CN118176008A - 用于治疗创伤性脑损伤的香叶天竺葵提取物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗、预防或改善受试者的创伤性脑损伤(TBI)、或用于改善遭受TBI的受试者的认知功能的方法和组合物，所述组合物包含从香叶天竺葵中提取的精油。

Description

用于治疗创伤性脑损伤的香叶天竺葵提取物

技术领域

本公开整体涉及一种用于脑损伤的新颖治疗。

背景技术

下面列出了被认为作为背景而与本文所公开的主题相关的参考文献：

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本文对上述参考文献的确认不应被推断为意味着这些参考文献以任何方式与本文所公开的主题的可专利性相关。

发明背景

创伤性脑损伤(TBI)每年影响全世界数百万人，并且是年轻人死亡和残疾的主要原因[1]。世界卫生组织已宣布TBI为重大公共卫生问题，并且美国国防部(DoD)报告称，超过313,816名军人遭受脑损伤[2,3]。创伤性头部损伤会导致即时症状以及受伤后可能持续多年的慢性症状，其中认知减退表现为学习、记忆和集中注意力的能力下降以及在相对年轻的年龄发作痴呆症[4,5]。

目前尚不存在针对即时和长期影响以及认知减退的有效药物治疗。这些后果损害受害者及其家人的生活质量，并且对卫生系统和照护家庭构成巨大的经济负担[6,7]。

Abbasloo等人[8]公开了Satureja khuzistanica Jamzad精油的腹膜内注射会减弱大鼠中创伤性脑损伤的影响。

先前已经表明，从植物香叶天竺葵(Pelargonium graveolens)中提取的精油能够抑制培养物中小胶质细胞的活化[9]。WO 2013/168090[10]公开了香叶天竺葵成分(即(S)(-)香茅醇)在体外抑制乙酰胆碱酯酶的活性。此外，香叶天竺葵油(也称为“天竺葵油”)显示出在帕金森病动物模型(MPTP)中可有效改善帕金森病的各种生理参数。

迫切需要开发一种能够减缓或消除与TBI相关的迟发症状和认知减退并从而减轻这些虚弱病状给个人、社会和经济带来的巨大负担的治疗方法。

发明内容

在一方面，本发明提供了一种用于治疗、预防或改善受试者的创伤性脑损伤的药物或营养组合物，该组合物包含从香叶天竺葵中提取的精油以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

在另一方面，本发明提供了一种用于改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的药物或营养组合物，该组合物包含从香叶天竺葵中提取的精油以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

在其另一方面，本发明提供了香叶天竺葵精油提取物，该香叶天竺葵精油提取物用于在治疗、预防或改善有此需要的受试者的TBI的方法中使用，该方法包括向受试者施用治疗有效量的所述香叶天竺葵精油提取物。

在其另一方面，本发明提供了香叶天竺葵精油提取物，该香叶天竺葵精油提取物用于在改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的方法中使用，该方法包括向受试者施用治疗有效量的所述香叶天竺葵精油提取物。

在其又一方面，本发明提供了一种治疗、预防或改善TBI的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的香叶天竺葵精油提取物或包含香叶天竺葵精油提取物的组合物。

在其又一方面，本发明提供了一种改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的香叶天竺葵精油提取物或包含香叶天竺葵精油提取物的组合物。

在一些实施例中，所述认知功能为学习能力、记忆(例如，空间记忆)或焦虑中的至少一者。

在一个实施例中，TBI是由外力、快速加速、爆炸波或到达脑组织的颅骨穿透引起的。

在一个实施例中，所述受试者为人。

在一个实施例中，所述受试者为选自由以下项组成的组的哺乳动物：绵羊、猪、牛、山羊、马、骆驼、水牛、兔、猫、犬和灵长类。

在一个实施例中，所述组合物呈食品、饮料、食品添加剂、食品补充剂、植物药物或药物组合物的形式。

在一个实施例中，所述组合物呈片剂、胶囊、液体糖浆、鼻喷雾剂、滴鼻剂、软凝胶、栓剂、贴剂和灌肠剂的形式。

在一个实施例中，所述组合物为包含药学上可接受的载剂的药物组合物。

在一个实施例中，所述药物组合物通过口服、腹膜内、皮下、经皮、局部、肌内、关节内、结膜下、鼻内或眼内施用来施用。

在一个实施例中，所述组合物以在约1mg/kg与50mg/kg之间的浓度施用。

在一个实施例中，所述组合物在TBI之后每天施用一次、两次、三次或更多次，或者每两天或每三天施用一次，持续约5天与四周之间或更长时间的治疗期，或者以预防性方式向处于TBI风险中的受试者施用。

