CN118275670A - 长链核苷酸的抗体偶联方法、抗原含量检测方法及试剂盒 - Google Patents

长链核苷酸的抗体偶联方法、抗原含量检测方法及试剂盒 Download PDF

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CN118275670A
CN118275670A CN202410379038.8A CN202410379038A CN118275670A CN 118275670 A CN118275670 A CN 118275670A CN 202410379038 A CN202410379038 A CN 202410379038A CN 118275670 A CN118275670 A CN 118275670A
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王力
惠薇
张泓
马展
丁国徽
张春雨
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Abstract

本发明提供一种长链核苷酸的抗体偶联方法、抗原含量检测方法及试剂盒，属于抗原检测技术领域。所述长链核苷酸的抗体偶联方法包括：准备poly A单链寡核苷酸并确定目标待偶联抗体；利用第一偶联试剂活化目标待偶联抗体；将目标待偶联抗体与目标长链核苷酸进行混合并进行第一次孵育；加入poly A单链寡核苷酸混合并进行第二次孵育得到双链偶联抗体。本发明提供了一种新的抗体偶联核苷酸的方法用于偶联较长片段的双链核苷酸，核苷酸能够兼容双链和单链，其长度可超过200bp以上，偶联效率能够达到95％以上。本发明简化了偶联步骤，缩短了偶联整体时间，降低了偶联成本。

Description

长链核苷酸的抗体偶联方法、抗原含量检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于抗原检测技术领域，尤其涉及一种长链核苷酸的抗体偶联方法、抗原含量检测方法及试剂盒。
背景技术
在当今生物技术和医学领域，对低丰度蛋白的精确与有效检测日益成为研究和临床诊断中的重要需求。低丰度蛋白的检测不仅对于早期疾病诊断具有关键意义，也对疾病机理研究、新药开发以及治疗效果监测等领域发挥着至关重要的作用。为了满足这一需求，科研人员和技术开发者利用抗体与寡核苷酸的偶联物技术，开发出了多种用于检测和分析低丰度蛋白的方法。这些抗体-寡核苷酸偶联物凭借其独特的生物化学特性，已广泛应用于免疫学、蛋白质组学、生物标志物发现以及临床诊断等多个生物技术领域。
目前，抗体-寡核苷酸偶联的技术主要分为胺类偶联、巯基偶联和糖类偶联三种类型。这些方法利用抗体上的不同官能团与寡核苷酸进行化学偶联，其中胺类偶联利用抗体表面的氨基残基进行偶联，巯基偶联通过氧化巯基暴露反应基团，而糖类偶联则是在抗体的糖类残基上进行。这些方法各有优势，但也面临不同的技术挑战，如偶联效率、抗体活性保持以及偶联产物的稳定性等。
采用常规方法的现有商品化核苷酸偶联试剂盒，对于偶联的核苷酸有长度和序列修饰要求，其中单链寡核苷酸的长度必须在10-120个碱基范围内，并且必须通过合成在末端嵌入一个氨基。5’位末端氨化的寡核苷酸偶联效率略高。双链寡核苷酸的长度最多不超过80个碱基，但只有一端应是氨化的。长度和修饰方面的要求意味着抗体上只能偶联引物或者探针，无法偶联较长片段的核苷酸。此外，试剂盒多为进口试剂，价格昂贵，操作步骤较为复杂。
并且，现有的ELISA试剂盒都是基于非均相的标记免疫技术。从功能上该技术有载体-抗原/抗体系统和信号放大系统两部分构成。放大系统的效率和信噪比决定了检测所能达到的灵敏度。为实现高的信噪比，一个良好的放大系统应能且只能在抗原抗体发生特异性结合后，才被出发产生可被检测的信号，且产生的信号于发生抗原抗体反应的分子数呈高度的相关关系。由于游离标记物和非特异结合的存在，这些信号被放大系统错误放大是造成现有技术灵敏度无法进一步提高的关键。因此，需要寻找更加高效、特异的检测系统和方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种长链核苷酸的抗体偶联方法，包括：
根据目标长链核苷酸，准备poly A单链寡核苷酸并确定需要偶联的目标待偶联抗体；其中，所述目标长链核苷酸包含有第一修饰物；
