CN118240091A - 一种抗pd-l1和tigit双特异性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及生物技术领域，具体地，本公开公开了一种抗PD‑L1和TIGIT双特异性抗体及其应用。本公开公开的抗PD‑L1和TIGIT双特异性抗体包括特异性结合PD‑L1的第一抗原结合域和特异性结合TIGIT的第二抗原结合域，其可用于治疗肿瘤。

Description

一种抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体及其应用
本申请请求2022年12月22日向中国国家知识产权局提交的中国专利申请(专利申请号为202211656550.X，发明名称为“一种抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体及其应用”)的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入本申请。
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体及其用途。
背景技术
免疫抑制性受体(IRs)在调节慢性病毒感染和癌症的免疫中发挥着重要的作用。在慢性抗原刺激下，T细胞功能失调或衰竭并上调IRs，包括程序性细胞死亡受体1(PD-1)和带有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。同时，肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APCs)在肿瘤微环境(TME)中表达IR配体，这导致肿瘤细胞可以逃避免疫监视。
TIGIT(也称为WUCAM、Vstm3、VSIG9)是脊髓灰质炎病毒受体(PVR)/黏连蛋白家黏连蛋白家族(隶属于免疫球蛋白超家族)的成员，在淋巴细胞中表达，特别是在效应和调节性CD4+T细胞、滤泡辅助CD4+T细胞、效应CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞中高表达。TIGIT与DCs或肿瘤细胞上表达的CD155结合，诱导CD155磷酸化并触发信号级联反应，促进免疫耐受性DCs形成，抑制固有免疫和适应性免疫；TIGIT还可以直接抑制CD8+T细胞效应，或TIGIT+Treg可以抑制CD8+T细胞，防止癌细胞清除。
TIGIT可通过多种作用机制抑制淋巴细胞活化：首先，TIGIT是一种与共刺激受体CD226作用完全相反的抑制性受体，当TIGIT存在于淋巴细胞表面时，与CD226相比，它对其共同配体CD155的亲和力高于CD226，因此，TIGIT将会竞争性的优先与CD155结合，从而阻断CD226的共刺激效应；其次，TIGIT可以通过抑制CD226同源二聚体的形成，阻断CD226信号；此外，TIGIT的胞质尾部含有一种基于酪氨酸的免疫受体抑制基序(ITIM)，可能导致信号抑制，有研究表明这是TIGIT导致T细胞抑制的主要机制。
细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)是适应性免疫的免疫检查点，正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性T细胞(CD8+T细胞增生)。而PD-1与PD-L1结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，而且PD-1还可以借由调节Bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性T细胞的聚积。
发明内容
尽管PD-1/PD-PD-L1表达在多种肿瘤(例如，肾癌、胃癌、尿道上皮癌、卵巢癌和黑色素瘤)上，使用PD-L1抗体能杀死肿瘤细胞或抑制杀伤性T细胞的活性。L1抑制剂在肿瘤免疫领域中获得了巨大的成功，但其单药应答率有限(10％～35％)、持续治疗中逐渐出现耐药性或者复发等问题存在。TIGIT和PD1在T细胞和NK细胞上共表达，抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，可实现TIGIT与PD-(L)1通路的协同抑制效果，提高抗肿瘤效果。本公开披露了一种抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体。
本公开公开了一种抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其包含特异性结合PD-L1的第一抗原结合域和特异性结合TIGIT的第二抗原结合域；其中，
A)所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域包含重链可变区P-VH和轻链可变区P-VL，所述重链可变区P-VH包含SEQ ID NO：3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区P-VL包含SEQ ID NO：4中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；和/或
B)所述特异性结合TIGIT的第二抗原结合域包含重链可变区T-VH和轻链可变区T-VL，所述重链可变区T-VH包含SEQ ID NO：1中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区T-VL包含SEQ ID NO：2中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；
在一些实施方案中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3由IMGT编号系统定义，或由Kabat编号系统定义，或由Chothia编号系统定义，或由Contact编号系统定义，或由AbM编号系统定义。在一些实施方案中，前述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3根据Kabat编号系统定义。在一些实施方案中，前述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3根据IMGT编号系统定义。
在一些实施方案中，如上任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，所述抗体为鼠源抗体，嵌合抗体或人源化抗体；在一些实施方案中，所述抗体为人源化抗体。
在一些实施方案中，如上任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其中：所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域，所述重链可变区P-VH的HCDR1包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，和所述轻链可变区P-VL的LCDR1包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ IDNO：15的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如上任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其重链可变区P-VH包含分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，如上任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，所述重链可变区P-VH包含与SEQ ID NO：3具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区P-VL包括与SEQ IDNO：4具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变区P-VH包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和所述轻链可变区P-VL包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如上任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其中：所述特异性结合TIGIT的第二抗原结合域中，所述重链可变区T-VH的HCDR1包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，和所述轻链可变区T-VL的LCDR1包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如上任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其重链可变区P-VH包含分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，如上任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，所述重链可变区T-VH包含与SEQ ID NO：1具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区T-VL包括与SEQ IDNO：2具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变区T-VH包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，和所述轻链可变区T-VL包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如上任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其包括重链恒定区和轻链恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ或λ链恒定区；在一些实施方案中，所述恒定区的种属来源为鼠或人；在一些实施方案中，所述重链恒定区包括与SEQ ID NO：27具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区包括与SEQ ID NO：28具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；在一些实施方案中，所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体包含SEQ ID NO：27所示的重链恒定区和SEQ ID NO：28所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，如上任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域包含抗体重链恒定区CH和轻链恒定区CL，重链可变区P-VH的C端与重链恒定区CH的N端连接，轻链可变区P-VL的C端与轻链恒定区CL的N端连接；或者所述特异性结合TIGIT的第二抗原结合域包含抗体重链恒定区CH和轻链恒定区CL，重链可变区T-VH的C端与重链恒定区CH的N端连接，轻链可变区T-VL的C端与轻链恒定区CL的N端连接。