在一个实施例中，长期施用组合物。

在一个实施例中，所述组合物在每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如9次每日治疗的治疗期中施用。

在一个实施例中，所述组合物在每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如9次每日治疗的治疗期中施用，随后每周一次长期施用。

在一个实施例中，在TBI之后约4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月之间或更长时间向所述受试者施用使用所述组合物的至少一个另外的治疗期。

在一个实施例中，所述组合物每天一次或每两天或三天一次，以在约5mg/kg与约50mg/kg之间的浓度口服提供，持续每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如每期9次每日治疗的治疗期。

在一个实施例中，所述组合物每天一次或每两天或三天一次，以在约1mg/kg与约5mg/kg之间的浓度通过鼻内施用来提供，持续每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如每期9次每日治疗的治疗期。

在一个实施例中，所述组合物每天一次或每两天或三天一次，以在约0.1％与约10％之间的浓度通过吸入来提供，持续每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如每期9次每日治疗的治疗期。

在一个实施例中，在TBI之后9个月向所述受试者提供一个为期两周的另外的治疗期。

在一个实施例中，组合物为缓释组合物。

在另一方面，本发明提供了一种用于治疗、预防或改善受试者的创伤性脑损伤的药物或营养组合物，该组合物包含分离的香茅醇以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

在另一方面，本发明提供了一种用于改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的药物或营养组合物，所述组合物包含分离的香茅醇以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

在另一方面，本发明提供了分离的香茅醇，该分离的香茅醇用于在治疗、预防或改善有此需要的受试者的TBI的方法中使用，该方法包括向受试者施用治疗有效量的所述分离的香茅醇。

在另一方面，本发明提供了分离的香茅醇，该分离的香茅醇用于在改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的方法中使用，该方法包括向受试者施用治疗有效量的所述分离的香茅醇。

在另一方面，本发明提供了一种治疗、预防或改善TBI的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的分离的香茅醇。

在另一方面，本发明提供了一种改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的分离的香茅醇。

在某些实施例中，所述分离的香茅醇以在约1mg/kg与15mg/kg之间、例如4mg/kg或10mg/kg的浓度施用。

附图说明

为了更好地理解本文公开的主题并举例说明其是如何在实践中实行的，现在将参考附图仅通过非限制性实例来描述实施例，在附图中：

图1为示出以下小鼠组中的神经功能缺损评分(NSS)的图：受到创伤并且用媒介物治疗的小鼠(CHI+媒介物)；受到创伤并且用200mg/kg Pg油治疗的小鼠(CHI+200mg/kgPg)；以及受到创伤并且用500mg/kg Pg油治疗的小鼠(CHI+500mg/kg Pg)。在受伤之后的若干时间点测量NSS。在创伤后24小时为小鼠喂食Pg油，持续2周，总共9剂。CHI+媒介物：n＝39轮-7；CHI+500mg/kg：n＝30轮-5；以及CHI+200mg/kg：n＝28轮-4。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05，[**]指示P值<0.01，[***]指示P值<0.001，并且[****]指示P值<0.0001。P值是指组(CHI+媒介物)和(CHI+500mg/kg Pg)在指定时间点的比较。混合效应分析，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。

图2为示出以下小鼠组在旷场测试中的运动评估的图：未受创伤并且未治疗的对照小鼠(Sham)；未受创伤并且用媒介物治疗的对照小鼠(Sham+媒介物)；CHI+媒介物；CHI+500mg/kg Pg油；以及CHI+200mg/kg Pg油，受伤后3周。Sham n＝5轮-1；Sham+媒介物n＝18轮-3；CHI+媒介物n＝25轮-4；CHI+500mg/kg Pg油；n＝17轮-2；以及CHI+200mg/kg Pg油：n＝20轮-3。结果呈现为平均值±SD。单向ANOVA，随后进行Tukey校正。图2A示出总路径(m)的测量结果。图2B示出平均速度(m/sec)的测量结果。

