CN118252845A - 一种长双歧杆菌婴儿亚种e4胞外多糖的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种长双歧杆菌婴儿亚种胞外多糖在制备缓解免疫低下、肠道菌群及代谢物药物中的应用，属于微生物技术以及医药技术领域。本发明提供的长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖(EPS‑1和EPS‑2)能缓解环磷酰胺引起的小鼠免疫器官指数、免疫细胞(脾淋巴、NK、Th1、Th2、Th17和Treg细胞)和血清炎症因子(IFN‑γ、IL‑1β、IL‑2、IL‑6、IL‑10和TNF‑α)的下降。重要的是，EPS‑1和EPS‑2可调节小鼠肠道菌群及其代谢物，如Lachnospiraceae_NK4A136等，代谢产物如短链脂肪酸、α生育酚等的产生，同时，应用于发酵乳中。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术以及医药技术领域，具体涉及一种长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖在制备缓解免疫低下、肠道菌群及代谢物药物中的应用。
背景技术
双歧杆菌是革兰氏阳性菌的专性厌氧菌，在人类婴幼儿时期到老年时期的肠道内为优势菌群，通过定殖在肠道与宿主相互作用发挥其益生作用，如通过调节肠道细胞的增殖和分化以保护肠道屏障等。长双歧杆菌婴儿亚种作为最早期定殖在婴儿肠道中的“先驱”菌株，通过菌体本身与肠细胞互作达到“微生物-肠道”的免疫稳态调节，其细胞壁表面成分及代谢产物与婴儿肠道和机体的免疫活性产生有益关联。不同培养条件下的菌株能够产生具有多种化学结构和组成的生物聚合物，其中一些生物聚合物是分泌在周围环境中的多糖，被称为胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)。EPS是细菌产生的次级代谢产物，在免疫调节、抗癌、抗氧化、抗炎等方面都具有良好的生物活性。
免疫系统是人类防御感染性、炎症性、自身免疫性及肿瘤等疾病的重要屏障。多糖类化合物作为生命物质的组成成份之一，广泛参与了细胞的各种生命现象及生理过程的调节，大量药理及临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，能激活免疫受体，提高机体的免疫功能。自然杀伤细胞(NK细胞)是一种淋巴细胞亚型，与其它淋巴细胞不同，NK细胞参与先天免疫，对于机体的免疫监视功能至关重要，能识别肿瘤细胞及病毒感染的细胞并将其消除。有研究表明，EPS能够调节NK细胞活性，如保加利亚乳杆菌OLL1073R-1的EPS增强了小鼠的NK细胞活性。细胞免疫可以通过T细胞的增殖和分化实现调控，对免疫应答具有上调或下调的作用。在外周血中，成熟的T细胞中主要含有CD4+T，其可分为Th1、Th2、Th17和Treg细胞。多种免疫细胞和介质参与免疫反应的调节，不同类型的免疫反应可以通过T辅助(Th)细胞的不同亚群(如Th1和Th2细胞)来区分[15]。因此，调节Th1型和Th2型免疫之间的相互作用具有重要的意义。Th1细胞在针对病原体的免疫应答过程中被激活，主要分泌细胞因子IL-2、IFN-γ和TNFα，其触发细胞防御机制。而Th2细胞主要释放IL-4、IL-5和IL-13，同时，介导抗体反应包括IgE的产生。其它T淋巴细胞亚群，它们在某些条件下调炎症过程并与其它T细胞竞争，例如Th17细胞产生的IL-17与先天性和适应性免疫相关，以及调节性T细胞(Treg)产生的IL-10和TGF-β参与对抗原的过敏、口服耐受和自身免疫性疾病。
肠道微生物群是一个极其复杂的微生物群落，在已知的促进肠道发育及机体健康的益生菌中双歧杆菌是主要的群体之一。肠道中的微生物参与到机体的代谢的同时还对致病微生物产生干扰作用，防止其进入肠道定殖，另一方面，通过刺激机体免疫系统共同维持肠道平衡。EPS可以通过调节肠道微生物菌群方式保护微生物屏障，对肠道屏障起到保护作用。植物乳杆菌-12产生的EPS通过调节肠道微生物群和代谢物增强肠道屏障，缓解了嘧啶甲烷/葡聚糖硫酸钠盐(AOM/DSS)诱导的小鼠结肠癌症状。植物乳杆菌NCU116的胞外多糖EPS116通过调节肠道干细胞的增殖和分化以及增加了与肠道再生和糖代谢相关的微生物种群来促进肠道稳态。另一方面，EPS可以通过抑制致病菌来保护肠道屏障。