CN118178344B - 一种外泌体载药系统的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种外泌体载药系统的制备方法及其产品和应用，所述制备方法包括将外泌体、siRNA和电转缓冲液混合孵育，电转，得到第一混合液；将第一混合液与外泌体分离试剂混合，孵育，得到第二混合液；将第二混合液离心，即得。本发明所述的载药系统省时、可重复性高，可以通过负载各种不同功能的siRNA来实现对细胞或疾病的不同治疗作用。较之现有技术，本发明提供的载药系统能够把容易被环境RNA酶酶解的siRNA载入外泌体内，减少siRNA的损失，有利于siRNA更好地实现其调节功能。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种外泌体载药系统的制备方法及其产品和应用。
背景技术
外泌体又称细胞外囊泡，其直径约为30～200nm，密度约1.13～1.19g/mL，外泌体完整的外囊泡结构，能够保护其内部生物分子如蛋白质，DNA，RNA，siRNA等不受体液或外环境中各种降解因素的影响，达到保持其完整性和生物活性的作用。同时外泌体因为其囊泡由磷脂，糖蛋白等构成，非常容易被细胞吸收。
脐血中富含包括造血干细胞在内的各种干细胞，包括间充质干细胞等。由于脐血来源广泛，相比骨髓和脂肪间充质干细胞更为原始，及具有特殊的免疫学特性，因此，其间充质干细胞也具有特殊的优势和潜力，在多向分化、促进组织修复、抗炎、免疫抑制和保护神经等作用上表现出色，已有研究显示，外泌体作为间充质干细胞发挥旁分泌作用的主要载体，在促进组织修复、抗炎、免疫抑制和保护神经等方面同样显示出治疗潜力。随着科研及临床的研究发现，目前的对疾病的治疗，常常受限于具有特殊作用的siRNA生物技术药物过早被分解而无法顺利足量地被细胞吸收，导致药物效果大打折扣，因此一种合适的富载siRNA生物技术药物的载药系统将有极大的意义。
纵观现有技术，暂时还没有针对用于富集siRNA的脐带血源间充质干细胞外泌体的载药系统构建制备方法。因此，提供一种适用于富集siRNA的脐带血源间充质干细胞外泌体载药系统的构建方法是本领域追求的目标。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种外泌体载药系统的制备方法及其产品和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种外泌体载药系统的制备方法，所述制备方法包括：
(1)将外泌体与siRNA和电转缓冲液混合孵育，电转，得到第一混合液；
(2)将第一混合液与外泌体分离试剂混合，孵育，得到第二混合液；
(3)将第二混合液离心，即得。
本发明所述的载药系统省时、可重复性高，可以通过富载各种不同功能的RNA来实现对细胞或疾病的不同治疗作用。较之现有技术，本发明提供的载药系统能够容易被环境RNA酶酶解siRNA载入外泌体内，减少siRNA的损失，有利于siRNA更好地实现其调节功能。
本发明发现，在siRNA与外泌体混合后，进行一段时间的孵育，有利于载药系统载药量的提高。
优选地，所述外泌体包括脐血源间充质干细胞的外泌体。
优选地，所述外泌体与siRNA的质量比为(3-5):1，其中(3-5)中的具体点值均可选择3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明发现，外泌体与siRNA的比例对于载药量的提升十分重要。
优选地，所述电转包括脉冲电转。
优选地，所述电转的条件如下：
电压：380-420V，电容：120-130μF，电阻：40-60Ω，脉冲时间：2.5-3.5ms，脉冲次数：4-6次，脉冲间隔：55-65s。
所述电压可以选择380V、385V、390V、395V、400V、405V、410V、415V、420V等，所述电容可以选择120μF、122μF、124μF、126μF、128μF、130μF等，所述电阻可以选择40Ω、42Ω、44Ω、46Ω、48Ω、50Ω、52Ω、54Ω、56Ω、58Ω、60Ω等，所述脉冲时间可以选择2.5ms、2.6ms、2.7ms、2.8ms、2.9ms、3ms、3.1ms、3.2ms、3.3ms、3.4ms、3.5ms等，脉冲次数可以选择4次、5次、6次等，脉冲间隔可以选择55s、56s、57s、58s、59s、60s、61s、62s、63s、64s、65s等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述孵育的温度为4-20℃，时间为30-60min。
所述温度可以选择4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃等，时间可以选择30min、32min、34min、36min、38min、40min、42min、44min、46min、48min、50min、52min、54min、56min、58min、60min等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，第一混合液与外泌体分离试剂的体积比为1:(0.5-1)，其中(0.5-1)中的具体点值均可选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述孵育的温度为2-8℃，时间为12-18h。
所述温度可以选择2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等，时间可以选择12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明发现，siRNA与外泌体混合后孵育的时间对于载药量的提升十分重要。