图3A为示出在创伤后两周和以及用Pg油治疗结束后3天进行的巴恩斯迷宫(BM)测试中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。在采集期后的以下4个连续时间点对小鼠进行测试：1天、2天、3天和4天。测试了以下组：Sham；Sham+媒介物；CHI+媒介物；CHI+500mg/kg Pg油；以及CHI+200mg/kg Pg油。结果为4次重复测试的总结。Sham：n＝21轮-4；Sham+媒介物：n＝35轮-6；CHI+媒介物：n＝41轮-6；CHI+500mg/kg Pg油：n＝33轮-4；CHI+200mg/kg Pg油：n＝20轮-2。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05，[***]指示P值<0.001，并且[****]指示P值<0.0001。P值是指各组(CHI+媒介物)与治疗组(CHI+200mg/kg Pg油或CHI+500mg/kg Pg)在指定时间点的比较。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。

图3B为示出在学习完成后24小时(24h)和7天(7d)(分别自Pg油治疗结束时起7天和14天)进行的用于记忆评定的巴恩斯迷宫(BM)回忆测试(回忆2周)中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。测试了以下组：Sham n＝21轮-4；Sham+媒介物：n＝35轮-6；CHI+媒介物：n＝41轮-6；CHI+500mg/kg Pg油：n＝33轮-4；CHI+200mg/kg Pg油：n＝20轮-2。结果呈现为平均值±SEM。组(p＝0.01)与回忆时间(p＝0.0003)的显著主效应。[*]指示P值＝0.024(CHI+200mg/kg Pg油24h与7d的比较)，[**]指示P值<0.01(CHI+媒介物24h与7d的比较)。对于Sham组和CHI+500mg/kg Pg油，在24h与7天回忆之间无显著差异。P值<0.01。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。

图4A为示出在创伤后2个月进行的巴恩斯迷宫(BM)测试中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。在采集期后的以下4个连续时间点对小鼠进行测试：1天、2天、3天和4天。测试了以下组：Sham；Sham+媒介物；CHI+媒介物；CHI+500mg/kg Pg油。结果为4次重复测试的总结。Sham n＝5；Sham+媒介物n＝5；CHI+媒介物n＝12；CHI+500mg/kg Pg油n＝12。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05(CHI+媒介物与CHI+500mg/kg Pg油在不同时间点的比较)。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。

图4B为示出在创伤后2个月和最后一次用Pg油治疗后1.5个月进行的巴恩斯迷宫(BM)回忆测试中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。测试在学习完成后24小时(24h)和7天(7d)进行，用于记忆评定。测试了以下组：Sham n＝5；Sham+媒介物n＝5；CHI+媒介物n＝12；CHI+500mg/kg Pg油n＝12。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。

图5A至5E为示出巴恩斯迷宫(BM)测试中的学习策略的示意图。图5A示出典型的巴恩斯迷宫策略。图5B至5E示出在Sham小鼠(5B)、Sham+媒介物小鼠(5C)、TBI+媒介物小鼠(5D)以及TBI+Pg油小鼠(图5E)中创伤后两个月(以及最后一次用Pg油治疗后1.5个月)进行的BM测试中的学习策略。

图6A为示出在创伤后6个月进行的巴恩斯迷宫(BM)测试中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。在采集期后的以下4个连续时间点对小鼠进行测试：1天、2天、3天和4天。测试了以下组：Sham；Sham+媒介物；CHI+媒介物；以及CHI+200mg/Kg Pg油，在受伤后2周治疗，加上受伤后1年每周一次的一个剂量作为后续(FU)治疗。结果为4次重复测试的总结。Shamn＝5；Sham+媒介物n＝5；CHI+媒介物n＝11；CHI+200mg/kg Pg油(FU)n＝11。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05，[**]指示P值<0.01。P值是指组(CHI+媒介物)与Sham组在指定时间点的比较。CHI+200mg/kg Pg油FU与Sham组在所有时间点相比无显著差异。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。

