，而在创伤性脑损伤的小鼠模型中，在受控的皮层冲击损伤后，格列本脲的施用剂量为10μg持续3天(Xu ZM，et al.J Neurotumation.2017；34:925-933)。在脑缺血和再灌注损伤的啮齿类动物模型中，在再灌注前10分钟以1mg/kg的剂量施用格列本脲显示是有效的(Abdallah DM,et al.Brain Res.2011；1385:257-62)。在蛛网膜下腔出血的啮齿类动物模型中，格列本脲以10μg/kg的负荷剂量腹膜内施用、然后以200ng/hr的速度输注24小时(Simard,J.M,et al.Journal of Cerebral Blood Flow andMetabolism.2009；29；317–330)或一周(Tosun C,et al.Stroke.2013；44:3522-8)显示是有效的。在大鼠卒中的血栓栓塞模型中，在大脑中动脉闭塞后7天，通过连续输注施用格列本脲(75ng/h)可将脑水肿、梗塞体积和死亡率降低50％，其中梗塞体积的减少与皮质保留有关(Simard JM,et al.Nat Med.2006；12:433-40)。在小鼠实验性脑出血前或出血后2小时以10μg的剂量施用格列本脲显示出可以缓解脑水肿、血脑屏障破坏和神经功能缺损(XuF,et al.Brain Behav.2019；9:e01254)，在另一项研究中也获得了类似的发现(Jiang B,et al.Transl Stroke Res.2017；8:183–193)，但是，当在纹状体内注射胶原酶产生脑出血时，表明了在其他研究中已显示有效的广泛使用的格列本脲剂量(10μg/kg负荷剂量，然后200ng/h最多7天)是无效的(Wilkinson CM,et al.PLoS One.2019；14(5):e0215952)。

在一些临床试验中，格列本脲也显示出对卒中患者发挥有益作用。在对患有大脑半球大面积梗塞的患者进行的“格列本脲(glyburide)在恶性脑水肿和卒中治疗的优势研究(GAMES)”临床试验中，在前2分钟内以0.13mg静脉推注的形式静脉内施用(RP-1127)格列本脲(glyburide)，然后在前6小时内以0.16mg/h输注，然后在剩余66小时内以0.11mg/h输注。这揭示了关于脑肿胀(中线移位)、MMP-9、功能结果和死亡率的有前景的发现(King ZA,et al.Drug Des Devel Ther.2018；12:2539-2552)。在一项对急性大脑半球梗塞患者口服施用格列本脲的探究性研究中，显示出治疗是安全的，但该治疗并没有显著改善6个月的功能结果，尽管它与较轻的脑水肿有关，并且观察到不那么严重的残疾和死亡的轻微趋势(Huang K,et al.Acta Neurol Scand.2019May 29)。对急性缺血性卒中后几天内未服用磺酰脲类药物的糖尿病患者与服用磺酰脲类药物的糖尿病患者的数据进行回顾性分析发现，磺酰脲治疗与生存率提高、功能独立性增强、NIH卒中量表评分降低和出血性转换减少之间存在密切相关(Kunte H,et al.Ann Neurol.2012；72:799-806)。

上述临床前和临床发现可能与脑损伤如缺血后SUR1–TRPM4通道的上调有关(WooSK,et al.J Biol Chem.2013；288:3655-67；Mehta RI et al.J Neuropathol ExpNeurol.2015；74:835-49)。

已经报道了其他磺酰脲类药物在缺血和再灌注损伤动物模型中的神经保护作用，例如格列齐特的神经保护作用(Tan F,et al.Brain Res.2014；1560:83-90)，以及在其他组织的缺血和再灌注损伤动物模型中的保护作用，如格列美脲对心肌的保护作用(NishidaH et al.J Pharmacol Sci.2009；109:251-6)。

一些其他药物具有类似磺酰脲的胰岛素促分泌素作用；例子包括格列奈类药物(例如瑞格列奈、那格列奈和米格列奈)。此外，其他化合物，如白藜芦醇，已显示出可与磺酰脲受体结合(Hambrock A,et al.J Biol Chem.2007；282:3347-56)并在卒中和外伤性中枢神经系统损伤中具有神经保护作用(Lopez MS,et al.Neurochem Int.2015；89:75-82)。

申请人的研究以及在所附实施例中的更详细描述已经表明，即使磺酰脲仅以非常低的剂量施用，将磺酰脲(如格列本脲)与阿莫地喹和醛固酮拮抗剂(如坎利酸钾)联合施用也会产生临床有益效果。

胰岛素调节剂

在某些实施方案中，本发明的组合或药物组合物或药物产品包括胰岛素调节剂。

如本文所使用的，术语“胰岛素调节剂”是指能够直接或间接增加或降低胰岛素活性的药剂，继而可以增加或减少胰岛素介导的生理反应。

在一个实施方案中，胰岛素调节剂选自GLP-1激动剂、DPP-4抑制剂、PPAR激动剂、胰岛素以及它们的类似物。

GLP-1激动剂的例子包括艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、司美格鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(LY2189265)以及它们的可药用的盐。

DPP-4抑制剂的例子包括西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利格列汀、阿拉格列汀、特力利汀、阿格列汀、曲格列汀、吉格列汀、杜拓格列汀和奥格列汀(MK-3102)以及它们的可药用的盐。

PPAR激动剂的例子包括氯贝丁酯、吉非贝齐、环丙贝特、苯扎贝特、非诺贝特、萨格列扎、阿格列扎、莫格他唑和替格列扎以及它们的可药用的盐。

胰岛素类似物的例子包括赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素以及它们的可药用的盐。

因此，在一个实施方案中，胰岛素调节剂选自艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、司美格鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽、杜拉鲁肽(LY2189265)、西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利格列汀、阿拉格列汀、特力利汀、阿格列汀、曲格列汀、吉格列汀、杜拓格列汀、奥格列汀(MK-3102)、氯贝丁酯、吉非贝齐、环丙贝特、苯扎贝特、非诺贝特、萨格列扎、阿格列扎、莫格他唑、替格列扎、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素以及它们的可药用的盐。

在一个实施方案中，胰岛素调节剂是GLP-1激动剂，其选自艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、司美格鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(LY2189265)以及它们的可药用的盐。GLP-1激动剂优选是艾塞那肽。

艾塞那肽

在一个特别优选的实施方案中，胰岛素调节剂选自艾塞那肽、及其结构和功能类似物、及其可药用的盐。

在一个优选的实施方案中，艾塞那肽是可药用的盐的形式，更优选艾塞那肽乙酸盐的形式。在另一个优选的实施方案中，艾塞那肽是游离碱形式。

如本文所用，术语“艾塞那肽”是指具有以下序列的39-mer肽：

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

艾塞那肽(Exendin 4的同义词)最初是在1992年由Eng从希拉毒蜥(Helodermasuspectum)的唾液中分离出来的。它是一种具有类似于人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的葡萄糖调节作用的胰岛素促分泌素。

艾塞那肽模拟人胰高血糖素样肽1(GLP-1)，一种响应于营养素摄入而释放的肠道肠降血糖素激素(Goke et al.,J.Biol.Chem.,1993,268:19650-19655)。它通过GLP-1受体而发挥促胰岛素性能和胰岛素模拟性能。GLP-1受体广泛表达于许多器官中，包括心脏和血管内皮(Bullock et al.,Endocrinology,1996,137:2968-2978；Nystrom et al.,Am JPhysiol Endocrinol Metab,2004,287:E1209-E1215)。目前，艾塞那肽已被批准为抗糖尿病药物，用于治疗患2型糖尿病患者。该适应症的推荐剂量为起始剂量5μg(μg)，每日两次，1个月后根据临床反应增加至10μg，每日两次。

GLP-1作为治疗剂是无效的，因为其由于二肽基肽酶-4的快速降解而具有非常短的循环半衰期(不到2分钟)。艾塞那肽与GLP-1具有50％的同源性，但由于不存在二肽基肽酶-4切割位点，因此在人体中的半衰期为2.4小时。

艾塞那肽增强胰腺β细胞的葡萄糖依赖性胰岛素分泌，抑制不适当升高的胰高血糖素分泌，并减缓胃排空。艾塞那肽非常有效，在人体内的最低有效浓度为50pg/mL(12pM)。目前艾塞那肽的治疗包括每日两次注射此外，缓释制剂已被批准每周注射一次。

如本文所用，艾塞那肽的功能类似物是指具有相似结构、但在某些方面与其不同的化合物(例如，该功能类似物的一个或以上原子、官能团、氨基酸残基或亚结构可能与之不同，它们被其他原子、官能团、氨基酸残基或亚结构代替)。功能类似物表现出相似的药理学性质，并可能在结构上相关。

在一个实施方案中，艾塞那肽的结构或功能类似物为经修饰以延长半衰期的艾塞那肽形式，例如艾塞那肽的缀合物。

在一个优选的实施方案中，艾塞那肽的结构或功能类似物为PEG化的艾塞那肽。例如，在一个优选的实施方案中，结构或功能类似物为具有40kDa的PEG的单PEG化的艾塞那肽。可以通过本领域的已知方法来制备PEG化的艾塞那肽。举例来说，在WO2013/059323(Prolynx LLC)中描述了艾塞那肽的PEG化形式，其内容通过引入并入本文。艾塞那肽还可以与其他分子(例如蛋白质)缀合。

在一个特别优选的实施方案中，艾塞那肽的结构或功能类似物为缓释形式，例如以商品名销售的缓释形式。在另一个优选的实施方案中，艾塞那肽的结构或功能类似物为用于持续递送的多层纳米颗粒形式，例如，如Kim J Y et al,Biomaterials,2013；34:8444-9中所述的形式，其内容通过引入并入本文。

在另一个特别优选的实施方案中，艾塞那肽为可注射形式，如以商品名销售的可注射形式。

艾塞那肽的功能类似物包括GLP受体激动剂。合适的艾塞那肽的功能类似物包括利西拉肽、阿必鲁肽、司美格鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(LY2189265)。

在一个实施方案中，艾塞那肽的功能类似物包括经修饰的艾塞那肽，其中将一个或以上氨基酸残基替换为另一个氨基酸残基和/或其中使一个或以上氨基酸残基缺失和/或其中添加和/或插入一个或以上氨基酸残基。

在一个实施方案中，相对于艾塞那肽，艾塞那肽功能类似物包括小于10个氨基酸修饰(置换、缺失、添加(包括插入)以及它们的任意组合)，或者相对于艾塞那肽，包括小于9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个修饰。

在一个实施方案中，相对于艾塞那肽，艾塞那肽功能类似物包括10个氨基酸修饰(置换、缺失、添加(包括插入)以及它们的任意组合)，或者相对于艾塞那肽，包括9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个修饰。

艾塞那肽的结构和功能类似物还包括其盐、同分异构体、对映异构体、溶剂化物、多晶型物、前药和代谢物。

醛固酮拮抗剂

在某些实施方案中，本发明的组合或药物组合物或药物产品包括醛固酮拮抗剂。

急性心肌梗塞及其随后的血液动力学变化导致复杂的神经激素激活作用。肾素-血管紧张素-醛固酮通路是这种神经激素激活作用的一个基础。据报道，醛固酮在急性心肌梗塞后表现出最高水平，可促进广泛的有害心血管效应，包括急性内皮功能障碍、NO活性抑制、内皮氧化应激增加、血管张力增加、对组织再捕获儿茶酚胺的抑制、血管平滑肌细胞和心肌细胞坏死迅速发生、血管中胶原沉积、心肌肥大和纤维化(Struthers,Am Heart J,2002,144:S2-S7；Zannad and Radauceanu,Heart Fail Rev,2005,10:71-78)。此外，已经发现它可以预测不良结果(Beygui et al,Circulation,2006,114:2604-2610)。

醛固酮拮抗剂或抗盐皮质激素是利尿药物，可拮抗醛固酮对盐皮质激素受体的作用。这组药物通常用于治疗慢性心力衰竭。这类成员也用于治疗醛固酮增多症(包括Conn综合征)和女性多毛症(由于另外的抗雄激素作用)。大多数抗盐皮质激素为甾体类螺旋内酯甾酮。

盐皮质激素受体的拮抗作用抑制肾脏中肾单位收集管中的钠吸收。这会干扰钠/钾交换，减少尿钾排泄，并微弱地增加水分排泄(利尿)。在充血性心力衰竭中，除了其他药物外，还使用醛固酮拮抗剂来发挥额外的利尿作用，从而减轻水肿和心脏负荷。

根据EPHESUS试验的结果，目前的指南推荐在心肌梗塞后出现心力衰竭的患者中使用盐皮质激素受体拮抗剂。

在急性心肌梗塞动物模型和临床上的几项研究表明，醛固酮阻断剂在预防STEMI患者再灌注损伤和改善心脏功能方面具有益处。文献中有迹象表明，盐皮质激素受体拮抗剂可能对脑血管系统和在卒中期间具有有益效果(Dinh QN,et al.Neural RegenRes.2016；11:1230-1)。

用于本发明组合的醛固酮拮抗剂的例子包括螺旋内酯甾酮(此类中第一个也是使用最广泛的成员)、依普利酮(对靶标的选择性比螺旋内酯甾酮更强，但效力和有效性略低)、坎利酮和坎利酸钾、非奈利酮(非甾体类并且比依普利酮或螺旋内酯甾酮有效性和选择性更好)和丙利酮(prorenone)。一些药物除了它们的主要作用机制之外，还具有次要的抗盐皮质激素作用。例子包括黄体酮、屈螺酮、孕二烯酮和贝尼地平。

在一个特别优选的实施方案中，醛固酮拮抗剂是坎利酸钾。

本发明还包括醛固酮拮抗剂的结构和功能类似物，特别是经修饰以便延长药物半衰期的醛固酮拮抗剂的结构和功能类似物，例如醛固酮拮抗剂缀合物。

坎利酸钾

坎利酸钾(potassium canrenoate或canrenoate potassium)也称为坎利酸的钾盐，其是一种螺旋内酯甾酮类的醛固酮拮抗剂。与螺旋内酯甾酮一样，它是一种前药，在体内被代谢为坎利酮。通常以200mg/天至600mg/天的剂量范围静脉内给予坎利酸钾，用于治疗醛固酮增多症或低钾血症。

坎利酸钾的系统(IUPAC)命名法名称为3-[(8R,9S,10R,13S,14S,17R)-17-羟基-10,13-二甲基-3-氧-2,8,9,11,12,14,15,16八氢-1H-环戊并[a]菲-17-基]丙酸钾，分子式为C₂₂H₂₉KO₄，化学结构如下：

组合

在一个方面，本发明涉及一种组合，该组合包括以下组分、或基本上由以下组分组成、或由以下组分组成：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂；和

(iii)磺酰脲。

以下描述的优选的实施方案经必要修改后适用于本发明的其他方面，包括方法、用途、产品和组合物。

在一个实施方案中，根据胰岛素调节剂的上述实施方案中的任一项来定义胰岛素调节剂。

在一个实施方案中，根据醛固酮拮抗剂的上述实施方案中的任一项来定义醛固酮拮抗剂。

在一个实施方案中，根据磺酰脲的上述实施方案中的任一项来定义磺酰脲。

在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，该组合包括以下组分、或基本上由以下组分组成、或由以下组分组成：

阿莫地喹或其可药用的盐；

醛固酮拮抗剂；和

以下组分中的至少一种：胰岛素调节剂和磺酰脲。

阿莫地喹或其可药用的盐；

格列本脲、格列波脲、格列齐特、格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列派特、格列吡脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、醋磺己脲、氨磺丁脲、格列环脲、甲磺环己脲、美他己脲和妥拉磺脲中的至少一种；和

艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、司美格鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(LY2189265)或它们的可药用的盐中的至少一种，以及

坎利酸钾、坎利酮、螺旋内酯甾酮、依普利酮、非奈利酮和丙利酮或它们的可药用的盐中的至少一种，视情况而定。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合，该组合包括以下组分、或基本上由以下组分组成、或由以下组分组成：

阿莫地喹或其可药用的盐；

坎利酸钾、坎利酮、螺旋内酯甾酮、依普利酮、非奈利酮和丙利酮或它们的可药用的盐中的至少一种(视情况而定)。

阿莫地喹或其可药用的盐；

阿莫地喹或其可药用的盐；和

艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、司美格鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(LY2189265)或它们的可药用的盐中的至少一种。

在一个实施方案中，本发明涉及以下各组分的组合、或由以下各组分组成、或基本上由以下各组分组成、或包括以下各组分：

阿莫地喹或其可药用的盐；和

艾塞那肽或其可药用的盐。

阿莫地喹或其可药用的盐；

坎利酸钾，以及

格列本脲、格列波脲、格列齐特、格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列派特、格列吡脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、醋磺己脲、氨磺丁脲、格列环脲、甲磺环己脲、美他己脲和妥拉磺脲中的至少一种。

阿莫地喹或其可药用的盐；

坎利酸钾，以及

格列本脲、格列波脲、格列齐特、格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列派特和格列吡脲中的至少一种。

在一个实施方案中，本发明涉及以下各组分的组合或包括以下各组分：

阿莫地喹或其可药用的盐；

坎利酸钾、坎利酮、螺旋内酯甾酮、依普利酮、非奈利酮和丙利酮或它们的可药用的盐中的至少一种(视情况而定)，以及

格列本脲。

阿莫地喹；

坎利酸钾；和

格列本脲。

在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，该组合包括：

阿莫地喹或其可药用的盐；

在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，该组合包括：

阿莫地喹或其可药用的盐；

坎利酸钾。

在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，该组合包括：

阿莫地喹或其可药用的盐；

艾塞那肽或其可药用的盐；和

在一个实施方案中，本发明涉及以下各组分的组合、或包括以下各组分：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹或其可药用的盐；