利用第一偶联试剂活化所述目标待偶联抗体；其中，所述第一偶联试剂中含有能与所述一修饰物发生特异性的偶联反应的第一反应活性基团；
将活化后的所述目标待偶联抗体与所述目标长链核苷酸进行混合并进行第一次孵育；
孵育结束后，加入所述poly A单链寡核苷酸混合并进行第二次孵育，完成抗体偶联，得到双链偶联抗体；
优选地，所述目标长链核苷酸的长度为100bp-500bp；并且，所述目标长链核苷酸的正向链5’端有所述第一修饰物：叠氮基团；
优选地，所述poly A单链寡核苷酸的长度为20nt；并且，所述poly A单链寡核苷酸的5’端有叠氮修饰；
优选地，所述第一偶联试剂的第一反应活性基团为DBCO；
优选地，所述第一偶联试剂为DBCO-PEG5-NHS溶液。
优选地，所述利用第一偶联试剂活化所述目标待偶联抗体，包括：
取10μg-30μg的所述目标待偶联抗体，并加入10mM的DBCO-PEG5-NHS溶液，震荡混合，得到第一活化混合液；
将所述第一活化混合液室温静置20min-40min；
在低温环境下，加入活化终止剂，室温放置10min-20min终止活化，即得到活化后的所述目标待偶联抗体；
优选地，所述活化终止剂为Tris-HCl；
优选地，所述活化终止剂的pH＝8.0；
优选地，所述活化终止剂的加入浓度为1M。
优选地，所述第一次孵育，包括：
对活化后的所述目标待偶联抗体过滤；
用100μL-300μL 1X PBS重悬过滤后的所述目标待偶联抗体；
在重悬后的所述目标待偶联抗体中，加入所述目标长链核苷酸进行所述第一次孵育；
优选地，所述第一次孵育时的孵育温度条件为4℃或室温。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种抗原含量检测方法，包括：
取捕获抗体，进行磁珠包被后，得到磁珠偶联抗体；以及，利用如上述所述的长链核苷酸的抗体偶联方法制备得到双链偶联抗体；
根据所述磁珠偶联抗体和所述双链偶联抗体，配制反应体系；
基于所述反应体系，利用所述磁珠偶联抗体捕获目标抗原，并且利用所述双链偶联抗体标记被捕获的所述目标抗原，得到标记混合液；
针对所述标记混合液，基于qPCR技术进行反应，得到所述目标抗原对应的含量检测结果。
优选地，所述取捕获抗体，进行磁珠包被后，得到磁珠偶联抗体，包括：
将所述捕获抗体和第二偶联试剂震荡混合，得到第二活化混合液；其中，所述第二偶联试剂中含有第二反应活性基团；
在低温环境下，加入活化终止剂，室温放置10min-20min终止活化，过滤后，即得到活化后的且由所述第二偶联试剂标记的所述捕获抗体，作为标记抗体；
将所述标记抗体与含有第二修饰物的标记磁珠混合孵育，再加入poly A单链寡核苷酸进行反应；其中，所述标记磁珠的所述第二修饰物能与所述第二偶联试剂的所述第二反应活性基团发生特异性的偶联反应；
利用磁力架冲洗并重悬后，即得到所述磁珠偶联抗体；
优选地，所述第二偶联试剂的第二反应活性基团为Azido；
优选地，所述第二偶联试剂为Azido-PEG8-NHS溶液；
优选地，所述标记磁珠为DBCO修饰的磁珠；
优选地，所述活化终止剂为Tris-HCl；
优选地，所述活化终止剂的pH＝8.0；
优选地，所述活化终止剂的加入浓度为1M。
优选地，所述反应体系中包括：洗液、封闭液、所述磁珠偶联抗体和所述双链偶联抗体；
优选地，每份的所述反应体系中各组分加入量分别为：
以总量为500μL计，其中所述封闭液55μL、所述磁珠偶联抗体55μL和所述双链偶联抗体18.7μL，以及所述洗液为余量；
优选地，所述洗液中的组分包括：Tris、NaCl、KCl和Tween 20。
优选地，所述基于所述反应体系，利用所述磁珠偶联抗体捕获目标抗原，并且利用所述双链偶联抗体标记被捕获的所述目标抗原，得到标记混合液，包括：
将根据所述反应体系分别配制得预设数量的实验组反应液；
向不同的所述实验组反应液中加入与所述预设数量对应的预设梯度浓度的目标抗原，得到预设数量个混合反应液，并分别进行洗涤、重悬即得到所述标记混合液；
优选地，所述预设数量为至少5个；
优选地，所述预设数量为5个；
优选地，在所述预设数量为5个时，所述预设梯度浓度包括：9pg/mL、90pg/mL、900pg/mL、9000pg/mL和90000pg/mL。
优选地，所述针对所述标记混合液，基于qPCR技术进行反应，得到所述目标抗原对应的含量检测结果，包括：