图6B为示出在学习完成后24小时(24h)和7天(7d)进行的巴恩斯迷宫(BM)回忆测试(自创伤起6个月和最后一次用Pg油治疗后5.5个月回忆)中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。测试了以下组：Sham n＝5；Sham+媒介物n＝5；CHI+媒介物n＝11；CHI+200mg/kg Pg油(FU)n＝11。结果呈现为平均值±SEM。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。未发现显著差异。

图6C为示出在创伤后12个月进行的巴恩斯迷宫(BM)测试中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。在采集期后的以下4个连续时间点对小鼠进行测试：1天、2天、3天和4天。测试了以下组：Sham；Sham+媒介物；CHI+媒介物；以及CHI+200mg/Kg Pg油，在受伤后2周治疗，加上受伤后1年每周一次的一个剂量作为后续(FU)治疗。结果为4次重复测试的总结。Shamn＝5；Sham+媒介物n＝5；CHI+媒介物n＝11；CHI+200mg/kg Pg油(FU)n＝11。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05。P值是指组(CHI+媒介物)与(CHI+200mg/Kg Pg油)组在指定时间点的比较。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。

图6D为示出在习得后24h和创伤后12个月进行的巴恩斯迷宫(BM)回忆测试中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。测试了以下组：Sham；Sham+媒介物；CHI+媒介物；以及CHI+200mg/Kg Pg油，在受伤后2周治疗，加上受伤后1年每周一次的一个剂量作为后续(FU)治疗。Sham n＝5；Sham+媒介物n＝5；CHI+媒介物n＝11；CHI+200mg/kg Pg油(FU)n＝11。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05。P值是指组(CHI+媒介物)与(CHI+200mg/Kg Pg油)组在指定时间点的比较。单向Anova，随后进行Fisher氏LSD检验。

图7A为示出在创伤后9个月进行的巴恩斯迷宫(BM)测试中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。在采集期后的以下4个连续时间点对小鼠进行测试：1天、2天、3天和4天。测试了以下组：Sham；Sham+媒介物；CHI+媒介物；以及CHI+500mg/kg Pg油。结果为4次重复测试的总结。Sham n＝5；Sham+媒介物n＝5；CHI+媒介物n＝12；CHI+500mg/kg Pg油n＝12。结果呈现为平均值±SEM。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。未发现显著差异。

图7B为示出在学习完成后24小时(24h)和7天(7d)进行的巴恩斯迷宫(BM)回忆测试(自创伤起9个月和最后一次用Pg油治疗后8.5个月回忆)中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。测试了以下组：Sham n＝5；Sham+媒介物n＝5；CHI+媒介物n＝12；CHI+500mg/kg Pg油n＝12。结果呈现为平均值±SEM。组(p＝0.01)与回忆时间(p＝0.002)的显著主效应。[**]指示P值<0.01(CHI+媒介物24h与7天的比较)。所有其他组(包括Sham、Sham+媒介物和CHI+500Pg mg/kg油)在24h与7天回忆之间未显示出显著差异。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。

图8为示出新物体识别(NOR)测试的结果的图。结果呈现为识别新物体所花费的时间占总时间的百分比。测试了以下组：Sham；Sham+媒介物；CHI+媒介物；CHI+500mg/kg Pg油；CHI+200mg/kg Pg油。使用两个不同批次的Pg油对用500mg/kg剂量治疗的动物进行测试。Sham：n＝14轮-4；Sham+媒介物：n＝34轮＝6；CHI+媒介物：n＝44轮-6；CHI+500mg/kg Pg油：n＝38轮-4；CHI+200mg/kg Pg油n＝15轮-3。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05，[***]指示P值<0.001，并且[****]指示P值<0.0001。双向ANOVA分析，随后进行Fisher氏LSD检验。