艾塞那肽或其可药用的盐；和

格列本脲。

阿莫地喹或其可药用的盐；

艾塞那肽或其可药用的盐；和

坎利酸钾。

阿莫地喹或其可药用的盐；

艾塞那肽或其可药用的盐

坎利酸钾；和

格列本脲。

在本发明的一个方面，对于上述各实施方案，所述组合由Nurr1激动剂(例如阿莫地喹或其可药用的盐)和磺酰脲和/或醛固酮拮抗剂和/或胰岛素调节剂组成，即这些是唯一存在的活性剂。在另一(替代)方面，该组合还可包括一种或以上如下文所述的另外的活性剂。

在上述各实施方案中，除了活性剂之外，所述组合任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、载体或赋形剂。

如本文所用，“主要由……组成”一词是指可以存在特定的其他组分，即那些不会对所述组合或组合物的基本特性产生实质性影响的组分。

在一个优选的实施方案中，在根据本发明的组合或药物组合物或药物产品中不存在其他药物活性剂，即，存在的唯一药物活性剂是Nurr1激动剂和至少一种选自醛固酮拮抗剂、胰岛素调节剂、和磺酰脲的另外的组分。然而，该组合任选地还可包括其他非活性成分，例如一种或以上可药用的稀释剂、载体或赋形剂。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种药物产品或药物组合物，其由以下组分组成：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂；和

(iii)磺酰脲；和

(c)可药用的稀释剂、赋形剂或载体。

优选的实施方案经必要修改后适用于第一方面，例如，关于活性物质的选择和排列。

药物组合的效果本质上是不可预测的，而且往往存在一种药物部分或完全抑制另一种药物的效果的倾向。本发明证明，包括Nurr1激动剂(如阿莫地喹)和至少一种选自磺酰脲(如格列本脲)、胰岛素调节剂(如艾塞那肽)和醛固酮拮抗剂(如坎利酸钾)的另外的活性组分的组合，当同时、单独或按顺序施用时，不会导致两种药剂之间的任何显著或严重的不良相互作用。意想不到地不存在任何这种拮抗作用对该组合的临床应用至关重要。

此外，根据本发明的优选组合令人惊讶地证明了单个组分的效果增强，使得药剂的最佳剂量低于这些药剂在批准的适应症中的推荐剂量，和/或也低于文献中报道的剂量。

在一个实施方案中，与单独施用的各药物相比，本发明的活性剂的组合产生了增强的效果。

因此，在一个优选的实施方案中，该组合具有协同效应，即至少两种活性物质以协同(即大于相加)的方式相互作用。

举例来说，申请人的研究表明，在本发明要求保护的组合的情况下，格列本脲的优选剂量显著低于文献中先前报道的用于降低血糖(例如糖尿病)的剂量。事实上，本发明要求保护的组合中使用的格列本脲的优选剂量比用于治疗糖尿病的格列本脲(微粉化制剂)的推荐维持剂量低大约20倍至285倍(对于格列本脲的微粉化制剂，推荐维持日剂量为1.25mg至20mg，对于70kg的成年人，对应于18μg/kg至285μg/kg，而本发明要求保护的联合治疗中所要求的格列本脲的优选剂量可以低至1μg/kg体重)。有利的是，以这些优选的较低剂量使用格列本脲避免了否则可能导致不良副作用的对血糖水平的任何影响。申请人的研究还表明，格列本脲与低剂量的艾塞那肽和/或坎利酸钾作为根据本发明的双或三联组合的临床有效剂量也显著低于文献中发表的临床研究中显示出具有神经保护作用的格列本脲的剂量(0.16mg/h或0.11mg/h的连续输注，即每日3.84mg或2.64mg)(参见King ZA etal)。

此外，在另一个实施方案中，本发明的活性剂的组合产生意想不到的协同作用，如短暂性大脑中动脉闭塞的大鼠模型所证明的。

两种或以上药物的组合可能导致不同类型的药物相互作用。当两种药物的组合效果等于单独给予的各药剂的效果之和时，药物相互效果被称为相加效果。如果两种药物的联合效果超过单独给予的各药物的效果，则称药物相互作用具有协同作用(Goodman andGilmans"The Pharmacological Basis of Therapeutics",12th Edition)。

联合疗法是许多疾病情境(settings)的重要治疗方式，包括心血管疾病、癌症和传染病。最近的科学进展增加了对这些和其他复杂疾病背后的病理生理过程的理解。这种理解的增加使得通过使用针对多个治疗靶点的药物组合来进一步推动开发新的治疗方法，以提高治疗反应，最大限度地减少耐药性的形成，或最大限度地减少不良事件。在联合疗法提供显著治疗优势的情境中，人们对开发两种或以上药物的新组合越来越感兴趣。

有利地，协同组合可以允许各组分以较低剂量存在，从而降低治疗的毒性，同时产生和/或保持相同的治疗效果或增强的治疗效果。因此，在一个特别优选的实施方案中，该组合的各个组分以亚治疗量存在。术语“亚治疗有效量”是指低于通常单独使用各药物治疗产生治疗效果所需的量。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：Nurr1激动剂或其可药用的盐和胰岛素调节剂，任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐和胰岛素调节剂，任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：Nurr1激动剂或其可药用的盐和磺酰脲，任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐和磺酰脲，任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：Nurr1激动剂、磺酰脲和醛固酮拮抗剂，任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐、磺酰脲和醛固酮拮抗剂，任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：Nurr1激动剂、胰岛素调节剂和醛固酮拮抗剂，任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐、胰岛素调节剂和醛固酮拮抗剂，任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：Nurr1激动剂、胰岛素调节剂、磺酰脲和醛固酮拮抗剂，任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐、胰岛素调节剂、磺酰脲和醛固酮拮抗剂，任选地还包括一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐、磺酰脲以及：坎利酸钾、坎利酮、螺旋内酯甾酮、依普利酮、非奈利酮和丙利酮或它们的可药用的盐中的至少一种，视情况而定。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：

阿莫地喹或其可药用的盐；

格列本脲、格列波脲、格列齐特、格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列派特和格列吡脲中的至少一种；和

艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、司美格鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(LY2189265)或它们的可药用的盐中的至少一种；和

坎利酸钾。

阿莫地喹或其可药用的盐；

格列本脲、格列波脲、格列齐特、格列吡嗪、格列美脲、格列喹酮、格列派特和格列吡脲中的至少一种；

艾塞那肽或其可药用的盐；和

坎利酸钾。

阿莫地喹或其可药用的盐；

坎利酸钾、坎利酮、螺旋内酯甾酮、依普利酮、非奈利酮和丙利酮或它们的可药用的盐中的至少一种；

艾塞那肽或其可药用的盐；和

阿莫地喹或其可药用的盐；

坎利酸钾、坎利酮、螺旋内酯甾酮、依普利酮、非奈利酮和丙利酮或它们的可药用的盐中的至少一种；和

艾塞那肽或其可药用的盐。

阿莫地喹或其可药用的盐；

坎利酸钾；和

阿莫地喹或其可药用的盐；

坎利酸钾；和

阿莫地喹或其可药用的盐；

格列本脲。

阿莫地喹或其可药用的盐；

艾塞那肽，或其结构或功能类似物，或其可药用的盐；和

格列本脲，或其结构或功能类似物，或其可药用的盐。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐以及艾塞那肽或其可药用的盐。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐、艾塞那肽或其可药用的盐以及坎利酸钾。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐、坎利酸钾以及格列本脲(glibeclamide)。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐、艾塞那肽或其可药用的盐以及格列本脲。

在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括以下组分、或由以下组分组成：阿莫地喹或其可药用的盐、坎利酸钾、格列本脲以及艾塞那肽或其可药用的盐。

其他活性药物成分

在一个实施方案中，上述组合、药物组合物和药物产品包括至少一种另外的活性药物成分(API)。

在一个实施方案中，上述组合可进一步包括选自β受体阻滞剂、肾素-血管紧张素抑制剂、他汀类药物(HMG-CoA还原酶抑制剂)、血小板活化或聚集抑制剂、磷酸二酯酶-3抑制剂、钙增敏剂、抗氧化剂和抗炎剂中的至少一种另外的API。

β-阻滞剂的例子包括普萘洛尔、美托洛尔、布新洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尓、喷布洛尔、吲哚洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。

肾素-血管紧张素抑制剂包括血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素AT₁受体抑制剂和肾素抑制剂。

血管紧张素转换酶抑制剂的例子包括卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、咪达普利、群多普利、西拉普利和福辛普利。

血管紧张素AT₁受体拮抗剂的例子包括氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦和替米沙坦。

肾素抑制剂的例子包括雷米克仑和阿利克仑。

钙增敏剂的例子包括左西孟旦及其类似物。

他汀类药物的例子包括阿托伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀。

血小板激活或聚集抑制剂的例子包括前列环素(依前列醇)及其结构和功能类似物(例如曲前列环素、伊洛前列素)、不可逆环加氧酶抑制剂(例如阿司匹林、三氟柳)、二磷酸腺苷(ADP)受体抑制剂(例如氯吡格雷、普拉格雷、替卡格雷、噻氯匹定)、磷酸二酯酶抑制剂(例如西洛他唑)、蛋白酶激活受体-1(PAR-1)拮抗剂(例如沃拉帕沙)、糖蛋白IIB/IIIA抑制剂(例如阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班)、腺苷再摄取抑制剂(例如双嘧达莫)以及血栓烷抑制剂，包括血栓素合成酶抑制剂和血栓素受体拮抗剂(例如特鲁曲班)。

磷酸二酯酶-3(PDE-3)抑制剂的例子包括氨力农、米力农及其类似物。

抗氧化剂的例子包括抗坏血酸、硫辛酸、谷胱甘肽、褪黑素和白藜芦醇。

抗炎剂的例子包括COX-2抑制剂(例如塞来昔布)、糖皮质激素(例如氢化可的松)和非甾体抗炎药(例如布洛芬)。

在一个实施方案中，上述组合包括至少一种选自下列物质的其他API：普萘洛尔、美托洛尔、布新洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尓、喷布洛尔、吲哚洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔、卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、咪达普利、群多普利、西拉普利、福辛普利、氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、替米沙坦、雷米克仑、阿利克仑、褪黑素和白藜芦醇。

在另一个实施方案中，上述组合包括至少一种选自下列物质的其他API：卡维地洛、美托洛尔、氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、替米沙坦、卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、咪达普利、群多普利、西拉普利、福辛普利、雷米克仑、阿利克仑、褪黑素和白藜芦醇。

在另一个实施方案中，上述组合包括至少一种选自卡维地洛、美托洛尔、褪黑素和白藜芦醇的其他API。

可药用的盐

本发明的活性药剂可以作为可药用的盐存在。

本发明药剂的可药用的盐包括其合适的酸加成盐或碱盐。对合适的药用盐的综述可以参见Berge et al.,J Pharm Sci,66,1-19(1977)。盐是用(例如)下列酸形成的：强无机酸，如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸(例如HCl、HBr)；强有机羧酸，如具有1至4个碳原子的未取代或取代(例如，被卤素取代)的链烷羧酸，如乙酸；饱和或不饱和二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未取代或取代(例如，被卤素取代)的(C₁-C₄)-烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。

对映异构体/互变异构体

本发明还适当地包括活性药剂的全部对映异构体和互变异构体。本领域技术人员将会鉴定出具有光学性质(一个或以上手性碳原子)或互变异构特性的化合物。可以通过本领域已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变异构体。

立体和几何异构体

本发明的一些活性剂药剂可以以立体异构体和/或几何异构体的形式存在，它们可能具有一个或以上不对称中心和/或几何中心，因此可以两个或以上立体异构和/或几何异构的形式存在。本发明涵盖那些抑制剂的所有单独的立体异构体和几何异构体、及其混合物的用途。权利要求中所使用的术语包括这些形式，条件是所述形式保持了合适的功能活性(虽然不必具有相同程度)。

本发明还包括活性药剂或其可药用盐的所有合适的同位素变型。本发明的药剂或其可药用盐的同位素变型被定义为这样的情况：至少一个原子被具有相同原子序数、但原子量不同于通常在自然界中所发现的原子量的原子替代。能够引入药剂及其可药用盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如它们分别为²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。药剂及其可药用盐的某些同位素变型在药物和/或基质组织分布研究中是有用的，例如那些引入放射性同位素(例如³H或¹⁴C)的同位素变型。就容易制备和检测而言，氚(即³H)和碳-14(即¹⁴C)同位素是特别优选的。此外，利用同位素(例如氘，即²H)进行置换可以提供一定程度的治疗优势，这归因于其具有更大的代谢稳定性，例如体内半衰期的延长或剂量需求的减少，因此其在某些情况下可能是优选的。通常，可以通过常规方法采用合适药剂的适当同位素变型来制备本发明药剂和其可药用盐的同位素变型。

溶剂化物

本发明还包括本发明活性药剂的溶剂化物形式。权利要求中使用的术语涵盖了这些形式。

多晶型物

本发明还涉及以它们各种结晶形式、多晶型形式和无水/水合形式存在的本发明的活性药剂。制药业中已经有如下的成熟方法：通过稍微改变用于合成制备此类化合物的纯化方法和/或溶剂分离方法，可以分离出任何此类形式的化合物。

药物组合物

在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含如上所述的根据本发明的组合和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

虽然本发明的化合物(包括它们的可药用的盐)可以单独施用，但它们通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合施用，特别是用于人体治疗。药物组合物可以分别用于人类医学或兽医学中的人类或非人类动物应用。

用于本文所述的各种不同形式的药物组合物的这些合适的赋形剂的例子可以参见由A Wade和PJ Weller编辑的“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第2版，(1994)。

用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是众所周知的，并且(例如)在Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑，1985)中说明。载体(或如果存在不止一种载体的话各个载体)必须在与制剂的其他成分相容且对受者无害的意义上是可接受的。合适载体的例子包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。合适的稀释剂的例子包括乙醇、甘油和水。

药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药物实践进行选择。施用途径的例子包括经肠胃外(例如，静脉内、肌内、皮内、腹膜内或皮下)、口服、吸入、经皮(局部)、眼内、离子电渗和经粘膜施用。

药物组合物可包括任何合适的一种或以上粘结剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂、缓冲剂、调味剂、表面活性剂、增稠剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等作为载体、赋形剂或稀释剂，或除载体、赋形剂或稀释剂之外该药物组合物可包括任何合适的一种或以上粘结剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂、缓冲剂、调味剂、表面活性剂、增稠剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等，以及为了使制剂与预期受者的血液等渗而包括的物质。

合适的粘结剂的例子包括淀粉、明胶、天然糖类(如葡萄糖、无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂)、天然和合成树胶(如阿拉伯胶、黄花胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素和聚乙二醇。

合适的润滑剂的例子包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。

药物组合物中可以加入防腐剂、稳定剂、染料、甚至调味剂。防腐剂的例子包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

药物制剂包括那些适用于口服、局部(包括经皮肤、口腔和舌下)、直肠或胃肠外(包括皮下、皮内、肌内和静脉内)、鼻腔和肺部施用(例如通过吸入)的药物制剂。在适当的情况下，该制剂可以方便地以离散的剂量单位存在，并且可以通过药学领域中公知的任何方法制备。所有方法均包括使活性化合物与液体载体或被精确划分的固体载体或两者结合的步骤，然后，如有必要，将产物成形为所需的制剂。

在一个实施方案中，药物组合物用于口服施用。适合口服施用的药物制剂(其中载体是固体)最优选以单位剂量制剂的形式存在，例如丸剂、胶囊或片剂，其各自均含有预定量的活性化合物。片剂可以与任选地一种或以上辅助成分一起压缩或模制而制成。可以通过以下方式制备压缩片剂：在合适的机器中压缩自由流动形式的活性化合物，例如任选与粘结剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合的粉末或颗粒。可以通过用惰性液体稀释剂模制活性化合物来制备模制片剂。片剂可以任选地被包衣，并且如果未包衣，可以任选地进行刻痕。可以通过将活性化合物单独或与一种或以上辅助成分混合，填充到胶囊壳中，然后以常规方式密封来制备胶囊。扁囊剂类似于胶囊，其中活性化合物与任何一种或以上辅助成分一起密封在米纸封中。也可以将活性化合物配制成分散颗粒，其可以例如在施用前悬浮在水中，或撒在食物上。颗粒可以被包装在如小袋中。其中载体是液体的适合口服施用的制剂，可以以水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、或水包油液体乳液的形式存在。

口服施用的制剂包括控释剂型，例如片剂，其中活性化合物被配制在适当的控释基质中或用适当的控释膜包衣。这样的制剂会特别便于预防性用途。

适合直肠施用的药物制剂(其中载体是固体)最优选以单位剂量栓剂的形式提供。合适的载体包括可可脂和本领域常用的其他材料。可以通过将活性化合物与一种或以上软化或熔化的载体混合，然后冷却并在模具中成型而方便地形成栓剂。适于胃肠外施用的药物制剂包括活性化合物在含水或含油载剂(vehicle)中的无菌溶液或悬浮液。