在一些实施方案中，所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域包括与SEQ ID NO：19具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列的重链，和SEQ ID NO：20具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列的轻链；在一些实施方案中，所述特异性结合TIGIT的第二抗原结合域包括与SEQ ID NO：17具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列的重链，和与SEQ IDNO：18具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列的轻链；在一些实施方案中，所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域包括SEQ ID NO：19所示的重链和SEQ ID NO：20所示的轻链。
在一些实施方案中，如上任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其中所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域为全长抗体，其包含重链可变区P-VH和重链恒定区CH，以及轻链可变区P-VL和轻链恒定区CL；所述特异性结合TIGIT的第二抗原结合域为scFv抗原结合片段，其包括重链可变区T-VH和轻链可变区T-VL。在一些实施方案中，所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体包括两条具有式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链：
(b).[P-VL]-[CL]；
(a).[T-VL]-[L1]-[T-VH]-[L2]-[P-VH]-[CH]，[T-VH]-[L1]-[T-VL]-[L2]-[P-VH]-[CH]，
[P-VH]-[CH]-[L1]-[T-VL]-[L2]-[T-VH]，或[P-VH]-[CH]-[L1]-[T-VH]-[L2]-[T-VL]；
式(a)中，连接子L1和L2优选为肽连接子；在一些实施方案中，所述连接子L1和L2独立地选自(GxS)y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自0-6的整数；在一些实施方案中，所述连接子为如SEQ ID NO：29或30所示连接子。在一些实施方案中，所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体第一链包括SEQ ID NO：21-26任一项所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ IDNO：20所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体包括2条SEQ ID NO：21所示的第一链和2条SEQ ID NO：20所示的第二链。在一些实施方案中，所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体包括2条SEQ ID NO：26所示的第一链和2条SEQ ID NO：20所示的第二链。
在一些实施方案中，本公开公开一种抗原结合分子，其与前面任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体竞争性结合人PD-L1和人TIGIT，或与前面任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体结合相同表位。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包含前面任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体。
在一些实施方案中，如上任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体或抗原结合分子，其具有以下特性中的至少一种：
A.能与人PD-L1特异性结合；在一些实施方案中，能以≤10nM(例如，≤5nM、≤4.50nM、≤3.00nM、≤2.50nM、≤2.00nM、≤1.00nM或更小)的EC50值与CHO-PDL1细胞结合，其中，所述EC50值通过流式细胞分析法测定；在一些实施方案中，所述EC50值通过本公开实施例2方法测定；
B.能与人TIGIT特异性结合；在一些实施方案中，其能以≤10nM(例如，≤6nM、≤5.50nM、≤3.00nM、≤2.00nM、≤1.00nM、≤0.9nM、≤0.8nM、≤0.7nM、≤0.6nM、≤0.5nM、≤0.4nM、≤0.3nM、≤0.2nM、≤0.1nM、≤0.05nM、≤0.01nM或更小)的EC50值与CHO-TIGIT细胞结合，其中，所述EC50值通过流式细胞分析法测定；在一些实施方案中，所述EC50值通过本公开实施例2方法测定；
C.能阻断人PDL1与人PD1蛋白结合；在一些实施方案中，其能以≤10nM(例如，≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤3nM、≤1nM、≤1nM、≤0.5nM、≤0.1nM、≤0.01nM或更小)的IC50值阻断PD1与CHO-PDL1结合，其中，所述IC50值通过流式细胞分析法测定；在一些实施方案中，所述IC50值通过本公开实施例3方法测定；
D.能阻断人TIGIT与人PVR结合结合；在一些实施方案中，其能以≤10nM(例如，≤5nM、≤4.50nM、≤3.00nM、≤2.00nM、≤1.00nM、≤0.9nM、≤0.8nM、≤0.7nM、≤0.6nM、≤0.5nM、≤0.4nM、≤0.3nM、≤0.2nM、≤0.1nM、≤0.05nM、≤0.01nM或更小)的IC50值阻断PVR与CHO-TIGIT结合，其中，所述IC50值通过流式细胞分析法测定；在一些实施方案中，所述IC50值通过本公开实施例4方法测定；
E.能阻断人PDL1与人CD80蛋白结合；在一些实施方案中，其能以≤10nM(例如，≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤3nM、≤1nM、≤1nM、≤0.5nM、≤0.1nM、≤0.01nM或更小)的IC50值阻断CD80与CHO-PDL1结合，其中，所述IC50值通过流式细胞分析法测定；在一些实施方案中，所述IC50值通过本公开实施例5方法测定；
F.能促进T细胞分泌细胞因子；在一些实施方案中，所述细胞因子为IL2；在一些实施方案中，所述IL2通过本公开实施例7方法测定；或
G.能抑制肿瘤增长；
在一些实施方案中，本公开公开一种分离的核酸分子，其编码如上任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体或抗原结合分子。
在一些实施方案中，本公开公开一种载体，其含前述的核酸分子。
在一些实施方案中，本公开公开一种细胞，其含如上任一项所述的核酸分子或载体。
在一些实施方案中，本公开公开一种药物组合物，其包含如上任一项所述所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体、抗原结合分子、核酸分子、载体或细胞；在一些实施方案中，其还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，本公开公开如上任一项所述所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体、抗原结合分子、核酸分子、载体、细胞或药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。在一些实施方案中，所述肿瘤为人PD-L1表达异常相关疾病；在一些实施方案中，所述肿瘤为人TIGIT表达异常相关疾病。在一些实施方案中，所述肿瘤为人PD-L1高表达相关肿瘤。
在一些实施方案中，本公开提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的前面任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体、抗原结合分子、核酸分子、载体、细胞或药物组合物的步骤。在一些实施方案中，所述肿瘤为人PD-L1表达异常的相关疾病；在一些实施方案中，所述肿瘤为人TIGIT表达异常的相关疾病。在一些实施方案中，所述肿瘤为人PD-L1高表达相关肿瘤。
在另一个方面，本公开还提供用作药物的前述任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体、抗原结合分子、核酸分子、载体、细胞或药物组合物。在一些实施方案中，药物用于治疗肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤为人PD-L1表达异常相关疾病；在一些实施方案中，所述肿瘤为人TIGIT表达异常相关疾病。在一些实施方案中，所述肿瘤为人PD-L1高表达相关肿瘤。
