CN118221843A - 一种羧甲基化野菊花多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种羧甲基化野菊花多糖，所述羧甲基化野菊花多糖的制备原料包括野菊花多糖CIP、氢氧化钠和氯乙酸；所述氢氧化钠先与CIP主链上的碳进行反应形成活性点，所述氯乙酸再将羧甲基基团接枝到CIP网状结构中。本发明还提供了一种上述羧甲基化野菊花多糖的具体制备方法以及在制备抗氧化材料、抗菌材料、止血材料和皮肤缺损修复材料中的应用。相较于单纯的野菊花多糖，本发明羧甲基化野菊花多糖Zeta电位和颗粒粒径显著减小，极大程度上提升了多糖网络体系的稳定性和水溶性；同时，羧甲基化野菊花多糖具有很好的生物活性和生物相容性，在抗菌、止血、抗氧化、皮肤缺损修复方面都具有应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药材料技术领域，尤其涉及一种羧甲基化野菊花多糖及其制备方法和在制备抗氧化材料、抗菌材料、止血材料和皮肤缺损修复材料中的应用。
背景技术
野菊花花蕾中含有多糖物质，通常称为野菊花多糖(Chrysanthemumindicumpolysaccharide，简称CIP)。从野菊花花蕾中分离出的野菊花多糖能够刺激巨噬细胞产生炎性因子来调节机体免疫反应，加速创面愈合，因而有望成为新一代皮肤敷料的天然基材。
然而，单纯的野菊花多糖的抗菌、抗炎、抗氧化生物活性较弱，难以达到令人满意的疗效。同时，由于多糖的亲水性强，分子间作用力大，导致它在溶液中往往呈现凝胶态和其他聚集态，溶解性和加工性能差，在生理环境下难以维持稳定，严重限制其在生物医药领域的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种羧甲基化野菊花多糖及其制备方法和应用，其通过羧甲基化方式对野菊花多糖进行改性，改性后的羧甲基化野菊花多糖十分稳定，并具有极强的生物活性，在抗氧化、抗菌、止血、皮肤缺损修复等方面具有重要的应用价值。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种羧甲基化野菊花多糖，其制备原料包括野菊花多糖CIP、氢氧化钠和氯乙酸；所述氢氧化钠先与CIP主链上的碳进行反应形成活性点，所述氯乙酸再将羧甲基基团接枝到CIP网状结构中。
本发明通过接枝羧甲基基团得到的多糖网络体系十分稳定，并具有极强的生物活性。
作为本发明的优选方式之一，所述野菊花多糖CIP的获得方法为：将野菊花粉末分散于蒸馏水中，持续搅拌过夜；离心后去除上清液，并用蒸馏水提取沉淀物；在90～100℃温度下持续搅拌2～4h，收集上清液；最后，将所得上清液在蒸馏水中透析，蒸馏、冷冻、干燥后所得的淡黄色棉絮状多糖即为目标所需多糖。
作为本发明的优选方式之一，所述野菊花多糖CIP包括摩尔比分别为32.5：26.6：19.4的D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、L阿拉伯糖，以及少量的L-古洛糖醛酸、D-甘露糖、D-氨基葡萄糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-氨基半乳糖、D-半乳糖、D-木糖、L-岩藻糖，含糖量在20～30％，分子量在150～200万Da。
作为本发明的优选方式之一，所述野菊花多糖CIP与氯乙酸的摩尔比为(1～2):(1～4.5)。此处，不同的CIP：氯乙酸摩尔比是为了制备不同羧甲基取代度的羧甲基化野菊花多糖；例如，当n(CIP)：n(氯乙酸)＝2：1时，多糖的羧甲基取代度为26.67％；当n(CIP)：n(氯乙酸)＝1：1时，多糖的羧甲基取代度为31.04％；当n(CIP)：n(氯乙酸)＝1：2时，多糖的羧甲基取代度为59.56％；当n(CIP)：n(氯乙酸)＝1：4.5时，多糖的羧甲基取代度为77.78％。
一种上述羧甲基化野菊花多糖的制备方法，先将野菊花多糖溶液与氢氧化钠溶液在20～30℃下初步反应60～90min，再与氯乙酸溶液在55～65℃下反应4～4.5h，经透析、冷冻干燥后得到羧甲基野菊花多糖。
改性后的羧甲基化野菊花多糖具有可调节的物理化学性能，网络体系的稳定性和水溶性大幅度提高，同时所含杂质少，得到的多糖物质较纯。
