CN118272245A - 生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌、木聚糖酶的制备方法和应用 - Google Patents
生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌、木聚糖酶的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌、木聚糖酶的制备方法和应用。该毕赤酵母工程菌含有多拷贝的木聚糖酶XYN10基因，以及过表达的内源调控因子的基因；内源调控因子包括Hac1p、Gcn4或Sec1中的两种或三种。能够解决现有技术中难以构建高产的木聚糖酶毕赤酵母工程菌的问题，适用于分子生物学及微生物技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及微生物技术领域，具体而言，涉及一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌、木聚糖酶的制备方法和应用。
背景技术
木质纤维素是地球上蕴藏量最丰富的可再生有机碳源，它通常储存在植物细胞壁中，主要由纤维素、半纤维素和木质素这三种聚合物组成。木质纤维素的生物转化与利用被认为是解决人类目前面临的能源危机的有效途径之一，但由于木质纤维素生物质原料具有复杂的结构和化学组成，使得木质纤维素的完全降解依赖于多种酶组分的共同作用，木聚糖酶便是其中必不可少的酶蛋白之一。另外，木聚糖酶在畜牧业、食品行业和造纸行业等领域同样拥有着广阔的应用前景。
微生物发酵法是目前生产木聚糖酶的主要方式，用来生产木聚糖酶的底盘细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母与毕赤酵母等。其中毕赤酵母表达系统由于具有强有力且严格调控的诱导型启动子PAOX1、对表达的外源蛋白可进行翻译后的加工和修饰、易于高密度发酵以及自身分泌蛋白少等优势而逐渐得到人们的青睐。
在现有技术中，主要是通过对毕赤酵母底盘菌株进行诱变，或对所表达的木聚糖酶基因进行突变来提高木聚糖酶在毕赤酵母中的相对生产水平。但是，诱变的方法通常具有不确定性，导致最终获得的木聚糖酶毕赤酵母工程菌株不够稳定，产量不高，即蛋白分泌水平低或酶活性低。而通过对木聚糖酶基因进行突变，由于木聚糖酶中的结构与催化活性关系复杂，需要经过大量的筛选试验，寻找到能使木聚糖酶在毕赤酵母中的相对生产水平提高的突变位点十分困难，因此难以通过现有技术的方法，构建获得稳定高产的木聚糖酶毕赤酵母工程菌。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌、木聚糖酶的制备方法和应用，以解决现有技术中难以构建高产的木聚糖酶毕赤酵母工程菌的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，该毕赤酵母工程菌中含有多拷贝的木聚糖酶XYN10基因，以及过表达的内源调控因子的基因；内源调控因子包括Hac1p、Gcn4或Sec1中的两种或三种。
进一步地，上述木聚糖酶为具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQID NO：1所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；优选地，多拷贝的木聚糖酶XYN10基因的拷贝数为2～5；优选地，拷贝数为5。
进一步地，内源调控因子的组合选自如下任意一种：Hac1p+Gcn4、Hac1p+Sec1、Gcn4+Sec1或Hac1p+Gcn4+Sec1；优选地，Hac1p为具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；优选地，Gcn4为具有SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；优选地，Sec1为具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；优选地，表达Hac1p的多聚核苷酸为具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的多聚核苷酸或与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有70％同源性的多聚核苷酸；优选地，表达Gcn4的多聚核苷酸为具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的多聚核苷酸或与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有70％同源性的多聚核苷酸；优选地，表达Sec1的多聚核苷酸为具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的多聚核苷酸或与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有70％同源性的多聚核苷酸。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种木聚糖酶的制备方法，该制备方法包括：利用上述任一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌进行发酵培养，获得木聚糖酶。
进一步地，发酵培养包括：将生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵培养。
进一步地，发酵培养基包括YPD培养基、BMGY培养基、BMMY培养基或BSM培养基；优选地，BSM培养基包括BSM无机盐培养基。
进一步地，发酵培养的温度为25-30℃。
进一步地，发酵培养的溶氧量为15-60％。
进一步地，发酵培养的pH为4～6。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种上述任一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，或上述任一种木聚糖酶的制备方法在制备木聚糖酶中的应用。
应用本发明的技术方案，在毕赤酵母中表达多拷贝的木聚糖酶基因的同时，表达Hac1p、Gcn4或Sec1中任意两种或三种毕赤酵母的内源调控因子的组合，能够显著提高木聚糖酶在毕赤酵母中的相对生产水平，获得高产的木聚糖酶毕赤酵母工程菌。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本申请实施例2中表达不同木聚糖酶基因拷贝数的重组菌株经甲醇诱导发酵120h时的木聚糖酶酶活与上清蛋白量结果示意图。
图2示出了根据本申请实施例3中过表达不同内源调控因子对重组菌株的木聚糖酶酶活与上清蛋白量的结果示意图。
图3示出了根据本申请实施例6中不同的内源调控因子组合对重组菌株的木聚糖酶酶活与上清蛋白量的结果示意图。
图4示出了根据本申请实施例6中不同的重组菌株的木聚糖酶分泌表达情况结果示意图。
图5示出了根据本申请实施例6中不同重组菌株的生长情况结果示意图。
图6示出了根据本申请实施例7中重组菌株5copy+Hac1p+Gcn4+Sec1在5L发酵罐中高密度发酵过程中木聚糖酶表达情况结果示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，难以通过现有技术的方法，构建获得的稳定高产的木聚糖酶毕赤酵母工程菌。在本申请中发明人尝试开发一种新的生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌的构建方法，因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，该毕赤酵母工程菌含有多拷贝的木聚糖酶XYN10基因，以及过表达的内源调控因子的基因；内源调控因子包括Hac1p、Gcn4或Sec1中的两种或三种。
重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达涉及转录、翻译、翻译后修饰与蛋白分泌等多个阶段，通过对上述阶段进行优化有助于提高重组蛋白的分泌表达水平。但由于毕赤酵母中的内源调控因子过多，且不同的木聚糖酶具有结构特异性，催化活性差异较大，因而难以确定与多拷贝的特定木聚糖酶基因适配，且还能够对木聚糖酶的蛋白分泌水平以及活性进行正向调控的毕赤酵母内源调控因子。因此，目前少有将上述优化手段组合应用于提高木聚糖酶在毕赤酵母中分泌表达水平和活性中。
在本申请中，通过提高木聚糖酶(Penicillium ucsense)的XYN10基因(SEQ IDNO：1)的拷贝数，来提高其转化入毕赤酵母中时，蛋白的分泌水平以及活性。但是在构建重组工程菌时，因蛋白的表达具有平台期，当其表达到达平台期时，即使提高基因的拷贝数，也不会再提高蛋白的分泌水平以及活性。基因拷贝数越高，对技术人员的实验操作水平要求越高，操作更为复杂，且还需考虑特定基因的多拷贝数与毕赤酵母内源调控因子的适配度问题。因此，提高木聚糖酶的基因拷贝数并非越高越好。在本申请中，通过在获得的表达多拷贝木聚糖酶基因的重组菌株的同时，对毕赤酵母中的内源调控因子进行了筛选，获得了与多拷贝的木聚糖酶基因适配度高的毕赤酵母内源调控因子的组合，且获得了高产的毕赤酵母工程菌，经高密度发酵培养后获得的木聚糖酶，酶活性高，且蛋白表达量和蛋白分泌水平高。
在本申请中，多拷贝的木聚糖酶XYN10基因在一个质粒(在本申请中为pPICZα-A-PucXyn10质粒，制备方法参见专利申请CN 116622679 A)上，由多个完整的XYN10基因表达盒串联形成，每一个表达盒中包括启动子、木聚糖酶XYN10基因以及终止子。Hac1p+Gcn4+Sec1这3个内源调控因子在另一个质粒(在本申请中为pGAPZA质粒)上，两个质粒分别整合在毕赤酵母基因组的不同位置中共同表达，增强木聚糖酶的蛋白分泌量和酶活性，形成本申请中高产的生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌。
