CN118226630A - 一种消逝场散射成像装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种消逝场散射成像装置，涉及全内反射荧光成像领域，包括发光机构、光纤、角度调节器、准直透镜、聚焦透镜、分光镜、全内反射物镜、遮挡光阑和成像机构，发光机构位于光纤的进口的一侧，角度调节器用于调节光纤的出口的角度，准直透镜、聚焦透镜和分光镜依次设置于光纤的出口的一侧，分光镜由上至下朝向靠近聚焦透镜的一侧倾斜设置，分光镜与水平面之间的夹角为45度，全内反射物镜设置于分光镜的上方，成像机构设置于分光镜的下方，分光镜与成像机构之间设置有遮挡光阑，遮挡光阑设置于分光镜靠近聚焦透镜一侧的下方。该消逝场散射成像装置提升了信噪比和空间分辨率，方便外加实验条件。

Description

一种消逝场散射成像装置

技术领域

本发明涉及全内反射荧光成像领域，特别是涉及一种消逝场散射成像装置。

背景技术

等离子体纳米颗粒因其出众的光学特性，例如高度光稳定性，抗光漂白性和抗闪烁性，在显微成像领域正在受到广泛研究和探索，有望成为传统荧光染料的出色替代品。此外，据报道，单个等离子体纳米颗粒的散射信号强度约强于单个荧光分子发射光信号强度的五个数量级以上。并且，一种名为局域表面等离子体共振的效应赋予等离子体纳米颗粒独特的光学特性。当等离子体纳米颗粒与光子接触时，其表面的自由电子与内部电子形成集体震荡，在特定的波长产生等离子体共振，并在该波长处表现出最大消光效应，即局域表面等离子体共振效应。当等离子体纳米颗粒在遇到特定物质时，会经历聚集或解聚集，或者形貌改变，以上变化过程都会伴随共振峰位置的敏感变化。因此，局域表面等离子体共振效应常被应用于特定物质分析。

检测局域表面等离子体共振峰的差异，目前常用的方法有紫外可见分光消光光谱法，但本方法主要有两个问题：一是当共振峰变化主峰移出光谱范围时，很难进行定量检测；二是此方法检测整体溶液的消光光谱变化，不能体现颗粒层级的细微变化，从而导致有时信噪比不足以进行定量检测。

另一种常见方法是暗场高光谱检测。但是，在传统的透射式暗场显微镜的结构里，样品需制备在载玻片和盖玻片中间，上下分别浸在镜油里接触高倍物镜及暗场聚光镜，不方便外加如给药、加热、光照等刺激，对于原位表征动态变化极为不利。对于传统反射式暗场成像装置，高倍物镜与样品之间工作距离亦小于1毫米，同样不便于外加刺激并且无法对于液体中的样品成像。并且，暗场高光谱全幅成像时间平均接近3分钟，对于捕捉动态反应极为不利。另外，虽然用于成像的物镜都是高倍数，但受限于原理，数值孔径一般在0.7以下，限制了空间分辨率。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提供一种消逝场散射成像装置，提升了信噪比和空间分辨率，方便外加实验条件。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种消逝场散射成像装置，包括发光机构、光纤、角度调节器、准直透镜、聚焦透镜、分光镜、全内反射物镜、遮挡光阑和成像机构，所述发光机构位于所述光纤的进口的一侧，所述角度调节器用于调节所述光纤的出口的角度，所述准直透镜、所述聚焦透镜和所述分光镜依次设置于所述光纤的出口的一侧，所述分光镜由上至下朝向靠近所述聚焦透镜的一侧倾斜设置，所述分光镜与水平面之间的夹角为45度，所述全内反射物镜设置于所述分光镜的上方，所述成像机构设置于所述分光镜的下方，所述分光镜与所述成像机构之间设置有所述遮挡光阑，所述遮挡光阑设置于所述分光镜靠近所述聚焦透镜一侧的下方。