作为本发明的优选方式之一，所述野菊花多糖溶液为野菊花多糖的有机溶液，所用有机溶剂为异丙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺中的一种或多种，优选为异丙醇。本发明可通过将多糖分散于有机溶剂中，加热至25～35℃，保持0.5～1h，得到相应的野菊花多糖溶液。
作为本发明的优选方式之一，所述野菊花多糖溶液的浓度为25～40wt.％，优选30～35wt.％。
作为本发明的优选方式之一，所述氢氧化钠溶液浓度为20～40wt.％，优选25～30wt.％。
作为本发明的优选方式之一，所述野菊花多糖与氯乙酸的摩尔比为(1～2):(1～4.5)，用于制备不同羧甲基取代度的羧甲基化野菊花多糖。当n(CIP)：n(氯乙酸)＝2：1时，多糖的羧甲基取代度为26.67％；当n(CIP)：n(氯乙酸)＝1：1时，多糖的羧甲基取代度为31.04％；当n(CIP)：n(氯乙酸)＝1：2时，多糖的羧甲基取代度为59.56％；当n(CIP)：n(氯乙酸)＝1：4.5时，多糖的羧甲基取代度为77.78％。
作为本发明的优选方式之一，野菊花多糖溶液与氢氧化钠溶液在20～30℃下初步反应过程中，均包括剧烈搅拌的步骤，搅拌的转速为500～800转/秒。通过剧烈搅拌，可使多糖主链上的碳形成更多的活性点，从而有利于羧甲基基团的接枝，且搅拌速率越快，结构越均匀，多糖网络体系越稳定。同时，为避免搅拌速率过高导致温度升高造成液体沸腾，应控制搅拌速率不宜过高。
作为本发明的优选方式之一，所述透析时间为36～72h，优选48～60h；所述透析温度为10～30℃，优选20～25℃；所述透析所用的液体优选无菌水，水的体积可根据实际情况进行调整，能将所装多糖溶液的透析袋浮于表面即可。通过透析的方式，能够将沉淀物中的蛋白质、无机盐、色素、单糖等影响多糖的结构和生物活性的杂质去除，有效提高多糖的生物活性。
作为本发明的优选方式之一，所述冷冻干燥时间为18～36h，优选24～32h；所述冷冻干燥温度为-10℃～-35℃，优选-20～-30℃。温度过高或过低，都会导致多糖类物质结晶不完全或者出现杂质，影响产物的质量和稳定性。通过干燥的方式可蒸发掉多糖溶液中大量的水分，使其形成无规则的交错网状结构。干燥后的多糖应呈现棉絮状，若仍存在少量结晶，可适当延长干燥时间。
一种上述羧甲基化野菊花多糖在制备抗氧化材料、抗菌材料、止血材料和皮肤缺损修复材料中的应用。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)相较于单纯的野菊花多糖，本发明中的羧甲基化野菊花多糖Zeta电位和颗粒粒径显著减小，极大程度上提升了多糖网络体系的稳定性和水溶性；同时，羧甲基化野菊花多糖具有很好的生物活性和生物相容性，在抗菌、止血、抗氧化、皮肤缺损修复方面都具有应用价值；
(2)本发明通过“羧甲基化”的方式，将羧甲基基团接枝到多糖中，改性后的羧甲基化野菊花多糖具有可调节的物理化学性能，例如羧甲基取代度为59.56％的多糖对DPPH和羟自由基有极高的清除率，取代度为31.04％的多糖对超氧阴离子有极高的清除率；
(3)本发明的制备方法简单，原料易得。
附图说明
图1为本发明野菊花多糖CIP的HPLC色谱图(图中，标记1：L-古洛糖醛酸，2：D-甘露糖，3：D-氨基葡萄糖，4：D-核糖，5：L-鼠李糖，6：D-葡萄糖醛酸，7：D-半乳糖醛酸，8：D-氨基半乳糖，9：D-葡萄糖，10：D-半乳糖，11：D-木糖，12：L-阿拉伯糖，13：L-岩藻糖)；
图2为本发明野菊花多糖CIP与羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4的红外谱图；
图3为本发明羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4的羧甲基取代度；
图4为本发明野菊花多糖CIP与羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4的zeta电位图；
图5为本发明野菊花多糖CIP与羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4的粒径分布图；