Hac1p与Gcn4属于毕赤酵母中的转录因子，Sec1属于毕赤酵母中形成分泌蛋白囊泡的必需蛋白组分。其中，Hac1p通过激活毕赤酵母细胞内未折叠蛋白(UPR)响应来增强木聚糖酶分泌蛋白的表达水平；Gcn4具有增强毕赤酵母工程菌合成氨基酸的能力，以此来进一步提高木聚糖酶蛋白的合成水平；Sec1能够提高细胞内囊泡的量，来提高木聚糖酶蛋白的分泌能力。三者与多拷贝木聚糖酶XYN10基因能够发挥协同作用，进一步提高了木聚糖酶蛋白的分泌量和酶活性，获得本申请高产的生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌。
过表达包括但不限于利用现有技术的重组质粒转化、转染或启动子优化的方法，来提高内源调控因子Hac1p、Gcn4和Sec1在毕赤酵母中的表达量。提高表达量包括但不限于提高5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的表达量。
在一种优选的实施例中，木聚糖酶为具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；优选地，多拷贝的木聚糖酶XYN10基因的拷贝数为2～5，包括2、3、4或5；优选地，拷贝数为5。
SEQ ID NO：1(NCBI GenBank：KAF7714546.1)：
MVHLSASSLLLAAGILPNLALGAGLNDAAVSIGQVYFGSATDNPELSDSTYVKQLSNTADFGQITPGNSQKWDATEPSRNVFTYSGGDTVAKLAQSNGQKLRCHNLVWHSQLPSWVTSGNFNNATLISIMKNHITNLVQHYKGQCYAWDVVNEALNEDGTYRQSVWYNTIGPAYLPIAFATAASVDPDVKLYYNDYNIEYSGAKAAGARRIVELVQSYGAKIDGVGLQAHFIVGSTPSKADQKTTMAGYTAYGVEVAITELDIRMTLPSTNALLTQQATDYSNTVSACVETKKCVGVTIWDWTDKYSWVPNTFPGQGAACPWDSNYQKKPAYNAILSALNAGSSSGGGSTTTTTTTTTAAVTTTTSASGSGPTGGSGVAQQWGQCGGSGWTGPTTCVSGTTCKYSNPWYSQCL。
本申请一种具体的实施例中，提高木聚糖酶基因XYN10在毕赤酵母菌株中的基因拷贝数的方法如下：
(1)以重组质粒pPICZα-A-PucXyn10(来源于专利申请CN 116622679 A)作为出发质粒，利用同尾酶BglII与BamHI在出发质粒上累加XYN10基因表达盒的拷贝数。
(2)将含有不同拷贝数XYN10基因表达盒的DNA片段，与来源于质粒pPIC9K的带有卡那霉素抗性基因表达盒与HIS4基因的载体片段连接并构建得到携带不同木聚糖酶基因拷贝的重组质粒。
(3)将上述重组质粒电转化入Pichia pastoris GS115感受态细胞并进行阳性转化子筛选。
在一种优选的实施例中，内源调控因子的组合选自如下任意一种：Hac1p+Gcn4、Hac1p+Sec1、Gcn4+Sec1或Hac1p+Gcn4+Sec1；优选地，Hac1p为具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；优选地，Gcn4为具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；优选地，Sec1为具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；优选地，表达Hac1p的多聚核苷酸为具有SEQID NO：5所示的核苷酸序列的多聚核苷酸或与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有70％同源性的多聚核苷酸；优选地，表达Gcn4的多聚核苷酸为具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的多聚核苷酸或与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有70％同源性的多聚核苷酸；优选地，表达Sec1的多聚核苷酸为具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的多聚核苷酸或与SEQ IDNO：7所示的核苷酸序列具有70％同源性的多聚核苷酸。
SEQ ID NO:2(NCBI GenBank：WJE88854):MPVDSSHKTASPLPPRKRAKTEEEKEQR RVERILRNRRAAHASREKKRRHVEFLENHVVDLESALQESAKATNKLKEIQDIIVSRLEALGGTVSDLDLTVPEVDFPKSSDLEPMSDLSTSSKSEKASTSTRRSLTEDLDEDDVAEYDDEEEDEELPRKMKVLNDKNKSTSIKQEKLNELPSPLSSDFSDVDEEKSTLTHLKLQQQQQQPVDNYVSTPLSLPEDSVDFINPGNLKIESDENFLLSSNTLQIKHENDTDYITTAPSGSINDFFNSYDISESNRLHHPAAPFTANAFDLNDFVFFQE。
SEQ ID NO:3(NCBI GenBank：XP_002490462.1):MSASTYSFDQAMDFDIVQSVTST QDHIPMVLGESVLRSFVGNDANKAPAIKQEYEALPLNAQIVNPELTPSVGTISPLEIHTSVLDSVLSTDFTDADNSPMFESPESEDPNNWVSLFADETTLATTPAVSRAPAASASPVVPSLKTTSGDEQQLTVKQFVEYPSAKDKLSPKSVEKKISFKKDHLGVVGYTRRQRSSPLAPIVVKDDDPVSMKRARNTEAARRSRAKKMKRMSQLEDKVEELLICKSELEAEVERLKSLVKHQ。
SEQ ID NO:4(NCBI GenBank：XP_002493540.1):MASDLINLQRDYLLKLIGSVETSN GLKCLVLDANSERLVNSLIDSNTLLRYVTTVERIDKKRKIRLSMEGVYLIGPTKFSVNCLLADFQINPTRYKKAHLLFLSPLARELTNLIMGNKQLEANTITRRTVDFTLLPLESHVFLSDAPDSLPTLYNENCLDLIRYQASRAVQTLMNLCIITGEYPLVRYYSPQNPINKSSVLPRMIAQEFQSTLDDYCRIKQDFPGDNPRPRSIFIITDRTMDLLAPLMHDFTYEAMCFDLLEFAENVDGDYPNTYRYSVENENGELLDREASLKPPIDDYWEELRNMHILDASNQLDVKLNKLITNNPMMVDRDKASGTRDFLFIVAHLHGFDEERRKIMLHKKLTEELLVINNERHLAECADFEQNCAAFGVSYDGEKIKDMASFLLSWISLDYFTTSDKIRLILIYAIYRGGLIRADVSKLVKFAGLASAEEHVMTLFENFSLLGFQLLKAHPKDKSFKKQFWHKIDSNAVLNTSRYKPAIQAIVELASKGILDEASFPYIKDKPLEVSETNPDSATSLKNPRYRAAWSRKGSSYSPPKQRIVVYSAGGITYSEMKAGYDAGCLLNKDVFIGSDEVITPRMFVNNVIDLTSDRASLSLFYDRRRAAGESAPKVLFEQESHHRPSIGGPVDSSASLASTTSQSHEPPTNDKEKHRKRDKLKKFWK。
SEQ ID NO:5(NCBI GenBank：OQ326497.1)：ATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAGAC AGCTAGCCCACTTCCACCTCGTAAAAGAGCAAAGACGGAAGAAGAAAAGGAGCAGCGTCGAGTGGAACGTATCCTACGTAATAGGAGAGCGGCCCATGCTTCCAGAGAGAAGAAACGAAGACACGTTGAATTTCTGGAAAACCACGTCGTCGACCTGGAATCTGCACTTCAAGAATCAGCCAAAGCCACTAACAAGTTGAAAGAAATACAAGATATCATTGTTTCAAGGTTGGAAGCCTTAGGTGGTACCGTCTCAGATTTGGATTTAACAGTTCCGGAAGTCGATTTTCCCAAATCTTCTGATTTGGAACCCATGTCTGATCTCTCAACTTCTTCGAAATCGGAGAAAGCATCTACATCCACTCGCAGATCTTTGACTGAGGATCTGGACGAAGATGACGTCGCTGAATATGACGACGAAGAAGAGGACGAAGAGTTACCCAGGAAAATGAAAGTCTTAAACGACAAAAACAAGAGCACATCTATCAAGCAGGAGAAGTTGAATGAACTTCCATCTCCTTTGTCATCCGATTTTTCAGACGTAGATGAAGAAAAGTCAACTCTCACACATTTAAAGTTGCAACAGCAACAACAACAACCAGTAGACAATTATGTTTCTACTCCTTTGAGTCTTCCGGAGGATTCAGTTGATTTTATTAACCCAGGTAACTTAAAAATAGAGTCCGATGAGAACTTCTTGTTGAGTTCAAATACTTTACAAATAAAACACGAAAATGACACCGACTACATTACTACAGCTCCATCAGGTTCCATCAATGATTTTTTTAATTCTTATGACATTAGCGAGTCGAATCGGTTGCATCATCCAGCAGCACCATTTACCGCTAATGCATTTGATTTAAATGACTTTGTATTCTTCCAGGAATAG。