优选地，还包括滤光片，所述滤光片设置于所述发光机构与所述光纤的出口之间。

优选地，还包括光阑，所述光阑设置于所述准直透镜和所述聚焦透镜之间。

优选地，所述发光机构包括外侧激发光源、第一反光镜和第二反光镜，所述第二反光镜设置于所述光纤的进口的上方，所述第一反光镜设置于所述第二反光镜的一侧，所述第二反光镜由上至下朝向远离所述第一反光镜的一侧倾斜设置，所述第一反光镜由上至下朝向远离所述第二反光镜的一侧倾斜设置，所述第一反光镜和所述第二反光镜与水平面之间的夹角均为45度，所述外侧激发光源设置于所述第一反光镜的下方。

优选地，所述发光机构还包括若干个中间发光组件，所述中间发光组件包括中间激发光源和二向色镜，所述二向色镜位于所述第一反光镜和第二反光镜之间，所述所述二向色镜与所述第一反光镜相平行，所述中间激发光源位于所述二向色镜的下方，所述中间激发光源的波长与所述外侧激发光源的波长不同。

优选地，所述角度调节器为电动角度调节器。

优选地，所述遮挡光阑为半圆形遮挡光阑，所述半圆形遮挡光阑的直线边的延伸方向与分光镜上的入射光和反射光所在的平面相垂直，所述半圆形遮挡光阑的直线边与散射光的光路圆心之间的距离为0～2mm。

优选地，还包括吸光部件，所述吸光部件设置于所述分光镜远离所述聚焦透镜的一侧。

优选地，所述成像机构包括由上至下依次设置的成像筒镜和成像相机。

优选地，所述成像相机为sCMOS相机。

本发明相对于现有技术取得了以下技术效果：

本发明的消逝场散射成像装置利用消逝场极薄的照明厚度，只照亮盖玻片上小于200纳米范围内的样品，完全抑制了非成像平面的背景，同时收集信号方向为照明方向的反向，亦极大压缩了有用信号的光程，令散射光信号不再经历样品溶液的进一步散射而直接进入检测光路，所以较紫外可见消光光谱法提升信噪比。本发明用于等离子体纳米颗粒散射成像，由于纳米颗粒远小于激发波长，故可以视为点光源，在光学系统中以点扩散函数形式被成像，因此可以直观地获得同一视野中具有不同局域表面等离子体共振峰的颗粒分布信息及相应的谱峰信息，更利于直接计算不同谱峰颗粒所占比例。本发明应用倒置显微镜成像，用于装载样品溶液的盖玻片上方完全开放，无任何必需配件，因此，方便外加实验条件的实施例如光照、药品、溶液、气体、加热等。本发明的有效数值孔径高于常用的暗场显微成像物镜的数值孔径，因此空间分辨率有提升。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的消逝场散射成像装置的结构示意图；

图2为本发明提供的消逝场散射成像装置中遮挡光阑的工作原理图；

图3为本发明提供的消逝场散射成像装置的消逝场散射信号采集及光源信号排除的原理示意图；

图4为采用遮挡光阑时成像机构所获得的成像示意图；

图5为本发明提供的消逝场散射成像装置采用遮挡光阑时成像机构所获得的成像示意图；

图6为图5中A处的局部放大图；

图7为本发明提供的消逝场散射成像装置采用405纳米激光时的成像示意图；

图8为本发明提供的消逝场散射成像装置采用488纳米激光时的成像示意图；

图9为本发明提供的消逝场散射成像装置采用561纳米激光时的成像示意图；

图10为本发明提供的消逝场散射成像装置采用647纳米激光时的成像示意图；

图11为本发明提供的消逝场散射成像装置采用四种激光耦合时的成像示意图；

图12为图11中B处的局部放大图；

图13为本发明提供的消逝场散射成像装置对纳米银胶体溶液进行消逝场散射成像单颗粒成像质量的初步评估时感兴趣区域的成像示意图；

图14为图13中C处的局部放大图；

图15为本发明提供的消逝场散射成像装置对纳米银胶体溶液进行消逝场散射成像单颗粒成像质量的初步评估时感兴趣区域的三维强度展示图；

图16为本发明提供的消逝场散射成像装置对纳米银胶体溶液进行消逝场散射成像单颗粒成像质量的初步评估时单颗粒在x和y方向上的信号强度曲线以及高斯拟合曲线图。

附图标记说明：1、外侧激发光源；2、第一反光镜；3、中间激发光源；4、二向色镜；5、第二反光镜；6、滤光片；7、光纤；8、角度调节器；9、准直透镜；10、光阑；11、聚焦透镜；12、分光镜；13、全内反射物镜；14、遮挡光阑；15、成像筒镜；16、成像相机；17、吸光部件；18、盖玻片；19、消逝场；20、入射光；21、反射光；22、散射光。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是提供一种消逝场散射成像装置，提升了信噪比和空间分辨率，方便外加实验条件。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