两歧双歧杆菌WBIN03和植物乳杆菌R315胞外多糖对蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性乳杆菌、白色念珠菌、鼠伤寒沙门氏菌等多种病原菌具有一定的抗菌活性。此外，短双歧杆菌UCC2003产的胞外多糖可以促进上皮细胞释放抑菌物质来抑制有害菌的生长，进而调节肠道微生物平衡，保护肠道屏障。其作为细胞外基质的主要成分，参与了生物膜的形成并且可以促进细胞间的黏附，作为一层物理屏障保护细菌群落不受周围环境的影响。EPS被应用于各个行业，特别是食品、化妆品、制药、纺织和农业。因此，EPS的开发及其改善体液免疫、菌群及代谢物中的应用具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种改善体液免疫、肠道菌群及代谢物作用的长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖组份EPS-1和EPS-2。通过用EPS-1和EPS-2干预环磷酰胺(CTX)诱导的小鼠免疫低下，判断其初步预防及缓解效果。
本发明提供的缓解CTX诱导的小鼠免疫低下变化，可以缓解小鼠免疫器官指数、免疫细胞(脾淋巴、NK、Th1、Th2、Th17和Treg细胞)的下降。
本发明提供的缓解CTX诱导的小鼠免疫低下，在抑制小鼠血清炎症因子(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α)的下降方面。
本发明提供改善CTX诱导的小鼠肠道菌群变化，在提高优势菌株Lachnospiraceae_NK4A136_，降低Desulfovibrio等菌的丰度方面。
本发明还提供了改善CTX诱导的小鼠肠道代谢物变化，包括调节短链脂肪酸、α生育酚等的产生。
本发明还提供了一种含长双歧杆菌婴儿亚种胞外多糖的发酵乳制品，其中含有EPS-1和EPS-2的比例约为3：2，进一步的，所述产品可以是多复合剂，可包括其它乳酸菌及益生元。
具体地，一种长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)E4胞外多糖在制备缓解免疫低下、肠道菌群及代谢物药物中的应用，长双歧杆菌婴儿亚种E4产生粗胞外多糖并得到纯化组份EPS-1和EPS-2。
EPS-1和EPS-2的制备方法包括以下步骤：长双歧杆菌婴儿亚种E4接种于含有2％v/v盐酸L-半胱氨酸的MRS培养液中，菌体的生长加入3％v/v的接种量，在37℃下孵育24h，5000×g离心10分钟；其中上清液用于胞外多糖的提取；旋转蒸发上清液至原体积的1/10，获得浓缩液，再向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，4℃过夜后离心获得沉淀，得到的沉淀物溶解于相当于沉淀20倍量的去离子水中，再在8-14kDa透析袋中4℃透析48小时后冻干；利用DEAE-纤维素52，以0，0.1和0.3M NaCl依次洗脱，每个梯度洗脱6个柱体积，流速为1mL/min，收集0.3M NaCl洗脱液，获得纯化粗胞外多糖cEPS；利用Sepharose CL-6B柱在0.1M NaCl和流速0.5mL/min的条件下洗脱粗胞外多糖cEPS，收集前两个柱体积的洗脱液，纯化去盐，浓缩，干燥后获得EPS-1，再收集后三个柱体积的洗脱液，纯化去盐，浓缩，干燥后获得EPS-2。
EPS-1和EPS-2调节免疫器官、免疫细胞。
EPS-1和EPS-2调节肠道菌群。
EPS-1和EPS-2调节肠道代谢物。
一种长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)E4胞外多糖在制备发酵乳产品中的应用。
发酵乳的制备方法包括以下步骤：
(1)脱脂乳的配制：配制脱脂乳为12g/100mL，充分混合，在95℃条件下杀菌10min，取出脱脂乳置于室温中自然降温；
(2)制备发酵乳：当脱脂乳降温达到42℃时，向容器中加入丹尼斯克发酵剂，其中接种量为5.6×106CFU/mL，充分混匀，密封后置于42℃培养箱中发酵5h，凝乳前，向其中加入长双歧杆菌婴儿亚种E4粗胞外多糖30mg/mL混合，凝乳后，置于4℃冰箱后熟12h，低温贮存。
长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖产生粗胞外多糖cEPS的产量为476.57mg/L，EPS-1和EPS-2的得率为30.51％和23.01％，EPS-1和EPS-2在粗胞外多糖cEPS中的比例为3:2。