可注射制剂可适于团注或连续输注。在单位剂量或多剂量容器中方便地提供这种制剂，所述容器在引入制剂后被密封直到需要使用。或者，活性化合物可以是粉末形式，其在使用前由合适的载剂构成，例如无菌的、无热原的水。

活性化合物也可配制为长效制剂(long-acting depot preparations)，其可通过肌内注射或植入，例如皮下或肌内方式施用。长效制剂可以包括(例如)合适的聚合物或疏水性材料、或离子交换树脂。这种长效制剂特别便于预防用途。

提供适于经由口腔进行肺部施用的制剂，使得含有活性化合物并且理想地直径范围在0.5微米至7微米的颗粒被递送到受者的支气管树中。

作为一种可能性，这样的制剂是精细粉碎粉末的形式，其可以方便地以适用于吸入装置中的可穿刺胶囊(如明胶)提供，或者可替代地作为自推进制剂提供，所述自推进制剂包括活性化合物、合适的液体或气体推进剂以及任选的其他成分，例如表面活性剂和/或固体稀释剂。合适的液体推进剂包括丙烷和氯氟烃，合适的气体推进剂包括二氧化碳。也可以使用自推进制剂，其中活性化合物以溶液或悬浮液的液滴形式分配。

这种自推进制剂类似于本领域已知的那些，并且可以通过既定程序进行制备。自推进制剂适于在容器中提供，该容器设置有具有所需喷雾特性的手动可操作或自动工作的阀；有利地，阀是计量型的，在每次操作时递送固定体积，如25微升至100微升。

作为另一种可能性，活性化合物可以是用于雾化器或喷雾器的溶液或悬浮液的形式，由此使用加速气流或超声震荡来产生用于吸入的细液滴雾。

在另一个实施方案中，药物组合物用于鼻内施用。适于鼻腔施用的制剂包括通常类似于上述肺部施用的那些制剂。当分配时，此类制剂应当理想地具有在10微米至200微米范围内的粒径，以使得能够保留在鼻腔中；这可以通过适当地使用合适颗粒尺寸的粉末或选择合适的阀来实现。其他合适的制剂包括：粒径在20微米至500微米范围内的粗粉末，用于从紧贴鼻子的容器通过鼻腔通道快速吸入而施用；以及在水溶液或油溶液或悬浮液中包含0.2％w/v至5％w/v活性化合物的滴鼻剂。

可药用的载体是本领域技术人员熟知的，包括但不限于0.1M、优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％的盐水。此外，这种可药用的载体可以是水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载剂包括氯化钠溶液、葡萄糖林格氏液、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液、或不挥发性油。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

适于局部制剂的制剂可以例如以凝胶、乳膏或软膏的形式提供。这种制剂可以例如应用于伤口或溃疡，或者直接涂抹在伤口或溃疡的表面上，或者载于合适的支持载体上，例如绷带、纱布、网状物或类似物，可将这些支持载体应用于并覆盖待治疗的区域上。

还可以提供液体或粉末制剂，其可以直接喷或洒在待治疗的部位(例如伤口或溃疡)上。或者，可以将制剂喷或洒在载体如绷带、纱布、网状物等上，然后将其应用于待治疗部位。

根据本发明的另一个方面，提供了一种制备如上所述的药物组合物的方法，该方法包括使一种或以上活性化合物与载体结合，例如通过混合与载体结合。

通常，通过使活性剂与液体载体或细分固体载体或两者均匀紧密地结合，然后在必要时使产品成型来制备制剂。本发明延及制备药物组合物的方法，包括使本文所述的化合物与药用或兽用载体或载剂混合或结合。

在一个实施方案中，药物组合物用于经肠胃外施用(例如，静脉内、动脉内、鞘内、肌内、皮内、腹膜内或皮下)。优选地，由无菌或可灭菌溶液制备组合物。

在另一个实施方案中，药物组合物用于静脉内、肌内或皮下施用。

在另一个实施方案中，药物组合物用于静脉内施用。

用于经肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括下列组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及渗透压调节剂，如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)来调节pH。

适合于注射用途的药物组合物可以包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor^TM或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有的情况下，用于经肠胃外施用的组合物必须是无菌的并且应当为达到易于注射程度的流体。在制造和储存条件下应该是稳定的，并且必须防腐以抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染影响。

可以通过这样的方式来制备无菌可注射溶液：按需将所需量的活性化合物与上文列举的一种成分或多种成分的组合加入到合适的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物加入到无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂含有基础分散介质和来自上文列举的那些所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这些方法可以从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分以及任何其他所需成分的粉末。本发明还涵盖包括活性剂的脂质体和纳米颗粒制剂。这些制剂以及它们的制备方法对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。

药物产品

在另一个方面，本发明涉及一种药物产品，其包括以下组分、或由以下组分组成：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂；和

(iii)磺酰脲。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种药物产品，该药物产品包括：

阿莫地喹或其可药用的盐；

醛固酮拮抗剂；和

以下组分中的至少一种：胰岛素调节剂和磺酰脲。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种药物产品，该药物产品由以下组分组成、或基本上由以下组分组成：

阿莫地喹或其可药用的盐；

醛固酮拮抗剂；和

以下组分中的至少一种：胰岛素调节剂和磺酰脲。

在另一个方面，本发明涉及一种药物产品，该药物产品包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

在另一个方面，本发明涉及一种药物产品，该药物产品由以下组分组成、或基本上由以下组分组成：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

在一个优选的实施方案中，药物产品的各组分用于单独施用。

在一个优选的实施方案中，将各组分组合成单一制剂。

在一个实施方案中，药物产品是包括用于治疗过程的所有必要设备(例如，药物小瓶、稀释剂小瓶、注射器和针头)的部件的套件。

套件和药物产品的组分如上所定义。在优选的实施方案中，套件或药物产品的各组分与一种或以上可药用的稀释剂、赋形剂和/或载体混合。

在一个实施方案中，套件包括用于各个活性剂的单独容器。所述容器可以是安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶。

在另一个实施方案中，套件包括含有各个活性剂的组合制剂的容器。

套件可以进一步包括用于治疗和/或预防再灌注损伤的说明书。

治疗用途

本发明还涉及上述组合、药物产品或药物组合物用于治疗下文详细说明的各种治疗性病症，以及与之相关的治疗方法。

本发明的一个方面涉及如本文所述的组合、药物组合物或药物产品用于治疗和/或预防下列疾病中的一种或以上的用途：缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞，或用于提供针对心脏毒性药物的心脏保护的用途，或用于提供神经保护的用途。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗或预防卒中。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗或预防卒中的神经退行性后果。

卒中是指流向大脑的血液较差导致细胞死亡。卒中主要有两种类型：缺血性卒中，由于缺乏血液流动；出血性卒中，由于出血。它们会导致部分大脑功能异常。卒中的体征和症状可能包括身体一侧无法移动或没有感觉，理解或说话有问题，感觉世界在旋转，或一侧失明等。缺血性卒中通常是由血管堵塞引起的。缺血性卒中的治疗包括手术，以为那些有问题的狭窄患者打开(再灌注)连接大脑的动脉。如果缺血性卒中是在三到四个半小时内发现的，可以用可以分解血栓的药物进行治疗。2013年，卒中是仅次于冠状动脉疾病的第二大常见死亡原因，死亡人数为640万(占总数的12％)。

缺血性卒中和急性心肌梗塞需要紧急再灌注以改善功能结果(Patel and Saver,2013,Stroke,44:94-98)。长期以来，静脉注射组织型纤溶酶原激活剂一直是唯一一种证明对急性缺血性卒中患者具有临床疗效的再灌注疗法。正如在急性心肌梗塞中发生的那样，在急性缺血性卒中中恢复再灌注的血管内方法可能会使患者面临更大的缺血/再灌注损伤，从而由于促进均被视为再灌注损伤标志物的出血转化和严重的血管源性水肿而不利于获得再通的益处(Bai and Lyden.2015；Int J stroke,10:143-152)。实验证据表明，可以通过缺血预处理和缺血后处理来减轻脑缺血再灌注损伤(如心肌再灌注损伤那样)。格列本脲已经显示出可增强大鼠严重卒中后早期失温的疗效(Zhu S,et al.Aging Dis.2018；9:685-695)。此外，在临床相关的卒中大鼠模型(大脑中动脉闭塞)中，4.5小时后开始再灌注，同时施用重组组织纤溶酶原激活剂，然后在缺血开始后4.5h或10h开始施用格列本脲(10μg/kg IP负荷剂量加上200ng/h持续皮下输注)；格列本脲显著降低了24h时的半球肿胀和48h时的死亡率，并提高了48h时的Garcia评分，这表明格列本脲的治疗窗口延长至缺血发生后10h。这一发现与回顾性临床研究中的观察结果一致，表明在急性缺血性卒中后rt-PA辅助再通/再灌注的情境下使用磺酰脲类药物是有益的(Simard,JM,etal.Ann.N.Y.Acad.Sci.2012；1268:95–107)。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗或预防脑出血(ICH)。

在一个优选的实施方案中，卒中是出血性卒中。

在另一个优选的实施方案中，卒中是缺血性卒中。缺血性卒中是再灌注损伤最常见的临床指征之一。

本申请人使用短暂性大脑中动脉闭塞的大鼠模型进行的研究表明，当在灌注前20分钟施用并在灌注后7天每日两次施用时，与用载剂治疗的对照相比，用本发明组合的治疗提高了神经功能评分并显著减小了梗塞面积(参见实施例2)。此外，可在较长的时间内观察到与治疗相关的有利效果。例如，当在灌注后立即治疗并在灌注后每日两次持续28天时，与载剂对照相比，三联疗法显著提高了神经功能评分，并改善了踏步实验和前肢放置实验的表现。在研究的第2周期间，用本发明的组合进行的治疗也显著改善了高架十字迷宫实验中的焦虑。此外，28天后，在物体识别认知实验中观察到认知功能得到改善，并且梗塞面积的显著减小(参见实施例3)。

因此，与目前批准可用的短期治疗相比，用低剂量的根据本发明的组合进行的长期治疗为治疗卒中和其他慢性病症提供了一种新的治疗方法。由于在卒中后并未停止损害的形成，而是甚至在循环恢复后继续，因此长期低剂量施用根据本发明的组合在治疗上是有利的。同时，长期低剂量施用可以最大限度地减少通常与传统短期高剂量治疗相关的副作用。用根据本发明的组合治疗卒中被理解为两步法。第一步涉及最大限度地减少再灌注损伤的有害影响，第二步涉及卒中后的免疫应答，从而改善大脑功能的恢复。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗或预防神经炎症或神经炎症性病症。

神经炎症被定义为神经组织的炎症，可由各种不同的刺激引发。神经炎症被广泛认为是中枢神经系统的慢性炎症而非急性炎症(Streit WJ et al,July 2004,Journal ofNeuroinflammation；1(1):14)。慢性炎症涉及神经胶质细胞的持续激活和将其他免疫细胞募集进入大脑。慢性神经炎症的常见诱因包括：有毒代谢物、自身免疫、老化、微生物、病毒、创伤性脑损伤、脊髓损伤、空气污染和被动吸烟。

小胶质细胞是中枢神经系统的先天免疫细胞(Gendelman HE,December 2002,Journal of Neurovirology；8(6):474-9)，其响应于神经损伤而主动调查它们的环境，并显著改变它们的细胞形态(Garden GA,October 2013,Neurotherapeutics.10(4):782–8)。星形胶质细胞是参与维持/支持神经元的胶质细胞，是血脑屏障的重要组成部分。星形胶质细胞在中枢神经系统中大量存在，为神经元提供营养支持，促进突触的形成和功能，并通过吞噬作用修剪突触，此外还实现一系列其他维持内环境稳定的功能。在大脑受到损伤后，如创伤性脑损伤，星形胶质细胞可能会响应于损伤的神经元或激活的小胶质细胞释放的信号而被激活(Mayer CL et al,Headache.53(9):1523–30；Ebert SE et al,Eur J Neurol2019.doi:10.1111/ene.13971)。星形胶质细胞一旦被激活，则可能会释放各种生长因子并发生形态学变化。

星形胶质细胞被认为既有保护作用，也有有害作用。Liddelow等人(Nature,2017,Jan 26；541(7638):481-487)区分了两种不同类型的反应性星形胶质细胞，分别称为“A1”和“A2”。缺血诱导的反应性星形胶质细胞(称为A2星形胶质细胞)被认为可以促进中枢神经系统的恢复和修复，而在神经炎症中由激活的小胶质细胞诱导的星形胶质细胞(称为A1反应性星形胶质细胞)则失去其正常的星形胶质细胞功能并变得具有神经毒性。

Liddelow等人公开了神经毒性星形胶质细胞在中枢神经系统对神经炎症、急性中枢神经系统损伤和许多神经退行性疾病的病理反应中起着关键作用。在脑损伤后，或在某些疾病中，星形胶质细胞经历了一种称为“反应性星形胶质细胞增生(reactiveastrocytosis)”的戏剧性转变，上调许多基因的表达并形成胶质瘢痕。在激活的小胶质细胞诱导下，A1反应性星形胶质细胞失去其大部分正常星形胶质细胞功能而获得新的神经毒性功能，快速杀死神经元和成熟分化的少突胶质细胞。Liddelow证明，中枢神经系统损伤后，A1在体内迅速形成，导致急性中枢神经系统受伤后的神经元死亡。Liddelow进一步证明，急性中枢神经系统损伤后抑制A1反应性星形胶质细胞的形成能够防止轴突切断神经元(axotomized neuron)的死亡。

申请人通过组织病理学研究表明，与对照载剂相比，用阿莫地喹/坎利酸钾/格列本脲的三联组合治疗使得NG2少突胶质细胞祖细胞的具有统计学意义地减少。活化的小胶质细胞的减少与有害的A1反应性星形胶质细胞的减少一致。申请人的其他研究表明，与对照载剂相比，用本发明的三联组合处理减少了GFAP标志物(代表反应性星形胶质细胞)，而且还减少了Iba-1(小胶质细胞)，这再次与A1反应性星形胶质细胞的减少一致。通过双皮质素染色测量，研究还显示神经形成增加。在所附实施例中列出了这些实验的其他细节(具体参见实施例3)。

总之，这些研究表明，根据本发明的组合对神经炎症通路具有作用。在不希望受理论约束的情况下，本发明要求保护的组合可以用于保护细胞免受神经毒性影响(例如，由有毒物质的累积或阻止其去除引起)并且/或支持修复机制。根据Liddelow(Nature 2017)中描述的机制通路，上述组织病理学结果表明，本文所述的组合在治疗各种神经炎症性病症和/或具有神经炎症组分的疾病中具有治疗应用。

众所周知，神经炎症也在神经退行性疾病中发挥作用(Chen et al.2016)。最近的数据表明，炎症过程、特别是促炎细胞因子的作用，与多种神经退行性通路密切相关。特别是，已知A1反应性星形胶质细胞存在于许多神经退行性疾病中，包括阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、ALS和MS(Liddelow et al,2017)。神经炎症的细胞和分子机制在老化和代谢性疾病、高血压、糖尿病、抑郁症和痴呆症或脑损伤(如卒中)后可能是相同的。虽然多种机制可能是阿尔茨海默病(AD)中的神经退行性变的病因和进展的原因，但现在已经广泛认可和接受了神经炎症的致病作用(Onyango et al,2021)。Kinoshita等人的研究表明，Nurr1激动剂阿莫地喹可减轻脑出血小鼠模型中的炎症事件和神经功能缺陷(Kinoshita etal.2019)。更具体地，研究表明，从ICH诱导后3小时开始每日施用阿莫地喹(40mg/kg，腹腔内)减少了血肿周围的小胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞的活化。阿莫地喹还抑制了ICH诱导的IL-1β、CCL2和CXCL2的mRNA表达，并改善了小鼠的运动功能障碍。阿莫地喹的施用不仅减轻了与神经胶质细胞激活相关的炎症反应，而且改善了ICH后的神经系统结果。

在一个优选的实施方案中，神经炎症性病症选自阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性视神经炎(AON)、横贯性脊髓炎和视神经脊髓炎(NMO)。

在一个优选的实施方案中，神经炎症与创伤性脑损伤、脊髓损伤、老化、精神分裂症、抑郁症、偏头痛、癫痫、神经病理性疼痛、唐氏综合症、自闭症、早产儿、青光眼或病毒感染有关。

神经炎症在偏头痛的病理生理学中起着重要作用，神经炎症通路(特别是涉及炎症小体蛋白质的通路)是很有前途的治疗候选靶点(Kurson et al.2021)。

在一个优选的实施方案中，神经炎症与老化有关。老化的特征是神经炎症的进行性增加，这会导致认知障碍，与老化和包括阿尔茨海默病在内的与年龄相关的神经退行性疾病有关。

在一个实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗老化相关疾病(通常称为年龄相关疾病或“ARD”)。从本质上讲，老化相关疾病是由衰老引起的并发症，区别于老化过程本身。老化相关疾病的例子有：动脉粥样硬化和心血管疾病、癌症、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压和阿尔茨海默病。所有这些疾病的发病率均随着年龄的增长呈指数级增长。