图9为示出创伤后一个月和最后一次用Pg油治疗后18天进行的Y迷宫测试中的平均偏好指数(PI)的图。测试了以下组：Sham：n＝19轮-4；Sham+媒介物：n＝32轮＝6；CHI+媒介物：n＝39轮-6；CHI+500mg/kg Pg油：n＝32轮-4；CHI+200mg/kg Pg油：n＝19轮-3。结果呈现为平均值±SEM。[**]指示P值<0.01，并且[***]指示P值<0.001。单向ANOVA，随后进行Fisher氏LSD检验。

图10A为示出在创伤后2周和最后一次用香茅醇治疗后3天进行的巴恩斯迷宫(BM)习得测试中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。在采集期后的以下4个连续时间点对小鼠进行测试：1天、2天、3天和4天。测试了以下组：CHI+媒介物n＝3；CHI+125mg/kg香茅醇n＝5；以及CHI+50mg/kg香茅醇n＝5；所有组均进行一轮。结果为4次重复测试的总结。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05(CHI+媒介物与治疗组的比较)。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。

图10B为示出在学习完成后24小时(24h)和7天(7d)(分别自香茅醇治疗结束时起7天和14天)进行的用于记忆评定的巴恩斯迷宫(BM)回忆测试(回忆2周)中以秒(sec)为单位的逃避潜伏期的图。测试了以下组：CHI+媒介物：n＝3；CHI+125mg/kg香茅醇：n＝5；以及CHI+50mg/kg香茅醇：n＝5；所有组均进行一轮。结果呈现为平均值±SEM。混合效应分析，随后进行Fisher氏LSD检验。未检测到显著差异。

图11A为示出以下小鼠组中呈现为占全脑病灶面积的百分比的病灶体积的图：CHI+媒介物：n＝10轮-3；CHI+500mg/kg Pg油：n＝6轮-2；以及CHI+200mg/kg Pg油：n＝6轮-2。结果呈现为平均值±SEM。

图11B为示出以下小鼠组中的左脑室体积(mm²)的图：Sham：n＝6轮-2；CHI+媒介物：n＝10轮-3；CHI+500mg/kg Pg油：n＝6轮-2；以及CHI+200mg/kg Pg油：n＝6轮-2。结果呈现为平均值±SEM。

图12A至12C为示出以下小鼠组中左半球海马的各个区域(CA1(图12A)、DG(齿状回)(图12B)和CA3(图12C))中的细胞数量(平均神经元数量)的图：Sham：n＝7轮-2；Sham+媒介物：n＝6轮-3；CHI+媒介物：n＝9轮-3；CHI+500mg/kg Pg油：n＝7轮-3；以及CHI+200mg/kgPg油：n＝6轮-2。结果呈现为平均值±SEM，使用双向ANOVA，随后进行Fisher氏LSD检验。[*]指示P值<0.05，[**]指示P值<0.01，并且[***]指示P值<0.001。

图13A至13C为示出以下小鼠组中右半球海马的各个区域(CA1(图13A)、DG(图13B)和CA3(图13C))中的细胞数量(平均神经元数量)的图：Sham：n＝7轮-2；Sham+媒介物：n＝6轮-3；CHI+媒介物：n＝9轮-3；CHI+500mg/kg Pg油：n＝7轮-3；以及CHI+200mg/kg Pg油：n＝6轮-2。结果呈现为平均值±SEM，使用双向ANOVA，随后进行Fisher氏LSD检验。[*]指示P值<0.05，[**]指示P值<0.01，并且[***]指示P值<0.001。

图14为示出同侧皮质中GFAP染色强度(％平均强度)的图。测试了以下组：Sham n＝4；Sham+媒介物n＝3；CHI+媒介物n＝7；CHI+500mg/kg Pg油n＝7；以及CHI+200mg/kg Pg油n＝4；所有组均进行2轮。结果呈现为百分比平均值±SEM。[*]指示P<0.05，[***]指示P值<0.001，并且[****]指示P值<0.0001。单向ANOVA，随后进行Fisher氏LSD检验。

图15A至15C为示出通过测量同侧皮质区域中的NeuN染色所确定的细胞数量的图：额叶皮质(15A)、前肢皮质(15B)和顶叶皮质(15C)。测试了以下组：Sham n＝3；CHI+媒介物n＝3；以及CHI+500mg/kg Pg油n＝5；所有组均进行一轮。结果呈现为平均值±SEM。[**]指示P值<0.01。