本发明的有益效果：
本发明提供的一种长双歧杆菌婴儿亚种胞外多糖在改善体液免疫、菌群及代谢物中的应用，属于微生物技术以及医药技术领域。本发明提供的长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖(EPS-1和EPS-2)能缓解环磷酰胺引起的小鼠免疫器官指数、免疫细胞(脾淋巴、NK、Th1、Th2、Th17和Treg细胞)和血清炎症因子(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α)的下降。重要的是，EPS-1和EPS-2可调节小鼠肠道菌群及其代谢物，如Lachnospiraceae_NK4A136等，代谢产物如短链脂肪酸、α生育酚等的产生。
附图说明
图1小鼠体重及免疫器官指数。(A)体重，(B)脾脏指数，(B)胸腺指数
图2ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化。
图3小鼠NK细胞活性。
图4血清炎症因子水平。(A)IFN-γ，(B)IL-1β，(C)IL-2，(D)IL-6，(E)IL-10和(F)TNF-α
图5外周血T淋巴细胞亚群。(A)流式细胞图，(B)Th1，(C)Th2，(D)Th17，(E)Treg
图6小鼠肠道菌群组成。(A)门水平，(B)属水平
图7小鼠肠道内容物中短链脂肪酸的含量。
图8小鼠肠道内容物差异代谢物热图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
本发明中，长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)E4购自中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号为CCTCC M 2022385。接种于含有盐酸L-半胱氨酸(2％v/v)的MRS培养液中，菌体的生长加入3％(v/v)的接种量，在37℃下孵育24h，5000×g离心10分钟。其中上清液用于胞外多糖的提取。
长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖EPS通过以下方法进行分离和纯化。旋转蒸发上清液至原体积的1/10，获得浓缩液，再向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，4℃过夜后离心获得沉淀，得到的沉淀物溶解于相当于沉淀20倍量的去离子水中，再在8-14kDa透析袋中4℃透析48小时后冻干。利用DEAE-纤维素52，以0，0.1和0.3M NaCl依次洗脱，每个梯度洗脱6个柱体积，流速为1mL/min，收集0.3M NaCl洗脱液，获得纯化cEPS。利用Sepharose CL-6B柱在0.1M NaCl和流速0.5mL/min的条件下洗脱，收集前200mL洗脱液，纯化去盐，浓缩，干燥后获得EPS-1，再收集后300mL洗脱液，纯化去盐，浓缩，干燥后获得EPS-2。下述实施例中涉及的小鼠为6周龄雌性SPF级(Specific pathogen free，无特定病原体)Balb/c小鼠，购自北京维生河动物科技有限公司；下述实施例ELISA试剂盒购自北京诚林生物科技有限公司；
实施例1
长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖缓解CTX诱导的小鼠免疫低下
1、动物实验设计、体重及免疫器官指数
SPF级雌性Balb/c小鼠40只，6周龄，体重18～20g。小鼠被饲养在聚碳酸酯笼中，在温度控制(22.5℃±2.5℃)的宿舍中测量(320×180×150mm)，湿度为50±10％，光照/黑暗周期为12小时。小鼠被允许自由进食和饮水。摄食适应期为7d。4组分别为正常对照组(NC)、模型对照组(MC)、EPS-1组(EPS-1)和EPS-2组(EPS-2)。MC组、EPS-1组和EPS-2组小鼠分别于第1、2、3、10、17天腹腔注射CTX 80mg/kg体重/d。NC组腹腔注射生理盐水。NC组和MC组小鼠每天灌胃生理盐水。EPS-1组和EPS-2组分别给予EPS-1和EPS-2 300mg/kg体质量/d灌胃。第1、3、10、17天称量小鼠体重。眼球抽血后处死小鼠。采集全血，部分全血于4℃下5000rpm离心10min，获得血清。同时收集脾脏和胸腺样本进行进一步分析。计算体重、脾脏指数和胸腺指数:
注射环磷酰胺后测量各组小鼠的体重(图1A)。4组中NC组体重增长(％)最高(112.60％)，且随时间增加而增加。MC组、EPS-1组和EPS-2组大鼠体重在第3天开始下降，之后呈上升趋势。第17天，3组大鼠中EPS-1的体重增长(％)最高(109.04％)，其次为EPS-2(107.27％)。EPS-1、EPS-2对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响如图1(B-C)所示。结果表明:MC组脾脏指数和胸腺指数显著高于对照组(p<0.05)均显著低于NC组。此外，与MC组相比，EPS-1组和EPS-2组的脾脏指数和胸腺指数显著增加(p<0.05)。EPS-1组和EPS-2组的脾脏和胸腺指数差异无显著差异(p>0.05)。结果表明，注射环磷酰胺可影响小鼠体重，而EPS-1和EPS-2可减轻小鼠体重下降，同时，改善小鼠脾脏指数下降。
2.免疫细胞的测定
2.1ConA诱导的小鼠淋巴脾细胞转化试验
将1mL计数为3×106个/mL脾细胞加入到24孔板中，NC、MC、EPS-1和EPS-2组分别设置加入75μL ConA溶液(100μg/mL)和不加入ConA溶液的对照孔。置于37℃、含5％CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，取90μL脾细胞转移至96孔板中，每组3个平行孔，加入MTT溶液10μL/孔，继续培养4h。弃上清，加入100μL的DMSO，在490nm下检测光密度值(OD值)，脾淋巴细胞增殖结果见图2所示。与NC组相比，MC组脾淋巴细胞增殖能力显著降低(p<0.05)。EPS-1和EPS-2组的脾淋巴细胞增殖能力显著高于MC组，说明EPS-1和EPS-2能缓解CTX造成的脾细胞增殖能力降低的情况，具有体内免疫调节能力。另外，EPS-1组与EPS-2组光密度值差异显著(p<0.05)，EPS-1组促进脾淋巴细胞增殖能力优于EPS-2组。
2.2NK细胞活性的检测
LDH基质液的配置为在0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH 8.2)，加入乳酸锂(5×10-2mol/L)、碘硝基氯化四氮唑蓝(IN，6.6×10-4mol/L)、酚酞二甲酯硫酸盐(PMS，2.8×10- 4mol/L)和氧化型辅酶Ⅰ(NAD，1.3×10-3mol/L)混合均匀避光备用。随后，调整靶细胞(YAC-1细胞)3×106个/mL，调整效应细胞(脾细胞)4×106个/mL。NC，MC、EPS-1和EPS-2组的反应孔中将200μL的靶细胞和效应细胞以50:1加入到96孔培养板中。同时，设置靶细胞自然释放孔(仅含有靶细胞200μL)，靶细胞最大释放孔(加靶细胞和1％NP40各100μL)，每组设置3个平行孔，于37℃、5％ CO2培养箱中培养4h。以1500rpm/min离心5min，取上清液100mL于96孔板中加入100μL LDH基质液，在室温下反应3min后加入30μL HCl(1mol/L)，在酶标仪490nm处测定吸光度值(OD值)。NK细胞活性计算公式如下：
NK细胞是淋巴细胞的主要代表细胞群，在抗肿瘤和抗病毒免疫过程中起重要作用。由图3可知，MC组的NK细胞杀伤活性均显著低于NC组(p<0.05)。相比于MC、EPS-1和EPS-2组小鼠NK细胞活性显著提高(p<0.05)。结果表明，EPS-1能提高正常小鼠NK细胞活性。EPS-2也能缓解CTX造成小鼠NK细胞活性降低的情况。结果表明EPS-1和EPS-2均具有体内免疫调节活性，且EPS-1组高于EPS-2组。
2.3外周血流式细胞的检测
取血液样本100μL，加入CD25、CD4抗体各1μg，混匀后4℃避光染色30min。加入固定/破膜液500μL，4℃避光染色40min。加入破膜洗液1mL，400g离心5min，弃上清，重复洗涤一次。加入抗体FoxP3、IL-17A、IFN-γ、IL-4各1μg，混匀后4℃避光染色30min。使用400μLPBS重悬细胞后立即用ZE5流式细胞仪检测，采用Everest软件对数据进行分析。小鼠外周血T淋巴细胞亚群(Th1，Th2，Th17和Treg)的流式细胞结果见图4，Th17和Treg细胞比例在NC、MC、EPS-1和EPS-2组之间无显著差异(p>0.05)，分别为2.63％、1.85％、2.87％、2.40％和3.52％、2.89％、3.53％和3.33％。