SEQ ID NO:6(NCBI GenBank：XM_002490417.1)：ATGTCTGCAAGTACTTACAGTTTTGACCAAGCAATGGACTTTGACATCGTTCAGTCCGTGACGTCGACCCAGGACCATATCCCCATGGTTCTTGGCGAGTCAGTGCTTCGTTCTTTTGTTGGAAATGATGCCAACAAGGCTCCTGCTATCAAGCAGGAATATGAGGCCTTGCCGCTAAACGCTCAAATCGTCAATCCTGAGCTGACACCATCCGTCGGAACTATTTCTCCTTTGGAGATCCATACTTCCGTTTTGGATTCTGTATTGTCGACAGACTTTACTGATGCTGACAACTCCCCCATGTTTGAATCTCCAGAGTCTGAAGATCCAAACAACTGGGTTTCGTTGTTTGCAGATGAAACTACTCTTGCTACCACTCCAGCCGTTTCTCGTGCACCAGCAGCCTCTGCCTCTCCAGTAGTCCCTTCGTTGAAGACCACCTCTGGAGACGAGCAACAGCTGACTGTTAAACAATTCGTCGAGTATCCTTCCGCTAAGGATAAGCTTTCTCCCAAGTCAGTGGAGAAAAAGATTTCTTTCAAGAAGGACCACTTAGGTGTTGTTGGCTACACTAGAAGACAGCGTTCCTCTCCCTTGGCTCCAATCGTGGTCAAGGATGACGATCCTGTTTCTATGAAGCGTGCCCGTAACACGGAAGCCGCTCGTCGTTCCAGGGCTAAGAAGATGAAGAGAATGAGTCAACTGGAAGACAAAGTTGAGGAGTTACTGATTTGCAAGAGCGAGTTGGAAGCTGAGGTTGAGCGTTTAAAGAGTTTAGTGAAACATCAGTGA。
SEQ ID NO:7(NCBI GenBank：XM_002493495.1)：ATGGCTTCTGATCTGATTAACCTCCAAAGAGATTATTTACTGAAACTAATAGGGAGTGTGGAAACGTCCAATGGCCTCAAGTGTCTTGTCCTGGACGCCAATTCAGAGAGGTTAGTCAATAGCTTAATCGACAGCAACACTTTGCTGAGGTATGTTACCACGGTGGAAAGAATAGATAAGAAGCGGAAAATACGGCTCTCAATGGAAGGAGTCTATTTAATTGGACCTACAAAGTTTTCAGTTAATTGCCTTCTGGCAGACTTCCAGATCAATCCCACTCGATACAAAAAAGCTCATTTGTTGTTTTTATCTCCGTTAGCAAGAGAGTTGACGAATCTAATTATGGGAAACAAACAGTTGGAGGCAAACACAATTACGCGAAGGACCGTAGATTTTACTTTGCTGCCTTTGGAAAGTCATGTCTTCCTTTCGGATGCTCCCGATTCTCTCCCAACCTTGTACAATGAGAACTGTTTGGACTTGATTCGATATCAAGCGTCTCGAGCTGTGCAAACTTTAATGAATCTTTGCATTATAACTGGAGAGTATCCTTTAGTTAGGTACTATTCTCCCCAGAATCCCATTAATAAGTCCTCGGTATTGCCCCGAATGATTGCACAGGAGTTTCAAAGCACACTGGATGATTATTGCAGAATTAAGCAAGATTTCCCTGGTGATAACCCAAGGCCCCGGTCAATTTTTATCATCACCGATAGAACAATGGACCTGCTGGCACCATTGATGCATGATTTTACCTATGAGGCAATGTGTTTTGATCTACTTGAGTTCGCTGAAAATGTTGACGGTGATTATCCCAATACGTATCGTTATTCTGTGGAGAATGAAAATGGAGAGTTATTGGATAGAGAAGCTTCATTAAAACCCCCCATTGATGACTACTGGGAAGAGTTGAGAAATATGCATATTTTAGATGCCAGCAATCAATTAGATGTGAAATTGAATAAGCTGATAACTAATAACCCTATGATGGTTGATAGAGATAAAGCCTCAGGAACAAGAGATTTTCTTTTCATTGTTGCTCACTTGCATGGATTTGACGAAGAGCGCAGGAAGATAATGTTACACAAGAAATTGACTGAAGAGCTGTTGGTAATAAATAATGAACGTCATTTGGCAGAGTGTGCTGATTTTGAGCAAAACTGTGCTGCATTTGGAGTTTCTTATGATGGCGAAAAAATCAAAGACATGGCATCTTTTTTACTTTCATGGATCTCTTTAGACTATTTTACCACTTCCGATAAGATACGTTTAATCCTGATTTACGCCATCTACAGAGGTGGACTGATTAGAGCAGATGTATCAAAGCTGGTAAAATTTGCGGGATTAGCTTCTGCTGAGGAACACGTCATGACATTGTTTGAGAATTTTTCTTTACTTGGATTTCAGCTTTTGAAAGCTCATCCAAAAGACAAAAGTTTCAAGAAACAGTTTTGGCACAAGATAGATAGTAATGCTGTTCTAAACACATCCAGATATAAACCAGCAATCCAGGCTATCGTAGAACTAGCATCAAAGGGAATCCTGGATGAAGCTTCATTTCCTTACATAAAGGATAAGCCTTTGGAAGTTAGTGAAACAAACCCTGATTCGGCAACTTCTCTCAAAAATCCAAGGTATAGAGCTGCTTGGAGCAGAAAGGGTAGCAGTTATAGTCCGCCTAAGCAGAGAATAGTAGTATATTCTGCAGGCGGTATAACATACTCTGAAATGAAGGCTGGATATGACGCTGGATGTTTATTGAATAAAGATGTTTTTATTGGAAGTGATGAGGTCATCACTCCGAGGATGTTTGTGAATAATGTTATTGACTTGACGTCTGATAGAGCCTCATTATCGCTATTCTATGATCGAAGAAGAGCAGCGGGAGAGTCTGCTCCAAAAGTTTTGTTTGAACAGGAGAGTCATCATCGTCCTTCTATAGGTGGTCCTGTTGATTCTTCTGCTAGTTTGGCGTCCACCACATCGCAATCCCACGAGCCTCCTACAAATGATAAAGAAAAGCATCGAAAAAGGGATAAGCTGAAGAAATTTTGGAAATAG。
本说明书中的同源性(Identity)是指氨基酸序列之间的“同源性”，即氨基酸序列中的种类相同的氨基酸残基的比率的总计，以及核苷酸序列中的种类相同的碱基的比率的总计。氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可以利用BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)、FASTA等比对程序来确定。
上述与SEQ ID NO：1序列提供的蛋白具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上(比如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％以上，甚至99.9％以上)同源性且具有相同功能的蛋白质，其活性位点、活性口袋、活性机制、蛋白结构等均和(a)序列提供的蛋白质大概率相同，为通过氨基酸突变获得的同源蛋白。以及上述与SEQ ID NOs：2～4序列提供的核苷酸具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上(比如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％以上，甚至99.9％以上)同源性且具有相同功能的多聚核苷酸。
具有上述同源性序列的获得，可以分别通过氨基酸或碱基的取代、替换等来实现。取代、替换等规则，一般情况下，性质类似的氨基酸之间相互替换后的效果也类似。为方便描述，此处先将氨基酸残基缩写罗列如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。核苷酸序列中的碱基缩写如下：A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)和T(胸腺嘧啶)。
氨基酸的取代或替换，例如，在上述同源蛋白中，可发生保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”包括但不限于：
疏水性氨基酸(Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、Ile、Leu)被其他疏水性氨基酸取代；
侧链粗大的疏水性氨基酸(Phe、Tyr、Trp)被其他侧链粗大的疏水性氨基酸取代；
侧链带正电的氨基酸(Arg、His、Lys)被其他侧链带正电的氨基酸取代；
侧链有极性不带电的氨基酸(Ser、Thr、Asn、Gln)被其他侧链有极性不带电的氨基酸取代。
本领域技术人员也可以根据现有技术中的“blosum62评分矩阵”等本领域技术人员熟知的氨基酸替换规则对氨基酸进行保守替换。
在本申请中通过同时过表达Hac1p+Gcn4、Hac1p+Sec1、Gcn4+Sec1或Hac1p+Gcn4+Sec1的内源调控因子的组合，与多拷贝木聚糖酶基因，增强木聚糖酶的活性以及其蛋白的表达分泌，获得本申请中高产的生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌。
在一种具体的实施例中，本申请对多种毕赤酵母的内源调控因子进行了筛选，以筛选出与多拷贝的木聚糖酶基因，在增强木聚糖酶的表达中适配程度高的内源调控因子及组合，筛选的方法示例如下：
(1)设计引物以毕赤酵母反转录cDNA为模板扩增出多种内源调控因子。
(2)将上述基因片段连接至质粒pGAPZA中，得到表达内源调控因子基因的重组质粒。
(3)将上述重组质粒电转化表达多拷贝木聚糖酶基因的感受态细胞并进行阳性转化子筛选。
(4)摇瓶发酵检测过表达不同内源调控因子基因对重组菌株多拷贝木聚糖酶表达的影响。