图16A至16C为示出通过测量对侧皮质区域中的NeuN染色所确定的细胞数量的图：对侧额叶皮质(16A)、对侧前肢皮质(16B)和对侧顶叶皮质(16C)。测试了以下组：Sham n＝3；CHI+媒介物n＝3；以及CHI+500mg/kg Pg油n＝5；所有组均进行1轮。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05。

图17A至17C为示出同侧皮质区域中NF200染色的平均强度的图：额叶皮质(17A)、前肢皮质(17B)和顶叶皮质(17C)。测试了以下组：Sham n＝3；CHI+媒介物n＝3；以及CHI+500mg/kg Pg油n＝5；所有组均进行一轮。结果呈现为平均值±SEM。P值示于图中。

图18A至18C为示出对侧皮质区域中NF200的平均强度的图：对侧额叶皮质(18A)、对侧前肢皮质(18B)和对侧顶叶皮质(18C)。测试了以下组：Sham n＝3；CHI+媒介物n＝3；以及CHI+500mg/kg Pg油n＝5；所有组均进行一轮。结果呈现为平均值±SEM。P值示于图中。

图19A至19B为示出同侧(19A)和对侧(19B)皮质中表达CREB的平均细胞数量的图。测试了以下组：Sham n＝3；CHI+媒介物n＝3；以及CHI+500mg/kg Pg油n＝5；所有组均进行一轮。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05。在图19A中，P值示于图中。

图20A至20D描述了小胶质细胞分支长度和端点。图20A和20B为骨架化小胶质细胞的图示。20A-Sham手术小鼠；20B-CHI小鼠的皮质病灶。图20C和图20D为示出病变皮质区域中Iba-1阳性细胞的分支长度/细胞(μm)(20C)和端点/细胞的数量(20D)的图。测试了以下组：Sham n＝5；CHI+媒介物n＝4；以及CHI+500mg/kg Pg油n＝5；所有组均进行一轮。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05，[**]指示P值<0.01，[***]指示P值<0.001，并且[****]指示P值<0.0001。

图21A至21B为示出左侧皮质的病变区域中用Iba-1阳性染色的小胶质细胞的细胞计数(细胞数量)(21A)以及双阳性(CD206+和Iba-1+)的小胶质细胞占Iba-1+细胞总数的百分比(21B)的图。Sham n＝5，CHI+媒介物n＝4，以及CHI+500mg/kg Pg油n＝5，所有组均进行一轮。结果呈现为平均值±SEM。[*]指示P值<0.05，[**]指示P值<0.01，并且[****]指示P值<0.0001。

图22为示出在20μg/ml Pg油存在下或在媒介物存在下BV2小鼠小胶质细胞对pHrodo红色大肠杆菌生物颗粒的吞噬作用的时程(小时)的图。吞噬作用已被量化为每个时间点的总积分荧光，平均值±SEM，n＝3个孔。

图23为示出TBI后24小时取自左侧皮质的皮质蛋白质中的相对(％)TNFα水平的图。在TBI之前2天和TBI当天(总共3次治疗)，用500mg/kg Pg油对以下小鼠组进行治疗：Sham+媒介物；TBI+媒介物；以及TBI+Pg。结果呈现为两次独立实验的平均值±SEM，每个治疗组总共包括10只动物(每个实验5只小鼠)。利用ELISA测定TNFα水平。使用180μg皮质蛋白质对每只动物进行一式两份测试。Sham+媒介物组中的TNFα水平被视为100％。100％＝42.72pg TNFα/μg蛋白质。ANOVA，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。*p<0.05。

图24A和24B为示出TBI后11天取自左侧皮质的TNFαpg/μg皮质蛋白质(图24A)或取自左侧海马的海马蛋白质(图24B)的图。从TBI后一天开始，在以下小鼠组中用500mg/kg Pg油治疗小鼠9次：Sham+媒介物；不具有媒介物的Sham；TBI+媒介物；以及TBI+Pg油。结果呈现为每个治疗组中所有动物的平均值±SEM(每个治疗组中有3只至4只动物)。结果表示进行一式两份测试的单个体内实验。使用180μg皮质蛋白质和159μg海马蛋白质通过ELISA测定TNFα水平。ANOVA，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。***p<0.001。