与NC组小鼠相比，MC组的小鼠外周血细胞Th1和Th2细胞比例显著降低(p<0.05)。在Th1细胞中，MC、EPS-1和EPS-2组之间不具有显著差异(p>0.05)，分别为4.35％、5.50％和5.39％。然而，在Th2细胞中，MC组(MC，0.19％)与EPS-1(0.36％)、EPS-2(0.33％)组具有显著差异(p<0.05)，而EPS-1和EPS-2组之间不具有显著差异(p>0.05)。结果表明CTX的处理降低了小鼠T淋巴细胞亚群(Th1、Th2、Th17和Treg)的比例，而EPS-1和EPS-2改善了由于免疫抑制引起的免疫细胞减少现象。其中，在对Th1、Th17和Treg细胞的调节中EPS-1更加突出，而在对Th2细胞的调节中，EPS-2的效果更佳。
3.炎症因子的测定
按照ELISA试剂盒(诚林生物技术有限公司，北京)说明书检测小鼠血清中IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α水平结果见图5。与NC组相比，MC组小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α水平显著下降(p<0.05)。相比于MC、EPS-1组和EPS-2组均显著提高了小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的水平(p<0.05)。其中EPS-1组、EPS-2组的小鼠血清中INF-γ和IL-10的水平无显著差异(p>0.05)。EPS-1组与NC组小鼠中IL-6、TNF-α的水平无显著差异(p<0.05)。对于细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α，EPS-1组的作用效果要显著高于EPS-2组(p<0.05)。分析结果表明，EPS-1和EPS-2具有体内免疫活性，能够促进血清中细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的分泌。
因此，本发明的长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖组份EPS-1和EPS-2对小鼠体重、免疫器官及免疫细胞具有较好的调节作用。
实施例2
长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖调节肠道菌群
将实施例1中的步骤(1)得到的造模结束后小鼠处死，收集小鼠肠道内容物，按照QIAamp DNAMini试剂盒(Qiagen)中描述的方法提取微生物DNA。选择细菌16S rRNA基因的一个高度可变的V3-V4区(长度约为250bp)进行测序。PCR产物使用Quant-iT PicoGreendsDNA检测试剂盒在BioTek，FLx800微孔板读卡器上进行定量，在浓度大于2nM时计算合格文库。对于合格的文库，我们使用MiSeq Reagent Kit V3(600循环)进行2×300bp配对端测序。在门和属水平上对每个样品制作物种直方图。为了了解不同组小鼠肠道微生物的差异，在门水平以及属水平上对肠道菌群进行了分类见图6。在门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势门，总丰度均大于80％，其次为放线菌门(Actinobacteriota)和脱硫杆菌门(Desulfobacterota)。与NC组相比，MC组Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteriota的相对丰度降低，Desulfobacterota、变形菌门(Patescibacteria和Proteobacteria)的相对丰度升高。结果表明CTX改变了小鼠的肠道菌群。而EPS-1和EPS-2组可恢复由于CTX处理引起的Firmicutes，Bacteroidetes和Actinobacteriota的丰度下降，同时降低Desulfobacterota、Patescibacteria和Proteobacteria的丰度(图6A)。在属水平上，Lachnospiraceae_NK4A136_group和Muribaculaceae在丰度上具有优势，总丰度大于30％。与NC组相比较，上述两菌的丰度在MC组降低，而EPS-1和EPS-2提高其丰度。