图6为本发明野菊花多糖CIP、羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4以及维生素C对DPPH的清除率结果图；
图7为本发明野菊花多糖CIP、羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4以及维生素C对羟自由基的清除率结果图；
图8为本发明野菊花多糖CIP、羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4以及维生素C对超氧阴离子自由基的清除率结果图；
图9为本发明野菊花多糖CIP和羧甲基化野菊花多糖CCIP3对大肠杆菌的抑制圈法实验实物图(A)和实验结果(B)；
图10为本发明野菊花多糖CIP和羧甲基化野菊花多糖CCIP3对金黄色葡萄球菌的抑制圈法实验实物图(A)和实验结果(B)；
图11为本发明羧甲基化野菊花多糖CCIP3对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MICs)测定的实验结果(A)和对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MICs)测定的实验结果(B)；
图12为本发明野菊花多糖CIP、羧甲基化野菊花多糖CCIP3以及云南白药在大鼠断尾止血试验的实物图(上图)以及实验结果(下图)；
图13为本发明野菊花多糖CIP、羧甲基化野菊花多糖CCIP3以及云南白药在大鼠肝脏切割止血试验的实物图(上图)以及实验结果(下图)；
图14为在全血中加入水、PBS和羧甲基化野菊花多糖CCIP3孵育不同时间的实物图；
图15为在全血中加入不同浓度羧甲基化野菊花多糖CCIP3后的未溶红细胞比例；
图16为本发明野菊花多糖CIP、羧甲基化野菊花多糖CCIP3以及云南白药在创面修复实验中小鼠皮肤缺损的初始状态图；
图17为本发明野菊花多糖CIP、羧甲基化野菊花多糖CCIP3以及云南白药在创面修复实验中不同时间后的皮肤修复效果图。
图18为本发明野菊花多糖CIP、羧甲基化野菊花多糖CCIP3以及云南白药在创面修复实验中不同时间的创面愈合率结果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。同时，本发明所使用的试剂产品及实验方法，未经特别说明的，均为本领域常规试剂或方法，不再赘述。
实施例1
本实施例的一种野菊花多糖，制备方法如下：
将干燥的野菊花粉末分散于蒸馏水中，在25℃下持续搅拌过夜；离心后去除上清液，并用蒸馏水提取上一步沉淀物；在90℃下持续搅拌2h，收集上清液；最后，将所得上清液在蒸馏水中透析3天，蒸馏、冷冻、干燥后即得到淡黄色的棉絮状多糖，标记为CIP。
实施例2
本实施例的一种野菊花多糖，制备方法如下：
将干燥的野菊花粉末分散于蒸馏水中，在25℃下持续搅拌过夜；离心后去除上清液，并用蒸馏水提取上一步沉淀物；在95℃下持续搅拌3h收集上清液；最后，将所得上清液在蒸馏水中透析3天，蒸馏、冷冻、干燥后即得到淡黄色的棉絮状多糖，标记为CIP。
实施例3
本实施例的一种野菊花多糖，制备方法如下：
将干燥的野菊花粉末分散于蒸馏水中，在25℃下持续搅拌过夜；离心后去除上清液，并用蒸馏水提取上一步沉淀物；在100℃下持续搅拌4h，收集上清液；最后，将所得上清液在蒸馏水中透析3天，蒸馏、冷冻、干燥后即得到淡黄色的棉絮状多糖，标记为CIP。
实施例4
本实施例的一种羧甲基化野菊花多糖，制备方法如下：
(1)在25℃下，将CIP(野菊花多糖)分散于二甲基亚砜中，搅拌0.5h，制备25wt.％浓度的野菊花多糖分散液。
(2)配置20wt.％的氢氧化钠溶液，分次缓慢滴加到步骤(1)的野菊花多糖分散液中，并在20℃下剧烈搅拌反应60min，拌的转速为500转/秒。
(3)将氯乙酸溶于异丙醇，再将该溶液分三次缓慢滴加到步骤(2)反应体系中；滴加完毕后，将反应体系升温到55℃，反应4h；其中，最终反应体系中，CIP与氯乙酸的摩尔比为2:1。
(4)反应后去除上清液，冷却至室温后向其加入100mL无水乙醇，分装入离心管内，去除上清液，用相同操作再次洗涤一次，随后将沉淀物分装到离心管中，在30℃下超声1h。