本申请中进行筛选的内源调控因子包括如下调控因子：Haclp的核苷酸序列为SEQID NO:5，Gcn4的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，Sec1的核苷酸序列为SEQ ID NO:7，Yap1的核苷酸序列为SEQ ID NO:8(NCBI GenBank：XM_002493995.1)，Pdi1的核苷酸序列为SEQ IDNO:9(NCBI GenBank：EU805807.1)，Cne1的核苷酸序列为SEQ ID NO:10(NCBI GenBank：XM_002491173.1)，Sly1的核苷酸序列为SEQ ID NO:11(NCBI GenBank：XM_002493616.1)，Ero1的核苷酸序列为SEQ ID NO:12(NCBI GenBank：XM_002489600.1)。
SEQ ID NO:8：ATGAGTGACGTGGTAAACAAGAGAGCGGCAACGTCCAGCACGCAG ACCAATAAGAGACAGGAACTCAGCTCGGCGCTGACAAAACCTGGAAGGAAACCAGTGCAGACGGAACCCAAGGACAAAAGAACTGCCCAGAATAGAGCTGCTCAACGGGCTTTCCGTGAGCGGAAAGAGAAGAAGATGAAAGAATTAGAAACCAAGGTTGAAGAGCTAGAGAGACAAAAATCTCAGCTGAATACTGAAAGCGAATTTCTGCGATCCCAGGTGGAAACATTAATTCATGAACTCTCAAAATATAGGGGAGAAACAGATGTACTAAGCCTACTGCCGACAAGTATACCGCAGGAGAGTAAAAAAATGGTGAGAACTCCTAGTAGCAATACAACAAACTCCAGTTCTGTCGGGGTTACTCCGTCTTCTTCCACTCTGCGTTCGTCATCTAGTAGTGGAGTATATGAATTTCCCTGGAAGCTTTCTAATAGTCAAAATCCAAGTGGAAGCAACAGCCCATTGGATCTCACTAAGGCAGGCCAACTACCGTCACCAACTTCTATCAATCAGAATCCTGGGTTGACGGCCGAATCGGTGAAGAGCTCCTCGGTTTCAAGTGAGTCACCAAACTCCAATATAGAAGATTTTTTGAATAGCAGGAATAGCAATTTTGACAACCGATTTGATGAGTCTGTGGATGGCTTTTGTTCCAACTTAGGCCAAGCTTGCGGTAACAAAGACATTCCTCTTCCAAAAGAGACTTCATCCATAAGGAACCCTGGCGTGATAGATAGTTTGTCGAATTTCAACTCGAATTCCGATATACAAACTCTTTTCTCTCCCAACTCCTTACAAAATGACCCGCTGGCCGAGTTTGACCCTACCCCTATTGACCAAAATCTTGTGTTTGGGTTAAACGCTCCTGAGACGAATTTGGATGGTCTTTTTGGTGACTTTAATAAATACCACACGGATCCCCTTGCGTCTCTTGTCACTGAAGAATCTATCTTTGACCCATTGAGAGCGACATCCAACTCTGTATCCCATTCAAAGCCGAACCCTATCACAACTACGAGTTTGCATAATTTGGAAGCCAAGCACAAGGTACCAGAGGCTGACGAAGATTGCAACGATAATTTGGACAACATGGTGGTACCTAACAGAGAAGGCTCTCTACTCAAGTGTTCAGAGATATGGGAGAGAATTACGACTCACCCCAGATATTCGGAAATCGACATTGATGGGCTCTGTATGGAACTGAAACACAAAGCCAAATGTAGTGAAAGTGGTGTTGTGGTAGATGATGCTGATGTTGATTCACTTTTACAGAGGGCTGCTCTCAAGTATCCCATAAAGACTGAGCCAGATGTTGTCGATTTTTCCATGTTTAAATAG。
SEQ ID NO:9：ATGCAATTCAACTGGAATATTAAAACTGTGGCAAGTATTTTGTCCGCTCTCACACTAGCACAAGCAAGTGATCAGGAGGCTATTGCTCCAGAGGACTCTCATGTCGTCAAATTGACTGAAGCCACTTTTGAGTCTTTCATCACCAGTAATCCTCACGTTTTGGCAGAGTTTTTTGCCCCTTGGTGTGGTCACTGTAAGAAGTTGGGCCCTGAACTTGTTTCTGCTGCCGAGATCTTAAAGGACAATGAGCAGGTTAAGATTGCTCAAATTGATTGTACGGAGGAGAAGGAATTATGTCAAGGCTACGAAATTAAAGGGTATCCTACTTTGAAGGTGTTCCATGGTGAGGTTGAGGTCCCAAGTGACTATCAAGGTCAAAGACAGAGCCAAAGCATTGTCAGCTATATGCTAAAGCAGAGTTTACCCCCTGTCAGTGAAATCAATGCAACCAAAGATTTAGACGACACAATCGCCGAGGCAAAAGAGCCCGTGATTGTGCAAGTACTACCGGAAGATGCATCCAACTTGGAATCTAACACCACATTTTACGGAGTTGCCGGTACTCTCAGAGAGAAATTCACTTTTGTCTCCACTAAGTCTACTGATTATGCCAAAAAATACACTAGCGACTCGACTCCTGCCTATTTGCTTGTCAGACCTGGCGAGGAACCTAGTGTTTACTCTGGTGAGGAGTTAGATGAGACTCATTTGGTGCACTGGATTGATATTGAGTCCAAACCTCTATTTGGAGACATTGACGGATCCACCTTCAAATCATATGCTGAAGCTAACATCCCTTTAGCCTACTATTTCTATGAGAACGAAGAACAACGTGCTGCTGCTGCCGATATTATTAAACCTTTTGCTAAAGAGCAACGTGGCAAAATTAACTTTGTTGGCTTAGATGCCGTTAAATTCGGTAAGCATGCCAAGAACTTAAACATGGATGAAGAGAAACTCCCTCTATTTGTCATTCATGATTTGGTGAGCAACAAGAAGTTTGGAGTTCCTCAAGACCAAGAATTGACGAACAAAGATGTGACCGAGCTGATTGAGAAATTCATCGCAGGAGAGGCAGAACCAATTGTGAAATCAGAGCCAATTCCAGAAATTCAAGAAGAGAAAGTCTTCAAGCTAGTCGGAAAGGCCCACGATGAAGTTGTCTTCGATGAATCTAAAGATGTTCTAGTCAAGTACTACGCCCCTTGGTGTGGTCACTGTAAGAGAATGGCTCCTGCTTATGAGGAATTGGCTACTCTTTACGCCAATGATGAGGATGCCTCTTCAAAGGTTGTGATTGCAAAACTTGATCACACTTTGAACGATGTCGACAACGTTGATATTCAAGGTTATCCTACTTTGATCCTTTATCCAGCTGGTGATAAATCCAATCCTCAACTGTATGATGGATCTCGTGACCTAGAATCATTGGCTGAGTTTGTAAAGGAGAGAGGAACCCACAAAGTGGATGCCCTAGCACTCAGACCAGTCGAGGAAGAAAAGGAAGCTGAAGAAGAAGCTGAAAGTGAGGCAGACGCTCACGACGAGCTTTAA。
SEQ ID NO:10：ATGAAGATCTCTACCATTGCAAGTTCTACGTTGTTCGCTGTTGGTGCTTTAGCCGAATCCGAACCCGCTGAGTTCAGACCCTTGGAAGCTCAGTTGGACAAGTCATCTTTCTTTGAACAATTCGACAAGGAACCGAAACTCGGCGACACCTGGAAGATCTCCCATGCCGTTAAGAATGAAGAATTCACTTATGTTGGAGAATGGGCCATTGAGGAACCTGTTGTCTATCCTGGATTCAAGAAGGACAGGGGTCTGGTTGTGAAATCTGAGGCAGCTCACCACGCAATATCTGCCCAATTACCACAGGTATTTGACAACACTGACAATACGTTGGTCTTGCAATACGAAGTCAAGCTTCAACAAGGATTGAACTGTGGAGGTGCTTATGTTAAATTATTGAGTGCTGAGGGTCTGAACAAGAATGAGTTCTCTAACGAGACCCCTTATCAAGTCATGTTTGGTCCTGATAAATGTGGAACCACGAATAAAGTGCACTTGATTATTAAGAGGAAGAACCCAGCCACCGGCGAATATGAGGAACATCAATTGGCTACTCCTCCAATGGGTAGAATCGTCAAGACTACTTCTCTATACACCCTGATTATCAAGCCCAATAATGACTTTGAAATCAGAATCAACGGTGAGGTTGCTAAAGCTGGTAACTTGTTGAACGAGAAGTTGATAAAGCCACCATTTGGCGCTCCGAAGGAGATTGACGATCCGGAAGACCAAAAACCCGAAGATTGGGTTGATGAAGACATGATCCCAGATCCAGATGCTGTCAAGCCTGAAGATTGGGACGAGTCCGAGCCATTGCGAATCGTCGATCCGGAAGCTGTGAAACCAGAAAACTGGAACGAAGATGCTGAATTGTACATCCCTGATCCAGAGGCCACCAAGCCCGAAGACTGGGACGATGAAGAGGATGGCGAATGGGTTGCTCCTGTTATTCCAAATCCAGAATGCGCAGATATTGGATGTGGCCCTTGGAAGGCTCCATATATTACCAATCCTAACTACAAGGGTAAGTGGAGTCCTCCTCTTATTGAGAACCCTGATTACAAGGGACCTTGGAGCCCTAAGAAGATTGCCAACCCTAACTACTTTGAAGACAAGAAACCAGCAAACTTGGAACCTATTGGAGGTCTTGGTTTTGAGTTGTGGACCATGAATGCAGATATTCTCTTTGACAACATCTACCTAGGCCATTCTATTAAGGAAGCTGAATTCATTGGAAACGAAACTTTTGTTCCAAAATTGGAGTTGGAGGAAGCAGAATCTGCAAAGAATGCTCCAAAGCCAGATTTTGAGCCTGAAACCCCACCTGAAACTGGTTTAGACTCTACTGGAAACATTTTTACAGATGTGTTCGACACTGTTTTCCAAACTGTATTGGAGTATTACGTCAGTGCTAACGCCTTTTTGAATGATGTTGTTCAAGAACCCTCAGTTTTGTTGGAACGTCCGGGCGAAGCAGTTTACTACTTGGTCACATTTTTTTCGGGTTTCACCTTCCTTGTAGCCGTTTGGTCAGGTTTGATTTTTGCATTGACCGGTGCTGGCAAGAAGCCAGAGACTTCTGCAAAGACACCAACAAAGTCTACCCAGAAGATCGAGGAGGTTACTGAAGATGAGACTGAGAAGACTGATTCCTCGTCTGCTGCTAAGAACTCGACTAAAGCTACAAAGAGAACCTAG。