随着衰老的增加，ARD出现频率通常越来越高，这种现象的特征是细胞分裂停止。衰老是一种细胞程序，它对受损细胞或老的细胞施加稳定的阻滞，以避免它们复制。除了生长停滞之外，衰老细胞还经历深刻的表型变化，包括染色质重组、β-半乳糖苷酶(称为衰老相关β-半乳糖苷酶或SA-β-Gal)活性增加以及多种因子(主要是促炎因子)的分泌，这些统称为衰老相关分泌表型(SASP)。衰老细胞在老化过程中累积并与许多疾病有关，包括癌症、纤维化和许多与年龄有关的病理。最近的证据表明，衰老细胞在多种病理中是有害的，它们的消除带来了许多优点、改善了多种病理并延长了健康期和寿命。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗或预防神经退行性疾病，优选选自帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和血管性痴呆。

在一个优选的实施方案中，神经退行性病症是帕金森病。

在一个优选的实施方案中，神经退行性病症是肌萎缩侧索硬化症(ALS)。

在一个优选的实施方案中，神经退行性病症是血管性痴呆。在所附实施例中更详细地说明了根据本发明的组合在血管性痴呆大鼠模型中的作用的研究(参见实施例1)。

在一个优选的实施方案中，神经退行性病症是阿尔茨海默病。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于提供神经保护，甚至更优选用于提供针对神经毒性药物的神经保护。

如本文所用，术语“神经保护”是指例如通过预防、减少或延迟可能导致神经元死亡和神经退行性病症(如阿尔茨海默病、帕金森病或血管性痴呆)的脑损伤来保护包括大脑在内的神经实体。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于提供卒中中的神经保护。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于在神经退行性病症中提供神经保护。

在一个实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于为受试者提供针对药物的神经毒性作用的神经保护。在Gouzoulis-Mayfrank和Daumann(Dialogues ClinNeurosci.2009；11(3):305-17)中说明神经毒性药物的例子。神经毒性药物包括滥用药物(如3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺、甲基苯丙胺和苯丙胺)、杀虫剂(如有机磷杀虫剂)、某些化疗药物(如铂)和多巴胺。

在一个实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于为受试者提供针对药物(例如蒽环类药物)心脏毒性作用的心脏保护。在Bovelli等人(Annals ofOncology 21(Supplement 5):v277-v282,2010)中描述了心脏毒性药物的例子。

如本文所用，术语“心脏保护”是指(例如)通过预防、减少或延迟心肌损伤来保护心脏。心脏毒性药物包括与心脏衰竭相关的药物、与缺血或血栓栓塞相关的药物、与高血压相关的药物、与其他毒性作用相关的药物，如填塞和心内膜心肌纤维化、出血性心肌炎、缓慢型心律失常、雷诺现象、自主神经病、QT间期延长或尖端扭转型室速或肺纤维化。心脏毒性药物的例子包括：蒽环类/蒽醌类、环磷酰胺、曲妥珠单抗和其他基于单克隆抗体的酪氨酸激酶抑制剂、抗代谢物(氟尿嘧啶、卡培他滨)、抗微管剂(紫杉醇、多烯紫杉醇)、顺铂、沙利度胺、贝伐单抗、舒尼替尼、索拉非尼、白消安、紫杉醇、长春碱、博来霉素、长春新碱、三氧化二砷、博来霉素和甲氨蝶呤。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤。

如本文所用，术语“再灌注损伤”是指当在缺血一段时间后血液供应返回组织时对组织造成的损伤。血液中缺乏氧气和营养物质会造成这样的情况，在这种情况下，循环的恢复会通过诱导氧化应激而导致炎症、线粒体功能障碍和氧化损伤，而不是恢复正常功能。再灌注损伤可以发生在自发发生事件(例如动脉阻塞)或计划事件(例如许多外科手术干预中的任何一种)之后。心肌再灌注损伤可能发生在(例如)心肌梗塞后，或作为心脏移植的结果而发生。脑再灌注损伤可发生在(例如)缺血性卒中后或作为新生儿窒息的结果而发生。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗和/或预防卒中中的再灌注损伤。

在更优选的实施方案中，缺血和/或再灌注损伤是脑、心脏、肺、肾的缺血和/或者再灌注损伤，优选脑缺血、脑再灌注损伤或者卒中。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗和/或预防容易受再灌注损伤影响的脑、心脏、肺、肾或其他器官/组织的再灌注损伤。

在一个实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗和/或预防容易受缺血影响的脑、心脏、肺、肾或其他器官/组织的缺血。

在一个实施方案中，缺血和/或再灌注损伤是脑的缺血和/或再灌注损伤，优选脑缺血和/或脑再灌注损伤。

在一个实施方案中，缺血和/或再灌注损伤是心脏的缺血和(或)再灌注损伤，优选心肌缺血和/或心肌再灌注损伤。

在另一个实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗和/或预防脑(brain)的再灌注损伤，优选脑(cerebral)再灌注损伤。

在另一个实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗和/或预防心脏缺血，优选心肌缺血。

在一个特别优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗和/或预防急性心肌梗塞。急性心肌梗塞是再灌注损伤最常见的临床指征之一。

在一个实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗患有心源性休克的受试者。心源性休克是一种危及生命的医学状况，由心室原发性功能衰竭而导致的血液循环不足引起。在2％至10％的因心肌梗塞住院的患者中发生心源性休克，其是这些患者死亡的主要原因(Holmes et al,1995,J Am Coll Cardiol,26:668-674)。更具体而言，心源性休克是一个复杂过程的结果，包括氧气输送失败、全身ATP缺乏和由心脏泵衰竭引发的多器官功能障碍(Okuda,2006,Shock,25:557-570)。由于这是一种循环性休克，组织灌注不足，无法满足对氧气和营养的需求。这种状况涉及越来越普遍的因氧气匮乏(缺氧)和营养匮乏(如低血糖)的细胞死亡。正因为如此，它可能导致心脏骤停(或循环停止)，这是心脏泵功能的突然停止(以及呼吸停止和意识丧失)。心源性休克是指尽管左心室充盈压力足够，但持续低血压并伴有组织灌注不足。组织灌注不足的症状包括尿量低(<30mL/小时)、四肢凉和意识水平改变。几项大型实验已经证明，冠状动脉重建术是提高患者生存率的最重要策略(Hochman et al,1999,N Engl J Med,341:625-634)。然而，尽管进行了急性重建术，但发生心源性休克的患者仍预后较差，这可能是由于再灌注损伤而导致的，并认为与产生的梗塞面积有关。事实上，已经证明了低温在心肌缺血中能够提供组织保护，并且临床前研究已经显示出在实验诱导的心肌梗塞中减少梗塞面积的有益结果(Dae et al,2002,AmJ Physiol Heart Circ Physiol,282:H1584-H1591)。因此，在猪模型中，轻度低温治疗降低了心源性休克的急性死亡率，并改善了血液动力学参数(Gotberg et al,2010,Resuscitation,81:1190-96)。

在一个实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗患有心脏骤停的受试者。心脏骤停是指由于心脏无法有效收缩而导致的有效血流突然停止。心脏骤停最常见的原因是冠状动脉疾病。心脏骤停的治疗方法是立即心肺复苏(CPR)，如果出现可电击心律，则进行除颤。在美国，每年每10,000人中约有13人(326,000例)发生院外心脏骤停。另有209,000例发生医院内心脏骤停(Kronick et al,Circulation,2015,132:S397-S413)。除了提供高质量的心肺复苏外，优化心脏骤停后综合征的管理对于改善心脏骤停患者的长期效果至关重要。在这种综合征(“心脏骤停后综合征”)中，有三个主要的重点领域：(1)心脏骤停后的脑损伤；(2)心脏骤停后心肌功能障碍和再灌注损伤；和(3)全身缺血再灌注反应。现在很清楚的是，复苏后的护理会影响幸存者的长期生存率以及心肌和神经系统的恢复和功能(Kern,2015,Circ J,79:1156-1163)。

在一个实施方案中，受试者有血管闭塞损伤或心脏缺血再灌注损伤的风险(或易受其影响)。

在一个实施方案中，在心脏移植之前和/或期间和/或之后，将如本文所述的组合或药物组合物或药物产品施用给供体受试者和/或受体受试者。例如，在一些实施方案中，所述组合可施用于第一受试者，其中将从所述第一受试者取出心脏器官以移植到第二受试者。此外或可选地，在一些实施方案中，在将心脏器官引入第二受试者之前，将所述组合施用于取出的心脏器官。此外或可选地，在一些实施方案中，在心脏移植之前、期间和/或之后对第二受试者施用所述组合的疗法。

在一个优选的实施方案中，本文所述的组合或药物组合物或药物产品用于治疗或预防新生儿窒息。

新生儿窒息(或围生期窒息)是由于新生儿缺氧而导致的医疗状况，其在出生过程中持续时间足够长会对身体造成伤害，通常是对大脑造成伤害。新生儿窒息最常见的原因是(例如)由于循环或灌注不足、呼吸努力受损或通气不足所导致的分娩期间母体血压下降或其他对婴儿大脑血流的干扰。

新生儿窒息会对婴儿的大部分器官(心脏、肺、肝脏、肠道、肾脏)造成缺氧性损伤，但脑损伤是最令人担忧的，并且可能最不可能迅速或完全治愈。在更突出情况中，婴儿会存活下来，但大脑损伤表现为精神损伤(如发育迟缓或智力残疾)或身体损伤(如痉挛)。患有严重围生期窒息的婴儿通常在以下方面不佳：肤色(发绀)、灌注、反应性、肌肉张力和呼吸努力。重度窒息可导致心脏骤停和死亡。足月出生的新生儿中，每1000名新生儿中就有2至10人发生新生儿窒息，早产新生儿的窒息率更高。世界卫生组织估计，每年有400万新生儿死于出生窒息，占5岁以下儿童死亡人数的38％。

在一个优选的实施方案中，如本文所述的组合或药物组合物或药物产品被配制用于静脉内施用。

在一个优选的实施方案中，如本文所述的组合或药物组合物或药物产品被配制用于皮下施用。

在一个优选的实施方案中，如本文所述的组合或药物组合物或药物产品被配制用于口服施用。

在一个优选的实施方案中，如本文所述的组合或药物组合物或药物产品被配制用于鼻内施用。

另一方面涉及以下物质在制备用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的药物中的用途：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂，和

(iii)磺酰脲。

本发明的一个优选的实施方案涉及以下物质在制备用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的药物中的用途：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

本发明的另一个优选的实施方案涉及以下物质在制备用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的药物中的用途：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

另一方面涉及一种治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的方法，所述方法包括对有需要的受试者同时、按顺序或单独施用：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂，和

(iii)磺酰脲。

经必要修改后适用上面描述的本发明优选的实施方案。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，更优选地是人类。

在一个优选的实施方案中，该方法包括对有需要的受试者同时、按顺序或单独施用：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

施用

本发明的药物组合物可适于经直肠、鼻腔、支气管内、局部(包括口腔和舌下)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内、动脉内和皮内)、腹膜内或鞘内施用。优选的制剂经口服施用制剂。制剂可以方便地以单位剂量的形式(即包括单位剂量的离散部分形式)提供，或以单位剂量的数倍或亚单位的形式提供。例如，制剂可以是片剂和缓释胶囊的形式，并且可以通过药学领域中公知的任何方法制备。

本发明中用于口服施用的制剂可以以以下形式提供：离散单位，如胶囊、凝胶剂(gellule)、滴剂、扁囊剂、丸剂或片剂，其各自均含有预定量的活性剂；粉末或颗粒；活性剂在水性液体或非水性液体中的溶液、乳液或悬浮液；或者水包油液体乳液或油包水液体乳液；或者大丸药等。优选地，这些组合物每剂量包含1mg至250mg活性成分，并且更优选为10mg至100mg活性成分。

对于口服施用的组合物(如片剂和胶囊)，术语“可接受的载体”包括载剂，如常见赋形剂，例如粘合剂，如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填料和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和褐藻酸；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他金属硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯硬脂酸、硅油、滑石蜡、油和胶体二氧化硅。也可以使用诸如薄荷、冬青油、樱桃调味剂等调味剂。可能需要添加着色剂以使剂型易于识别。也可以通过本领域熟知的方法对片剂进行包衣。

片剂可以通过任选地与一种或以上辅助成分一起压缩或模制制成。可以通过以下方式制备压缩片剂：在合适的机器中压缩自由流动形式的活性化合物，例如任选与粘结剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的粉末或颗粒。可以通过在合适的机器中对用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物进行模制来制备模制片剂。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以进行配制以提供缓释或受控释放的活性剂。

适于口服施用的其他制剂包括：锭剂(lozenge)，其包括在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性剂；锭剂(pastille)，其包括在惰性基质(如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性剂；以及漱口水，其包括在合适的液体载体中的活性剂。

其他的施用形式包括可经静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内或肌内注射的溶液或乳液，所述溶液或乳液由无菌或可灭菌的溶液制备。可注射形式通常每剂量包含10mg至1000mg，优选10mg至250mg的活性成分。

本发明的药物组合物也可以是栓剂、阴道栓剂、悬浮液、乳液、涂液(lotions)、软膏、乳膏、凝胶、喷雾剂、溶液或粉剂的形式。

经皮施用的另一种方式是使用皮肤贴剂。例如，可以将活性成分掺入由聚乙二醇或液体石蜡的水性乳液组成的乳膏中。还可以将活性成分以1重量％至10重量％的浓度掺入由白蜡或白色软石蜡基料以及可能需要的稳定剂和防腐剂组成的软膏中。

该组合的药物活性组分可以单独施用或作为组合制剂施用。优选地，药物活性组分是单独施用的。

各组分均可以通过与其他组分相同或不同的途径施用。

在另一个优选的实施方案中，所述组合的各组分通过相同的途径施用。

在另一个优选的实施方案中，所述组合的各组分通过多于一种途径施用。例如，在一个优选的实施方案中，胰岛素调节剂经皮下施用，并且该组合的其他组分经口服施用。

在一个优选的实施方案中，所述组分经肠胃外施用(例如，静脉内、肌内、皮内、腹膜内或皮下)。

在一个优选的实施方案中，所述组分经静脉内、肌内或皮下施用。更优选地，所述组分经静脉内施用。

在另一个优选的实施方案中，所述组分经口服施用。

在一个优选的实施方案中，所述组分经皮下施用。

在另一个优选的实施方案中，所述组分经鼻内施用。

在一个优选的实施方案中，所述组分每日施用一次。

在另一个优选的实施方案中，所述组分每日施用两次。

在一个优选的实施方案中，在治疗的不同阶段通过多于一种途径施用所述组分。

在一个优选的实施方案中，在第一施用阶段和至少第二施用阶段施用所述组分。

在第一施用阶段内，可以通过相同或不同的施用途径施用组合的各组分。

在第二施用阶段内，可以通过相同或不同的施用途径施用组合的各组分。

在一个优选的实施方案中，在第一施用阶段期间，所述组分经肠胃外施用，更优选静脉内施用。通常，第一施用阶段发生在临床环境中，例如医院或诊所。

在第二施用阶段期间，可以通过与第一施用阶段相同或不同的途径施用组合的组分。

在一个优选的实施方案中，在第二施用阶段期间，通过与第一施用阶段不同的途径施用组合的组分，例如经口服、鼻内或皮下施用，更优选口服。该第二施用阶段可以称为长期施用阶段，并且可以持续较长的时间，例如数天、数周或数月。

在一个优选的实施方案中，在第一施用阶段和至少一个第二施用阶段施用所述组分，其中所述第一施用阶段的组分经肠胃外施用，并且所述至少一个第二施用阶段的组分经口服施用。

在一个优选的实施方案中，在第一施用阶段和至少一个第二施用阶段施用所述组分，其中所述第一施用阶段的组分经静脉内施用，并且所述至少一个第二施用阶段的组分经口服施用。

在一个优选的实施方案中，在第一施用阶段和至少一个第二施用阶段施用所述组分，其中所述第一施用阶段的组分经肠胃外施用，并且所述至少一个第二施用阶段的组分经鼻内施用。

在一个优选的实施方案中，在第一施用阶段和至少一个第二施用阶段施用所述组分，其中所述第一施用阶段的组分经静脉内施用，并且所述至少一个第二施用阶段的组分经鼻内施用。

在一个优选的实施方案中，在第一施用阶段和至少一个第二施用阶段施用所述组分，其中所述第一施用阶段的组分经肠胃外施用，并且所述至少一个第二施用阶段的组分经皮下施用。

在一个优选的实施方案中，在第一施用阶段和至少一个第二施用阶段施用所述组分，其中所述第一施用阶段的组分经静脉内施用，并且所述至少一个第二施用阶段的组分经皮下施用。

在一个优选的实施方案中，在第二施用阶段通过不同途径施用组合的各组分。例如，在一个优选的实施方案中，胰岛素调节剂经皮下施用，并且该组合的其他组分经口服施用。

在一个优选的实施方案中，第一施用阶段包括每日施用1或2剂的该组合，持续约1至约7天，更优选约2至约7天。

在一个优选的实施方案中，在第一施用阶段：

Nurr1激动剂的施用剂量为0.05mg/kg至0.5mg/kg；

胰岛素调节剂的施用剂量为0.01μg/kg至0.1μg/kg；

醛固酮拮抗剂的施用剂量为0.1mg/kg至1mg/kg；

磺酰脲的施用剂量为0.5μg/kg至5μg/kg。

优选地，在第一施用阶段，Nurr1激动剂、胰岛素调节剂、醛固酮拮抗剂和磺酰脲以上述剂量每日施用一次或两次，施用时间为约1至约7天，更优选为约2至约7日。

在一个优选的实施方案中，第二施用阶段包括在第一施用阶段结束后约7至约90天的时间内每日施用1或2剂。

在一个优选的实施方案中，在第一施用阶段结束后立即开始第二施用阶段。例如，在一个优选的实施方案中，第一施用阶段在某一天结束，随后在第二天开始第二施用阶段。

在另一个优选的实施方案中，第一施用阶段和第二施用阶段相隔一段时间，在此期间不施用本发明组合的任何组分，即在第一施用阶段和第二施用阶段之间存在延迟。例如，该时间段(或延迟)可以是至少1、2、3、4、5、6、7、14或21天。