以所述标记混合液为模板，进行qPCR反应，分别得到每个所述标记混合液对应的Ct值；
根据所述Ct值确定所述目标抗原对应的含量检测结果。
优选地，所述根据所述Ct值确定所述目标抗原对应的含量检测结果，包括：
以所述目标抗原的所述预设梯度浓度为横坐标，以每个所述标记混合液对应的Ct值为纵坐标回执标准曲线，得出标准曲线公式；
根据所述标准曲线公式确定所述含量检测结果。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种试剂盒，采用如上述所述的长链核苷酸的抗体偶联方法进行长链核苷酸的偶联；和/或，采用如上述所述的抗原含量检测方法进行抗原的含量检测。
本发明提供长链核苷酸的抗体偶联方法、抗原含量检测方法及试剂盒，其中，所述长链核苷酸的抗体偶联方法包括：根据目标长链核苷酸，准备poly A单链寡核苷酸并确定需要偶联的目标待偶联抗体；其中，所述目标长链核苷酸包含有第一修饰物；利用第一偶联试剂活化所述目标待偶联抗体；其中，所述第一偶联试剂中含有能与所述一修饰物发生特异性的偶联反应的第一反应活性基团；将活化后的所述目标待偶联抗体与所述目标长链核苷酸进行混合并进行第一次孵育；孵育结束后，加入所述poly A单链寡核苷酸混合并进行第二次孵育，完成抗体偶联，得到双链偶联抗体。本发明提供了一种新的抗体偶联核苷酸的方法，用于偶联较长片段的双链核苷酸，核苷酸能够兼容双链和单链，其长度可超过200bp以上，偶联效率能够达到95％以上。本发明简化了偶联步骤，缩短了偶联整体时间，降低了偶联成本。
本发明所提供的长链核苷酸的抗体偶联方法，偶联后的抗体-寡核苷酸偶联物可应用于进一步的抗原抗体反应，提高蛋白检测和定量的灵敏度，从而进行抗原含量检测方法中的含量检测；本发明提供的抗原含量检测方法的检测下限高出ELISA 100-10000倍，明显优于一般的ELISA法。
本发明提供的抗原含量检测方法中的免疫反应使用磁珠包被抗体，样本量较大时，可实现全流程机器化操作，缩短检测时间，提高检测效率，减少人为因素导致的误差。
附图说明
图1为本发明长链核苷酸的抗体偶联方法的流程示意图；
图2为本发明抗原含量检测方法的流程示意图；
图3为本发明实施例1中电泳结果示意图。
具体实施方式
术语解释：
ELISA：酶标抗体法，又名酶联免疫吸附法，利用酶标记抗原或抗体以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。
偶联：偶联反应，也作偶连反应、耦联反应、氧化偶联，是由两个有机化学单位进行某种化学反应而得到一个有机分子的过程。
HRP：辣根过氧化物酶，是从辣根中分离出来的，属于过氧化物酶的铁原卟啉基团。
TMB：四甲基联苯胺，为白色结晶粉末，无嗅、无味，难溶于水，易溶于丙酮、乙醚、二甲亚砜、二甲基甲酰胺等有机溶剂。一种新型安全的色原试剂。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参考图1，本发明提供一种长链核苷酸的抗体偶联方法，包括：
步骤S1，根据目标长链核苷酸，准备poly A单链寡核苷酸并确定需要偶联的目标待偶联抗体；其中，所述目标长链核苷酸包含有第一修饰物。
上述，在这一步，首先准备目标长链核苷酸，这些核苷酸包含有第一修饰物，如磷酸化位点、生物素标记或其他化学修饰，使其能够在后续步骤中与抗体进行特异性偶联。同时，确定需要偶联的目标待偶联抗体，这通常涉及选择与目标蛋白或分子具有高度特异性结合能力的抗体。
上述，采用poly A单链寡核苷酸在抗体-核苷酸偶联技术中其作用在于：
使用PolyA单链寡核苷酸，是因为碱基序列单一，不会与现有的序列互补结合，封闭DBCO基团的同时，不会与偶联的双链核苷酸或者游离的其他核苷酸互补结合，不会干扰后续的qPCR检测结果。
步骤S2，利用第一偶联试剂活化所述目标待偶联抗体；其中，所述第一偶联试剂中含有能与所述一修饰物发生特异性的偶联反应的第一反应活性基团；
上述，利用含有第一反应活性基团的第一偶联试剂(如NHS酯、马来酰亚胺等)来活化目标待偶联抗体。这一过程涉及将活性基团引入抗体的特定位点(如氨基残基)，从而使抗体能够与目标长链核苷酸中的修饰物进行特异性反应。
步骤S3，将活化后的所述目标待偶联抗体与所述目标长链核苷酸进行混合并进行第一次孵育；