相同的，与MC组相比，另枝菌属(Alistipes)、肠杆菌属(Enterorhabdus)、毛螺菌属(Lachnospiraceae_UCG-006和Lachnospiraceae_UCG-008)、布鲁氏杆菌(Blautia)和罗氏菌属(Roseburia)在EPS-1和EPS-2组中均呈现丰度上调的情况。相反的，一些有害菌如大肠杆菌属(Colidextribacter)，脱硫弧菌(Desulfovibrio)和大肠埃氏菌属-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)，与MC组相比，在EPS-1和EPS-2组中丰度降低，更接近于NC组(图6B)。结果表明，EPS-1和EPS-2均可通过增加有益菌减少有害菌不同程度的恢复由CTX造成的小鼠肠道菌群的变化。
因此，本发明的长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖组份EPS-1和EPS-2对小鼠肠道菌群具有调节作用。
实施例3
长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖调节肠道代谢物
1.1肠道内容物短链脂肪酸的检测
将实施例1中的步骤(1)得到的造模结束后小鼠处死，收集小鼠肠道内容物，使用气相色谱质谱联用(GC-MS)对小鼠肠道内容物的短链脂肪酸进行检测。取内容物样品0.1g，加1mL蒸馏水混匀，加200μL50％硫酸，再加10mg/L的内标(环己酮)溶液100μL和乙醚1mL匀浆1min，于4℃和12000r/min条件下离心10min，取上清上机测试。其中，仪器条件为色谱柱：HP-INNOWAX(30m，0.25mm，0.25μm)；进样口温度：220℃；进样方式：分流/不分流进样；升温程序：60℃保持1min，以30℃/min升至210℃，保持3min；离子源：EI源；离子源温度：230℃；接口温度：230℃；采集模式：SIM。不同处理组小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸(SFCAs)的含量见图7。与NC组相比，MC组的总短链脂肪酸(TSCFAs)显著降低(p<0.05)。同时，乙酸、丙酸和丁酸水平均低于NC组。与MC组相比，EPS-1和EPS-2组的总短链脂肪酸、乙酸、丙酸和丁酸水平显著升高(p<0.05)。相比之下，EPS-1和EPS-2组的乙酸、丙酸和丁酸水平与NC组相比无显著差异(p>0.05)。对于EPS-1和EPS-2组来说，乙酸、丁酸和总短链脂肪含量在EPS-1中较高，分别为1154.72mg/kg、67.48mg/kg和1551.08mg/kg。EPS-2中的丙酸含量高于EPS-1组为343.57mg/kg。上述结果表明，EPS-1和EPS-2均可提高CTX小鼠盲肠内容物中SCFAs的含量。
1.2肠道内容物的非靶向代谢物检测
将实施例1中的步骤(1)得到的造模结束后小鼠处死，收集小鼠肠道内容物。选择MC组和EPS-1组、MC组和EPS-2组小鼠肠道内容物，采用液相色谱-质谱法(LC-MS)进行非靶向代谢组学检测。简单地说，提取溶剂1000μL(乙腈：甲醇：水＝2:2:1)和各组内容物50mg，涡旋混合30s，45Hz均质4min，冰水浴超声5min，以此重复3次。然后样品在-20℃下保存2h，在4℃下以12000r/min离心15min。正模流动相条件为0.1％甲酸和乙腈。负模流动相条件为5mM乙酸铵(用氨水调节pH为9.0)和乙腈。进样量为1μL。同时，采用Q Exactive Orbitrap高分辨率质谱仪采集了一次和二次质谱数据。采用以下条件：ESI离子源喷雾电压为3800V(正离子模式)或-3100V(负离子模式)；鞘气流速为45Arb；毛细管温度320℃；辅助气流量为15Arb；扫描范围70～1000m/z；一级和二级分辨率分别为70000和17500；步进碰撞能量分别为20eV、40eV和60eV强度为3；扫描速率，7Hz。在2mL注射瓶中加入200μL上清液进行LC-MS检测，以p值<0.05和VIP≥1为特异性代谢物，用聚类热图分析差异代谢物。将EPS-1和EPS-2组分别与MC组进行比较得到差异代谢产物，见图8。