(5)采用无菌水作为透析液对步骤(4)所得物透析，透析时间为36h，透析温度为10℃；透析后，进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为18h，冷冻干燥温度为-10℃；冷冻干燥后即得淡黄色的海绵状多糖。
实施例5
本实施例的一种羧甲基化野菊花多糖，制备方法如下：
(1)在25℃下，将CIP(野菊花多糖)分散于异丙醇中，搅拌0.5h，制备33.33wt.％浓度的野菊花多糖分散液。
(2)配置30wt.％的氢氧化钠溶液，分次缓慢滴加到步骤(1)的野菊花多糖分散液中，并在25℃下剧烈搅拌反应90min，拌的转速为600转/秒。
(3)将氯乙酸溶于异丙醇，再将该溶液分三次缓慢滴加到步骤(2)反应体系中；滴加完毕后，将反应体系升温到60℃，反应4h；其中，最终反应体系中，CIP与氯乙酸的摩尔比为1:2。
(4)反应后去除上清液，冷却至室温后向其加入100mL无水乙醇，分装入离心管内，去除上清液，用相同操作再次洗涤一次，随后将沉淀物分装到离心管中，在30℃下超声1h。
(5)采用无菌水作为透析液对步骤(4)所得物透析，透析时间为36h，透析温度为25℃；透析后，进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为24h，冷冻干燥温度为-20℃；冷冻干燥后即得淡黄色的海绵状多糖。
实施例6
本实施例的一种羧甲基化野菊花多糖，制备方法如下：
(1)在30℃下，将CIP(野菊花多糖)分散于N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌0.6h，制备35wt.％浓度的野菊花多糖分散液。
(2)配置35wt.％的氢氧化钠溶液，分次缓慢滴加到步骤(1)的野菊花多糖分散液中，并在25℃下剧烈搅拌反应80min，拌的转速为700转/秒。
(3)将氯乙酸溶于异丙醇，再将该溶液分三次缓慢滴加到步骤(2)反应体系中；滴加完毕后，将反应体系升温到60℃，反应4.2h；其中，最终反应体系中，CIP与氯乙酸的摩尔比为1:1。
(4)反应后去除上清液，冷却至室温后向其加入100mL无水乙醇，分装入离心管内，去除上清液，用相同操作再次洗涤一次，随后将沉淀物分装到离心管中，在30℃下超声1h。
(5)采用无菌水作为透析液对步骤(4)所得物透析，透析时间为60h，透析温度为25℃；透析后，进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为32h，冷冻干燥温度为-30℃；冷冻干燥后即得淡黄色的海绵状多糖。
实施例7
本实施例的一种羧甲基化野菊花多糖，制备方法如下：
(1)在35℃下，将CIP(野菊花多糖)分散于N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌1h，制备40wt.％浓度的野菊花多糖分散液。
(2)配置40wt.％的氢氧化钠溶液，分次缓慢滴加到步骤(1)的野菊花多糖分散液中，并在30℃下剧烈搅拌反应90min，拌的转速为800转/秒。
(3)将氯乙酸溶于异丙醇，再将该溶液分三次缓慢滴加到步骤(2)反应体系中；滴加完毕后，将反应体系升温到65℃，反应4.5h；其中，最终反应体系中，CIP与氯乙酸的摩尔比为1:4.5。
(4)反应后去除上清液，冷却至室温后向其加入100mL无水乙醇，分装入离心管内，去除上清液，用相同操作再次洗涤一次，随后将沉淀物分装到离心管中，在30℃下超声1h。
(5)采用无菌水作为透析液对步骤(4)所得物透析，透析时间为72h，透析温度为30℃；透析后，进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为36h，冷冻干燥温度为-35℃；冷冻干燥后即得淡黄色的海绵状多糖。
以下应用制备例为按照本发明方法制备不同羧甲基取代度的羧甲基化野菊花多糖。
应用制备例1
本应用制备例用于按照本发明方法制备羧甲基化野菊花多糖CCIP1(羧甲基取代度26.67％)，参考实施例5方法参数，步骤如下：
(1)在25℃下，将1g CIP粉末(实施例2所得CIP粉末)分散于30mL异丙醇中，搅拌0.5h，制备33.33wt.％浓度的野菊花多糖分散液。
(2)配置30wt.％的氢氧化钠溶液，取3mL分次缓慢滴加到步骤(1)的分散液中，并在25℃下剧烈搅拌反应90min，拌的转速为600转/秒。