步骤S4，孵育结束后，加入所述poly A单链寡核苷酸混合并进行第二次孵育，完成抗体偶联，得到双链偶联抗体；
上述，将活化后的抗体与目标长链核苷酸混合并进行孵育，使之发生特异性偶联反应。这一步骤中，抗体上的活化基团与核苷酸上的修饰物之间发生结合，形成稳定的抗体-核苷酸偶联物。
在第一次孵育结束后，加入poly A单链寡核苷酸进行第二次孵育。这一步骤是为了封闭结合物质，形成稳定的抗体偶联双链氨基酸。
本发明提供了一种新的抗体偶联核苷酸的方法，用于偶联较长片段的双链核苷酸，核苷酸能够兼容双链和单链，其长度可超过200bp以上，偶联效率能够达到95％以上。本发明简化了偶联步骤，缩短了偶联整体时间，降低了偶联成本。
进一步的，所述目标长链核苷酸的长度为100bp-500bp；并且，所述目标长链核苷酸的正向链5’端有所述第一修饰物：叠氮基团；
进一步的，所述poly A单链寡核苷酸的长度为20nt；并且，所述poly A单链寡核苷酸的5’端有叠氮修饰；
进一步的，所述第一偶联试剂的第一反应活性基团为DBCO；
进一步的，所述第一偶联试剂为DBCO-PEG5-NHS溶液。
上述，第一偶联试剂DBCO-PEG5-NHS溶液，是一种偶联化学试剂，用于生物分子的偶联反应，特别是在点击化学(click chemistry)应用中。这里的DBCO指的是叠氮环辛烯(Dibenzocyclooctyne)，PEG5表示连接DBCO和NHS的聚乙二醇(Polyethylene Glycol)链长度为5个单元，而NHS指的是N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide)。这种溶液通常用于促进特定生物分子(如蛋白质、抗体等)与其他分子(如标记物、药物或其他蛋白质)的共价结合，而不需要紫外线或其他激发光源。
第一反应活性基团，即DBCO是一种非常活跃的化学基团，能够与含有叠氮基(Azide，-N3)的分子发生特异性的点击反应，形成稳定的共价键结构。这种反应在室温下进行，反应条件温和，且具有很高的选择性和特异性。DBCO-PEG5-NHS溶液通过PEG链提供了一定的空间柔性和水溶性，同时NHS活化的末端能与蛋白质或其他含有氨基(-NH2)的生物分子发生反应，形成稳定的酰胺键。
进一步的，所述步骤S2，利用第一偶联试剂活化所述目标待偶联抗体，包括：
步骤S21，取10μg-30μg的所述目标待偶联抗体，并加入10mM的DBCO-PEG5-NHS溶液，震荡混合，得到第一活化混合液；
步骤S22，将所述第一活化混合液室温静置20min-40min；
步骤S23，在低温环境下，加入活化终止剂，室温放置10min-20min终止活化，即得到活化后的所述目标待偶联抗体；
上述，低温环境，为低于室温的环境，在本发明中，采用冰浴，或者冰上直接进行操作，从而达到一定的低温环境。
进一步的，所述活化终止剂为Tris-HCl；
进一步的，所述活化终止剂的pH＝8.0；
进一步的，所述活化终止剂的加入浓度为1M。
进一步的，所述步骤S3中，第一次孵育，包括：
步骤S31，对活化后的所述目标待偶联抗体过滤；
步骤S32，用100μL-300μL 1X PBS重悬过滤后的所述目标待偶联抗体；
步骤S33，在重悬后的所述目标待偶联抗体中，加入所述目标长链核苷酸进行所述第一次孵育；
进一步的，所述第一次孵育时的孵育温度条件为4℃或室温。
此外，参考图2，本发明还提供一种抗原含量检测方法，包括：
步骤S5，取捕获抗体，进行磁珠包被后，得到磁珠偶联抗体；以及，利用如上述所述的长链核苷酸的抗体偶联方法制备得到双链偶联抗体；
步骤S6，根据所述磁珠偶联抗体和所述双链偶联抗体，配制反应体系；
步骤S7，基于所述反应体系，利用所述磁珠偶联抗体捕获目标抗原，并且利用所述双链偶联抗体标记被捕获的所述目标抗原，得到标记混合液；
步骤S8，针对所述标记混合液，基于qPCR技术进行反应，得到所述目标抗原对应的含量检测结果。
进一步的，所述步骤S5，取捕获抗体，进行磁珠包被后，得到磁珠偶联抗体，包括：
步骤S51，将所述捕获抗体和第二偶联试剂震荡混合，得到第二活化混合液；其中，所述第二偶联试剂中含有第二反应活性基团；
步骤S52，在低温环境下，加入活化终止剂，室温放置10min-20min终止活化，过滤后，即得到活化后的且由所述第二偶联试剂标记的所述捕获抗体，作为标记抗体；