在EPS-1组中的苯基丙酮和多酮类化合物：7-(4-羟苯基)-1-苯基-4-庚烯-3-酮(7-(4-Hydroxyphenyl)-1-phenyl-4-hepten-3-one)；多酮类化合物：新林那罗汀(Neolinderatin)；甾醇脂类：26,26,26,27,27,27-六氟-1-α,25-二羟基-23,23,24,24-四氢维生素D3(26,26,26,27,27,27-hexafluoro-1alpha,25-dihydroxy-23,23,24,24-tetradehydrovitam in D3)；脂质和类脂质分子：维生素K1氢醌(Phylloquinol)和1,2-二肉豆蔻基-sn-甘油(1,2-Dimyristyl-sn-glycerol)；其他：α生育酚(alpha-Tocopherol acetate)等代谢物丰度上调。甘油磷脂：PA(P-20:0/22:2(13Z,16Z))，PG(O-20:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))；脂质和类脂质分子：DG(11D3/11M3/0:0)，2-(2-甲基丁酰基)-9-(3-甲基-2E-戊烯酰基)-2b(2-(2-Methylbutanoyl)-9-(3-methyl-2E-pentenoyl)-2b)，月桂酸(Faradiol laurate)；鞘磷脂：PE-Cer(d16:2(4E,6E)/24:1(15Z))；苯基丙酮和多酮类化合物：Randilongin等丰度下调(图8A)。在EPS-2组中上调了甾醇脂类：26,26,26,27,27,27-六氟-1-α(26,26,26,27,27,27-hexafluoro-1alpha)，24-亚甲基胆固醇硫酸盐(24-methylene-cholesterol sulfate)；脂质和类脂分子：17,23-环氧基-29-羟基-27-去甲醇-8-烯-3,15,24-三酮(17,23-Epoxy-29-hydroxy-27-norlanost-8-ene-3,15,24-trione)，维生素D3(Vitamin D3)，维生素K1氢醌(Phylloquinol)，二氢茶甾醇(Dihydrotachysterol)，(22E,24x)-麦角甾-4,6,8,22-四烯-3-酮((22E,24x)-Ergosta-4,6,8,22-tetraen-3-one)，泛醌-4(Ubiquinone-4)，3-甲基-5-戊基-2-呋喃十五烷酸(3-Methyl-5-pentyl-2-furanpentadecanoic acid)；核苷酸：脱氧尿苷(Deoxyuridine)；有机酸及其衍生物：蛋氨酰-脯氨酸(Methionyl-Proline)等代谢物的丰度。下调了脂质和类脂分子：DG(11D3/11M3/0:0)；甘油磷脂：PG(O-20:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))，PE(17:0/20:2(11Z,14Z))；丙烯醇脂质：叶黄素酯(Loroxanthin ester)；鞘磷脂：PE-Cer(d14:2(4E,6E)/24:0)；有机酸及其衍生物：苯丙氨酰-精氨酸(Phenylalanyl-Arginine)；有机氧化合物：4-氧代-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(4-Oxo-1-(3-pyridyl)-1-butanone)等代谢物的丰度(图8B)。结果表明EPS-1及EPS-2干预后，由CTX诱导的小鼠肠道菌群代谢物发生变化。
因此，本发明的长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖组份EPS-1和EPS-2对小鼠肠道菌群及内容物中的代谢产物包括短链脂肪酸等进行调节。
实施例4
含长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖发酵乳的应用
(1)脱脂乳的配制：配制脱脂乳为12g/100mL，充分混合，在95℃条件下杀菌10min，取出脱脂乳置于室温中自然降温。
(2)制备发酵乳：当脱脂乳降温达到42℃时，向容器中加入丹尼斯克发酵剂(YO-MIX 300LYO 100ACU)，其中接种量为5.6×106CFU/m L，充分混匀，密封后置于42℃培养箱中发酵5h，凝乳前，向其中加入长双歧杆菌婴儿亚种E4粗胞外多糖(30mg/mL)混合，凝乳后，置于4℃冰箱后熟12h，低温贮存。
(3)发酵乳质构：发酵乳的制备如实施例4(2)中所述，测定4℃冰箱后熟12h后发酵乳的稠度、硬度、黏性指数、黏聚性和持水力。持水能力检测：将25.0g发酵乳称量放置于50mL离心管中，低温条件下4℃，4000rpm离心10min，去除水分后并称重。发酵乳持水性能计算公式如下：