在一些实施方案中，前面任一项所述的治疗，进一步包括向受试者施用另外的治疗药物。
在一些实施方式中，前面任一项所述的疾病，其为PD-L1和/或TIGIT介导的疾病；在一些实施方式中，所述疾病为肿瘤；在一些实施方式中，为高表达PD-L1的肿瘤。在一些实施方式中，所述的肿瘤包括但不限于黑素瘤癌、肾癌、肺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌、头或颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、阴道癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、前列腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，膀胱癌、输尿管癌、中枢神经系统肿瘤、神经胶质瘤、垂体腺瘤、脑肿瘤。
本公开还提供一种检测或测定人PD-L1和TIGIT的方法，所述方法包括使用如前任一项所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体或抗原结合分子的步骤。
本公开还提供一种试剂盒，其包含如前任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体或抗原结合分子；在一些实施方案中，所述试剂盒用于检测或测定人PD-L1和TIGIT。
本公开还提供了一种制备如前任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体或抗原结合分子的方法，其包括培养如前任一项所述的细胞，然后分离和纯化获得抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体或抗原结合分子的步骤。
本公开公开的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体或抗原结合分子能够特异性结合人PD-L1和TIGIT；在一些实施方案中，所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体在体外和体内展示良好的抗肿瘤活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明本公开实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明本公开的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为双特异性抗体结构示意图；
图2为双特异性抗体与CHO-PDL1细胞的结合活性检测结果图；
图3为双特异性抗体与CHO-TIGIT细胞的结合活性检测结果图；
图4为双特异性抗体对PD1/PDL1阻断活性检测结果图；
图5为双特异性抗体对TIGIT/PVR阻断活性检测结果图；
图6为双特异性抗体对CD80/PDL1阻断活性检测结果图；
图7为双特异性抗体Jurkat-hTIGIT和CHO-hPDL1细胞交联检测结果图；
图8为双特异性抗体对PBMC释放IL-2影响检测结果图；
图9为双特异性抗体Jurkat-hTIGIT和CHO-hPDL1细胞交联检测结果图；
图10为双特异性抗体体内肿瘤抑制实验结果图。
具体实施方式
为使本公开实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但是描述和实施例不应被解释为限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
本公开中，所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。另外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。术语“多个”的含义是至少两个，例如2个、3个、4个等，除非另有明确具体的限定。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物或氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸；常见的天然氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝胺酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
在本公开中，术语“抗体”在最广义上使用，该术语涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等)、鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全长抗体或其抗原结合片段(或称抗原结合部分)，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。
“天然抗体”指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个重链可变区(VH，又称作可变重域)，接着是重链恒定区(CH)，天然IgG重链恒定区通常包括三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个轻链可变区(VL，又称作可变轻域)，接着是一个轻链恒定区(CL，也称轻链恒定域)。
术语“全长抗体”或“完整抗体”指包含与天然抗体结构基本类似的结构的抗体，或重链包含Fc区的抗体。
术语“双特异性抗体”指能够对两个不同抗原或同一抗原的至少两个不同抗原表位特异性结合的抗体(包括抗体或其抗原结合片段，如单链抗体)。现有技术已公开了各种结构的双特异性抗体，根据IgG分子的完整性可分为IgG样双特异性抗体和抗体片段型双特异性抗体，根据抗原结合区域的数量可分为二价、三价、四价或更多价的双特异性抗体，根据结构左右是否对称可分为对称结构双特异性抗体和不对称结构双特异性抗体。其中，基于抗体片段的双特异性抗体，例如缺乏Fc片段的Fab片段，其通过将2个或多个Fab片段结合在一个分子中形成双特异性抗体，其具有较低的免疫原性，且分子量小，具有较高的肿瘤组织渗透性，该类型的典型的抗体结构如F(ab)2、scFv-Fab、(scFv)2-Fab等双特异性抗体；IgG样双特异性抗体(例如具有Fc片段)，这类抗体相对分子量较大，Fc片段有助于抗体后期的纯化，并提高其溶解性、稳定性，Fc部分还可能会与受体FcRn结合，增加抗体血清半衰期，典型的双特异性抗体结构模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、FcΔAdp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2:1TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等双特异性抗体(参见Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discoveryvolume18，pages585–608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019Feb 11；2019:4516041)。本公开中，“抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体”是能够对PD-L1和TIGIT两个抗原特异性结合的抗体。
术语抗体“可变区”指抗体重链或轻链中涉及抗体结合抗原的区域。抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)各包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。本文中，“特异性结合PDL1的抗原结合域”是包含抗PDL1抗体可变区的抗体的部分，特异性结合PDL1的抗原结合域中的重链可变区标示为P-VH，轻链可变区标示为P-VL；在一些实施方式中，抗PDL1抗体可变区参见国际专利申请PCT/CN2022/121054中的抗PDL1抗体的可变区(例如176L6H5的轻重链可变区)，本公开通过引用将PCT/CN2022/121054全文并入本公开。“特异性结合TIGIT的抗原结合域”是包含抗TIGIT抗体可变区的抗体的部分，特异性结合TIGIT的抗原结合域中的重链可变区标示为T-VH，轻链可变区标示为T-VL；在一些实施方式中，抗TIGIT抗体可变区参见国际专利申请PCT/CN2022/120984中的抗TIGIT抗体的可变区(例如15H10L3的轻重链可变区)，本公开通过引用将PCT/CN2022/120984全文并入本公开。
术语“互补决定区”或“CDR”指可变区内主要促成与抗原特异性结合的区域；“框架”或“FR”是指除CDR残基之外的可变结构域残基。VH包含3个CDR区：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3个CDR区：LCDR1、LCDR2和LCDR3。每个VH和VL由从氨基末端(也称N末端)排到羧基末端(也称C末端)按以下顺序排列的3个CDR和4个FR构成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在本公开具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链中2个以上CDR。可以通过各种公知方案来确定CDR的氨基酸序列边界，例如：“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则、“ABM”编号规则、“contact”编号规则(参见Martin,ACR.Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003))等；各种编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。