SEQ ID NO:11：ATGCTTCATTTGAATGAGCCCATTGTGGATAATGGTTCAGATATACAAGCGGAGTTAACATGGAAGGTACTGATTCTGGATAGTAGGAGTACTGCAATTGTTTCTTCTGTTCTGCGAGTTAATGACCTGCTTTCTTCTGGCATCACTATGCATAGCAATATCAGATCCAAGAGAGCGGCTTTGCCAGATGTTCCTGTCATTTACTTTGTTGAACCTAATGCGGAAAATATCAACTTTATCATTGATGACTTGGAAAGAGATCAGTACGCTCATTTTTATATCAACTTCACTTCCAGTCTAAATAGAGATCTTTTGGAGGAGTTTGCTAAGAAAGTGGCTACGATTGGTAAGTCCTACAAGATTAAACAGGTTTATGATCAGTACCTCGATTACATTGTCACTGAACCCAACCTGTTCTCTTTGGACTTGGTTAACATTTACTCGCAGCTAAATAACCCTAACTCACTGGAAGATGAAATCAATAAAGTTGCTGACAAGATTTCCAATGGTATATTCGCAGCAATCCTAACTATGAATGGGATCCCTACTATTAGATGTTGCAGAGGAGGTCCAGCAGAACTAATAGCGTCCAAACTAGATCAGAAGCTACGTGATCATGTTATCAATACAAAGTCATCTGCCTCTTTCACTAACAGTAAATTAGTGCTTATCCTGCTGGATAGAAACATTGATTTGGCTTCCATGTTTGCTCATTCATGGATTTATCAATGTATGGTGAGTGATGTTTTTGAGTTGAAAAGAAATACAATCAAAATTCCCTCTCAAAAGCCCAATGAATCTACGAAAGAATATGATATCGACCCAAAGGATTTTTTTTGGGCAGCCAACAACAGTTTGCCCTTCCCTGATGCTGTAGAAAATGTGGAGAACGAACTTTCTAGATACAAAGCGGATGCTGCAGAGCTAACTAGAAAGACTGGGGTTTCTTCTCTTCAAGATATTGATCCCAATGCAATTACTGACACCACAGATATACAGCTTGCTGTGAAGTCTTTACCTGAATTGGCTTTTAGAAAAAGCATCCTTGATATGCATATGAAAGTACTTGCGTCTTTGCTGCAAGAACTGGAATCAAAGTCATTGGATTCATACTTTGAAATTGAACAAAACTACAAAGATCCCAAAAACCAGAAGCAGTTTATCAGTATCCTCAACAACGGGAATGAGCATACCTTGAACGACAAACTGAGAACCTACATCATGTTGTATCTGTTAACAGATCTCCCAGGGTCGTTCGTTGAAGAATGTGAAGAGTATTTCAAAAAGAATTCCGCTGAGCTTGGTTCGTTGAGTTATATCAAGCGGGCAAAAGAGGTGATCAAGTTGTCTAATTATGAGTTGTCCATGTCAATTGATGCTAGCCACTCGACCACTAGTGGATTGGTGAATGAAGCTCAAAAGTCTGCTTTGTTCCAAGGATTGTCGTCCAAGCTATATGGATTAACAGATGGTGGTAGTAGGCTTACAGAGGGGGTGGGGTCATTAATTACTGGGTTGAAAAACTTGCTACCCGACAAGAAACAACTGCCTATTACCAATATTGTTGAATCGATAATGGAACCAAGTCTGGCCACTCAAGAGTCGATAAAACTAACGGACGATTACCTATATTTTGACCCTATTAGCACAAGAGGAGTTCACTCCAAACCACCCAAAAGACAGCAATACAACAATTCTATTGTGTTTGTTGTAGGAGGGGGCAACTATTTGGAGTACCAAAATTTGCAAGAATGGGTTACGAAGACCAATACTAGCAACGTCAATGGCACTAAGTCTGTAATCTACGGTAGTACCAGTATCGTGACCGCGAACGAGTTCTTGAAGGAGTGCTCCTTGCTCGGTGCCGAAGCAAAATAA。
SEQ ID NO:12：ATGAGGATAGTAAGGAGCGTAGCTATCGCAATAGCCTGTCATTGTATAACAGCGTTAGCAAACCCTCAAATCCCTTTTGACGGCAACTACACCGAGATCATCGTGCCAGATACCGAAGTTAACATCGGACAGATTGTAGATATTAACCACGAAATAAAACCCAAACTGGTGGAACTGGTCAACACAGACTTCTTCAAATATTACAAATTAAACCTATGGAAACCATGTCCGTTTTGGAATGGTGATGAGGGATTCTGCAAGTATAAGGATTGCTCTGTCGACTTTATCACTGATTGGTCTCAGGTGCCTGATATCTGGCAACCAGACCAATTGGGTAAGCTTGGAGATAACACGGTACATAAGGATAAGGGCCAAGATGAAAATGAGCTGTCCTCAAATGATTATTGCGCTTTGGATAAAGACGACGATGAAGATTTAGTATATGTCAATTTGATTGATAACCCTGAAAGATTCACCGGTTATGGTGGTCAGCAATCTGAATCTATTTGGACTGCGGTCTATGATGAGAACTGTTTCCAGCCGAATGAAGGATCACAATTGGGTCAAGTTGAAGACCTCTGTTTGGAGAAACAGATCTTTTACCGATTGGTTTCTGGTTTGCATTCTAGTATCTCCACCCACCTCACAAACGAATATCTGAATTTGAAAAATGGAGCATACGAACCAAATTTGAAACAGTTCATGATCAAAGTTGGGTATTTTACTGAAAGAATTCAAAACTTACATCTCAATTATGTCCTTGTATTGAAGTCACTAATAAAGCTACAAGAATACAATGTTATCGACAATCTACCTCTCGATGACTCTTTGAAAGCTGGTCTTAGCGGTTTAATATCTCAAGGAGCACAGGGTATTAACCAGAGCTCTGATGATTATCTATTTAACGAGAAGGTTCTTTTCCAAAATGACCAAAATGATGATTTGAAAAATGAATTCCGTGACAAATTCCGCAACGTGACTAGATTAATGGATTGTGTCCATTGCGAGAGATGCAAATTATGGGGAAAATTGCAAACTACAGGGTACGGGACTGCATTGAAGATTCTATTTGATTTGAAGAATCCTAATGACTCCATCAATTTAAAGAGAGTTGAGTTAGTTGCTCTAGTCAACACATTCCATAGATTGTCCAAATCTGTTGAAAGCATTGAAAACTTTGAAAAACTATATAAGATTCAACCGCCAACGCAGGATCGTGCATCAGCGTCGTCCGAATCCTTAGGCCTTTTCGATAACGAAGATGAACAAAATCTCCTCAACTCGTTTTCGGTTGATCAGGCAGTCATTTCATCGAAAGAGGCACCAGAAGAAATCAAAAGCAAACCTGTTGGAAAAGCCGCATATAAACAAAACAGTTGTCCATCATTGGGTTCAAAATCTATCAAAGAAGCATTCCATGAAGAACTTCACGCATTTATTGATGCAATTGGATTTATATTGAACTCTTACAGGACTTTGCCCAAGCTGTTGTACACACTTTTCCTCGTTAAATCATCTGAATTATGGGACATTTTCATTGGCACTCAAAGGCACCGAGATACCACATATAGAGTAGACTTGTAA。
在获得的表达多拷贝木聚糖酶基因的重组菌株中组合过表达多种内源调控因子的方法示例如下：
(1)通过PCR定点引入突变将重组质粒pGAPZA-Hac1p与pGAPZA-Sec1上的XmaJI位点消除，(经过PCR后质粒上的XmaJI位点序列将由“CCTAGG”突变为“GCTAGG”，目的是使得表达内源调控因子Hac1p与Sec1的基因片段不具该酶切位点，便于后续的重组连接)分别获得重组质粒pGAPZA-Hac1p-NoXmaJI与pGAPZA-Sec1-NoXmaJI。