如图1-图3所示，本实施例提供一种消逝场散射成像装置，包括发光机构、光纤7、角度调节器8、准直透镜9、聚焦透镜11、分光镜12、全内反射物镜13、遮挡光阑14和成像机构，发光机构位于光纤7的进口的一侧，光纤7用于传输激光，角度调节器8用于调节光纤7的出口的角度，直接作用于光纤7的出口接口处，进而调节生成消逝场19的入射光20角度，准直透镜9、聚焦透镜11和分光镜12依次设置于光纤7的出口的一侧，准直透镜9用于准直同时扩大光束，焦距及距光纤7出口距离与光纤7数值孔径相匹配；聚焦透镜11用于聚焦准直激光束，焦点聚焦于物镜后焦面上。分光镜12由上至下朝向靠近聚焦透镜11的一侧倾斜设置，分光镜12与水平面之间的夹角为45度，即分光镜12与竖直设置的聚焦透镜11之间的夹角为45度，全内反射物镜13设置于分光镜12的上方，成像机构设置于分光镜12的下方，分光镜12与成像机构之间设置有遮挡光阑14，遮挡光阑14设置于分光镜12靠近聚焦透镜11一侧的下方。分光镜12用于将激光束导入全内反射物镜13，用于成像的散射光22信号可以透过分光镜12并最终达到成像机构上；全内反射物镜13用于生成消逝场19，并收集散射光22信号；遮挡光阑14用于生成消逝场19的反射光21的阻挡，使之不最终向下传递至成像机构而影响散射光22成像。

工作时，在全内反射物镜13的上部涂抹浸镜油之后放置盖玻片18，并在盖玻片18上方放置样品。发光机构发出的光通过光纤7照射到准直透镜9准直后，通过聚焦到物镜后焦面的聚焦透镜11，照射到分光镜12，一部分光源被反射进入全内反射物镜13，在全内反射物镜13的镜头处形成平行光束。通过角度调节器8调整入射光20角度，使之大于全内反射角，在样品水溶液和盖玻片18的界面上生成强度指数衰减的消逝场19，有效照明厚度<200纳米，激发样品产生散射光22信号，利用散射光22信号成像。消逝场19被样品散射，利用进入全内反射物镜13穿过分光镜12的散射光22对样品进行成像，而严重影响成像的高亮度反射光21被遮挡光阑14阻挡，无法进入成像机构，进而实现消逝场19散射成像。

本实施例中利用全内反射物镜13生成消逝场19并作为光源，因其本身极薄的照明厚度(<200纳米)，只照亮很薄一层样品，可以有效抑制非照明平面的信号，从而提高信噪比；并且使用全内反射物镜13作为消逝场19生成装置同时发挥成像功能，安装在倒置显微镜上，使全内反射物镜13上方空间完全开放，方便施加外部刺激如加药、光照、换液等。

本实施例用于等离子体纳米颗粒散射成像，由于纳米颗粒远小于激发波长，故可以视为点光源，在光学系统中以点扩散函数形式被成像，因此可以直观地获得同一视野中具有不同局域表面等离子体共振峰的颗粒分布信息及相应的谱峰信息，更利于直接计算不同谱峰颗粒所占比例。本实施例的有效数值孔径高于常用的暗场显微成像物镜的数值孔径，因此空间分辨率有提升。