术语“抗原结合片段”“抗原结合域”指包含完整抗体的部分的分子，所述部分能够与完整抗体所结合的抗原特异性结合。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv(由VH和VL组成)、Fab(由一条轻链和一条重链的恒定区1(CH1)及重链可变区组成)、Fab'(由Fab区和铰链区组成)、Fab'-SH(Fab'片段的铰链区的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团)、(Fab')2(二聚化Fab')、scFv(单链抗体分子，由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过连接子连接，例如VH-Linker-VL或VL-Linker-VH)、scFab(单链Fab)、dsFv(二硫键稳定化的Fv片段)、(dsFv)2(二聚化dsFv)，以及由抗体结合片段形成的多特异性抗体。
术语“Fc区”用于定义抗体重链的C末端区域，包括天然Fc区和改造的Fc区。在一些实施方式中，用于本文所述抗体的Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2a、IgG2b)、IgG3和IgG4的Fc区。在一些实施方式中，Fc区为包含DLE突变的人IgG1。在一些实施方式中，Fc区的边界还可以变化，例如缺失Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)或缺失Fc区的C末端甘氨酸和赖氨酸(根据EU编号系统的残基446和447)。除非另有说明，Fc区的编号规则为EU编号系统，又称作EU索引。在一些实施方式中，Fc区的C末端赖氨酸残基(K)突变成丙氨酸(A)，以减少融合蛋白的切割水解。
术语“嵌合抗体”指抗体中，其中重链和/或轻链的一部分源自一种物种，而重链和/或轻链的其它部分源自另外物种。
术语“人源化抗体”是保留非人抗体的反应性，同时在人中具有较低免疫原性的抗体。例如，可以通过保留非人CDR区，其余部分用人源抗体对应物(即，恒定区以及可变区的框架区部分)替换来实现。
术语“人抗体”、“人源抗体”、“全人抗体”、“完全人抗体”可以互换使用，意指可变区及恒定区是人序列的抗体。
术语“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合部位与其结合配体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总体的强度。除非另外指明，如本文所用，结合“亲和力”是指内部结合亲和力，其反映出结合对(例如，抗体与抗原)的成员之间1:1相互作用。分子X对其配体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量。术语“kassoc”或“ka”指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，术语“kdis”或“kd”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。术语“KD”指解离常数，其获得自kd与ka的比率(即kd/ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公知的方法测定抗体的KD值。例如，使用生物传感系统例如系统测量表面等离子体共振(例如Biacore)，或通过溶液平衡滴定法(SET)测量溶液中的亲和力。
术语“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列突变的Fc区)的生物学活性。抗体效应子功能的例子包括但不限于：C1q结合和补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
术语“单克隆抗体”指基本上均质的抗体的群，即在该群中包含的抗体分子的氨基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突变以外。相比之下，多克隆抗体制剂通常包含在其可变结构域具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，其通常特异性针对不同表位。“单克隆”表示从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。在一些实施方式中，本公开提供的抗体是单克隆抗体。
术语“抗原”是指能够由抗原结合蛋白(例如抗体)选择性结合剂结合的分子。抗原可具有一个或多个能够与不同的抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用的表位。
术语“表位”指能够与抗体特异性结合的抗原上的区域(area或region)。表位可以由连续氨基酸串(线性表位)形成或包含非连续氨基酸(构象表位)，例如因抗原的折叠(即通过蛋白质性质的抗原的三级折叠)而变成空间接近。构象表位和线性表位的差别在于：在变性溶剂的存在下，抗体对构象表位的结合丧失。构象表位包含处于独特空间构象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10个氨基酸。筛选结合特定表位的抗体(即那些结合相同表位的)可以使用本领域常规方法来进行，例如丙氨酸扫描，肽印迹，肽切割分析，表位切除，表位提取，抗原的化学修饰(见Prot.Sci.9(2000)487-496)，和交叉阻断。
与参照抗体结合相同表位的抗体或与参照抗体竞争结合的抗体意指在竞争测定法中，将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，或其对抗原的结合被参照抗体阻断50％或更多的抗体。例如，为了测定待测抗体是否与参照抗体结合相同表位，在饱和条件下容许参照抗体结合抗原，然后在去除过量的参照抗体后，评估待测抗体结合抗原的能力；如果该待测抗体能够在参照抗体的饱和结合之后结合抗原，那么可以得出结论，该待测抗体与参照抗体结合不同表位；而如果该待测抗体在参照抗体的饱和结合之后不能够结合抗原，那么该待测抗体可结合与参照抗体结合相同的表位。为了确认待测抗体是否结合相同表位，可以使用常规实验(例如，肽突变和使用ELISA、RIA、表面等离子共振、流式细胞术或本领域可获得的任何其它定量或定性抗体结合测定的结合分析)检测。在一些实施方案中，如在竞争性结合测定中所测量的(参见例如，Junghans等，Cancer Res.50(1990)1495-1502)，如果一个过量(例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍)的抗体抑制另一个抗体与抗原的结合至少50％、至少75％、至少90％或甚至99％或更多，则可以认为两个抗体结合相同或重叠的表位。
术语“能够特异性结合”、“特异性结合”或“结合”是指相比其他抗原或表位，抗体能够以更高的亲和力结合至某个抗原或该抗原内的表位。通常地，抗体以约100nM或更小(例如约10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或抗原内的表位。在一些实施方式中，抗体与抗原结合的KD为该抗体结合至非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10％或更低(例如1％)。可使用已知的方法来测量KD，包括但不限于Biacore测定法、Octet方法、微量热泳法、HPLC-MS方法和流式细胞荧光分选技术。
本公开提供的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体与人PD-L1和TIGIT的结合也可以用“半最大有效浓度”(EC50)值表示，一般EC50越小亲和力越好，表示更低的浓度下即可以与抗原结合。可以通过本领域已知的结合检测法，例如直接或间接结合检测法(例如酶联免疫吸附检测法(ELISA)、流式细胞荧光分选技术和其他结合检测法)来测定EC50值。
术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被靶细胞与具有裂解活性的效应细胞(诸如自然杀伤细胞(NK)、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)发生的相互作用。例如，NK细胞表达FcγRIIIa，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa。本文提供的抗体的ADCC活性可使用体外测定，使用表达抗原的细胞作为靶细胞和NK细胞作为效应细胞进行评定。根据从裂解的细胞中释放的标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白)来检测细胞裂解。