步骤S53，将所述标记抗体与含有第二修饰物的标记磁珠混合孵育，再加入poly A单链寡核苷酸进行反应；其中，所述标记磁珠的所述第二修饰物能与所述第二偶联试剂的所述第二反应活性基团发生特异性的偶联反应；
步骤S54，利用磁力架冲洗并重悬后，即得到所述磁珠偶联抗体；
进一步的，所述第二偶联试剂的第二反应活性基团为Azido；
进一步的，所述第二偶联试剂为Azido-PEG8-NHS溶液；
进一步的，所述标记磁珠为DBCO修饰的磁珠；
进一步的，所述活化终止剂为Tris-HCl；
进一步的，所述活化终止剂的pH＝8.0；
进一步的，所述活化终止剂的加入浓度为1M。
上述，捕获抗体可以为内脂素捕获抗体。
上述，第二偶联试剂Azido-PEG8-NHS是一种用于生物分子的偶联反应的化学试剂，尤其是在生物共价修饰和生物标记领域。这种试剂由三个主要部分组成：Azido基团、PEG8链和NHS酯。
Azido基团(-N3)：即第二反应活性基团，这是一种能够参与点击化学反应的官能团，尤其是与环辛烯(如DBCO)进行无催化剂的[3+2]环加成反应，形成稳定的三氮杂环庚烷结构。这种反应条件温和，特异性强，适用于生物分子的修饰。
PEG8链：即聚乙二醇链，具有8个乙二醇单元。PEG链作为连接器，增加了分子间的空间距离，减少了生物分子间的立体阻碍，提高了分子的水溶性和生物相容性。
NHS酯(N-Hydroxysuccinimide ester)：这是一种能够与含有氨基(-NH2)的分子发生反应的活性酯，形成稳定的酰胺键。这种反应适用于蛋白质、多肽等氨基酸序列的N端或侧链上的游离氨基。
在反应中，Azido-PEG8-NHS主要作为一种活化试剂，用于先将第二反应活性基团Azido通过NHS酯与目标分子(如蛋白质、抗体等)上的氨基形成稳定的共价键接枝，从而在目标分子上引入第二反应活性基团(Azido官能团)。随后，通过点击化学反应(如与DBCO修饰的分子反应)，进一步实现对目标分子的修饰或偶联其他分子，如在本发明中，是将内脂素捕获抗体与DBCO修饰的磁珠进行偶联。
综上所述，Azido-PEG8-NHS在这个过程中起到了至关重要的中间介质作用，不仅实现了抗体的功能化修饰，也为后续的点击化学反应提供了必要的反应基团，使得抗体可以与其他功能化分子进行高效、特异性的偶联。
进一步的，所述反应体系中包括：洗液、封闭液、所述磁珠偶联抗体和所述双链偶联抗体；
进一步的，每份的所述反应体系中各组分加入量分别为：
以总量为500μL计，其中所述封闭液55μL、所述磁珠偶联抗体55μL和所述双链偶联抗体18.7μL，以及所述洗液为余量；
进一步的，所述洗液中的组分包括：Tris、NaCl、KCl和Tween 20。
进一步的，所述步骤S7，基于所述反应体系，利用所述磁珠偶联抗体捕获目标抗原，并且利用所述双链偶联抗体标记被捕获的所述目标抗原，得到标记混合液，包括：
步骤S71，将根据所述反应体系分别配制得预设数量的实验组反应液；
步骤S72，向不同的所述实验组反应液中加入与所述预设数量对应的预设梯度浓度的目标抗原，得到预设数量个混合反应液，并分别进行洗涤、重悬即得到所述标记混合液；
进一步的，所述预设数量为至少5个；
进一步的，所述预设数量为5个；
为了进行标准曲线的绘制，理论上数值可以为2个以上，但是为了提高检测精度，预设数量至少为5个。
上述，在配制得到实验组反应液后，需要进行配置混合反应液，同时可以制备对照样品，从而在进一步进行计算时，通过对照样品评估检测和计算过程的合理性和准确性。
进一步的，在所述预设数量为5个时，所述预设梯度浓度包括：9pg/mL、90pg/mL、900pg/mL、9000pg/mL和90000pg/mL。
进一步的，所述步骤S8，针对所述标记混合液，基于qPCR技术进行反应，得到所述目标抗原对应的含量检测结果，包括：
步骤S81，以所述标记混合液为模板，进行qPCR反应，分别得到每个所述标记混合液对应的Ct值；
步骤S82，根据所述Ct值确定所述目标抗原对应的含量检测结果。
进一步的，所述步骤S82，根据所述Ct值确定所述目标抗原对应的含量检测结果，包括：
步骤S821，以所述目标抗原的所述预设梯度浓度为横坐标，以每个所述标记混合液对应的Ct值为纵坐标回执标准曲线，得出标准曲线公式；
步骤S822，根据所述标准曲线公式确定所述含量检测结果。