本实施例中还包括滤光片6，滤光片6设置于发光机构与光纤7的出口之间，用于调节激光出射强度。

于本具体实施例中，滤光片6为中性密度滤光片。

本实施例中还包括光阑10，光阑10设置于准直透镜9和聚焦透镜11之间，用于调节光束直径大小。

本实施例中的分光镜12为百分比透射/反射分光镜，装于倒置显微镜的滤光块盒中，所选反射透射比例为70/30、50/50或30/70，依据实际实验选择。

具体地，发光机构包括外侧激发光源1、第一反光镜2和第二反光镜5，第二反光镜5设置于光纤7的进口的上方，第一反光镜2设置于第二反光镜5的一侧，第二反光镜5由上至下朝向远离第一反光镜2的一侧倾斜设置，第一反光镜2由上至下朝向远离第二反光镜5的一侧倾斜设置，第一反光镜2和第二反光镜5与水平面之间的夹角均为45度，外侧激发光源1设置于第一反光镜2的下方。

发光机构还包括若干个中间发光组件，中间发光组件包括中间激发光源3和二向色镜4，二向色镜4位于第一反光镜2和第二反光镜5之间，二向色镜4与第一反光镜2相平行，中间激发光源3位于二向色镜4的下方，中间激发光源3的波长与外侧激发光源1的波长不同。外侧激发光源1和中间激发光源3耦合后进入光纤7。

具体地，发光机构包括多个中间发光组件，多个中间激发光源3的波长和外侧激发光源1的波长互不相同。外侧激发光源1和多个由外至内依次设置的多个中间激发光源3的波长依次减小或依次增大。

于本具体实施例中，外侧激发光源1和中间激发光源3的波长均为400～700纳米。

本实施例中发光机构包括三个中间激发光源3，外侧激发光源1和多个由外至内依次设置的三个中间激发光源3分别为405纳米激光、488纳米激光、561纳米激光和647纳米激光。

本实施例中采用了用于耦合四种激光的第一反光镜2、第二反光镜5及二向色镜4，调正方向使四种激光同位置同方向出射。生成消逝波的激光光源为四色激光耦合，可分别激发样品，并对同一视野四色散射信号各自成像，从而实现对于不同的局域表面等离子体共振峰的区分，实现对于等离子体纳米颗粒出众光学特性的充分利用。

于本具体实施例中，角度调节器8为电动角度调节器，具有亚微米级移动分辨率，由电脑软件控制的伺服电机控制，用于调整入射光20角度生成消逝场19。

具体地，遮挡光阑14为半圆形遮挡光阑，半圆形遮挡光阑的直线边的延伸方向与入射光20和反射光21所在的平面相垂直，半圆形遮挡光阑的直线边与散射光22的光路圆心之间的距离为0～2mm，使得半圆形遮挡光阑的遮挡区域适宜。

于本具体实施例中，遮挡光阑14采用黑色吸光材料制作而成。半圆形遮挡光阑的直线边与散射光22的光路圆心之间的距离为1mm。

本实施例中还包括吸光部件17，吸光部件17设置于分光镜12远离聚焦透镜11的一侧。吸光部件17采用黑色吸光材料制作而成。

具体地，成像机构包括由上至下依次设置的成像筒镜15和成像相机16。成像筒镜15用于将无限远场校正全内反射物镜13的平行光束聚焦到成像相机16，焦距与所使用全内反射物镜13规格匹配；成像相机16用于将散射光22信号成像。

于本具体实施例中，成像相机16为sCMOS相机，通过应用sCMOS相机成像，时间分辨率可达毫秒级别，对比暗场高光谱线扫描模式分钟级别的时间分辨率有极大提升，更有利于动态反应的成像。

需要说明的是，本实施例中的sCMOS相机亦可替换成CCD、EMCCD等成像装置，不同的成像装置会影响成像速度、信号强度、信噪比、视野大小等参数。

本实施例中的遮挡光阑14可以遮住大部分用于生成消逝场19的被反射下来，通过分光镜12的光源激光束。若不加遮挡光阑14，则成像结果如图4所示，绝大多数散射光22信号被淹没在激光光斑中，完全不能达到散射光22成像的效果。应用遮挡光阑14，成像结果如图5所示，可见成像相机16中心部分的激发光束信号已完全被挡掉，取其中心575*575像素拍照，即获得消逝场散射光图像，成像结果如图6所示。本结果所用样品为纳米胶体银溶液，直径100纳米。