术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“ADCP”)是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的Fc效应域结合并激活补体成分C1q，C1q继而激活补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的激活也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)来促进CDC。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。编码多肽或融合蛋白的分离的核酸指编码多肽或融合蛋白的一个或更多个核酸分子，包括在单一载体或分开的载体中的这样的一个或更多个核酸分子，和存在于宿主细胞中一个或更多个位置的这样的一个或更多个核酸分子。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，如下详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语序列“同一性”指，当对两条序列进行最佳比对时(必要时引入间隙，以获取最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分)，两条序列的氨基酸/核酸在等价位置相同的程度(百分比)。为测定序列同一性百分比，比对可以通过本领域技术已知的技术来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接附加的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体(AAV或AAV2)，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。术语“表达载体”或“表达构建体”是指可对宿主细胞进行转化，且含有指导和/或控制(连同宿主细胞一起)与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译且在存在内含子时影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞包括原核和真核宿主细胞，其中真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞系植物细胞和真菌细胞。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞和HEK-293细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、海藻毕赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(Pichia koclamae)、膜状毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母(Pichiaopuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酿酒酵母属、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、勒克氏菌(Chrysosporium lucknowense)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusarium gramineum)、菜镰刀菌(Fusariumvenenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。毕赤酵母属、任何酿酒酵母属、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、任何克鲁维酵母属、白色念珠菌(Candida albicans)、任何曲霉属、里氏木霉(Trichoderma reesei)、勒克霉菌(Chrysosporium lucknowense)、任何镰刀菌属、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。
如在本申请中所使用的，“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，并且所有这样的名称均包括子代。词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来源于其的培养物，而与传代的次数无关。还应理解的是，由于有意或无意的突变，使得并非所有子代均具有完全相同的DNA内容物。包括与筛选出其的原始转化细胞具有相同功能或生物活性的突变子代。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述的抗体等活性成分与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。
术语“药学上可接受的载体”指药学配制剂中与活性成分不同的成分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“受试者”或“个体”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类(例如，食蟹猴)、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。如本文所使用的，术语“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“施用”或“给予”，当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。
术语“样本”是指从受试者分离的类似流体、细胞、或组织的采集物，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本为生物流体，诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等，组织活检样本、细针穿刺、手术切除的组织、器官培养物或细胞培养物。
“治疗(treatment或treat)”指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本公开的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
“有效量”一般是足以降低症状的严重程度及/或频率、消除这些症状及/或潜在病因、预防症状及/或其潜在病因出现及/或改良或改善由疾病状态引起或与其相关的损伤(例如肺病)的量。在一些实施例中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以治疗疾病状态或症状、尤其与该疾病状态相关的状态或症状，或者以其他方式预防、阻碍、延迟或逆转该疾病状态或以任何方式与该疾病相关的任何其他不理想症状的进展的量。“预防有效量”是当给予受试者时将具有预定预防效应，例如预防或延迟该疾病状态的发作(或复发)，或者降低该疾病状态或相关症状的发作(或复发)可能性的量。完全治疗或预防效未必在给予一个剂量之后便发生，可能在给予一系列剂量之后发生。因而，治疗或预防有效量可以一次或多次给予的方式给予。“治疗有效量”和“预防有效量”可取决于多种因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括例如患者改善的健康状况。
在本公开公开了抗体的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员可以采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本公开的抗体，其均属于本公开的保护范围。
除非另外指明，否则实践本公开将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用并入本文中。
以下结合实施例对本公开的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1.双特异性抗体的制备
采用抗TIGIT抗体(R0774)的重链可变区和轻链可变区构建的scFv作为双特异性抗体中特异性结合人TIGIT的部分，其与特异性人PDL1的抗体R0919以不同的结构融合(参见附图1)，示例性地，连接序列为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：29)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：30)。
对于融合蛋白采用瞬时或稳定转染的标准方案，用位于相同表达载体或分开的表达载体中的编码轻链的DNA和编码重链的DNA来转染哺乳动物细胞。将构建表达的质粒瞬时转染人胚肾HEK 293细胞，分离纯化细胞产生的双特异性抗体，其在非还原条件下于SDS-PAGE上的条带分子量约为170kD和203kD。
表1.抗体可变区序列表
表2.抗体CDRs序列表
备注：上述表2所述抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根据Kabat编码系统确认。
抗体重链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：27):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗体轻链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO：28):
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
示例性地，抗体全长氨基酸序列如下：
R0774重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
R0774轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQ
GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG
LSSPVTKSFNRGEC
R0919重链链的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)：
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYWNWIRKPPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRA
WIRTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY
ICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
R0919轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)：
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPDQSPKLLIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFG
QGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ
GLSSPVTKSFNRGEC
R1155重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQ
GTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTST
AYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYWNWIRK
PPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRAWIRTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG
GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK
R1155轻链的氨基酸序列同R0919轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)
R1156重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIH
DYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGS
GTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYWNWIRK
PPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRAWIRTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG
GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK
R1156轻链的氨基酸序列同R0919轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)
R1157重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)：
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYWNWIRKPPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRA
WIRTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY
ICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFT
SYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG
GGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRT
FGQGTKLEIK
R1157轻链的氨基酸序列同R0919轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)
R1158重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)：
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYWNWIRKPPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRA
WIRTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY
ICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIY
SNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSG
AEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYW
GQGTLVTVSS
R1158轻链的氨基酸序列同R0919轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)
R1159重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)：
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYWNWIRKPPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRA
WIRTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY
ICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMN
WVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDI
QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGT
KLEIK
R1159轻链的氨基酸序列同R0919轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)
R1160重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQ
GTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVD
KSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGEVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYW
NWIRKPPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRAWIRTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS
KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP
ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSPGK
R1160轻链的氨基酸序列同R0919轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)
实施例2.双特异性抗体与肿瘤细胞的结合活性测定(FACS)
本公开的双特异性抗体与相应细胞上的靶抗原结合。本公开CHO-PDL1细胞(表达人PDL1的CHO细胞)作为PDL1阳性细胞，CHO-TIGIT细胞(表达人TIGIT的CHO细胞)作为TIGIT阳性的细胞，并以本公开制备的双特异性抗体测定其与细胞结合活性。
1.利用流式分析法检测双特异性抗体与CHO-PDL1细胞的结合活性
培养足够的CHO-PDL1细胞，离心收集细胞。同时用PBS+3％FBS稀释双特异性抗体以及对应的单克隆抗体，浓度从200nmol开始，3倍梯度稀释，得到8个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+3％FBS洗一遍后加PBS+3％FBS重悬细胞至2×106个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔100μl(2×105个细胞)，加入100μl稀释好的抗体，4℃孵育30分钟；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的PE标记的抗人IgG FC抗体(Biolegend，409304)重悬细胞，4℃避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100μl PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism 7.0进行分析计算抗体与CHO-PDL1的结合亲和力EC50值。
实验结果见图2，结果表明本公开构建的双特异性抗体均与CHO-PDL1细胞有较好结合活性。
2.利用流式分析法检测双特异性抗体与CHO-TIGIT细胞的结合活性
培养足够的CHO-TIGIT细胞，离心收集细胞。接下来的实验过程与上述利用流式分析法检测双特异性抗体与CHO-PDL1细胞的结合活性实施例相同，用100μl PBS重悬细胞，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism 7.0进行分析计算抗体与CHO-TIGIT的结合亲和力EC50值。
实验结果见图3，实验结果表明，本公开的R1155、R1160具有较好TIGIT结合活性。
实施例3.双特异性抗体对PD1/PDL1阻断活性的测定(FACS)
我们检测了双特异性抗体对表达于CHO-PDL1细胞表面的PDL1与PD1蛋白结合的阻断情况。
培养足够的CHO-PDL1细胞，离心收集细胞。同时用PBS+3％FBS稀释双特异性抗体以及对应的单克隆抗体，浓度从200nmol开始，3倍梯度稀释，得到8个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+3％FBS洗一遍后加PBS+3％FBS重悬细胞至2×106个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔100μl(2×105个细胞)，加入50μl稀释好的抗体，4℃孵育30分钟，之后再加入50μl的1.2ug/ml的PD1-mFc抗原，4℃孵育30分钟；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的PE标记的抗鼠IgG FC抗体(Biolegend，405307)重悬细胞，4℃避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100μl PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism7.0进行分析计算抗体阻断Raji-PDL1与PD1结合的IC50值。
实验结果见图4所示，所有分子均可较好阻断PD1与CHO-PDL1结合。
实施例4.双特异性抗体对TIGIT/PVR阻断活性的测定(FACS)