此外，本发明还提供一种试剂盒，采用如上述所述的长链核苷酸的抗体偶联方法进行长链核苷酸的偶联；和/或，采用如上述所述的抗原含量检测方法进行抗原的含量检测。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1：抗体偶联核苷酸
本实施例中，进行了长链核苷酸的抗体偶联。
实验方法：
1、制备长链核苷酸：
目标待偶联抗体选择了内脂素检测抗体。为了避免与人源样本产生交叉反应，设计一段非人源的双链核苷酸序列作为所述目标长链核苷酸，核苷酸长度为263bp，双链核苷酸5’端有叠氮基修饰。
根据所设计的序列合成了长链核苷酸，核苷酸的正向序列(除5’端的N3修饰外)如SEQ ID NO.1所示。具体为：
N3-5CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT。
合成一段长度为20nt的5’段有叠氮基修饰的poly A单链寡核苷酸。合成后的双链核苷酸使用qubit定量试剂进行定量，本双链核苷酸的浓度为100ng/μL。
2、对长链核苷酸进行偶联反应：
(1)使用超滤管过滤抗体，去除抗体中的甘油，Tris和叠氮钠等物质，确保抗体溶解在1X PBS中。
(2)纯化后的抗体重新使用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，确定蛋白的最终浓度。以内脂素检测抗体为例，蛋白浓度为2μg/μL。
(3)取15μg抗体，加入2μL10mM的DBCO-PEG5-NHS溶液，震荡混匀后室温静置30min。
(4)在冰上加入3μL1MTris-HCl(pH＝8.0)，室温放置15min。
(5)将抗体加入50mL超滤管中，使用1X PBS溶液2mL洗涤三次。去除非反应性DBCO-NHS酯，最后溶于1X PBS溶液，得到纯化后的抗体。
(6)将DBCO-PEG5-NHS标记的抗体与7.5ug双链核苷酸混合，在4℃下孵育过夜。(约10-12h)。
(7)加入5μL poly A单链寡核苷酸(浓度为100uM)，4℃继续反应1h。
(8)将抗体加入50mL超滤管中，使用1X PBS溶液2mL洗涤三次。最后溶于1X PBS溶液，加1/10体积的10X封闭液(封闭液配方为：1M Tris PH7.4,30mg/mL BSA,1mg/mL鲑鱼精DNA)保存。
(9)使用SDS凝胶质检偶联抗体，根据如图3所示的电泳图可以看出抗体因为偶联双链核苷酸后，明显发生位移，偶联成功，得到双链偶联抗体。
实施例2：抗原含量检测
本实施例中，利用实施例1中所制备得到的双链偶联抗体进行抗原含量检测。
实验方法：
1、磁珠包被抗体：
(1)取17ug内脂素捕获抗体，加入2μL 10mM Azido-PEG8-NHS，震荡混匀后室温静置30min。
(2)在冰上加入3μL 1M Tris-HCl(pH＝8.0)，室温静置15min。
(3)用50mL超滤管过滤去除非反应性Azido-PEG8-NHS酯，3mL 1XPBS溶液过滤3次。
(4)将Azido-PEG8-NHS酯标记的抗体(250μL)与30μL DBCO修饰的Beasds混合，在4℃下孵育过夜。(约10-12h)。
(5)加入5μL poly A单链寡核苷酸(浓度为100uM)，4℃继续反应1h。
(6)将反应后的Beads用磁力架1X PBS洗三次，最后用280μL 1X PBS重悬，加1/10体积的10X封闭液保存。
2、抗原抗体结合
(1)按照0.05M Tris,0.138M NaCl,0.0027M KCl，0.1％ Tween 20的配方配制洗液。
(2)在离心管中配制反应液，反应体系如下：
表1、反应体系表
上表中，偶联磁珠的抗体#1，即为实施例2中所制备得到的磁珠包被抗体；偶联双链的抗体#2，即为实施例1中所制备得到的双链偶联抗体。
按照上述体系配置对照组以及实验组，并做好标记；
(3)向对照组离心管中加入55μL 10X封闭液。向实验组离心管中分别加入如下5组浓度：55μL 9pg/mL、90pg/mL、900pg/mL、9000pg/mL、90000pg/mL的抗原。
(4)涡旋10s后，瞬时离心，将其分装到8连管中，每孔100ul，做好标记，置于旋转仪中室温旋转3h。
(5)从旋转仪上取下，离心5s，置于磁力架上，去除上清。加入200μL洗液，取新的离心管盖子盖好并旋转八连管，使磁珠重新吸附至磁力架一端，重复旋转3次，去除上清，再加入200μL洗液，盖好盖子，轻轻倒置混匀，使磁珠重悬，静置5min，离心5s，重新置于磁力架上。