在一个优选的实施方案中，本发明包括第一施用阶段(其包括每日1或2剂的所述组合的第一剂量)持续约1至约7天，更优选2至约7天，随后是第二施用阶段(其包括每日1或2剂的所述组合的第二剂量)持续7至90天的时间。优选地，第一剂量和第二剂量不同。

优选地，第二剂量低于第一剂量，即第二施用阶段可以被认为是“长期”施用阶段。如本文所用，“第一剂量”和“第二剂量”在各情况下均是指组合的相应组分的剂量。在不希望受理论约束的情况下，认为在第一施用阶段施用更高的剂量有利于减轻再灌注损伤的有害影响，而在第二施用阶段，例如在更长的时间内施用较低剂量，可能对卒中后的免疫应答潜在有益，从而改善脑功能的恢复。

在另一个优选的实施方案中，第二施用阶段包括在第一施用阶段结束后的至少30天的时间周期内每日施用1或2剂的所述组合的第二剂量。在另一个优选的实施方案中，第二施用阶段包括在第一施用阶段结束后的至少60天周期内每日施用1或2剂的所述组合的第二剂量。在另一个优选的实施方案中，第二施用阶段包括在第一施用阶段结束后至少90天的时间周期内每日施用1或2剂的所述组合的第二剂量。

在一个优选的实施方案中，在第二施用阶段：

Nurr1激动剂的施用剂量为0.05mg/kg至0.5mg/kg；

胰岛素调节剂的施用剂量为0.01μg/kg至0.1μg/kg；

醛固酮拮抗剂的施用剂量为0.1mg/kg至1mg/kg；

磺酰脲的施用剂量为0.5μg/kg至5μg/kg。

优选地，在第二施用阶段，Nurr1激动剂、胰岛素调节剂、醛固酮拮抗剂和磺酰脲以上述剂量在第一施用阶段结束后的7至90天时间周期内每日施用一次或两次。

在一个优选的实施方案中，所述方法包括同时向所述受试者施用所述组分。

在一个优选的实施方案中，所述组合、药物产品或药物组合物的各个药物活性组分是单独施用的。

本发明组合的组分可以同时、按顺序或单独施用(作为给药方案的一部分)。

阿莫地喹、艾塞那肽或其结构或功能类似物或其可药用的盐、坎利酸钾或其结构或功能类似物、以及格列本脲或其结构或者功能类似物或其可药用的盐可以同时、按顺序或者单独施用(作为给药方案的一部分)。

如本文所用，“同时”是指同时施用两种药剂。

如本文所用，“按顺序”是指活性剂不是同时施用的，而是一种接一种地施用。因此，“按顺序”施用可以允许在一种药剂施用之后的5分钟、10分钟或几小时内施用另一种药剂，前提是第一种施用药剂的循环半衰期使得它们二者同时以治疗有效量存在。各组分施用之间的时间延迟将取决于各组分的确切性质、组分之间的相互作用及其各自的半衰期而不同。

与“按顺序”相反，在本文中“单独”是指施用一种药剂和另一种药剂之间存在较长间隔，即当施用第二种药剂时，第一种施用的药剂可能不再以治疗有效量存在于血流中。

在一个实施方案中，所述组分是同时施用的。

在一个实施方案中，所述组分是按顺序或单独施用的。

对于两种组分的组合，这两种组分可以以任何顺序同时或单独施用。

对于三种组分的组合，所有三种组分均可以同时施用，或者任意两种组分可以同时施用，而第三种组分单独或按顺序施用。或者，所有三种组分均可以以任意顺序单独或按顺序施用。

对于四种组分的组合，所有四种组分可以同时施用，或者两种或三种组分可以同时施用，其余一种或以上组分单独或按顺序施用。或者，所有四种组分均可以以任意顺序单独或按顺序施用。

在一个实施方案中，所述组分各自以相对于单个组分的治疗有效量施用。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以实现所需治疗和/或预防效果的量，例如，使得能够预防或减少缺血和/或再灌注损伤、或与缺血和/或者再灌注损伤相关的一种或以上症状的量。

在治疗或预防应用的背景下，施用给受试者的组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体型(body)、体重和对药物的耐受性。还将取决于疾病的严重程度和类型。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素来确定合适的剂量。该组合物也可以与一种或以上另外的治疗剂联合施用。

在一个实施方案中，所述组分各自以相对于单个组分的亚治疗有效量(sub-therapeutically effective amount)施用。

在一个实施方案中，所述组分在受试者的再灌注之前施用。

在一个实施方案中，所述组分在受试者的再灌注期间施用。

在一个实施方案中，所述组分在受试者的再灌注之后施用。

在一个实施方案中，所述组分在受试者的再灌注之前和/或期间和/或之后施用。

在一些实施方案中，在受试者的再灌注之前、期间和之后连续施用一种或以上组分，并且在再灌注之前或再灌注之后施用其余组分。

在一些实施方案中，在受试者的再灌注之前、期间和之后连续向受试者施用所述组分。

在一些实施方案中，可以在再灌注后另外施用一种或以上组分。优选地，该重复施用进行至少两次，更优选2次至100次，或者可以是连续输注的形式。

在该方法的一些实施方案中，在再灌注之前向受试者以单次注射剂量(bolusdose)施用所述组分。

在该方法的一些实施方案中，在再灌注期间向受试者以单次注射剂量施用所述组分。

在该方法的一些实施方案中，在再灌注之后向受试者以单次注射剂量施用所述组分。

如本文所用，“再灌注”是指使血液流动减少或阻断的任何器官或组织恢复血液流动。例如，可以使受缺血或缺氧影响的任何器官或组织恢复血液流动。可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行血液流动的恢复(再灌注)。例如，可以由血运重建实现缺血性心脏组织的再灌注。

在一个实施方案中，通过血运重建术实现再灌注。在一个实施方案中，血运重建术选自：经皮冠状动脉介入术；球囊血管成形术；旁路移植术；支架植入术；定向冠脉内斑块切除术；用一种或以上溶栓剂进行的治疗；以及去除血管闭塞。

在一个实施方案中，一种或以上溶栓剂选自：组织纤溶酶原激活剂；尿激酶；尿激酶原；链激酶；酰化形式的纤溶酶原；酰化形式的纤溶酶；和酰化链激酶纤溶酶原复合体。

剂量

本领域普通技术人员无需过度实验即可容易地确定向受试者施用的一种本发明组合物的合适剂量。通常，医生将确定最适合个体患者的实际剂量，这将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合、特定病情的严重程度以及正在接受治疗的个体。本文公开的剂量是平均情况的示例。当然，可以存在应给予更高或更低剂量范围的个别情况，并且这在本发明的范围内。

在本发明的一个更优实施方案中，在组合中Nurr1激动剂(例如阿莫地喹)的剂量通常低于其在目前批准的疗法的背景下通常用于单一疗法的剂量，和/或低于再灌注损伤文献中报道的常用剂量。

在本发明的一个更优实施方案中，组合中的胰岛素调节剂(例如艾塞那肽)的剂量通常低于其在目前批准的疗法的背景下通常用于单一疗法的剂量，和/或低于再灌注损伤文献中报道的常用剂量。

在本发明的一个更优实施方案中，组合中醛固酮拮抗剂(例如坎利酸钾)的剂量通常低于其在目前批准的疗法的背景下通常用于单一疗法的剂量，和/或低于再灌注损伤文献中报道的常用剂量。

在本发明的一个更优实施方案中，组合中磺酰脲(例如格列本脲)的剂量通常低于其在目前批准的疗法的背景下通常用于单一疗法的剂量，和/或低于再灌注损伤文献中报道的常用剂量。

所要求保护的组合的各个组分可以以单位剂量的形式(即，以包含单位剂量的离散部分的形式)配制，或以单位剂量的数倍或亚单位的形式配制。本文所述的剂量可应用于上述医学用途中的每一种。

在一个优选的实施方案中，阿莫地喹或其可药用的盐以如下剂量施用：约0.01mg/kg至约20mg/kg受试者体重，优选约0.1mg/kg至约10mg/kg，更优选约0.1mg/kg至约5mg/kg，甚至更优选约0.1mg/kg至约1mg/kg。在另一个优选的实施方案中，阿莫地喹或其可药用的盐以约1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约5mg/kg的剂量施用。在一个优选的实施方案中，阿莫地喹或其可药用的盐以约2mg/kg或约7mg/kg的剂量施用。在一个特别优选的实施方案中，阿莫地喹或其可药用的盐以约0.1mg/kg至约0.5mg/kg，更优选约0.1mg/kg至约0.25mg/kg的剂量施用。有利地，适合在本发明组合中使用的阿莫地喹的剂量显著低于文献中报道的剂量，例如，文献中报道的剂量在治疗脑出血的情况下为40mg/kg(Kinoshita etal.2019)，在通过增加成体海马神经发生而增强认知功能的情况下为20mg/kg(Kim etal.2016)。

在一个更优实施方案中，阿莫地喹或其可药用的盐以约0.5mg/kg的剂量施用。在一个更优实施方案中，阿莫地喹或其药用盐以约0.1mg/kg或约0.15mg/kg的剂量施用。

当用于本发明要求保护的组合中时，胰岛素调节剂(例如艾塞那肽)的施用剂量优选为约0.001μg/kg至约1.5μg/kg，更优选为约0.005μg/kg至约0.15μg/kg。在一个优选的实施方案中，胰岛素调节剂(例如艾赛那肽)的施用剂量优选为约0.01μg/kg至约1.5μg/kg，更优选为约0.05μg/kg至约1.5μg/kg。如本文所用，胰岛素调节剂的剂量以μg/kg体重计(μg＝微克)。

在一个优选的实施方案中，胰岛素调节剂(例如艾塞那肽)的施用剂量优选为：约0.01μg/kg至约0.5μg/kg，更优选约0.02μg/kg至约0.5μg/kg，或约0.03μg/kg至约0.5μg/kg，或约0.04μg/kg至约0.5μg/kg，或约0.05μg/kg至约0.5μg/kg，或约0.05μg/kg至约0.2μg/kg，或约0.05μg/kg至约0.15μg/kg。

在一个优选的实施方案中，胰岛素调节剂(例如艾塞那肽)的施用剂量优选为：约0.01μg/kg至约0.1μg/kg，更优选约0.02μg/kg至约0.08μg/kg，或约0.03μg/kg至约0.07μg/kg，或约0.04μg/kg至约0.06μg/kg，或者剂量为约0.05μg/kg。

当用于本发明要求保护的组合中时，醛固酮拮抗剂(例如坎利酸钾)的施用剂量优选为：约0.03mg/kg至约10mg/kg，或约0.1mg/kg至约10mg/kg，或约0.3mg/kg至约5mg/kg，或约1mg/kg至约10mg/kg，或约1mg/kg至约5mg/kg，或约1mg/kg至约3mg/kg。如本文所用，醛固酮拮抗的剂量以mg/kg体重计。

在一个优选的实施方案中，醛固酮拮抗剂(例如坎利酸钾)的施用剂量优选为：约0.1mg/kg至约3mg/kg，或约0.2mg/kg至约2mg/kg，或约0.3mg/kg至约1.5mg/kg，或约0.3mg/kg至约1mg/kg。

在一个优选的实施方案中，醛固酮拮抗剂(例如坎利酸钾)的施用剂量优选为：约0.1mg/kg至约0.5mg/kg，或约0.2mg/kg至约0.5mg/kg，更优选约0.2mg/kg至约0.4mg/kg，甚至更优选约0.3mg/kg至0.4mg/kg。

当用于本发明要求保护的组合时，磺酰脲(如格列本脲)的施用剂量优选为：约0.001μg/kg至约30μg/kg，更优选约0.01μg/kg至约5μg/kg，甚至更优选约0.01μg/kg至约2μg/kg。如本文所用，磺酰脲的剂量以μg/kg体重计。

在一个优选的实施方案中，磺酰脲(例如格列本脲)的施用剂量优选为：约0.5μg/kg至约20μg/kg，或约0.5μg/kg至15μg/kg，或约0.5μg/kg至约10μg/kg，或约1μg/kg至约10μg/kg。

在一个优选的实施方案中，磺酰脲(例如格列本脲)的施用剂量优选为：约0.5μg/kg至约8μg/kg，或约0.5μg/kg至约7μg/kg，或约0.5μg/kg至约6μg/kg，或约0.5μg/kg至约5μg/kg。在一个优选的实施方案中，磺酰脲(例如格列本脲)的施用剂量优选为：约0.5μg/kg至约3μg/kg，或约0.5μg/kg至2μg/kg，或约0.5μg/kg至1.5μg/kg，或约0.8μg/kg至约1.2μg/kg，或约1μg/kg。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括预定剂量的相应药物活性组分，例如以允许对受试者施用上述剂量，例如约0.001μg/kg至约1.5μg/kg的艾塞那肽、约0.001μg/kg至约30μg/kg的格列本脲、约0.03mg/kg至约10mg/kg的坎利酸钾和约0.01mg/kg至约20mg/kg的阿莫地喹。

优选地，固定剂量的组合包括预定剂量的相应药物活性组分，以允许对受试者施用以下剂量。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.01μg/kg至约0.5μg/kg的艾塞那肽和约0.01mg/kg至约20mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.01μg/kg至约0.1μg/kg的艾塞那肽和约0.1mg/kg至约10mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.01μg/kg至约0.1μg/kg的艾塞那肽和0.1mg/kg至约5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.01μg/kg至约0.1μg/kg的艾塞那肽和约0.1mg/kg至约1mg/kg的阿莫地喹，更优选约0.1mg/kg至约0.5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括预定剂量的相应组分，例如约0.03mg/kg至约10mg/kg的坎利酸钾、约0.001μg/kg至约30μg/kg的格列本脲和约0.01mg/kg至约20mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.1mg/kg至约3mg/kg的坎利酸钾、约0.5μg/kg至约20μg/kg的格列本脲和约0.1mg/kg至约10mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.1mg/kg至约0.5mg/kg的坎利酸钾、约0.5μg/kg至约8μg/kg的格列本脲、约0.1mg/kg至约5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.1mg/kg至约0.5mg/kg的坎利酸钾、约0.5μg/kg至约1.5μg/kg的格列本脲和0.1mg/kg至约1mg/kg的阿莫地喹，更优选约0.1mg/kg至0.5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括预定剂量的相应组分，例如约0.03mg/kg至约10mg/kg的坎利酸钾、约0.005μg/kg至约0.15μg/kg的艾塞那肽和约0.01mg/kg至约20mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.1mg/kg至约3mg/kg的坎利酸钾、约0.01μg/kg至约0.5μg/kg的艾塞那肽和约0.1mg/kg至约10mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.1mg/kg至约0.5mg/kg的坎利酸钾、约0.01μg/kg至约0.1μg/kg的艾塞那肽和约0.1mg/kg至约5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.1mg/kg至约0.5mg/kg的坎利酸钾、约0.01μg/kg至约0.1μg/kg的艾塞那肽和约0.1mg/kg至约1mg/kg的阿莫地喹，更优选约0.1mg/kg至0.5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.03mg/kg至约10mg/kg的坎利酸钾、约0.01μg/kg至约0.5μg/kg的艾塞那肽、约0.001μg/kg至约30μg/kg的格列本脲和0.01mg/kg至约20mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.1mg/kg至约3mg/kg的坎利酸钾、约0.01μg/kg至约0.1μg/kg的艾塞那肽、约0.5μg/kg至约20μg/kg的格列本脲和0.1mg/kg至约10mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.1mg/kg至约0.5mg/kg的坎利酸钾、约0.01μg/kg至约0.1μg/kg的艾塞那肽、约0.5μg/kg至约8μg/kg的格列本脲和0.1mg/kg至约5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.1mg/kg至约0.5mg/kg的坎利酸钾、约0.01μg/kg至约0.1μg/kg的艾塞那肽、约0.5μg/kg至约1.5μg/kg的格列本脲和0.1mg/kg至约1mg/kg的阿莫地喹，更优选约0.1mg/kg至0.5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，包括约0.05μg/kg的艾塞那肽、1μg/kg的格列本脲和约0.5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，其包括约0.33mg/kg的坎利酸钾、约1μg/kg的格列本脲和约0.5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，包括约0.05μg/kg的艾塞那肽、约0.33mg/kg的坎利酸钾、约1μg/kg的格列本脲和约0.5mg/kg的阿莫地喹。

在一个更优实施方案中，该组合是固定剂量的组合，包括约0.05μg/kg的艾塞那肽和约0.5mg/kg的阿莫地喹。

非治疗性用途

在另一个方面，本发明涉及一种组合用于在移植之前或移植期间治疗和/或预防离体器官中的缺血和/或再灌注损伤的用途，所述组合包括以下组分或由以下组分组成：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂，和