如图7-图10所示，其为利用本实施例采用405纳米激光、488纳米激光、561纳米激光、647纳米激光分别对纳米胶体银溶液进行成像的结果，因样品本身的非均一性及局域表面等离子体共振效应，不同颗粒之间对于四种光源相应不同，所以消逝场19散射成像在不同波长同一视野内可以展示单颗粒的另一维度，即光谱维度的信息，且颗粒图像展现高信噪比(大于20)。如图11所示，其为利用本实施例采用405纳米激光、488纳米激光、561纳米激光、647纳米激光耦合后对纳米胶体银溶液进行成像的结果，其成像结果的放大图如图12所示。

利用本实施例对纳米银胶体溶液进行消逝场散射成像单颗粒成像质量的初步评估，单颗粒在成像结果中以点扩散函数形式存在。如图13所示，为选取的感兴趣区域的成像图像，如图14所示，为进一步放大的感兴趣区域内进行后续分析的一个单颗粒成像图像，如图15所示，为选取的感兴趣区域的三维强度展示图，如图16所示，为单颗粒在x和y方向上的信号强度曲线以及高斯拟合曲线，曲线拟合r平方值均大于0.9，且半高峰宽相近，说明成像系统图像失真度低。根据半高峰宽数据计算，有效数值孔径可达1.2，高于传统暗场显微镜，进一步表明空间分辨率有所提升。

本说明书中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种消逝场散射成像装置，其特征在于，包括发光机构、光纤、角度调节器、准直透镜、聚焦透镜、分光镜、全内反射物镜、遮挡光阑和成像机构，所述发光机构位于所述光纤的进口的一侧，所述角度调节器用于调节所述光纤的出口的角度，所述准直透镜、所述聚焦透镜和所述分光镜依次设置于所述光纤的出口的一侧，所述分光镜由上至下朝向靠近所述聚焦透镜的一侧倾斜设置，所述分光镜与水平面之间的夹角为45度，所述全内反射物镜设置于所述分光镜的上方，所述成像机构设置于所述分光镜的下方，所述分光镜与所述成像机构之间设置有所述遮挡光阑，所述遮挡光阑设置于所述分光镜靠近所述聚焦透镜一侧的下方。

2.根据权利要求1所述的消逝场散射成像装置，其特征在于，还包括滤光片，所述滤光片设置于所述发光机构与所述光纤的出口之间。

3.根据权利要求2所述的消逝场散射成像装置，其特征在于，还包括光阑，所述光阑设置于所述准直透镜和所述聚焦透镜之间。

4.根据权利要求1所述的消逝场散射成像装置，其特征在于，所述发光机构包括外侧激发光源、第一反光镜和第二反光镜，所述第二反光镜设置于所述光纤的进口的上方，所述第一反光镜设置于所述第二反光镜的一侧，所述第二反光镜由上至下朝向远离所述第一反光镜的一侧倾斜设置，所述第一反光镜由上至下朝向远离所述第二反光镜的一侧倾斜设置，所述第一反光镜和所述第二反光镜与水平面之间的夹角均为45度，所述外侧激发光源设置于所述第一反光镜的下方。

5.根据权利要求4所述的消逝场散射成像装置，其特征在于，所述发光机构还包括若干个中间发光组件，所述中间发光组件包括中间激发光源和二向色镜，所述二向色镜位于所述第一反光镜和第二反光镜之间，所述所述二向色镜与所述第一反光镜相平行，所述中间激发光源位于所述二向色镜的下方，所述中间激发光源的波长与所述外侧激发光源的波长不同。

6.根据权利要求1所述的消逝场散射成像装置，其特征在于，所述角度调节器为电动角度调节器。

7.根据权利要求1所述的消逝场散射成像装置，其特征在于，所述遮挡光阑为半圆形遮挡光阑，所述半圆形遮挡光阑的直线边的延伸方向与入射光和反射光所在的平面相垂直，所述半圆形遮挡光阑的直线边与散射光的光路圆心之间的距离为0～2mm。

8.根据权利要求1所述的消逝场散射成像装置，其特征在于，还包括吸光部件，所述吸光部件设置于所述分光镜远离所述聚焦透镜的一侧。

9.根据权利要求1所述的消逝场散射成像装置，其特征在于，所述成像机构包括由上至下依次设置的成像筒镜和成像相机。

10.根据权利要求9所述的消逝场散射成像装置，其特征在于，所述成像相机为sCMOS相机。