质构测定条件使用TA-XT Plus物性分析仪，探头：A/BE-d35，进入距离30mm，盘径35mm；夹具:TA-BT-KI；触发点负载:7g；形变量为50％；循环次数:2；预测试速度:2mm/s；测试速度:1mm/s；返回速度:1mm/s。每个样品重复测试5次，结果取平均值，见表1所示。
表1发酵乳的持水力及其质构
本发明中由长双歧杆菌婴儿亚种E4可产生粗胞外多糖的产量为476.57mg/L，EPS-1和EPS-2的得率为30.51％和23.01％，其在粗多糖中的比例约为3:2，实施例4(2)中所制备的发酵乳每100mL的含有粗多糖3000mg粗多糖，其中包含EPS-1和EPS-2分别为1053mg和690.3mg。此外，评价发酵乳持水力为37.85±0.21％、硬度为110.35±2.57g、稠度为32.58±1.68(g·s)、黏聚性为-34.95±3.01g、黏性指数为-35.16±5.11(g·s)，以上结果表明添加有长双歧杆菌婴儿亚种E4可产生粗胞外多糖的发酵乳仍然具有良好的品质特性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)E4胞外多糖在制备缓解免疫低下、肠道菌群及代谢物药物中的应用，其特征在于，长双歧杆菌婴儿亚种E4产生粗胞外多糖并得到纯化组份EPS-1和EPS-2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，EPS-1和EPS-2的制备方法包括以下步骤：长双歧杆菌婴儿亚种E4接种于含有2％v/v盐酸L-半胱氨酸的MRS培养液中，菌体的生长加入3％v/v的接种量，在37℃下孵育24h，5000×g离心10分钟；其中上清液用于胞外多糖的提取；旋转蒸发上清液至原体积的1/10，获得浓缩液，再向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，4℃过夜后离心获得沉淀，得到的沉淀物溶解于相当于沉淀20倍量的去离子水中，再在8-14kDa透析袋中4℃透析48小时后冻干；利用DEAE-纤维素52，以0，0.1和0.3M NaCl依次洗脱，每个梯度洗脱6个柱体积，流速为1mL/min，收集0.3M NaCl洗脱液，获得纯化粗胞外多糖cEPS；利用Sepharose CL-6B柱在0.1M NaCl和流速0.5mL/min的条件下洗脱粗胞外多糖cEPS，收集前两个柱体积的洗脱液，纯化去盐，浓缩，干燥后获得EPS-1，再收集后三个柱体积的洗脱液，纯化去盐，浓缩，干燥后获得EPS-2。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，EPS-1和EPS-2调节免疫器官、免疫细胞。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，EPS-1和EPS-2调节肠道菌群。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，EPS-1和EPS-2调节肠道代谢物。
6.根据权利要求1所述的一种长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)E4胞外多糖在制备发酵乳产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脱脂乳的配制：配制脱脂乳为12g/100mL，充分混合，在95℃条件下杀菌10min，取出脱脂乳置于室温中自然降温；
(2)制备发酵乳：当脱脂乳降温达到42℃时，向容器中加入丹尼斯克发酵剂，其中接种量为5.6×106CFU/mL，充分混匀，密封后置于42℃培养箱中发酵5h，凝乳前，向其中加入长双歧杆菌婴儿亚种E4粗胞外多糖30mg/mL混合，凝乳后，置于4℃冰箱后熟12h，低温贮存。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，长双歧杆菌婴儿亚种E4胞外多糖产生粗胞外多糖cEPS的产量为476.57mg/L，EPS-1和EPS-2的得率为30.51％和23.01％，EPS-1和EPS-2在粗胞外多糖cEPS中的比例为3:2。
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