(3)将0.3g氯乙酸溶于10mL异丙醇，再将该溶液分三次缓慢滴加到步骤(2)反应体系中，体系中n(CIP)：n(氯乙酸)＝2:1；滴加完毕后，将反应体系升温到60℃，反应4h。
(4)反应后去除上清液，冷却至室温后向其加入100mL无水乙醇，分装入离心管内，去除上清液，用相同操作再次洗涤一次，随后将沉淀物分装到离心管中，在30℃下超声1h。
(5)采用无菌水作为透析液对步骤(4)所得物透析，透析时间为36h，透析温度为25℃；透析后，进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为24h，冷冻干燥温度为-20℃；冷冻干燥后即得淡黄色的海绵状多糖，标记为CCIP1。
应用制备例2
本应用制备例用于按照本发明方法制备羧甲基化野菊花多糖CCIP2(羧甲基取代度31.04％)，参考实施例5方法参数，步骤如下：
(1)在25℃下，将1g CIP粉末(实施例2所得CIP粉末)分散于30mL异丙醇中，搅拌0.5h，制备33.33wt.％浓度的野菊花多糖分散液。
(2)配置30wt.％的氢氧化钠溶液，取3mL分次缓慢滴加到步骤(1)的分散液中，并在25℃下剧烈搅拌反应90min，拌的转速为600转/秒。
(3)将0.59g氯乙酸溶于10mL异丙醇，再将该溶液分三次缓慢滴加到步骤(2)反应体系中，体系中n(CIP)：n(氯乙酸)＝1:1；滴加完毕后，将反应体系升温到60℃，反应4h。
(4)反应后去除上清液，冷却至室温后向其加入100mL无水乙醇，分装入离心管内，去除上清液，用相同操作再次洗涤一次，随后将沉淀物分装到离心管中，在30℃下超声1h。
(5)采用无菌水作为透析液对步骤(4)所得物透析，透析时间为36h，透析温度为25℃；透析后，进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为24h，冷冻干燥温度为-20℃；冷冻干燥后即得淡黄色的海绵状多糖，标记为CCIP2。
应用制备例3
本应用制备例用于按照本发明方法制备羧甲基化野菊花多糖CCIP3(羧甲基取代度59.56％)，参考实施例5方法参数，步骤如下：
(1)在25℃下，将1g CIP粉末分(实施例2所得CIP粉末)散于30mL异丙醇中，搅拌0.5h，制备33.33wt.％浓度的野菊花多糖分散液。
(2)配置30wt.％的氢氧化钠溶液，取3mL分次缓慢滴加到步骤(1)的分散液中，并在25℃下剧烈搅拌反应90min，拌的转速为600转/秒。
(3)将1.18g氯乙酸溶于10mL异丙醇，再将该溶液分三次缓慢滴加到步骤(2)反应体系中，体系中n(CIP)：n(氯乙酸)＝1:2；滴加完毕后，将反应体系升温到60℃，反应4h。
(4)反应后去除上清液，冷却至室温后向其加入100mL无水乙醇，分装入离心管内，去除上清液，用相同操作再次洗涤一次，随后将沉淀物分装到离心管中，在30℃下超声1h。
(5)采用无菌水作为透析液对步骤(4)所得物透析，透析时间为36h，透析温度为25℃；透析后，进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为24h，冷冻干燥温度为-20℃；冷冻干燥后即得淡黄色的海绵状多糖，标记为CCIP3。
应用制备例4
本应用制备例用于按照本发明方法制备羧甲基化野菊花多糖CCIP4(羧甲基取代度77.78％)，参考实施例5方法参数，步骤如下：
(1)在25℃下，将1g CIP粉末(实施例2所得CIP粉末)分散于30mL异丙醇中，搅拌0.5h，制备33.33wt.％浓度的野菊花多糖分散液。
(2)配置30wt.％的氢氧化钠溶液，取3mL分次缓慢滴加到步骤(1)的分散液中，并在25℃下剧烈搅拌反应90min，拌的转速为600转/秒。
(3)将2.67g氯乙酸溶于10mL异丙醇，再将该溶液分三次缓慢滴加到步骤(2)反应体系中，体系中n(CIP)：n(氯乙酸)＝1:4.5；滴加完毕后，将反应体系升温到60℃，反应4h。
(4)反应后去除上清液，冷却至室温后向其加入100mL无水乙醇，分装入离心管内，去除上清液，用相同操作再次洗涤一次，随后将沉淀物分装到离心管中，在30℃下超声1h。