我们检测了双特异性抗体对表达于CHO-TIGIT细胞表面的TIGIT抗原与PVR结合的阻断情况。
培养足够的CHO-TIGIT细胞，离心收集细胞。同时用PBS+3％FBS稀释双特异性抗体以及对应的单克隆抗体，浓度从200nmol开始，3倍梯度稀释，得到8个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+3％FBS洗一遍后加PBS+3％FBS重悬细胞至2×106个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔100μl(2×105个细胞)，加入50μl稀释好的抗体，4℃孵育30分钟，之后再加入50μl的40ug/ml的PVR-mFc(人PVR的ECD的C端连接鼠mFc)，4℃孵育30分钟；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的PE标记的抗鼠IgG FC抗体(Biolegend，405307)重悬细胞，4℃避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100μl PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism 7.0进行分析计算抗体阻断TIGIT与PVR结合的IC50值。
实验结果见图5所示，R1155以及R1160具有较好阻断PVR与TIGIT结合活性。
实施例5.双特异性抗体对CD80/PDL1阻断活性的测定(FACS)
我们检测了双特异性抗体对表达于CHO-PDL1细胞表面的PDL1与CD80蛋白结合的阻断情况。
培养足够的CHO-PDL1细胞，离心收集细胞。同时用PBS+3％FBS稀释双特异性抗体以及对应的单克隆抗体，浓度从200nmol开始，3倍梯度稀释，得到8个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+3％FBS洗一遍后加PBS+3％FBS重悬细胞至2×106个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔100μl(2×105个细胞)，加入50μl稀释好的抗体，4℃孵育30分钟，之后再加入50μl的96ug/ml的CD80-mFc(人CD80 ECD的C末端连接鼠mFc)抗原，4℃孵育30分钟；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的PE标记的抗鼠IgG FC抗体(Biolegend，405307)重悬细胞，4℃避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100μl PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPadPrism7.0进行分析计算抗体阻断CHO-PDL1与CD80结合的IC50值。
实验结果见图6所示，所有分子均可阻断CD80与CHO-PDL1结合
实施例6.双特异性抗体交联两种细胞活性的测定(FACS)
我们检测了双特异性抗体R1155、R1160以及对应单抗将两种细胞交联到一起的活性。
培养足够的Jurkat-TIGIT(表达人TIGIT的Jurkat细胞，J-Tigit)和CHO-PDL1细胞，离心收集细胞，同时用DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)稀释双特异性抗体以及对应的单克隆抗体，浓度为20nmol。将收集的细胞用DPBS洗一遍后，分别用CFSE(BD Bioscience，565082)和CellTraceTMViolet(Thermo Fisher，C34557)标记细胞，之后用DPBS洗两遍，并调整细胞密度为2×106个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每种细胞每孔50μl(1×105个细胞)，加入100μl稀释好的抗体，室温避光孵育1小时。重悬后上机检测，展示FITC+PB450-、FITC-PB450+，以及FITC+PB450+所占百分比。
实验结果见图7所示，双特异性抗体R1155、R1160均能较好将两种细胞交联到一起。
实施例7.双特异性抗体在超抗原刺激下的PBMC活性调控
检测双特异性抗体在超抗原刺激下的PBMC活性调控。
抽取人静脉血，使用Ficoll淋巴分离液获得PBMC细胞，离心后用完全培养基调整细胞密度为1×106个细胞/ml，之后按照终浓度为400ng/mL加入SEB，混匀后备用，同时用完全培养基稀释双特异性抗体以及对应的单克隆抗体，浓度从20nmol开始，6倍梯度稀释，得到6个浓度梯度，备用。将含SEB的细胞铺板于96孔板中，每孔100μl(1×105个细胞)，加入100μl稀释好的抗体，将培养基置于37℃二氧化碳培养箱中孵育3天。孵育结束后，用细胞因子检测试剂盒(Invitrogen，88-7025-88)检测上清中IL2的浓度。
实验结果如图8所示，R1155以及R1160能促进PBMC释放IL-2。
实施例8.双特异性抗体的T细胞调控活性
用混合淋巴反应来测定双特异性抗体对T细胞免疫反应的调控活性。
人树突状细胞(DC)的获取：抽取人静脉血分离PBMC，用Human CD14 MicroBeads(Miltenyi，130-050-201)分离单核细胞，加入50ng/ml GM-CSF和50ng/ml IL4孵育3天，换液，继续孵育3天，换液，加入50ng/ml TNFα，再孵育3天。即得DC细胞。
人T细胞的获取：抽取人静脉血分离PBMC，用T细胞分离试剂盒(Stemcell，19051)分离人CD3 T细胞。
将收集到的来自不同人的DC细胞和T细胞重悬于完全培养基中，接种于96孔板，接种的DC细胞和T细胞分别为1×104/孔和1×105/孔，混合培养。并加入用完全培养基稀释的双特异性抗体以及对照。将培养基置于37℃二氧化碳培养箱中孵育。孵育3天后，用细胞因子检测试剂盒(Invitrogen，88-7025-88)检测上清中IL2的浓度，孵育5天后用细胞因子检测试剂盒(Invitrogen，88-7316-88)检测上清中IFN-γ的浓度。
实验结果见图9所示，本公开的双特异性抗体R1160的IL-2优于R1155及单抗R0919。
实施例10：双特异性抗体对鼠结肠癌细胞MC38-hPDL1的体内抗肿瘤药效评价
C57BL/6-hPD-1/hPD-L1/hTIGIT小鼠，雌性，6-8周(购自百奥赛图)；MC38-hPDL1细胞(MC38购自国家实验细胞资源共享平台，敲除MC38的鼠PDL1基因，并进一步构建表达人PDL1的MC38细胞)；RPMI-1640培养基(Gibco)，FBS(Gibco,10091-148)，0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco,25200056)，青霉素-链霉素(Gibco,15140122)，DMSO(Sigma,D2650)，DPBS(Hyclone,SH30028.02)
实验方法
将MC38敲除鼠PDL1，并敲入人PDL1，得到高表达人PDL1的小鼠结肠癌细胞MC38-hPDL1，培养在含有10％胎牛血清(Gibco)、1％青霉素-链霉素(1:1)的RPMI1640培养基(Gibco)中；然后收集对数生长期的MC38-hPDL1细胞，对雌性C57BL/6-hPD-1/hPD-L1/hTIGIT小鼠皮下接种MC38-hPDL1细胞(接种体积为0.1mL/小鼠，1*106/小鼠)，在肿瘤接种第11天，将小鼠按瘤体积随机分为4组(每组7只，每组小鼠的平均瘤体积相同或相近)，并将R1155抗体通过腹腔注射给药，同时以溶剂对照组作为阴性对照，以R0774、R0919为阳性对照，给药方案见表3。
表3.肿瘤模型给药方案表
备注：R1155 6.9mg/kg与5mg/kg的R0919或R0774的摩尔数相同，i.p.表腹腔给药，BIW*3表示每周给药2次，给药3周
D11开始测量肿瘤体积并记录，之后每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。以公式：(1/2)X长径X(短径)2计算肿瘤体积，同时每周2次检测小鼠体重。每只小鼠达到实验终点时(体重下降超20％或肿瘤体积超过2000mm3达到仁慈终点)，CO2窒息法处死小鼠。
肿瘤生长抑制TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，Ti为第i天治疗组的平均瘤体积，T0为治疗开始时治疗组的平均瘤体积，Vi为第i天溶剂对照组的平均瘤体积，V0为治疗开始时溶剂对照组的平均瘤体积。
实验结果见表4和附图10，实验结果表明R1155抗体的抗肿瘤作用明显优于抗人PDL1单抗R0919和抗TIGIT单抗R0774。另外，小鼠体重检测结果表明，各个给药组对小鼠体重无影响。
表4.抗体抑制肿瘤生长实验结果表
组别 肿瘤生长抑制(TGI,％)
Isotype /
R0919 13.2
R0774 -6.1
R1155 54.6
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其包含特异性结合PD-L1的第一抗原结合域和特异性结合TIGIT的第二抗原结合域，其中，
A)所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域包含重链可变区P-VH和轻链可变区P-VL，其中，所述重链可变区P-VH包含SEQ ID NO：3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区P-VL包含SEQ ID NO：4中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；和/或
B)所述特异性结合TIGIT的第二抗原结合域包含重链可变区T-VH和轻链可变区T-VL，其中，所述重链可变区T-VH包含SEQ ID NO：1中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述轻链可变区T-VL包含SEQ ID NO：2中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，所述抗体为鼠源抗体，嵌合抗体或人源化抗体；