(2)将Gcn4的基因片段连接到重组质粒pGAPZA-Sec1-NoXmaJI上得到重组质粒pGAPZA-Sec1-Gcn4。
(3)分别将Gcn4与Sec1的基因片段连接到重组质粒pGAPZA-Hac1p-NoXmaJI上，从而得到重组质粒pGAPZA-Hac1p-Gcn4与pGAPZA-Hac1p-Sec1。
(4)将表达Sec1且不具有XmaJI酶切位点的基因片段连接到重组质粒pGAPZA-Hac1p-Gcn4上，得到重组质粒pGAPZA-Hac1p-Gcn4-Sec1。
(5)将上述重组质粒电转化表达多拷贝木聚糖酶基因的感受态细胞并进行阳性转化子筛选。
(6)摇瓶发酵检测组合过表达多种内源调控因子基因对重组工程菌株的木聚糖酶表达的影响。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种木聚糖酶的制备方法，该制备方法包括：利用上述任一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌进行发酵培养，获得木聚糖酶。
在一种优选的实施例中，发酵培养包括：将生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵培养。
在一种优选的实施例中，发酵培养基包括YPD培养基、BMGY培养基、BMMY培养基或BSM培养基；优选地，BSM培养基包括BSM无机盐培养基。
在一种优选的实施例中，发酵培养的温度为25-30℃，包括但不限于25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。
在一种优选的实施例中，发酵培养的溶氧量为15-60％，包括但不限于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％。
在一种优选的实施例中，发酵培养的pH为4～6，包括但不限于4、4.5、5、5.5或6；优选地，发酵培养的pH为5.5。
在本申请的一种具体的实施例中，在发酵培养中，将构建获得生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌的在发酵培养基的平板划线，挑选单菌落接种到含有该发酵培养基的摇瓶中，装液量10％，30℃200rpm培养约24h得到一级种子液。将一级种子液按3％比例接种到新的发酵培养基中，装液量10％，30℃200rpm培养约24h得到二级种子液。将二级种子液按5％接种量接入5L发酵罐中进行生产。
发酵条件如下：初始装液量为2L，通气量为1vvm；在生长阶段温度为30℃，采用氨水(30％)及磷酸(30％)调节发酵体系的pH为5.5，期间不断补加50％(V/V)的甘油。
采用溶氧和转速偶联方式，使发酵罐中的溶氧量维持在30-60％。当OD600≥250左右时，停止流加甘油。待溶氧反弹至80％以上，开始流加甲醇进行诱导表达，并将培养温度降低至28℃，搅拌转速升高至800rpm，采用与溶氧偶联方式流加甲醇，使溶氧量维持在15-25％，获得木聚糖酶液。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种上述任一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，或上述任一种制备木聚糖酶的方法在制备木聚糖酶和/或降解木质纤维素中的应用。
利用本申请中的生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌的构建方法，或上述生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌与现有技术相比，木聚糖酶表达水平显著提高，其中，生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌5copy+Hac1p+Gcn4+Sec1的木聚糖酶的酶活力提高了3.18倍。且本申请中的生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌5copy+Hac1p+Gcn4+Sec1在5L发酵罐中高密度发酵时表达的木聚糖酶酶活达7548U/mL，具有良好的工业应用价值。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1携带多拷贝Penicillium ucsense来源的木聚糖酶XYN10基因的质粒的构建
(1)将重组质粒pPICZα-A-PucXyn10利用限制性内切酶BglII与BamHI进行双酶切，胶回收表达木聚糖酶PucXyn10的基因片段。同时利用限制性内切酶BamHI对重组质粒pPICZα-A-PucXyn10进行单酶切，回收线性化载体。
将回收的基因片段与线性化载体利用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物化学转化入E.coli Top10(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，zc104)。经博来霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经BglII与BamHI双酶切鉴定正确后，得到携带两拷贝Penic illium ucsense来源的木聚糖酶XYN10基因的重组质粒pPICZα-A-PucXyn10-2copy，本申请中的“copy”均指“拷贝”，2copy即为2个拷贝。
(2)利用限制性内切酶BamHI对重组质粒pPICZα-A-PucXyn10-2copy进行单酶切，回收线性化载体。将回收的线性化载体与步骤(1)中的基因片段利用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物化学转化E.coli Top10。经博来霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经BglII与BamHI双酶切鉴定正确后，得到携带三拷贝Penicillium ucsense来源的木聚糖酶XYN10基因的重组质粒pPICZα-A-PucXyn10-3copy。
(3)将重组质粒pPICZα-A-PucXyn10-2copy利用限制性内切酶BglII与BamHI进行双酶切，胶回收表达两拷贝木聚糖酶PucXyn10的基因片段。同时利用限制性内切酶BamHI对重组质粒pPICZα-A-PucXyn10-3copy进行单酶切，回收线性化载体。
将回收的基因片段与线性化载体利用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物化学转化E.coliTop10。经博来霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经BglII与BamHI双酶切鉴定正确后，得到携带五拷贝Penicillium ucsense来源的木聚糖酶XYN10基因的重组质粒pPICZα-A-PucXyn10-5copy。
(4)将重组质粒pPICZα-A-PucXyn10、pPICZα-A-PucXyn10-2copy、pPICZα-A-PucXyn10-3copy与pPICZα-A-PucXyn10-5copy分别利用限制性内切酶BglII与BamHI进行双酶切，胶回收表达不同拷贝数木聚糖酶PucXyn10的基因片段，这些基因片段分别命名为F1、F2、F3与F5。以质粒pPIC9K(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司，V17520)为模板，使用引物9K-1(SEQ ID NO：13)与9K-2(SEQ ID NO：14)扩增带有卡纳抗性基因表达盒与HIS4基因的载体片段，命名为pKH。
将基因片段F1、F2、F3与F5分别与载体片段pKH通过Gibson assembly的方式进行连接，将连接产物分别化学转化入E.coli Top10。经卡那霉素抗性平板分别筛选阳性转化子，对应的阳性转化子提取质粒经KspAI与BamHI双酶切鉴定正确后，分别得到携带单拷贝、两拷贝、三拷贝与五拷贝木聚糖酶PucXyn10基因的重组质粒pKH-PucXyn10、pKH-PucXyn10-2copy、pKH-PucXyn10-3copy与pKH-PucXyn10-5copy。
9K-1(SEQ ID NO：13)：5’-AGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCTCGATAAGCTTTAATGCGGT-3’；
9K-2(SEQ ID NO：14)：5’-ACCTTTCGTCTTTGGATGTTAGATCTCTGTCAGACCAAGTTTACTC-3’。
实施例2表达不同拷贝数木聚糖酶PucXyn10基因的毕赤酵母重组菌株的构建与产酶分析
(1)以限制性内切酶KspAI对实施例1中的重组质粒pKH-PucXyn10、pKH-PucXyn10-2copy、pKH-PucXyn10-3copy与pKH-PucXyn10-5copy进行线性化，纯化回收4种线性化载体并分别电转化Pichia pastoris GS115感受态细胞(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司，C18100)，在组氨酸营养缺陷型平板上进行阳性转化子筛选，得到的阳性转化子分别命名为1copy、2copy、3copy与5copy。
(2)将步骤(1)中获得的4种重组菌株分别接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养20h。6000rpm，4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近0.5，30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇。发酵五天后在6000rpm，4℃离心5min去除沉淀，回收发酵上清液，即木聚糖酶酶液。利用Bradford法测定上清蛋白浓度，并检测木聚糖酶酶活力。