(5)采用无菌水作为透析液对步骤(4)所得物透析，透析时间为36h，透析温度为25℃；透析后，进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为24h，冷冻干燥温度为-20℃；冷冻干燥后即得淡黄色的海绵状多糖，标记为CCIP4。
实验例
实验例用于分析本发明野菊花多糖(以对比例2CIP为例)以及羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4的结构表征和性能差异：
1、HPLC色谱图
本发明野菊花多糖CIP，其HPLC色谱图如图1所示。由图1可知：本发明制得的野菊花多糖原料共含有十三种单糖组分，各单糖含量和及组成比例有明显差异，其中，D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、L阿拉伯糖含量较高，且摩尔比分别为32.5：26.6：19.4；且其含糖量在20～30％，分子量在150～200万Da。
2、红外谱图
本发明野菊花多糖CIP以及羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4的红外谱图如图2所示。由图2可以看出：3304cm-1处的吸收峰对应多糖分子中-OH振动，经过羧甲基化修饰后，羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4在此处吸收峰变宽，表明羟基的缔合进一步增强，同时在1716cm-1处出现新的吸收峰，对应C＝O的伸缩振动，是羧甲基化的特征峰。另外，在1585cm-1、1419cm-1、1017cm-1处出现的强吸收峰表明存在COO-和C-O-C的伸缩振动，这些结果均证明野菊花多糖改性的成功。
3、取代度
采用中和滴定法对本发明羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4进行测定，结果如图3所示。由图3可以看出：羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4均有不同程度的羧甲基基团接枝，且CCIP4取代度较高，结果为77.78％。
4、zeta电位
本发明野菊花多糖CIP与羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4的zeta电位如图4所示。其中，野菊花多糖CIP的zeta电位接近于0，表明单纯的野菊花多糖分子间作用大，导致其在溶液中倾向于凝胶态和其他聚集态，而经过羧甲基化基团的接枝后；羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4的zeta电位均发生不同程度的减小，且CCIP3和CCIP4变化尤为显著，极大程度上提升了多糖网络体系的稳定性，这对于创面修复的实际运用具有重要意义。
5、粒径分布
本发明野菊花多糖CIP与羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4的粒径分布如图5所示。可以明显观察到：CCIP1和CCIP2颗粒粒径在400～800d.nm间的占比略有增加，而CCIP3和CCIP4颗粒粒径大多集中在200～400d.nm间。颗粒粒径越小，代表生物活性越高，因此这一结果也为CCIP3和CCIP4在性能测试中的良好表现奠定了理论基础。
6、抗氧化性能
采用DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)法、羟自由基法和超氧阴离子自由基法检测野菊花多糖CIP与羧甲基化野菊花多糖CCIP1～CCIP4的抗氧化能力，以维生素C作为阳性对照，多糖在不同时间对DPPH(0.2mmoL/L)的清除率如图6所示；在不同时间对硫酸亚铁(9mmoL/L)、水杨酸(9mmoL/L)和过氧化氢(6mmoL/L)混合物的清除率如图7所示；在不同时间对Tris-HCl缓冲液(50mmoL/L，pH＝8.2)的清除率如图8所示。结果表明：与单纯的野菊花多糖CIP和不同接枝率的羧甲基野菊花多糖相比，CCIP3对DPPH和羟自由基有极高的清除率，CCIP2对超氧阴离子有极高的清除率，而CCIP4较于CCIP3而言抗氧化性能有所下降。
7、抑菌性能