优选地，步骤(3)所述离心的转速为9000-12000×g，时间为50-70min。
所述转速可以选择9000xg、9500xg、10000xg、10500xg、11000xg、11500xg、12000xg等，时间可以选择50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min、60min、61min、62min、63min、64min、65min、70min等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述离心的温度为2-8℃，例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的外泌体载药系统的制备方法制备得到的外泌体载药系统。
第三方面，本发明提供一种根据第二方面所述的外泌体载药系统在制备药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所述的载药系统省时、可重复性高，可以通过富载各种不同功能的RNA来实现对细胞或疾病的不同治疗作用。较之现有技术，本发明提供的载药系统能够容易被环境RNA酶酶解siRNA载入外泌体内，减少siRNA的损失，有利于siRNA更好地实现其调节功能。
附图说明
图1是荧光值与对应浓度的标准曲线。
图2是外泌体载药系统CD9，CD63含量的检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例、对比例涉及的产品中包含的功效成分来源方式如下(仅体现功效成分，其他市售原料中含有的必要辅料成分不再赘述)：
脐带血来自广东省取得《医疗机构执业许可证》的二级以上妇产医院或综合医院。
电转缓冲液为购自Lonza公司商品名为Amaxa Cell Line Nucleofector Kit C的产品。
总外泌体分离试剂为购自InvitrogenTM公司商品名为Total Exosome IsolationReagent的产品。
实施例1
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，所述制备方法包括：
(1)利用ficoll密度梯度离心的方法，从脐血中分理处脐带血单个核细胞；
(2)利用添加脐血浆的间充质干细胞培养基对脐带血单个核细胞进行培养，经培养至P4代后获得脐血源间充质干细胞；
(3)收集P4代脐血源间充质干细胞的培养基，利用低温超速离心的方法分离提取出脐血源间充质干细胞的外泌体，外泌体的初始浓度约为12mg/mL；
(4)利用人工合成法获得带荧光标签的双链siRNA粉末，常规冻存于-80℃冰箱待用，所述双链siRNA正链的序列如SEQ ID No.1所示，反链的序列如SEQ ID No.2所示；
SEQ ID No.1：GUACAUCCAUUAUAAGCUG-dTdT；
SEQ ID No.2：FAM-CAGCUUAUAAUGGAUGUAC-dTdT；
(5)使用时解冻复融，操作时需保证在RNase-free条件下进行，siRNA存放于1.5mL的试管，开盖前先离心(约3000rpm，1min)，然后加入超纯水125μL复融(此时终浓度为20M)，溶解后盖上管盖震荡。
(6)取脐血源间充质干细胞的外泌体与复融的siRNA添加于黑边透明底的96孔空白酶标板中，外泌体与siRNA的质量比为4:1，添加电转缓冲液调配至100μL电转体系；
(7)外泌体与siRNA避光震荡孵育60min，利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：400V，125μF，电阻50Ω，脉冲时间3ms，脉冲次数5次，脉冲间隔1min；
(8)取出制备后的溶液转移到新的试管中，加入0.5体积的总外泌体分离试剂。通过涡旋或上下移液混合培养液，将样品在4℃下孵育过夜。孵育后，将样品在10,000×g、4℃下离心1小时。抽吸并丢弃上清液，外泌体包含在管底部的颗粒中，使用PBS复融底部颗粒球团，即得。
实施例2
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，所述制备方法包括：
(1)利用ficoll密度梯度离心的方法，从脐血中分理处脐带血单个核细胞；
(2)利用添加脐血浆的间充质干细胞培养基对脐带血单个核细胞进行培养，经培养至P4代后获得脐血源间充质干细胞；
(3)收集P4代脐血源间充质干细胞的培养基，利用低温超速离心的方法分离提取出脐血源间充质干细胞的外泌体，外泌体的初始浓度约为12mg/mL；
(4)利用人工合成法获得带荧光标签的双链siRNA粉末，常规冻存于-80℃冰箱代用待用，所述双链siRNA正链的序列如SEQ ID No.3所示，反链的序列如SEQ ID No.4所示；
SEQ ID No.3：CCAGCACACUGAGAAUCAATT；
SEQ ID No.4：UUGAUUCUCAGUGUGCUGGTT；
(5)使用时解冻复融，操作时需保证在RNase-free条件下进行，siRNA存放于1.5mL的试管，开盖前先离心(约3000rpm，1min)，然后加入超纯水125μL复融(此时终浓度为20M)，溶解后盖上管盖震荡；
(6)取脐血源间充质干细胞的外泌体与复融的siRNA添加于黑边透明底的96孔空白酶标板中，外泌体与siRNA的质量比为3:1，添加电转缓冲液调配至100μL电转体系；