(iii)磺酰脲。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种组合用于在移植之前或移植期间治疗和/或预防离体器官中的缺血和/或再灌注损伤的用途，所述组合包括以下组分、或由以下组分组成：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种组合用于在移植之前或移植期间治疗和/或预防离体器官中的缺血和/或再灌注损伤的用途，所述组合包括以下组分、或由以下组分组成：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

阿莫地喹、或其可药用的盐；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

由于缺乏血液流动，离体(从体内移除)器官可能容易受到再灌注损伤。因此，本发明的组合可用于防止移除器官的再灌注损伤。优选地，所述器官是心脏、肝脏或肾脏，更优选心脏。

在一些实施方案中，将移除的器官置于含有本发明组合的标准缓冲溶液中(例如本领域中常用的那些)。例如，可以将移除的心脏置于含有阿莫地喹、以及艾塞那肽、坎利酸钾和格列本脲中的一种或以上的心脏停搏液中。本领域技术人员可以容易地确定标准缓冲溶液中可用的阿莫地喹、艾塞那肽、坎利酸钾和格列本脲的浓度。例如，这些浓度可以在约0.1nM至约10μM之间，优选约1nM至10μM。

附图说明

参照所附的非限制性实施例和以下附图进一步描述本发明，其中：

图1：在第4周和第8周对每个实验进行三次试验T1、T2和T3，找到隐藏平台的时间(以秒为单位；平均值±SEM)。参见实施例1。统计分析-根据双向方差分析和Bonferroni事后比较(3M与1M)，**p<0.01。1M组：载剂治疗对照组；2M组：艾塞那肽0.05μg/kg+坎利酸钾0.33mg/kg+格列本脲1μg/kg；3M组：艾塞那肽0.05μg/kg+坎利酸钾0.33mg/kg+格列本脲1μg/kg+阿莫地喹20mg/kg；4M组：艾塞那肽0.05μg/kg+坎利酸钾0.33mg/kg+阿莫地喹20mg/kg；5M组：假手术组(SHAM)。

图2：游达隐藏平台的距离(以厘米为单位；平均值±SEM，在第4周和第8周对每个实验进行三次试验T1、T2和T3)。参见实施例1。统计分析-根据双向方差分析和Bonferroni事后比较(3M与1M)，*p<0.05。1M组：载剂治疗对照组；2M组：艾塞那肽0.05μg/kg+坎利酸钾0.33mg/kg+格列本脲1μg/kg；3M组：艾塞那肽0.05μg/kg+坎利酸钾0.33mg/kg+格列本脲1μg/kg+阿莫地喹20mg/kg；4M组：艾塞那肽0.05μg/kg+坎利酸钾0.33mg/kg+阿莫地喹20mg/kg；5M组：假手术组。

图3：研究结束时的海马CA1和CA3细胞损伤。参见实施例1。1M组：载剂治疗对照组；2M组：艾塞那肽0.05μg/kg+坎利酸钾0.33mg/kg+格列本脲1μg/kg；3M组：艾塞那肽0.05μg/kg+坎利酸钾0.33mg/kg+格列本脲1μg/kg+阿莫地喹20mg/kg；4M组：艾塞那肽0.05μg/kg+坎利酸钾0.33mg/kg+阿莫地喹20mg/kg；5M组：假手术组。

图4：整个研究的神经功能评分(阿莫地喹单一疗法)(第一部分)。参见实施例2。AM20＝阿莫地喹20mg/kg；AM7＝阿莫地喹7mg/kg；AM2＝阿莫地喹2mg/kg；AM0.5＝阿莫地喹0.5mg/kg。手术前所有动物行为正常。根据双向方差分析和Bonferroni事后比较，在第1天和第8天，在1M组(载剂)和药物治疗组2M阿莫地喹(20mg/kg)、3M阿莫地喹(7mg/kg)和5M阿莫地喹(0.5mg/kg)之间发现了具有统计学意义的差异。该图显示了平均值±SEM；**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。

图5：整个研究的神经功能评分(联合疗法)(第二部分)。参见实施例2。AM＝阿莫地喹；PC＝坎利酸钾；Gli＝格列本脲；Ex＝艾塞那肽。手术前，所有动物行为正常。在第1天发现1M组(载剂)和药物治疗组6M、7M、8M、9M和11M之间具有统计学意义的差异，并且在第8天发现所有治疗组之间具有统计学意义的差异。该图显示了平均值±SEM；使用双向方差分析统计分析和Bonferroni事后比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图6：终止时的脑梗塞面积(％)(阿莫地喹单一疗法)(第一部分)。参见实施例2。AM20＝阿莫地喹20mg/kg；AM7＝阿莫地喹7mg/kg；AM2＝阿莫地喹2mg/kg；AM0.5＝阿莫地喹0.5mg/kg。发现在1M组(载剂)与药物治疗组2M阿莫地喹20mg/kg、3M阿莫地喹7mg/kg和5M阿莫地喹0.5mg/kg之间的梗塞面积存在具有统计学意义的差异。该图显示了平均值±SEM；使用单向方差统计学分析和之后进行Bonferroni多重比较检验，*表示p<0.05；***表示p＜0.001。

图7：结束时的脑梗塞面积(％)(联合疗法)(第二部分)。参见实施例2。AM＝阿莫地喹；PC＝坎利酸钾；Gli＝格列本脲；Ex＝艾塞那肽。发现在1M组(载剂)与药物治疗组6M、8M、9M和11M之间的梗塞面积存在具有统计学意义的差异。该图显示了平均值±SEM；使用单向方差统计学分析和之后进行Bonferroni多重比较检验，*表示p<0.05；***表示p＜0.001。

图8：2M-11M组第8天的NSS评分和梗塞面积汇总，以对照值的百分比表示。参见实施例2。

图9显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，所选组合的神经系统严重程度评分(几何平均值±SD)。2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图10显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，所选组合的踏步实验结果(几何平均值±SD)。2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图11显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，所选组合的前肢放置实验结果(几何平均值±SD)。2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图12显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，所选组合的物体识别实验结果(几何平均值±SD)。2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图13显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，所选组合的高架十字迷宫实验结果(几何平均值±SD)。2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图14显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，所选组合在28天时的梗塞面积百分比。2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图15显示了实施例2和3中所选组合相对于对照(％)的NSS效果(第8天和第28天)。

图16显示了实施例2和3中所选组合相对于对照组(％)的梗塞面积效果(第8天和第28天)。

图17显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，对于所选组合，在28天研究结束时，α-半影、纹状体和背侧海马区域中的细胞凋亡结果(TUNEL染色)(平均值±SEM)。1M组：假手术组；2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图18显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，对于所选组合，在28天研究结束时，Olig-2成熟少突胶质细胞-活化细胞的百分比(平均值±SEM)。1M组：假手术组；2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图19显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，对于所选组合，在28天研究结束时，NG2少突胶质细胞祖细胞的细胞百分比(平均值±SEM)。1M组：假手术组；2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图20显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，对于所选组合，在28天研究结束时的NeuN损伤(平均值±SEM)。1M组：假手术组；2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图21显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，对于所选组合，在28天研究结束时的GFAP组织学结果(平均值±SEM)。1M组：假手术组；2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图22显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，对于所选组合，在28天研究结束时的Iba-1组织学结果(平均值±SEM)。1M组：假手术组；2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图23显示了在实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，对于所选组合，在第4周(28天)时的活化细胞的双皮质素染色百分比(平均值±SEM)。1M组：假手术组；2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

图24显示了如实施例3所述的慢性卒中大鼠模型研究中，对于所选组合，在研究结束时的MBP髓鞘损伤(平均值±SEM)。1M组：假手术组；2M组：载剂治疗；3M组：坎利酸钾+阿莫地喹+格列本脲；4M组：艾塞那肽+阿莫地喹+格列本脲；5M组：艾塞那肽+坎利酸钾+阿莫地喹；6M组：艾塞那肽+坎利酸钾+格列本脲；剂量：阿莫地喹(0.5mg/kg)；艾塞那肽(0.05μg/kg)；坎利酸钾(0.33mg/kg)；格列本脲(1μg/kg)。

具体实施方式

实施例

通过以下实施例进一步阐述本发明，这些实施例不应被解释为以任何方式限制本发明。

实施例1：阿莫地喹组合在血管性痴呆大鼠模型中的研究

研究目标

本研究的目的是使用Wistar大鼠血管性痴呆模型来评价阿莫地喹及其各种组合在两侧颈总动脉永久结扎后24小时静脉内给药，然后每日施用两次，持续三周后的神经保护功效。

材料

艾塞那肽醋酸盐得自Bachem AG(瑞士)。坎利酸钾得自Pfizer(瑞士)。格列本脲得自Tocris Bioscience。阿莫地喹得自Sigma。载剂是得自Biological Industries的盐水。

研究设计和时间线

本研究旨在评价在Wistar大鼠血管性痴呆模型中，不同组合通过每日两次持续三周低剂量的静脉内施用后的神经保护效果。该研究(由申请人赞助)在Pharmaseed Ltd(Ness-Ziona,Israel)分六个周期进行，各个周期包括12至15只大鼠。在颈总动脉结扎后24小时施用测试用化合物，每日两次，持续三周。在第1天，永久结扎两侧颈总动脉。在颈总动脉结扎前和在之后的第4周和第8周进行Morris水迷宫实验作为基础训练。研究结束时，在颈总动脉闭塞(CCAO)后第8周末和MWM测试完成后，用2.5％缓冲PFA对大鼠进行心脏灌注，并采集大脑，将其固定在同一溶液中，并在4℃下储存。按照计划进行组织学分析。

实验设计和研究时间线分别如表1和表2所示。

表1：研究设计

*颈总动脉结扎后预计平均存活率(average yield)为70％。

ROA＝施用途径

表2：研究时间线

CCAO＝颈总动脉闭塞；D＝天；W＝周；BW＝体重；MWM＝Morris水迷宫。

动物

本研究使用雄性Wistar大鼠，研究开始时体重196g至320g。

动物管理

饲养室

根据美国国立卫生研究院(NIH)和国际实验动物管理评估和认可委员会(AAALAC)的指南进行动物处理。动物被安置在尺寸为42.5×26.5×18.5cm的聚乙烯笼中(最多3只大鼠/笼)，所述聚乙烯笼具有不锈钢顶部格栅便于投喂塑料瓶中的粒化的食物和饮用水；垫料：蒸汽灭菌的干净稻壳(Envigo，Sani chips cat#7090C)。垫料材料与笼子一起每周至少更换两次。

饮食

动物用商业啮齿动物饲料喂养，自由进食(Teklad Certified Global 18％Protein Diet cat#:2018SC)。动物可以自由获得市政供应的经高压灭菌和酸化的饮用水(pH在2.5至3.5之间)。

环境条件

将动物安置在标准实验室条件下，进行空气调节和过滤(HEPA F6/6)，并提供充足的新鲜空气(每小时至少换气15次)。将动物留置在气候可控的环境中。温度范围为18℃至24℃，相对湿度范围为30％至70％，12小时光照和12小时黑暗进行循环。

随机性

根据Pharmaseed的SOP#027“动物的随机分配”，将动物随机分配到笼子中。

手术和评价

外科手术：结扎两侧颈总动脉

手术当天，在加热垫上用4％异氟烷(其在70％ N₂O和30％ O₂的混合物中)诱导麻醉，并用1.5％至2％异氟烷维持麻醉状态。皮下注射0.1mg/kg的丁丙诺啡。根据Hyun JoonLee等人(Citicoline Protects Against Cognitive Impairment in a Rat Model ofChronic Cerebral Hypoperfusion,J Clin Neurol.2009；5(1):33–38)描述的方法进行两次颈总动脉闭塞。通过颈部中线切口暴露两侧颈总动脉(CCA)，小心地解剖使其与周围神经和筋膜分离。在颈外动脉可见区域下方8mm至10mm处用4-0丝缝线双重结扎两侧动脉。闭合手术伤口，动物被送回笼中，从麻醉中恢复。当天结束时再次施用镇痛治疗，并在接下来的四天内每日施用两次。

组合的施用

动脉结扎后24小时通过静脉注射除阿莫地喹外的所有混合物开始治疗。阿莫地喹以20mg/kg的剂量通过腹膜内施用。连续治疗三周，每日两次。

Morris水迷宫实验

执行Morris水迷宫(MWM)实验用于评估颈总动脉结扎术后的认知缺陷。根据Pharmaseed的SOP 100(Morris Water-Maze Testing V6)和相关出版物(例如Brandeis R,Brandys Y and Yehuda S,“The use of the Morris Water Maze in the study ofmemory and learning”,Int J Neurosci.1989；48(1-2):29-69)进行实验。

术前训练

根据Pharmaseed的SOP 100和科学出版物(例如，参Brandeis R et al)，在Morris水迷宫中对动物进行训练并适应一周。在MWM之前，将大鼠的笼子从动物饲养室转移到行为测试室，进行约一小时的驯化。将最后一天的训练结果视为基础数据以用于比较。MWM实验的排除标准如下：未能在90秒内逃到平台(在训练第3天)。

颈总动脉结扎后测试

在MWM之前，将大鼠的笼子从动物饲养室转移到行为测试室，进行约一小时的驯化。在颈总动脉结扎后第4周和第8周进行MWM实验。

结束

颈总动脉闭塞(CCAO)后8周和MWM实验完成后处死大鼠。所有大鼠均接受2.5％缓冲PFA的心脏灌注，采集大脑并固定在同一溶液中，并在4℃下储存。

组织学分析

组织制备和修剪(受累半球)，各个大脑的纹状体(胼胝体)背侧海马和视束的X3精确横截面。石蜡块制备H&E和TUNEL染色，IHC：用于脑室下区中的神经再生的双皮质素。MBP(白质中的髓鞘)、用于小胶质细胞的Iba-1，以及用于反应性星形胶质细胞的GFAP。Olig-2用于成熟的少突胶质细胞，NG2用于年轻的少突细胞。切片评价分析；海马CA1和CA3区域的细胞体计数-各个大脑三个切片，各个切片三个视野。对海马区神经元死亡计数进行形态计量学分析，并对视束、纹状体和背侧海马区进行另外的MBP、Olig-2和NG2形态计量学分析。获得组织切片的图片。

结果

Morris水迷宫实验

进行Morris水迷宫(MWM)实验，以评价缺血性海马损伤后与血管性痴呆相关的认知障碍，表现为学习和记忆缺陷。不出所料，与假手术组5M相比，所有组在两次CCAO后四周的测试中，均观察到认知功能的显著下降。

五个研究组的MWM实验结果可以总结如下：

a)在手术前短暂进入迷宫的过程中，五组大鼠的表现相似。

b)仅接受假手术的大鼠(5M组)在认知实验中的表现优于所有接受血管性痴呆手术的大鼠，更快地到达隐藏平台，并显示出缺血性手术的有效性。

c)通过三联组合治疗的大鼠(2M组和4M组)以及四联组合治疗的大鼠(3M)在迷宫习得(更敏感的学习功能)期间的表现优于载剂治疗的大鼠(1M组)。这在第4周表现出来，主要是在学习任务的第一次和第二次试验中(图1中标记为T1和T2)。随后，在第8周的后续实验中，它们与载剂组相比没有任何改善。

d)动物游到平台的距离也表现出明显的缺血影响(参见图2)。不同治疗呈现出相似的模式，3M组与1M组相比表现出具有统计学意义的差异(在第4周试验2中，*p<0.05)。

组织学结果：通过Tunnel染色结果测得，三联组合(2M组)显著减少了海马中凋亡的细胞数量。4M组的凋亡细胞的数量有所减少，但少于2M组(*p＜0.05)。对CA1和CA3海马区处的皱缩细胞数量进行了评估。虽然已知CA1细胞对各种毒性物质敏感，但已经确定CA3细胞主要对氧合减少敏感，并且它们的损伤与认知功能障碍相关(T Kadar,M Silbermann,RBrandeis and A Levy,Age-related structural changes in the rat hippocampus:correlation with working memory deficiency,Brain Res 1990；512(1):113-120；TKadar,I Arbel,M Silbermann and A Levy,Morphological hippocampal changesduring normal aging and their relation to cognitive deterioration,J NeuralTransm Suppl.1994；44:133-143；B Shukitt-Hale,T Kadar,B E Marlowe,M J Stillman,R L Galli,A Levy,J A Devine,H R Lieberman,Morphological alterations in thehippocampus following hypobaric hypoxia,Hum Exp Toxicol.1996；15(4):312-319)。

如图3所示，CA1中皱缩细胞数量的平均值相对较低，与载剂对照组相比，任何治疗组之间均没有统计学意义的差异。如载剂治疗组1M所示，CA3中的皱缩损伤是巨大的。在该参数中，与载剂治疗相比，四联组合3M和三联组合4M均表现出比原始2M更好的显著结果。在所有动物组之间，在所有大脑区域的细胞中均没有发现Iba-1、GFAP、Olig-2、NG2、髓鞘密度和双皮质素具有统计学意义的差异。

讨论和结论

大鼠中的永久性双侧颈总动脉闭塞(BCCAO)诱导的慢性脑灌注不足已被证明会导致显著的白质损伤、学习和记忆障碍以及海马神经元损伤。因此，大鼠中的BCCAO为了解慢性脑血管灌注不足的病理生理学和筛选对血管性痴呆具有潜在治疗价值的药物提供了一个有用的模型。此外，该模型也与阿尔茨海默病有关，因为它还伴随着大脑血流缓慢进展的减少。