可选地，所述抗体为人源化抗体。
3.根据权利要求1或2所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3由IMGT编号系统定义，或由Kabat编号系统定义，或由Chothia编号系统定义，或由Contact编号系统定义，或由AbM编号系统定义；
可选地，所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域中，其中，所述重链可变区P-VH的HCDR1包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，和所述轻链可变区P-VL的LCDR1包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；
可选地，所述重链可变区P-VH包含与SEQ ID NO：3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区P-VL包括与SEQ ID NO：4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
可选地，所述重链可变区P-VH包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和所述轻链可变区P-VL包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，所述特异性结合TIGIT的第二抗原结合域中，其中，所述重链可变区T-VH的HCDR1包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，和所述轻链可变区T-VL的LCDR1包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；
可选地，所述重链可变区T-VH包含与SEQ ID NO：具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区T-VL包括与SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
可选地，所述重链可变区T-VH包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，和所述轻链可变区T-VL包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其包括重链恒定区和轻链恒定区；
可选地，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ或λ链恒定区；可选地，所述恒定区的种属来源为鼠或人；
可选地，所述重链恒定区包括与SEQ ID NO：27具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区包括与SEQ ID NO：28具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；可选地，所述抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体包含SEQ ID NO：27所示的重链恒定区和SEQ IDNO：28所示的轻链恒定区；
可选地，所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其中，I)所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域包含抗体重链恒定区CH和轻链恒定区CL，重链可变区P-VH的C端与重链恒定区CH的N端连接，轻链可变区P-VL的C端与轻链恒定区CL的N端连接；或者II)所述特异性结合TIGIT的第二抗原结合域包含抗体重链恒定区CH和轻链恒定区CL，重链可变区T-VH的C端与重链恒定区CH的N端连接，轻链可变区T-VL的C端与轻链恒定区CL的N端连接；
可选地，I)所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域包括与SEQ ID NO：19具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链，和SEQ ID NO：20具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链；或者II)所述特异性结合TIGIT的第二抗原结合域包括与SEQ ID NO：17具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链，和与SEQ ID NO：18具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链；可选地，所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域包括SEQ ID NO：19所示的重链和SEQ ID NO：20所示的轻链；
可选地，所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，其中所述特异性结合PD-L1的第一抗原结合域为全长抗体，其包含重链可变区P-VH和重链恒定区CH，以及轻链可变区P-VL和轻链恒定区CL；所述特异性结合TIGIT的第二抗原结合域为scFv抗原结合片段，其包括重链可变区T-VH和轻链可变区T-VL；
可选地，所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体包括两条具有式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链，
(b)[P-VL]-[CL]；
(a)[T-VL]-[L1]-[T-VH]-[L2]-[P-VH]-[CH]，
[T-VH]-[L1]-[T-VL]-[L2]-[P-VH]-[CH]，
[P-VH]-[CH]-[L1]-[T-VL]-[L2]-[T-VH]，或
[P-VH]-[CH]-[L1]-[T-VH]-[L2]-[T-VL]；
式(a)中，连接子L1和L2优选为肽连接子；可选地，所述连接子L1和L2独立地选自(GxS)y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自0-6的整数；可选地，所述连接子为如SEQ ID NO：29或30所示连接子；
可选地，所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体第一链包括SEQ ID NO：21-26任一项所示的氨基酸序列，第二链包括SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体或权利要求8所述的抗原结合分子，其具有以下特性中的至少一种：
A.能与人PD-L1特异性结合；可选地，其能以≤10nM的EC50值与CHO-PDL1细胞结合，其中，所述EC50值通过流式细胞分析法测定；
B.能与人TIGIT特异性结合；可选地，其能以≤10nM的EC50值与CHO-TIGIT细胞结合，其中，所述EC50值通过流式细胞分析法测定；
C.能阻断人PDL1与人PD1蛋白结合；可选地，其能以≤10nM的IC50值阻断PD1与CHO-PDL1结合，其中，所述IC50值通过流式细胞分析法测定；
D.能阻断人TIGIT与人PVR结合结合；可选地，其能以≤10nM的IC50值阻断PVR与CHO-TIGIT结合，其中，所述IC50值通过流式细胞分析法测定；
E.能阻断人PDL1与人CD80蛋白结合；可选地，其能以≤10nM的IC50值阻断CD80与CHO-PDL1结合其中，所述IC50值通过流式细胞分析法测定；
E.能促进T细胞分泌细胞因子，可选地，所述细胞因子为IL2；或
F.能抑制肿瘤增长。
7.一种抗原结合分子，其与权利要求1至6任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体竞争性结合人PD-L1和人TIGIT，或与权利要求1至6任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体结合相同表位。
8.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至6任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体或编码权利要求7所述的抗原结合分子；
可选地，一种载体，其包含所述的核酸分子；
可选地，一种细胞，其包含所述的核酸分子或所述的载体。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1至6任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，权利要求7所述的抗原结合分子，权利要求8所述的核酸分子、载体或细胞；可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.如权利要求1至6任一项所述的抗PD-L1和TIGIT双特异性抗体，权利要求7所述的抗原结合分子，权利要求8所述的核酸分子、载体或细胞，或权利要求9所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用；
可选地，所述肿瘤为人PD-L1高表达相关肿瘤；
可选地，所述肿瘤选自黑素瘤癌、肾癌、肺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌、头或颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、阴道癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、前列腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，膀胱癌、输尿管癌、中枢神经系统肿瘤、神经胶质瘤、垂体腺瘤和脑肿瘤。
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