(7)外泌体与siRNA避光震荡孵育30min，利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：380V，120μF，电阻40Ω，脉冲时间2.5ms，脉冲次数4次，脉冲间隔55s；
(8)取出制备后的溶液转移到新的试管中，加入0.8体积的总外泌体分离试剂。通过涡旋或上下移液混合培养液，将样品在8℃下孵育过夜。孵育后，将样品在9,000×g、8℃下离心70min。抽吸并丢弃上清液，外泌体包含在管底部的颗粒中，使用PBS复融底部颗粒球团，即得。
实施例3
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，所述制备方法包括：
(1)利用ficoll密度梯度离心的方法，从脐血中分理处脐带血单个核细胞；
(2)利用添加脐血浆的间充质干细胞培养基对脐带血单个核细胞进行培养，经培养至P4代后获得脐血源间充质干细胞；
(3)收集P4代脐血源间充质干细胞的培养基，利用低温超速离心的方法分离提取出脐血源间充质干细胞的外泌体，外泌体的初始浓度约为12mg/mL；
(4)利用人工合成法获得带荧光标签的双链siRNA粉末，常规冻存于-80℃冰箱待用，所述双链siRNA正链的序列如SEQ ID No.5所示，反链的序列如SEQ ID No.6所示；
SEQ ID No.5：GGAGGCCCUGGAUGUAAUUTT；
SEQ ID No.6：UUGAUUCUCAGUGUGCUGGTT；
(5)使用时解冻复融，操作时需保证在RNase-free条件下进行，siRNA存放于1.5mL的试管，开盖前先离心(约3000rpm，1min)，然后加入超纯水125μL复融(此时终浓度为20M)，溶解后盖上管盖震荡；
(6)取脐血源间充质干细胞的外泌体与复融的siRNA添加于黑边透明底的96孔空白酶标板中，外泌体与siRNA的质量比为5:1，添加电转缓冲液调配至100μL电转体系；
(7)外泌体与siRNA避光震荡孵育60min，利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：420V，130μF，电阻60Ω，脉冲时间3.5ms，脉冲次数6次，脉冲间隔65s；
(8)取出制备后的溶液转移到新的试管中，加入1体积的总外泌体分离试剂。通过涡旋或上下移液混合培养液，将样品在2℃下孵育过夜。孵育后，将样品在12,000×g、2℃下离心50min。抽吸并丢弃上清液，外泌体包含在管底部的颗粒中，使用PBS复融底部颗粒球团，即得。
实施例4
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(6)为“取脐血源间充质干细胞的外泌体与复融的siRNA添加于黑边透明底的96孔空白酶标板中，外泌体与siRNA的质量比为1:1，添加电转缓冲液调配至100μL电转体系”。
其他操作保持不变。
实施例5
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(6)为“取脐血源间充质干细胞的外泌体与复融的siRNA添加于黑边透明底的96孔空白酶标板中，外泌体与siRNA的质量比为7:1，添加电转缓冲液调配至100μL电转体系”。
其他操作保持不变。
实施例6
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(7)为“外泌体与siRNA避光震荡孵育10min，利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：400V，125μF，电阻50Ω，脉冲时间3ms，脉冲次数5次，脉冲间隔1min”。
其他操作保持不变。
实施例7
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(7)为“外泌体与siRNA避光震荡孵育80min，利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：400V，125μF，电阻50Ω，脉冲时间3ms，脉冲次数5次，脉冲间隔1min”。
其他操作保持不变。
实施例8
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(7)为“外泌体与siRNA避光震荡孵育60min，利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：400V，125μF，电阻50Ω，脉冲时间3ms，脉冲次数2次，脉冲间隔1min”。
其他操作保持不变。
实施例9
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(7)为“外泌体与siRNA避光震荡孵育60min，利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：400V，125μF，电阻50Ω，脉冲时间3ms，脉冲次数8次，脉冲间隔1min”。
其他操作保持不变。
实施例10
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(7)为“外泌体与siRNA避光震荡孵育60min，利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：150V，125μF，电阻50Ω，脉冲时间3ms，脉冲次数5次，脉冲间隔1min”。
其他操作保持不变。
实施例11