进行本研究以确定所提出的治疗方法是否能改善慢性脑灌注不足引起的认知缺陷，并减少大脑中的神经元损伤，主要发生在海马的CA-1和CA-3区域以及在白质区域的损伤。最初在手术后24小时静脉内施用这些组合，然后在三周内每日两次。不出所料，CCCA手术后第4周观察到认知功能损害。仅接受假手术的大鼠(5M组)在认知实验中的表现优于所有接受血管性痴呆手术的大鼠，更快地到达隐藏平台，并显示出缺血性手术的有效性。三联组合治疗的大鼠(2M组和4M组)以及四联组合(3M)在迷宫习得期间(更敏感的学习功能)的表现优于载剂治疗的大鼠(1M组)。该治疗在手术后24小时开始，然后连续三周每日两次，从而保护海马细胞免受损伤。新的三联组合(4M)也减少了凋亡细胞的数量。有利地，含有阿莫地喹的组合(3M组和4M组)表现出改善的抗皱缩和海马细胞死亡的活性。

实施例2：阿莫地喹组合在大鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型中的功效研究

目标

本研究的目的是评价以下药物的神经保护功效：a)四剂量的阿莫地喹与载剂对照组相比，以及b)评价阿莫地喹与其他两种测试项目(艾塞那肽和坎利酸钾)的组合与其各自单独使用以及载剂对照组相比较的功效。其中一种组合还包括格列本脲。

几种动物模型已被用于研究脑缺血，以了解其病理生理学，并确定将缺血性损伤的严重程度降至最低的治疗策略。大鼠中局灶性脑缺血引起局部脑梗塞，并通常由短暂性大脑中动脉闭塞(t-MCAO)引起。短暂性大脑中动脉闭塞模型已经作为人类半球梗塞的模型而被越来越多的人接受。MCAO后，大脑中动脉供应的血管区域内发生了具有时间和空间演变的皮质和纹状体梗塞。

材料

动物

研究中使用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，研究开始时体重300g至410g。

动物管理

饲养室

根据美国国立卫生研究院(NIH)和国际实验动物管理评估和认可委员会(AAALAC)的指南进行动物处理。动物被安置在尺寸为42.5×26.5×18.5cm的聚乙烯笼中(3只大鼠/笼)，所述聚乙烯笼具有不锈钢顶部格栅便于投喂塑料瓶中的粒化的食物和饮用水；垫料：蒸汽灭菌的干净稻壳(Envigo，Sani chips cat#7090C)，垫料材料与笼子一起每周至少更换两次。

饮食

动物用商业啮齿动物饲料喂养，自由进食(Teklad Certified Global 18％Protein Diet,Envigo cat#2018SC)。动物可以自由获得市政供应的标准自来水，并根据Pharmaseed的SOP No.214：”水系统”进行处理。动物饲料到货时附有分析证书，水在使用前经高压灭菌。

环境条件

随机性

根据Pharmaseed的SOP#027“动物的随机分配”，将抵达后的动物分配到笼子中。

实验设计和条件

减轻疼痛的方法

在用4％异氟烷(在70％ N₂O和30％ O₂的混合物中)麻醉的情况下进行MCAO手术，并用1.5％至2％异氟烷维持麻醉状态。在手术前和手术后通过皮下注射(SC)施用2mg/kg的美洛昔康，并在接下来的四天内每日施用一次。此后，只有在出现疼痛和不适迹象的情况下才施用。

实验期持续时间

驯化结束后七天。将第一个给药日指定为“第1天”，并且将结束日指定为“第8天”。

研究设计和时间线

该研究(由申请人赞助)在Pharmaseed Ltd(Ness-Ziona,Israel)进行。

第一部分：本研究的这一部分旨在评价与载剂对照组相比，通过每日两次在再灌注前20分钟口服施用四剂阿莫地喹的神经保护效果。

第二部分：与载剂对照组相比，对测试项目(艾塞那肽、坎利酸钾和格列本脲)与阿莫地喹的联合使用进行评价。前两项也与其单独使用的表现进行了比较。这项研究是分周期进行的，各周期至少包括九只大鼠。再灌注前20分钟施用测试用化合物，并且在再灌注后每日施用两次。在第1天，通过t-MCAO手术诱发卒中。在手术前、t-MCAO后24小时和7天分别进行神经功能评分(NSS)。在研究结束时，采集大脑，切成五个2mm厚的冠状切片，并用TTC染色以测量梗塞面积。研究的两个部分的实验设计和时间线如下所示。

研究设计

第一部分：单一疗法研究设计

给药方案：再灌注开始前20分钟以及再灌注后每日两次(每12小时一次)。

表3A：

第二部分：联合疗法研究设计

表3B：

表4：两部分的研究时间线

手术和评价

外科手术

根据R.Schmid-Elsaesser等人描述的方法进行短暂性大脑中动脉闭塞(t-MCAO)(Stroke；1998；29(10):2162-70)。通过颈部中线切口暴露出右侧颈总动脉(CCA)，并小心地解剖使其从分叉到颅底与周围神经和筋膜分离。分离颈外动脉(ECA)的枕动脉分支，并对这些分支进行解剖和凝固。进一步将ECA向远端解剖，并在即将到达其分叉前与舌动脉和上颌动脉的末端分支一起凝固。分离颈内动脉(ICA)并将其与邻近的迷走神经小心分离，并用5-0尼龙缝线在靠近其起点处结扎翼腭动脉。接下来，将4-0丝缝线松散地绑在活动的ECA残端周围，并将4cm长的4-0单丝尼龙缝线(插入前，用火焰钝化缝线的尖端，并用聚赖氨酸涂抹缝线)通过近端ECA插入ICA，然后插入Willis环，有效地闭塞MCA。闭合手术伤口，将动物送回笼中，其从麻醉中恢复。闭塞后一个半小时，将大鼠重新麻醉，抽出单丝以允许再灌注。闭合手术伤口，将大鼠送回笼中。手术后，将动物放在加热垫上，直到它们从麻醉中恢复。接下来所有动物在手术前和手术后每日皮下注射2mg/kg美洛昔康，持续两天。在t-MCAO手术当天经常观察它们，此后每日至少观察一次。

组合的施用

在再灌注前20分钟开始治疗，然后在同一天结束时通过腹膜内施用测试用化合物进行治疗。此后连续六天，每日两次继续治疗。

改良神经功能评分(mNSS)

动物在手术前(作为基线)、MCAO手术后24小时和7天接受NSS测试(W.R.,Berger C.,Kollmar R.,Seitz M.,Tanay E.,Kiessling M.,Schwab S.,Sommer C.Effectof brain-derived neurotrophic factor treatment and forced arm use onfunctional motor recovery after small cortical ischemia.Stroke.2004；35(4):992-997)。

结束

在MCAO手术后第8天，通过CO₂暴露处死动物。收集大脑，切成5个2mm厚的切片，用TTC染色，并进行组织学评价以确定梗塞体积。梗塞体积评价后，将切片储存在PFA中，以备将来进行组织学分析。

结果

研究期间的神经功能评分评价

手术后记录的一些临床观察结果在卒中诱导后很常见，并出现在所有组中。神经功能评分(NSS)包括一组临床神经功能测试(运动、感觉、反射和平衡测试的综合测试)，用于评价阿莫地喹单一疗法及其与艾塞那肽、格列本脲和坎利酸钾的联合疗法的效果。神经功能评分按0至18分进行分级(其中正常评分为0，最大缺陷评分为18)。手术前，所有动物均表现出正常行为，得分为零。t-MCAO后24小时，各组大鼠的神经功能均出现急剧下降(NSS增加)。与载剂治疗相比，2M、3M和5M组的NSS改善相似且具有统计学意义(参见图4)。这种改善已经在第2天的第一次测试中出现，并一直持续到第8天。与载剂治疗的对照组相比，阿莫地喹与艾塞那肽、格列本脲和坎利酸钾的联合疗法也使治疗组的NSS显著改善，从第2天的第一次测试持续到第8天(参见图5)。

梗塞面积

使用ImageJ程序通过图像分析测量梗塞面积。如图6和图7所示，在载剂治疗的t-MCAO动物中，脑梗塞面积为总半球体积的38％。在接受阿莫地喹治疗的动物中，与载剂治疗的对照组相比，脑梗塞面积减少，主要是在那些接受更高剂量治疗的动物中。与载剂治疗的对照组相比，阿莫地喹与艾塞那肽、格列本脲和坎利酸钾的联合疗法也使梗塞面积显著减少了近两倍。在再灌注前20分钟给予坎利酸钾和阿莫地喹+艾塞那肽治疗的动物中，观察到梗塞体积的减少不太明显。

对获得的梗塞面积数据进行T检验，以确定治疗组之间的统计学意义。6M组的表现明显好于10M组(***p＜0.001)、5M组(***p＜0.01)和8M组(*p＜0.05)。11M组的表现明显好于10组(**p<0.01)以及5M和7M组(*p<0.05)。10M组的表现明显好于8M组(*p＜0.05)。

图8总结了各组的性能，以对照组值的百分比表示。

讨论和结论

在研究的第一部分中，采用大鼠t-MCAO卒中模型，与载剂对照相比，评价了四个剂量的阿莫地喹的剂量响应效率(dose-response efficacy)。在第二部分中，与载剂对照相比，评价了其他三种活性剂(艾塞那肽、坎利酸钾和格列本脲)与阿莫地喹的组合，前两种也比较了其单独的性能。在研究的第一部分中，与载剂对照组的动物相比，阿莫地喹治疗组之间存在明显差异，主要是在高剂量的情况下。联合疗法观察到了更显著的效果。

主要观察结果总结如下：

·所有治疗均未影响动物的体重、健康或死亡率。

·与载剂治疗相比，不同剂量的阿莫地喹单一疗法显著改善了卒中后的神经功能评分，且呈剂量依赖性。

·与载剂治疗相比，阿莫地喹联合疗法也显著改善了神经功能评分。

·与载剂治疗相比，不同剂量的阿莫地喹单一疗法显著减少了梗塞面积。

·与载剂治疗相比，阿莫地喹联合疗法也显著减少了梗塞面积。

·特别优选“阿莫地喹+坎利酸钾+格列本脲”和“阿莫地喹+坎利酸钾+艾塞那肽”这两种三联组合。“阿莫地喹+艾塞那肽”的双联组合也表现良好。

鉴于这些发现，可以得出结论，在本研究的情况下，在大鼠短暂性t-MCAO模型中，当利用在再灌注前20分钟和再灌注后每日两次施用阿莫地喹单一疗法和阿莫地喹联合疗法进行治疗时，明显改善了感觉运动功能，并减少了梗塞面积。

实施例3：连续28天治疗期间短暂性大脑中动脉闭塞大鼠模型的功效研究

目标

本研究的目的是评价阿莫地喹、艾塞那肽和坎利酸钾及其组合、以及一种含有格列本脲的组合在大鼠卒中诱导28天后改善功能恢复的功效。

材料

动物

研究中使用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，研究开始时体重295g至330g。

动物管理

饲养室

饮食

动物用商业啮齿动物饲料喂养，自由进食(Teklad Certified Global 18％Protein Diet,Envigo cat#2018SC)。动物可以自由获得市政供应的标准自来水，并根据Pharmaseed's SOP No.214：“水系统”进行处理。动物饲料到货时附有分析证书，水在使用前经过高压灭菌。

环境条件

随机性

根据Pharmaseed’s SOP#027“动物的随机分配”，将抵达后的动物分配到笼子中。

实验设计和条件

减轻疼痛的方法

在用4％异氟烷(在70％ N₂O和30％ O₂的混合物中)麻醉的情况下进行MCAO手术，并用1.5％至2％异氟烷维持麻醉状态。在手术前和手术后通过皮下注射(SC)施用2mg/kg的美洛昔康，并在接下来的四天内每日施用一次。在手术后和工作日结束时施用0.01mg/kg的丁丙诺啡。此后，只有在出现疼痛和不适迹象的情况下才施用。

实验期持续时间

将第一个给药日指定为“第1天”，并且将手术后28天的结束日指定为“第29天”。

研究设计和时间线

测试项目-与载剂对照治疗或假手术组的大鼠相比，评价了阿莫地喹、坎利酸钾、格列本脲和艾塞那肽的各种组合。这项研究是分周期进行的，各个周期包括10只大鼠。在再灌注后立即施用测试用化合物，此后每日施用两次。在第1天，通过t-MCAO手术诱导卒中。在手术前(作为基线)、t-MCAO后24小时以及之后每周进行神经功能评分(NSS)。将得分为10分及以上的动物纳入研究。然后在研究的第2周和第4周，对踏步实验、前肢放置实验进行基础评价。在研究的第2周和第4周进行了高架十字迷宫实验，在第4周进行物体识别实验。在研究结束时，将动物麻醉，并用0.9％生理盐水和随后的2.5％缓冲PFA进行经心脏灌注。采集大脑并用相同的固定剂固定，并在4℃下储存。将脑样本包埋在石蜡中、切片并用H&E和其他染色法对组织学标志物进行染色，如前所述。实验设计和时间线如下：

研究设计：该研究(由申请人赞助)在Pharmaseed Ltd(Ness-Ziona,Israel)进行。

*MCAO手术后的平均存活率预计约为80％，研究结束时，每组7至9只动物。

研究时间线：

NSS＝神经功能评分；FPT＝前肢放置实验；EPMT＝高架十字迷宫实验；ORT＝物体识别实验

手术和评价

外科手术-t-MCAO

根据R.Schmid-Elsaesser等人描述的方法进行短暂性大脑中动脉闭塞(t-MCAO)。通过颈部中线切口暴露出右侧颈总动脉(CCA)并小心地解剖使其从分叉到颅底与周围神经和筋膜剥离。分离颈外动脉(ECA)的枕动脉分支，并对这些分支进行解剖和凝固。进一步将ECA向远端解剖，并在即将到达其分叉前与舌动脉和上颌动脉的末端分支一起凝固。分离颈内动脉(ICA)并将其与邻近的迷走神经小心分离，并用5-0尼龙缝线在靠近其起点处结扎翼腭动脉。接下来，将4-0丝缝线松散地绑在活动的ECA残端周围，并将4cm长的4-0单丝尼龙缝线(插入前，用火焰钝化缝线的尖端，并用聚赖氨酸涂抹缝线)通过近端ECA插入ICA，然后插入Willis环，有效地闭塞MCA。闭合手术伤口，将动物送回笼中，其从麻醉中恢复。闭塞后一个半小时，将大鼠重新麻醉，抽出单丝以允许再灌注。闭合手术伤口，将大鼠送回笼中。

手术后，将动物放在加热垫上，直到它们从麻醉中恢复。所有动物在手术前和手术后每日皮下注射2mg/kg美洛昔康，持续两天。在t-MCAO手术当天经常观察它们，此后每日至少观察一次。

测试项目的施用

再灌注后立即开始治疗，然后在同一天结束时，通过腹膜内施用1mL/kg剂量体积的测试用化合物。此后连续四周，每日两次继续治疗。

动物在手术前(作为基线)、手术后24小时和此后每周(为期四周)接受NSS测试。

前肢放置实验

在MCAO手术前(作为基线)、第2周和第4周进行前肢放置实验(FPT)。将动物紧紧按在台面上，并记录大鼠响应于胡须、视觉、触觉或本体感受的刺激而将前肢放在工作台表面上的能力得分。为各感觉输入模式获得单独的子得分，并相加得出总分。前肢放置实验的分数范围从0＝正常到12＝最大损伤。通常，在卒中后的第一个月，分数会缓慢而稳定地恢复。

踏步实验

根据Pharmaseed的SOP#111(“大鼠踏步实验”)，在踏步实验(ST)中对动物的前肢运动失能进行测试。在MCAO手术前、第2周和第4周进行ST。通过一只手固定后肢而抓住动物，另一侧前肢不受控，从而不受限制的前爪碰触工作台。当动物沿着工作台表面(约5秒内为85厘米)在两个前肢的正手和反手方向侧身移动时，计算调整踏步的数量。

高架十字迷宫实验(Pharmaseed SOP#120)

在第2周和第4周的高架十字迷宫实验中对动物的焦虑水平进行测试。大鼠在高架十字迷宫中的正常行为包括探究活动且它们在迷宫的开臂和闭臂中花费的时间相等。监测这项任务中的行为(即在开臂与闭臂中的访问)反映了啮齿动物对保护区域(如闭臂)的偏好与其探究新环境的内在动机之间的冲突。

物体识别实验(Pharmaseed SOP#116)

在第4周动物接受用于认知记忆测试的新物体识别任务的测试。将大鼠带至新物体(与熟悉的物体相比)。记录在新物体或熟悉的物体附近的访问次数和花费的时间。在正常情况下，新物体比熟悉的物体被更频繁地访问且访问时间更长。