以羧甲基化野菊花多糖CCIP3为例，采用抑菌圈法测试羧基化野菊花多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果，结果如图9、10所示；同时，还采用微量稀释法测定CCIP3的最小抑菌浓度(MICs)，结果如图11所示。结果显示：与未加入多糖的空白组以及单纯的野菊花多糖CIP相比，CCIP3能够明显抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，且在浓度达到25mg/mL时，可完全抑制两种细菌的生长。
8、止血性能
将一定量的羧甲基化野菊花多糖CCIP3用于大鼠断尾和肝脏切割止血实验中，检测失血量和止血时间，同时采用设置云南白药止血实验组以及空白对照组，结果如图12和13所示。实验结果显示：CCIP3在两个实验的止血时间分别为161s和185s，远小于空白对照以及:单纯的野菊花多糖CIP，且与云南白药无显著性差异。同时，CCIP3组的失血量也明显减少。
9、溶血性能
在全血中加入不同浓度的羧甲基化野菊花多糖CCIP3，检测不同时间点下红细胞的溶血情况，并与加入水、PBS以及CIP作比较，结果如图14和15所示。图14为在全血中加入水、PBS和CCIP3的实物图，图15为在全血中加入不同浓度的CCIP3后的未溶红细胞比例。结果显示：CCIP3在720min的溶血率仅为2.92％。
10、对皮肤缺损修复的性能
将羧甲基化野菊花多糖CCIP3和CIP用于小鼠缺损皮肤修复，以云南白药作为阳性对照，不同时间下的伤口恢复情况如图16、17、18所示。结果显示，与CIP相比，CCIP3能够显著促进皮肤的修复，14天后创面愈合率可达99.23％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种羧甲基化野菊花多糖，其特征在于，所述羧甲基化野菊花多糖的制备原料包括野菊花多糖CIP、氢氧化钠和氯乙酸；所述氢氧化钠先与CIP主链上的碳进行反应形成活性点，所述氯乙酸再将羧甲基基团接枝到CIP网状结构中。
2.根据权利要求1所述的羧甲基化野菊花多糖，其特征在于，所述野菊花多糖CIP的获得方法为：将野菊花粉末分散于蒸馏水中，持续搅拌过夜；离心后去除上清液，并用蒸馏水提取沉淀物；在90～100℃温度下持续搅拌2～4h，收集上清液；最后，将所得上清液在蒸馏水中透析，蒸馏、冷冻、干燥后所得的淡黄色棉絮状多糖即为目标所需多糖。
3.根据权利要求1所述的羧甲基化野菊花多糖，其特征在于，所述野菊花多糖CIP包括摩尔比分别为32.5：26.6：19.4的D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、L阿拉伯糖，且含糖量在20～30％，分子量在150～200万Da。
4.根据权利要求1～3任一所述的羧甲基化野菊花多糖，其特征在于，所述野菊花多糖CIP与氯乙酸的摩尔比为(1～2):(1～4.5)。
5.一种如权利要求1～4任一所述的羧甲基化野菊花多糖的制备方法，其特征在于，先将野菊花多糖溶液与氢氧化钠溶液在20～30℃下初步反应60～90min，再与氯乙酸溶液在55～65℃下反应4～4.5h，经透析、冷冻干燥后得到羧甲基野菊花多糖。
6.根据权利要求5所述的羧甲基化野菊花多糖的制备方法，其特征在于，所述野菊花多糖溶液为野菊花多糖的有机溶液，所用有机溶剂为异丙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的羧甲基化野菊花多糖的制备方法，其特征在于，所述野菊花多糖溶液的浓度为25～40wt.％，氢氧化钠溶液浓度为20～40wt.％。
8.根据权利要求7所述的羧甲基化野菊花多糖的制备方法，其特征在于，所述野菊花多糖与氯乙酸的摩尔比为(1～2):(1～4.5)。
9.根据权利要求5所述的羧甲基化野菊花多糖的制备方法，其特征在于，所述透析时间为36～72h，透析温度为10～30℃；所述冷冻干燥时间为18～36h，冷冻干燥温度为-10℃～-35℃。
10.一种如权利要求1～4任一所述的羧甲基化野菊花多糖在制备抗氧化材料、抗菌材料、止血材料和皮肤缺损修复材料中的应用。
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