BMMY培养基配方：1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)胰蛋白胨，1.34％(w/v)无氨基酵母氮源，10％(v/v)1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，115℃高压灭菌20min后，加入1％(v/v)甲醇。
木聚糖酶酶活力测定方法：在pH为7.0、50℃条件下，100μL 1％的榉木木聚糖底物和100μL适当稀释的酶液(四种酶液均稀释150倍)混合于水浴锅反应30min，加入600μL DNS溶液终止反应，沸水浴5min。冷却后测定540nm下吸光值(A540)，对照标曲读取还原糖含量。1个酶活力单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖所需要的酶量。
发酵120h后，木聚糖酶的分泌表达水平随着所表达的木聚糖酶PucXyn10基因拷贝数的提高而提高。
重组菌株5copy表达的木聚糖酶酶活力为88U/mL，木聚糖酶蛋白分泌表达量约为0.50g/L，如图1所示，相比于只表达1拷贝木聚糖酶PucXyn10基因的重组菌株1copy(所对应的木聚糖酶酶活力为53U/mL，蛋白分泌表达量约为0.30g/L)，木聚糖酶的酶活力与蛋白浓度均增加了67％。
实施例3过表达不同内源调控因子对多拷贝木聚糖酶PucXyn10在毕赤酵母中分泌表达水平的影响
(1)设计引物以毕赤酵母反转录cDNA为模板扩增出内源调控因子Yap1、Pdi1、Gcn4、Haclp、Cne1、Sly1、Sec1与Ero1基因片段，各内源调控因子的引物序列如下：
Yap-1(SEQ ID NO：15)：5’-AACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGAGTGACGTGGTAAACAA-3’；
Yap-2(SEQ ID NO：16)：5’-TCGGGCCCAAGCTGGCGGCCGCCTATTTAAACATGGA AAAAT-3’；
Pdi-1(SEQ ID NO：17)：5’-AACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGCAATTCAACTGGAATATTAA-3’；
Pdi-2(SEQ ID NO：18)：5’-TCGGGCCCAAGCTGGCGGCCGCTTAAAGCTCGTCGTG AGCGT-3’；
Gcn-1(SEQ ID NO：19)：5’-AACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGTCTGCAAGTACTTACAG-3’；
Gcn-2(SEQ ID NO：20)：5’-TCGGGCCCAAGCTGGCGGCCGCTCACTGATGTTTCAC TAAAC-3’；
Hac-1(SEQ ID NO：21)：5’-AACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGCCCGTAGATTCTTCTCA-3’；
Hac-2(SEQ ID NO：22)：5’-TCGGGCCCAAGCTGGCGGCCGCCTATTCCTGGAAGAA TACAA-3’；
Cne-1(SEQ ID NO：23)：5’-AACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGAAGATCTCTACCATTGCA-3’；
Cne-2(SEQ ID NO：24)：5’-TCGGGCCCAAGCTGGCGGCCGCCTAGGTTCTCTTTGT AGCTT-3’；
Sly-1(SEQ ID NO：25)：5’-AACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGCTTCATTTGAATGAGCCC-3’；
Sly-2(SEQ ID NO：26)：5’-TCGGGCCCAAGCTGGCGGCCGCTTATTTTGCTTCGGCA CCGA-3’；
Sec-1(SEQ ID NO：27)：5’-AACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGGCTTCTGATCTGATTAAC-3’；
Sec-2(SEQ ID NO：28)：5’-TCGGGCCCAAGCTGGCGGCCGCCTATTTCCAAAATTTCTTCAGCT-3’；
Ero-1(SEQ ID NO：29)：5’-AACAACTATTTCGAAACGAGGAATTCATGAGGATAGTAAGGAGCGT-3’；
Ero-2(SEQ ID NO：30)：5’-TCGGGCCCAAGCTGGCGGCCGCTTACAAGTCTACTCTATATGTGG-3’。
(2)将质粒pGAPZA(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司，V20020)利用限制性内切酶EcoRI与NotI进行双酶切，回收酶切后的质粒载体。将步骤(1)中的8种毕赤酵母内源调控因子的基因片段分别与载体片段通过Gibson assembly的方式进行连接，连接产物分别化学转化入E.coli Top10。经博莱霉素抗性平板分别筛选阳性转化子，对应的阳性转化子提取质粒经测序鉴定正确后，分别得到表达内源调控因子基因的重组质粒pGAPZA-Yap1、pGAPZA-Pdi1、pGAPZA-Gcn4、pGAPZA-Hac1p、pGAPZA-Cne1、pGAPZA-Sly1、pGAPZA-Sec1与pGAPZA-Ero1。
(3)利用限制性内切酶Esp3I对重组质粒pGAPZA-Cne1进行线性化，而使用XmaJI对其他7个重组质粒进行线性化，纯化回收8种线性化载体并分别电转化实施例2中重组菌株5copy的感受态细胞，在博莱霉素抗性平板上进行阳性转化子筛选，得到的过表达内源调控因子的阳性转化子分别命名为5copy+Yap1、5copy+Pdi1、5copy+Gcn4、5copy+Hac1p、5copy+Cne1、5copy+Sly1、5copy+Sec1与5copy+Ero1。
(4)将步骤(3)中获得的8种重组菌株以及实施例2中的重组菌株5copy分别接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养20h。6000rpm，4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近0.5，30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇。发酵五天后在6000rpm，4℃离心5min回收发酵上清液并检测木聚糖酶酶活力。
除Yap1与Pdi1外，过表达其余6种内源调控因子均对含有多拷贝基因的木聚糖酶的分泌表达具有促进作用，但Cne1、Sly1和Ero1的促进作用并不明显，其中，促进作用显著的三种内源调控因子为Hac1p、Gcn4与Sec1。发酵120h后，过表达这三种内源调控因子的重组菌株表达的木聚糖酶酶活力分别为98.6、97.6与96.4U/mL，相比于对照菌株5copy，木聚糖酶的酶活力分别增加了11.8％、10.7％与9.3％，如图2所示。
实施例4携带多种内源调控因子基因的质粒的构建
(1)分别以实施例3中的质粒pGAPZA-Hac1p与pGAPZA-Sec1为模板，利用引物XmaJI-1(SEQ ID NO：31)与XmaJI-2(SEQ ID NO：32)进行质粒环形PCR，经过PCR后质粒上的XmaJI位点序列将由“CCTAGG”突变为“GCTAGG”，目的是使得内源调控因子Hac1p与Sec1基因不具该酶切位点，便于后续的重组连接。
利用DpnI对PCR产物进行消化处理，以避免原质粒在后续转化中可能造成的假阳性情况。之后，取消化后产物化学转化E.coli Top10。经博莱霉素抗性平板分别筛选阳性转化子，对应的阳性转化子提取质粒经测序鉴定正确后，分别得到表达内源调控因子Hac1p与Sec1基因但不具有XmaJI酶切位点的重组质粒pGAPZA-Hac1p-NoXmaJI与pGAPZA-Sec1-NoXmaJI。
XmaJI-1(SEQ ID NO：31)：5’-TTCCACCGCCCGTTACCGTCGCTAGGAAATTTTACT CTGCT-3’。
XmaJI-2(SEQ ID NO：32)：5’-GACGGTAACGGGCGGTGGAA-3’。
(2)将实施例3中的重组质粒pGAPZA-Gcn4利用限制性内切酶BglII与BamHI进行双酶切，胶回收表达Gcn4的基因片段。同时利用限制性内切酶BamHI对步骤(1)中的重组质粒pGAPZA-Sec1-NoXmaJI进行单酶切，回收线性化载体。将回收的基因片段与线性化载体利用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物化学转化E.coli Top10。经博来霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经BglII与BamHI双酶切鉴定正确后，得到同时携带Sec1与Gcn4基因的重组质粒pGAPZA-Sec1-Gcn4。
(3)分别将实施例3中的重组质粒pGAPZA-Gcn4与pGAPZA-Sec1利用限制性内切酶BglII与BamHI进行双酶切，分别胶回收表达Gcn4与Sec1的基因片段。同时利用限制性内切酶BamHI对步骤(1)中的重组质粒pGAPZA-Hac1p-NoXmaJI进行单酶切，回收线性化载体。分别将回收的基因片段与线性化载体利用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物化学转化E.coliTop10。经博来霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经BglII与BamHI双酶切鉴定正确后，分别得到同时携带Hac1p与Gcn4基因的重组质粒pGAPZA-Hac1p-Gcn4与同时携带Hac1p与Sec1基因的重组质粒pGAPZA-Hac1p-Sec1。