重复该操作3次。
洗涤完3次后，置于磁力架上，去除上清，再加入100μL洗液，轻轻颠倒混匀，使磁珠重悬，离心5s，备好新的八连管，将溶液全部转移至新的八连管中，置于磁力架上，去除上清，再加入200μL洗液，重复步骤3一次，最后加入30μL TE buffer，轻轻颠倒混匀，使磁珠重悬，离心5s后，置于PCR仪上，95℃加热5min。加热完成后，离心10s,置于磁力架上，将上清转移至新的八连管中备用。
3、qPCR检测
以上述步骤的上清作为模板，进行去qPCR实验，qPCR反应体系如下：
表2、qPCR反应体系
其中，反应体系中所采用的引物序列，具体分别包括如下：
Primer-F：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.2)；
Primer-R：GCAATTAACCCTCACTAAAGG(SEQ ID NO.3)。
其运行程序可以参考下表：
表3、运行程序
4、结果和分析：
表4、测试数据
样本名称 Ct值
90000pg/mL 19.598
9000pg/mL 23.191
900pg/mL 25.035
90pg/mL 28.668
9pg/mL 31.012
对照组 UND
分析：
(1)根据上述结果，以抗原浓度为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线，可得公式：
y＝-1.229ln(x)+33.863，R2为0.9916，标准曲线符合要求。
(2)对照组未检测出信号，证明试剂盒可以区分阴性样本和阳性样本，根据标准曲线公式代入可以用来精确定量蛋白含量。
(3)试剂盒的检测限为9pg/mL，较现有试剂盒相比，灵敏度提高了10的2次方以上，实现了巨大的突破。
总之，本发明提供了一种长链核苷酸的抗体偶联方法、抗原含量检测方法及试剂盒，其中，长链核苷酸的抗体偶联方法，用于偶联长片段的双链核苷酸，简化了偶联步骤，缩短了偶联时间，降低了偶联成本。
同时偶联后的抗体-寡核苷酸偶联物可应用于抗原发现和抗原含量检测。抗原抗体结合稳定，特异性的引物和探针用于检测抗原抗体结合信号，在特异性上进行了双重确认，大大降低非特异信号的产生；在放大系统的层面上采用荧光定量PCR技术，融合了抗体的检测特异性和PCR的检测灵敏度，灵敏度提高了10的2次方以上，实现了巨大的突破。应用于免疫反应时，使用磁珠包被抗体，样本量较大时，可实现全流程机器化操作，缩短检测时间，提高检测效率，减少人为因素导致的误差。
以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量和反应容器的调整，这些都属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种长链核苷酸的抗体偶联方法，其特征在于，包括：
根据目标长链核苷酸，准备poly A单链寡核苷酸并确定需要偶联的目标待偶联抗体；其中，所述目标长链核苷酸包含有第一修饰物；
利用第一偶联试剂活化所述目标待偶联抗体；其中，所述第一偶联试剂中含有能与所述一修饰物发生特异性的偶联反应的第一反应活性基团；
将活化后的所述目标待偶联抗体与所述目标长链核苷酸进行混合并进行第一次孵育；
孵育结束后，加入所述poly A单链寡核苷酸混合并进行第二次孵育，完成抗体偶联，得到双链偶联抗体；
优选地，所述目标长链核苷酸的长度为100bp-500bp；并且，所述目标长链核苷酸的正向链5’端有所述第一修饰物：叠氮基团；
优选地，所述poly A单链寡核苷酸的长度为20nt；并且，所述poly A单链寡核苷酸的5’端有叠氮修饰；
优选地，所述第一偶联试剂的第一反应活性基团为DBCO；
优选地，所述第一偶联试剂为DBCO-PEG5-NHS溶液。
2.如权利要求1所述长链核苷酸的抗体偶联方法，其特征在于，所述利用第一偶联试剂活化所述目标待偶联抗体，包括：
取10μg-30μg的所述目标待偶联抗体，并加入10mM的DBCO-PEG5-NHS溶液，震荡混合，得到第一活化混合液；
将所述第一活化混合液室温静置20min-40min；
在低温环境下，加入活化终止剂，室温放置10min-20min终止活化，即得到活化后的所述目标待偶联抗体；