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(7)为“外泌体与siRNA避光震荡孵育60min，利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：200V，125μF，电阻50Ω，脉冲时间3ms，脉冲次数5次，脉冲间隔1min”。
其他操作保持不变。
实施例12
本实施例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(7)为“外泌体与siRNA避光震荡孵育60min，利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：500V，125μF，电阻50Ω，脉冲时间3ms，脉冲次数5次，脉冲间隔1min”。
其他操作保持不变。
对比例1
本对比例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(7)为“外泌体与siRNA避光震荡孵育60min”。
其他操作保持不变。
对比例2
本对比例提供一种外泌体载药系统的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(7)为“利用基因脉冲Xcell电穿孔系统Bio-Rad进行电转构建siRNA-外泌体载药系统，条件为：400V，125μF，电阻50Ω，脉冲时间3ms，脉冲次数5次，脉冲间隔1min”。
其他操作保持不变。
测试例1
载药量测试
标准曲线的制作
把带荧光标签的siRNA浓度配成400nM，200nM，100nM，50nM，25nM，12.5nM，6.25nM，0浓度依次添加到黑边透明底的96孔空白酶标板中，100μL/孔，每孔3次重复，作为标准曲线(见图1)。
针对待测样品，使用多功能微孔板读数仪进行荧光发射光检测，调整多功能微孔板读数仪的参数为激发光485nm，吸收发射光535nm，曝光时间为1.0s。利用根据荧光标准曲线测得siRNA-外泌体的siRNA载药量。
结果如表1所示。
表1
由表1数据可知，本申请所述外泌体载药系统具有较高的载药量，且外泌体与siRNA的质量比、二者混合后的孵育、电转电压、脉冲次数对于载药量和载入率十分重要。
测试例2
利用westernblot法检测siRNA-外泌体的CD9，CD63含量，每个样品重复3次。利用Image J软件对WB条带进行灰度分析，结果如图2所示。
由图2可知，制备后的的siRNA-exo载药系统仍具有外泌体的表面标记物，仍具有外泌体易于被细胞识别胞吞吸收的功能。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种外泌体载药系统的制备方法及其产品和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (7)
1.一种外泌体载药系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
（1）将外泌体、siRNA和电转缓冲液混合孵育，电转，得到第一混合液；
（2）将第一混合液与外泌体分离试剂混合，孵育，得到第二混合液；
（3）将第二混合液离心，即得；
所述外泌体由包括如下步骤的方法制得：利用ficoll密度梯度离心的方法，从脐血中分离脐带血单个核细胞；利用添加脐血浆的间充质干细胞培养基对脐带血单个核细胞进行培养，经培养至P4代后获得脐血源间充质干细胞；收集P4代脐血源间充质干细胞的培养基，分离提取出脐血源间充质干细胞的外泌体，外泌体的初始浓度为12 mg/mL；
所述外泌体与siRNA的质量比为(3-5):1；
所述电转包括脉冲电转，条件如下：
电压：380-420 V，电容：120-130 μF，电阻：40-60 Ω，脉冲时间：2.5-3.5 ms，脉冲次数：4-6次，脉冲间隔：55-65 s；
步骤（1）所述孵育的温度为4-20℃，时间为30-60 min；
所述siRNA的序列包括SEQ ID No.1-2的组合、SEQ ID No.3-4的组合或SEQ ID No.5-6的组合。
2.根据权利要求1所述的外泌体载药系统的制备方法，其特征在于，第一混合液与外泌体分离试剂的体积比为1:(0.5-1)。
3.根据权利要求1所述的外泌体载药系统的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述孵育的温度为2-8℃，时间为12-18h。
4.根据权利要求1所述的外泌体载药系统的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述离心的转速为9000-12000 ×g，时间为50-70 min。
5.根据权利要求1所述的外泌体载药系统的制备方法，其特征在于，所述离心的温度为2-8℃。
6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的外泌体载药系统的制备方法制备得到的外泌体载药系统。
7.一种根据权利要求6所述的外泌体载药系统在制备药物中的应用。
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| CN202410326701.8A CN118178344B (zh) | 2024-03-21 | 2024-03-21 | 一种外泌体载药系统的制备方法及其产品和应用 |
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| CN118178344A CN118178344A (zh) | 2024-06-14 |
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