(4)将步骤(1)中的重组质粒pGAPZA-Sec1-NoXmaJI利用限制性内切酶BglII与BamHI进行双酶切，胶回收表达Sec1且不具有XmaJI酶切位点的基因片段。同时利用限制性内切酶BamHI对步骤(3)中的重组质粒pGAPZA-Hac1p-Gcn4进行单酶切，回收线性化载体。
将回收的基因片段与线性化载体利用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物化学转化E.coli Top10。经博来霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经BglII与BamHI双酶切鉴定正确后，得到同时携带Hac1p、Gcn4与Sec1基因的重组质粒pGAPZA-Hac1p-Gcn4-Sec1。
实施例5组合过表达多种内源调控因子对木聚糖酶PucXyn10的分泌表达水平的影响
(1)利用限制性内切酶XmaJI对实施例4中的重组质粒pGAPZA-Sec1-Gcn4、pGAPZA-Hac1p-Gcn4、pGAPZA-Hac1p-Sec1与pGAPZA-Hac1p-Gcn4-Sec1进行线性化，纯化回收4种线性化载体并分别电转化实施例2中重组菌株5copy的感受态细胞，在博莱霉素抗性平板上进行阳性转化子筛选，得到的组合过表达内源调控因子的阳性转化子分别命名为5copy+Gcn4+Sec1、5copy+Hac1p+Gcn4、5copy+Hac1p+Sec1与5copy+Hac1p+Gcn4+Sec1。
(2)将步骤(1)中获得的4种重组菌株以及实施例3中的重组菌株5copy+Hac1p分别接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养20h。6000rpm，4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近0.5，30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇。发酵五天后在6000rpm，4℃离心5min回收发酵上清液。利用Bradford法测定上清蛋白浓度并检测木聚糖酶酶活力。
组合过表达多种内源调控因子相比于表达一种内源调控因子能够进一步提高木聚糖酶PucXyn10的分泌表达水平。在表达一种内源调控因子的毕赤酵母重组菌株中，发酵120h后，过表达调控因子Hac1p的菌株5copy+Hac1p具有最高的木聚糖酶酶活，达98.6U/mL。与之相比，组合过表达2种及以上的调控因子的重组菌株的木聚糖酶酶活进一步提高，其中组合过表达Hac1p、Gcn4与Sec1三种调控因子的菌株5copy+Hac1p+Gcn4+Sec1的木聚糖酶表达水平最高，木聚糖酶酶活可达168.9U/mL，蛋白浓度可达0.95g/L，结果示意图如图3所示，相比于对照菌株5copy+Hac1p，木聚糖酶的酶活力与蛋白浓度分别增加了71.3％与52％。
通常构建表达木聚糖酶的毕赤酵母菌株时，只会将携带一拷贝木聚糖酶基因的表达载体电转至商品化的出发菌株如GS115中，这样获得的重组菌株虽然能够实现木聚糖酶的分泌表达，但表达量往往不高(如本发明中的重组菌株1copy，所对应的木聚糖酶酶活力为53U/mL，蛋白分泌表达量约为0.30g/L)，而采用本发明的方法构建得到的高产木聚糖酶毕赤酵母菌株5copy+Hac1p+Gcn4+Sec1，与重组菌株1copy相比，木聚糖酶的酶活力提高了3.18倍，达168.9U/mL，分泌蛋白浓度增加了3.17倍，经SDS-PAGE电泳检查，结果示意图如图4所示，达0.95g/L，而且细胞生长情况与重组菌株1copy类似，如图5所示。
实施例7高产木聚糖酶重组工程菌的高密度发酵培养
YPD培养基配方：1％酵母提取物(w/v)，2％(w/v)胰蛋白胨，2％葡萄糖(YPD固体培养基配方还包括2％琼脂粉)，115℃高压灭菌20min。
将高产菌株5copy+Hac1p+Gcn4+Sec1在YPD培养基平板划线，挑选单菌落接种到YPD液体培养基摇瓶中，装液量10％，30℃200rpm培养约24h得到一级种子液。将一级种子液按3％比例接种到新的YPD培养基中，装液量10％，30℃200rpm培养约24h得到二级种子液。将二级种子液按5％接种量接入5L发酵罐中。
发酵条件如下：初始装液量：2L，通气量为1vvm；生长阶段温度为30℃，采用氨水(30％)及磷酸(30％)调节pH为5.5，补加50％(V/V)的甘油，采用溶氧和转速偶联方式，使溶氧维持在30-60％。当OD600≥250左右时，停止流加甘油。待溶氧再次反弹至80％以上，开始流加甲醇进行诱导表达，并将培养温度降低至28℃，搅拌转速升高至800rpm，采用与溶氧偶联方式流加甲醇，使溶氧维持在15-25％，获得木聚糖酶酶液。
每隔适当的发酵时间，对发酵培养获得的酶液进行取样，并根据实施例2的方法测定木聚糖酶酶活，最终木聚糖酶酶活最高可达7548U/mL，如图6所示。
从以上的描述中，可以看出，本申请上述的实施例实现了如下技术效果：本申请提供了一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌的构建方法，该方法包括提高木聚糖酶基因在毕赤酵母菌株中的基因拷贝数，筛选毕赤酵母内源且与蛋白分泌表达相关的调控因子，然后在获得的表达多拷贝木聚糖酶基因的重组菌株中组合过表达多种内源调控因子等步骤。相比于按照常规方法构建的木聚糖酶表达菌株1copy，采用本申请的方法构建的生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，木聚糖酶的酶活力以及蛋白的表达水平显著提高，其中，木聚糖酶的酶活力最高可提高3.18倍，在5L发酵罐中高密度发酵时表达的木聚糖酶酶活可达7548U/mL，具有良好的工业应用价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌中含有多拷贝的木聚糖酶XYN10基因以及过表达的内源调控因子的基因；
所述内源调控因子包括Hac1p、Gcn4或Sec1中的两种或三种。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述木聚糖酶为具有如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；
优选地，所述多拷贝的木聚糖酶XYN10基因的拷贝数为2～5；
优选地，所述拷贝数为5。
3.根据权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述内源调控因子的组合选自如下任意一种：Hac1p+Gcn4、Hac1p+Sec1、Gcn4+Sec1或Hac1p+Gcn4+Sec1；
优选地，所述Hac1p为具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；
优选地，所述Gcn4为具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；
优选地，所述Sec1为具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白或与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有70％同源性的蛋白；
优选地，表达所述Hac1p的多聚核苷酸为具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的多聚核苷酸或与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有70％同源性的多聚核苷酸；
优选地，表达所述Gcn4的多聚核苷酸为具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的多聚核苷酸或与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有70％同源性的多聚核苷酸；
优选地，表达所述Sec1的多聚核苷酸为具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的多聚核苷酸或与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有70％同源性的多聚核苷酸。
4.一种木聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
利用权利要求1-3中任一项所述的生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌进行发酵培养，获得所述木聚糖酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养包括：将所述生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行培养。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括YPD培养基、BMGY培养基、BMMY培养基或BSM培养基；
优选地，所述BSM培养基包括BSM无机盐培养基。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为25-30℃。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的溶氧量为15-60％。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的pH为4～6。
10.权利要求1-3中任一项所述的生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，或权利要求4-9中任一项所述的木聚糖酶的制备方法在制备木聚糖酶和/或降解木质纤维素中的应用。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN118272245A true CN118272245A (zh) | 2024-07-02 |
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