结束

·在MCAO手术后第29天，麻醉动物，并用0.9％生理盐水和随后的2.5％缓冲PFA进行心脏灌注。采集大脑，用相同的固定剂固定，并在4℃下储存。

·大脑宏观检查

·组织学分析包括：

ο所有存活动物的组织制备和修剪(受累半球)，卒中病变的X8准确横截面，间隔100微米。所关注的区域：α-半影、纹状体和背侧海马。

ο石蜡块制备。

ο H&E染色，分析所有存活动物的梗塞体积。

ο对所有三个所关注的区域进行了以下分析。

ο TUNEL–细胞凋亡方法(n＝46)。

ο IHC：用于脑室中神经再生的双皮质素和NeuN(用于成熟神经元)(n＝46)。

ο髓鞘分析：使用数字图像分析对MBP、Olig-2和NG2的IHC进行分析(n＝46)。

ο炎症分析：使用数字图像分析对Iba-1和GFAP的IHC进行分析(n＝46)。

ο神经死亡计数、MBP、Olig-2、NG2、GFAP和Iba-2的形态计量学分析(n＝46)。

结果

研究期间的神经功能评分评价

神经功能评分(NSS)包括一组临床神经功能测试(运动、感觉、反射和平衡测试的综合测试)，用于评估阿莫地喹与艾塞那肽、格列本脲和坎利酸钾联合使用的效果。神经功能评分按0至18分进行分级(其中正常评分为0，最大缺陷评分为18)。手术前，所有动物均表现出正常行为，得分为零。如图9所示，在接受t-MCAO手术的所有大鼠组中，t-MCAO后24小时，观察到神经功能均出现急剧下降(NSS增加)，此后随着时间的推移有所改善。6M组的改善仅从第2周开始才具有统计学意义。

根据双向方差分析和随后的Bonferroni事后比较，在第2天和第1至4周，在2M组(载剂对照组)和药物治疗组之间发现了具有统计学意义的差异，所述药物治疗组包括：3M阿莫地喹(0.5mg/kg)+坎利酸钾(0.33mg/kg)+格列本脲(1μg/kg)、4M阿莫地喹(0.5mg/kg)+艾塞那肽(0.05μg/kg)+格列本脲(1μg/kg)、5M阿莫地喹(0.5mg/kg)+坎利酸钾(0.33mg/kg)+艾塞那肽(0.05μg/kg)。对于6M组，仅从第2周开始出现具有统计学意义的差异，6M组为艾塞那肽(0.05μg/kg)+坎利酸钾(0.33mg/kg)+格列本脲(1μg/kg)。该图显示平均值±SEM；**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。

踏步实验(ST)

在踏步实验中对动物的前肢无活动能力进行测试，踏步实验通常用于测量神经肌肉功能，作为动物运动功能的指标。手术前一天，所有动物行为正常并与假手术组相似。如图10所示，与假手术组1M相比，所有t-MCAO组均表现出具有统计学意义的行为受损(得分较低)。与载剂治疗组2M相比，在所有治疗动物组中观察到运动功能随时间的具有统计学意义的改善(得分更高)(p＜0.001)。

前肢放置实验(FPT)

前肢放置实验用于评估躯体感觉和感觉运动缺陷。手术前一天，所有动物行为正常。与载剂治疗组相比，所有治疗组均观察到功能改善，这在p＜0.001时具有统计学意义(根据双向方差分析和随后的Bonferroni事后比较)。结果如图11所示。

高架十字迷宫实验(Pharmaseed SOP#120)

在第2周和第4周的高架十字迷宫实验中对动物的焦虑水平进行实验。如图13所示，所有动物在迷宫的闭臂中花费了更多的时间。在第2周和第4周，载剂治疗的2M组和用阿莫地喹+坎利酸钾+格列本脲处理的3M组之间存在具有统计学意义的差异。该图显示平均值±SEM；根据双向方差分析和随后的Bonferroni事后比较，***表示p＜0.001。在研究期间，所有其他组之间没有发现具有统计学意义的差异。

物体识别实验(Pharmaseed SOP#116)

在第4周动物接受用于认知记忆测试的新物体识别任务的实验。将大鼠带至新物体(与熟悉的物体相比)。记录在新物体或熟悉的物体附近花费的时间。与假手术组大鼠(p<0.05)相比，载剂治疗的动物表现出功能受损，花更多时间探究熟悉的物体。与载剂治疗组相比，发现3M组(通过阿莫地喹+坎利酸钾+格列本脲的组合治疗)和4M组(通过阿莫地喹+艾塞那肽+格列本脲的组合治疗)具有统计学意义的改善。测试结果如图12所示。该图显示了平均值±SEM；*表示p<0.05；**表示p<0.01，使用双向方差分析和随后的Bonferroni事后比较。

梗塞面积

使用ImageJ程序通过图像分析测量梗塞面积。如下图14所示，与载剂治疗的对照组相比，含有阿莫地喹的所有组(3M、4M和5M(除了6M))的治疗均显示出具有统计学意义的脑梗塞面积减少(小了两倍多)。3M组和5M组这两个组与6M组相比显示出具有统计学意义的改善。

组织学结果

通过TUNEL检测细胞凋亡

通过TUNEL染色法测定的神经保护的重要特定参数-细胞凋亡显示，与假手术组相比，所有t-MCAO组的凋亡细胞数量显著增加。与载剂治疗的对照组(2M组)相比，三联组合(3M组)中细胞的凋亡数量显著减少(*p＜0.05)。在此阶段，不含阿莫地喹的组合(6M组)显示出比3M组治疗更高的凋亡细胞百分比(**p<0.01)。参见图17。

通过IHC测量的髓鞘碱性蛋白(MBP)密度

MBP密度代表髓鞘的损伤。与假手术组的动物相比，对照载剂治疗的动物的髓鞘密度显著降低。与假手术组的动物相比，不使用阿莫地喹治疗的6M组的髓鞘密度也显著降低。然而，包括阿莫地喹在内的所有组合的组与假手术组的动物没有显著差异，这表明这些组合具有保护作用(见图24)。

通过形态计量学分析测量的Olig-2平均细胞数

根据单因素方差分析，与三联组合3M组(1M组)相比，三联组合4M组的Oligo-2密度显著增加(*p<0.05)。假手术组和所有其他组之间没有发现具有统计学意义的差异(图18)。

NG2少突胶质细胞祖细胞

与假手术组(1M)相比，载剂治疗组(2M组)的NG2少突胶质祖细胞显示具有统计学意义的增加，并且在两种治疗组合(4M和5M)中也很高(根据t检验，P<0.05)。根据单因素方差分析，与载剂对照组(2M组)相比，该阶段的三联组合的组(3M和6M)显著减少了活化的小胶质细胞面积(*p<0.05；**p<0.01)。有关更多详细信息，请参见图19。

NeuN神经元

载剂对照组(2M组)与假手术对照组(1M组)相比，NeuN密度显著降低(*p＜0.05)。根据单因素方差分析，与假手术对照组(1M组)相比，该阶段的三联组合的组(3M)也显著降低了NeuN密度(*p<0.05)。有关详细信息，请参见图20。

在第4周结束时，通过形态计量学分析评价的其他三个参数是大脑区域的GFAP、Ila-1和双皮质素，如图21、图22和图23所示。

GFAP

代表反应性星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的形态计量学分析显示，与假手术组1M(p<0.001)和6M(p<0.01)相比，载剂治疗的对照组2M的GFAP增加具有统计学意义。根据单因素方差分析，与载剂治疗组2M相比，三联组合治疗组3M、4M和5M降低了GFAP标志物(分别为p＜0.001、p＜0.001和p＜0.05)。参见图21。

Iba-1染色

Iba-1染色的形态计量分析结果(代表缺血性脑中的小胶质细胞)显示出与GFAP相同的趋势，即根据单因素方差分析，2M组(载剂治疗)显示最高值并且三联组合的组(3M、4M和5M以及假手术组1M)显示最低值，(**p<0.01；***p<0.001)。6M组只有与假手术组的1M组相比才具有统计学意义(p＜0.001)。参见图22。

双皮质素染色

根据t检验，与2M组(载剂治疗)相比，三联组合的3M、4M和5M组的双皮质素染色的形态计量分析结果(代表神经发生过程)显示出更高的值(p<0.05)。参见图23。

结论

实施例3的结果与先前的卒中模型研究(安慰剂组、梗塞面积、NSS测试)一致。随着时间的推移，观察到NSS的逐渐改善(第28天vs第8天)。此外，与第8天的结果相比，与对照组相比，在第28天观察到三联组合相对更好地改善了梗塞面积(从12％到8％、从15％到10％、从38％到27％)。记忆力测试也有显著改善。

在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方面的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，如所要求保护的本发明不应不当地局限于这样的特定实施方案。事实上，所描述的实施本发明的模式的各种修改对于相关领域的技术人员来说是显而易见的，这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。

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Claims

1.一种组合，包括：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂；和

(iii)磺酰脲。

2.根据权利要求1所述的组合，其中所述Nurr1激动剂选自阿莫地喹、氯喹、羟氯喹和格拉非宁以及它们的可药用的盐，并且更优选为阿莫地喹或其可药用的盐。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合，包括：

阿莫地喹或其可药用的盐；

醛固酮拮抗剂；和

以下组分中的至少一种：胰岛素调节剂和磺酰脲。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合，其中所述醛固酮拮抗剂是坎利酸钾、或其结构或功能类似物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合，其包括：阿莫地喹、或其可药用的盐；醛固酮拮抗剂；和胰岛素调节剂。

6.根据权利要求5所述的组合，其中所述胰岛素调节剂选自：艾塞那肽、及其结构和功能类似物、及其可药用的盐。

7.根据权利要求6所述的组合，其中所述艾塞那肽结构或功能类似物选自：利西拉肽、阿必鲁肽、司美格鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(LY2189265)。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的组合，其包括阿莫地喹或其可药用的盐；醛固酮拮抗剂；和磺酰脲。

9.根据权利要求8所述的组合，其中磺酰脲选自：格列本脲、及其可药用的盐、及其结构和功能类似物。

10.根据权利要求9所述的组合，其中所述格列本脲的结构或功能类似物选自：格列本脲、格列美脲、格列吡嗪和格列齐特的酰腙、磺酰胺和磺酰硫脲衍生物，优选格列齐特的酰腙、磺酰胺和磺酰硫脲衍生物。

11.根据权利要求1所述的组合，其包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

12.根据权利要求1所述的组合，其包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

13.根据权利要求1所述的组合，其包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

14.根据权利要求1所述的组合，其包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

15.根据权利要求1所述的组合，包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

16.根据权利要求2至15中任一项所述的组合，其包括阿莫地喹的盐酸盐。

17.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其包括至少一种另外的活性药物成分(API)，所述活性药物成分选自β受体阻滞剂、肾素-血管紧张素抑制剂、他汀类药物(HMG-CoA还原酶抑制剂)、血小板活化或聚集抑制剂、磷酸二酯酶-3抑制剂、钙增敏剂、抗氧化剂和抗炎剂。

18.一种药物组合物，其包括根据前述权利要求中任一项所述的组合以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

19.一种药物产品，包括：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂；和

(iii)磺酰脲。

20.根据权利要求19所述的药物产品，包括：

阿莫地喹或其可药用的盐；

醛固酮拮抗剂；和

以下组分中的至少一种：胰岛素调节剂和磺酰脲。

21.根据权利要求20所述的药物产品，包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

22.根据权利要求20所述的药物产品，包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

23.根据权利要求20所述的药物产品，包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

24.根据权利要求20所述的药物产品，包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

25.根据权利要求20所述的药物产品，包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

26.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或用于提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或用于提供神经保护的用途。

27.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品用于根据权利要求26所述的用途，其中所述缺血和/或再灌注损伤是脑、心脏、肺、肾的缺血和/或者再灌注损伤，优选脑缺血、脑再灌注损伤或卒中。

28.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品用于根据权利要求26所述的用于治疗或预防缺血性卒中的用途。

29.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品用于根据权利要求26所述的用于治疗或预防神经炎症或神经炎症性病症的用途。

30.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品用于根据权利要求29所述的用途，其中所述神经炎症性病症选自阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性视神经炎(AON)、横贯性脊髓炎和视神经脊髓炎(NMO)。

31.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品用于根据权利要求29所述的用途，其中所述神经炎症与如下疾病有关：创伤性脑损伤、脊髓损伤、老化、精神分裂症、抑郁症、偏头痛、癫痫、神经病理性疼痛、唐氏综合症、自闭症、早产儿、青光眼或病毒感染。

32.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品用于根据权利要求26所述用于治疗或预防神经退行性疾病的用途，所述疾病优选选自帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和血管性痴呆。

33.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品用于根据权利要求26所述的提供神经保护的用途。

34.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品，其被配制用于静脉内施用。

35.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品，其被配制用于皮下施用。

36.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品，其被配制用于口服施用。

37.根据权利要求1至17中任一项所述的组合、或根据权利要求18所述的药物组合物、或根据权利要求19至25中任一项所述的药物产品，其被配制用于鼻内施用。

38.一种治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的方法，所述方法包括对有需要的受试者同时、按顺序或单独施用：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂，和

(iii)磺酰脲。

39.根据权利要求38所述的方法，其包括对有需要的受试者同时、按顺序或单独施用：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

40.根据权利要求38所述的方法，其包括对有需要的受试者同时、按顺序或单独施用：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

41.根据权利要求38所述的方法，其包括对有需要的受试者同时、按顺序或单独施用：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

42.根据权利要求38所述的方法，其包括对有需要的受试者同时、按顺序或单独施用：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

43.根据权利要求38所述的方法，其包括对有需要的受试者同时、按顺序或单独施用：

阿莫地喹、或其可药用的盐；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

44.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其中所述缺血和/或再灌注损伤是脑、心脏、肺、肾的缺血和/或者再灌注损伤，优选脑缺血、脑再灌注损伤或者卒中。

45.根据权利要求38至44中任一项所述的方法，其用于治疗或预防缺血性卒中。

46.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其用于治疗或预防神经退行性疾病，所述神经退行性疾病优选选自帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症和血管性痴呆。

47.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其用于提供神经保护。

48.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其用于治疗或预防神经炎症或神经炎症性病症。

49.根据权利要求38至48中任一项所述的方法，其中经肠胃外施用所述组分，优选静脉内施用所述组分。

50.根据权利要求38至48中任一项所述的方法，其中口服施用所述组分。

51.根据权利要求38至48中任一项所述的方法，其中皮下施用所述组分。

52.根据权利要求38至48中任一项所述的方法，其中鼻内施用所述组分。

53.根据权利要求38至48中任一项所述的方法，其中在第一施用阶段和至少一个第二施用阶段施用所述组分，其中在所述第一施用阶段静脉内施用所述组分，并且在所述至少一个第二施用阶段口服施用所述组分。

54.根据权利要求38至48中任一项所述的方法，其中在第一施用阶段和至少一个第二施用阶段施用所述组分，其中在所述第一施用阶段静脉内施用所述组分，并且在所述至少一个第二施用阶段皮下施用所述组分。

55.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其包括以约0.001μg/kg至约30μg/kg受试者体重、更优选约0.01μg/kg至约5μg/kg受试者体重的剂量施用格列本脲。

56.根据权利要求39、41、42或43中任一项所述的方法，其包括以约0.001μg/kg至约1.5μg/kg受试者体重、优选约0.01μg/kg至约0.1μg/kg受试者体重的剂量施用艾塞那肽或其可药用的盐。

57.根据权利要求39、40或42中任一项所述的方法，其包括以约0.03mg/kg至约10mg/kg受试者体重、优选约0.3mg/kg至约5mg/kg受试者体重的剂量施用坎利酸钾。

58.根据权利要求39至43中任一项所述的方法，其包括以约0.01mg/kg至约20mg/kg受试者体重、优选约0.1mg/kg至约10mg/kg受试者体重、更优选约0.1mg/kg至约1mg/kg受试者体重、甚至更优选约0.5mg/kg或0.1mg/kg受试者体重的剂量施用阿莫地喹或其可药用的盐。

59.根据权利要求38至58中任一项所述的方法，其包括对所述受试者同时施用所述组分。

60.以下物质在制备用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的药物中的用途：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂，和

(iii)磺酰脲。

61.根据权利要求60所述的用途，其包括以下物质在制备用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的药物中的用途：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

62.根据权利要求60所述的用途，其包括以下物质在制备用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上的、或提供针对心脏毒性药物的心脏保护的、或提供神经保护的药物中的用途：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

63.根据权利要求60所述的用途，其包括以下物质在制备用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的药物中的用途：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

64.根据权利要求60所述的用途，其包括以下物质在制备用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的药物中的用途：

阿莫地喹、或其可药用的盐；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

65.根据权利要求60所述的用途，其包括以下物质在制备用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、神经炎症、神经炎症性病症、卒中、神经退行性疾病、新生儿窒息、心脏骤停、心源性休克和急性心肌梗塞中的一种或以上，或提供针对心脏毒性药物的心脏保护，或提供神经保护的药物中的用途：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

66.一种组合的用途，其用于在移植之前或移植期间治疗和/或预防离体器官中的缺血和/或再灌注损伤，所述组合包括：

(a)第一组分，其为Nurr1激动剂；和

(b)至少一种另外的组分，其选自：

(i)醛固酮拮抗剂；

(ii)胰岛素调节剂，和

(iii)磺酰脲。

67.根据权利要求66所述的组合的用途，所述组合包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

68.根据权利要求66所述的组合的用途，所述组合包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

69.根据权利要求66所述的组合的用途，所述组合包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

70.根据权利要求66所述的组合的用途，所述组合包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；

坎利酸钾、或其结构或功能类似物；

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐；和

格列本脲、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。

71.根据权利要求66所述的组合的用途，其用于在移植之前或移植期间治疗和/或预防离体器官中的缺血和/或再灌注损伤，所述组合包括：

阿莫地喹、或其可药用的盐；和

艾塞那肽、或其结构或功能类似物、或其可药用的盐。