优选地，所述活化终止剂为Tris-HCl；
优选地，所述活化终止剂的pH＝8.0；
优选地，所述活化终止剂的加入浓度为1M。
3.如权利要求1所述长链核苷酸的抗体偶联方法，其特征在于，所述第一次孵育，包括：
对活化后的所述目标待偶联抗体过滤；
用100μL-300μL1X PBS重悬过滤后的所述目标待偶联抗体；
在重悬后的所述目标待偶联抗体中，加入所述目标长链核苷酸进行所述第一次孵育；
优选地，所述第一次孵育时的孵育温度条件为4℃或室温。
4.一种抗原含量检测方法，其特征在于，包括：
取捕获抗体，进行磁珠包被后，得到磁珠偶联抗体；以及，利用如权利要求1-3任一项所述的长链核苷酸的抗体偶联方法制备得到的双链偶联抗体；
根据所述磁珠偶联抗体和所述双链偶联抗体，配制反应体系；
基于所述反应体系，利用所述磁珠偶联抗体捕获目标抗原，并且利用所述双链偶联抗体标记被捕获的所述目标抗原，得到标记混合液；
针对所述标记混合液，基于qPCR技术进行反应，得到所述目标抗原对应的含量检测结果。
5.如权利要求4所述抗原含量检测方法，其特征在于，所述取捕获抗体，进行磁珠包被后，得到磁珠偶联抗体，包括：
将所述捕获抗体和第二偶联试剂震荡混合，得到第二活化混合液；其中，所述第二偶联试剂中含有第二反应活性基团；
在低温环境下，加入活化终止剂，室温放置10min-20min终止活化，过滤后，即得到活化后的且由所述第二偶联试剂标记的所述捕获抗体，作为标记抗体；
将所述标记抗体与含有第二修饰物的标记磁珠混合孵育，再加入poly A单链寡核苷酸进行反应；其中，所述标记磁珠的所述第二修饰物能与所述第二偶联试剂的所述第二反应活性基团发生特异性的偶联反应；
利用磁力架冲洗并重悬后，即得到所述磁珠偶联抗体；
优选地，所述第二偶联试剂的第二反应活性基团为Azido；
优选地，所述第二偶联试剂为Azido-PEG8-NHS溶液；
优选地，所述标记磁珠为DBCO修饰的磁珠；
优选地，所述活化终止剂为Tris-HCl；
优选地，所述活化终止剂的pH＝8.0；
优选地，所述活化终止剂的加入浓度为1M。
6.如权利要求5所述抗原含量检测方法，其特征在于，所述反应体系中包括：洗液、封闭液、所述磁珠偶联抗体和所述双链偶联抗体；
优选地，每份的所述反应体系中各组分加入量分别为：
以总量为500μL计，其中所述封闭液55μL、所述磁珠偶联抗体55μL和所述双链偶联抗体18.7μL，以及所述洗液为余量；
优选地，所述洗液中的组分包括：Tris、NaCl、KCl和Tween 20。
7.如权利要求6所述抗原含量检测方法，其特征在于，所述基于所述反应体系，利用所述磁珠偶联抗体捕获目标抗原，并且利用所述双链偶联抗体标记被捕获的所述目标抗原，得到标记混合液，包括：
将根据所述反应体系分别配制得预设数量的实验组反应液；
向不同的所述实验组反应液中加入与所述预设数量对应的预设梯度浓度的目标抗原，得到预设数量个混合反应液，并分别进行洗涤、重悬即得到所述标记混合液；
优选地，所述预设数量为至少5个；
优选地，所述预设数量为5个；
优选地，在所述预设数量为5个时，所述预设梯度浓度包括：9pg/mL、90pg/mL、900pg/mL、9000pg/mL和90000pg/mL。
8.如权利要求7所述抗原含量检测方法，其特征在于，所述针对所述标记混合液，基于qPCR技术进行反应，得到所述目标抗原对应的含量检测结果，包括：
以所述标记混合液为模板，进行qPCR反应，分别得到每个所述标记混合液对应的Ct值；
根据所述Ct值确定所述目标抗原对应的含量检测结果。
9.如权利要求8所述抗原含量检测方法，其特征在于，所述根据所述Ct值确定所述目标抗原对应的含量检测结果，包括：
以所述目标抗原的所述预设梯度浓度为横坐标，以每个所述标记混合液对应的Ct值为纵坐标回执标准曲线，得出标准曲线公式；
根据所述标准曲线公式确定所述含量检测结果。
10.一种试剂盒，其特征在于，采用如权利要求1-3任一项所述的长链核苷酸的抗体偶联方法进行长链核苷酸的偶联；和/或，采用如权利要求4-9任一项所述的抗原含量检测方法进行抗原的含量检测。
CN202410379038.8A 2024-03-29 长链核苷酸的抗体偶联方法、抗原含量检测方法及试剂盒 Pending CN118275670A (zh)

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