图25为示出TBI后30天的TNFαpg/μg皮质蛋白质的图。从TBI后一天开始，小鼠接受用500mg/kg Pg油治疗9次。在以下小鼠组中，小鼠每天或每三天接受治疗，在12天内总共治疗9次：Sham+媒介物；TBI+媒介物；以及TBI+Pg。结果呈现为每个治疗组中所有动物的平均值±SEM(每个治疗组中有4只动物)。进行一式两份测试的单个体内实验。使用180μg皮质蛋白质通过ELISA测定TNFα水平。ANOVA，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。***p<0.001。

图26A和26B为示出以下小鼠实验组中在TBI后11天得到的左侧皮质(图26A：pg/μg皮质蛋白质，2个体内实验)和左侧海马(图26B：pg/μg海马蛋白质，1个体内实验)中的IL-1β水平：Sham(具有和不具有媒介物)；TBI+媒介物；以及TBI+Pg油。在TBI后24小时对小鼠进行治疗，在TBI后12天内总共进行9次治疗。结果呈现为每个治疗组中所有动物的平均值±SEM(在每个组中，n＝3)。对每只动物进行一式两份测试。使用180μg皮质匀浆和30μg海马匀浆通过ELISA测定IL-1β水平。ANOVA，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图26C为示出以下小鼠实验组中在TBI后一个月的左侧皮质中的IL-1β水平(pg/μg皮质蛋白质)的图：Sham(具有和不具有媒介物)；TBI+媒介物；以及TBI+Pg油(500mg/kg)。在TBI后24小时对小鼠进行治疗，在TBI后12天内总共进行9次治疗。结果呈现为每个治疗组中所有动物的平均值±SEM(在每个组中，n＝4)。对每只动物进行一式两份测试。使用45μg皮质匀浆通过ELISA测定IL-1β水平。ANOVA，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。

图27为示出TBI后48小时取自左侧海马的海马蛋白质中IL-1β的相对水平的图。在以下小鼠组中，在TBI之前2天和TBI当天用500mg/kg Pg对小鼠进行预治疗(总共治疗3次)：Sham+媒介物；TBI+媒介物；以及TBI+Pg油。结果呈现为每个实验组中所有动物的平均值±SEM(在每个组中，n＝5)。使用30μg海马匀浆每只动物进行一式两份测试。Sham+媒介物组中的IL-1β水平被视为100％。100％为121.33pg IL-1β/μg蛋白质。ANOVA，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。*P<0.05。

图28为示出TBI后30天的IL-1βpg/μg皮质蛋白质的图。在以下小鼠组中，在TBI之后一天对小鼠进行治疗(在12天内治疗9次)：Sham；TBI+媒介物；以及TBI+200mg/kg Pg油。结果呈现为每个治疗组中所有动物的平均值±SEM(每个治疗组中有3只至5只动物)。进行一式两份测试的单个体内实验。使用45μg皮质匀浆通过ELISA测定IL-1β水平。ANOVA，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。**P<0.01；***P<0.001。

图29为示出TBI后24小时的IL-6水平(pg/μg皮质蛋白质)的图。在以下小鼠组中，在TBI之前2天和TBI当天对小鼠进行预治疗(总共治疗3次)：Sham+媒介物；TBI+媒介物；以及TBI+500mg/kg Pg油。结果呈现为每个治疗组中所有10只至12只动物的平均值±SEM(在两个体内实验中n＝10，每个治疗组有5只动物)。对每只动物进行一式两份测试。使用90μg皮质匀浆通过ELISA测定IL-6水平。ANOVA，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。***P<0.001。

图30为示出TBI后48小时取自左侧皮质的皮质蛋白质中的相对(％)IL-6水平的图。在以下小鼠组中，在TBI之前2天和TBI当天施用Pg油(总共治疗3次)：Sham+媒介物；TBI+媒介物；以及TBI+500mg/kg Pg油。结果呈现为每个治疗组中所有10只至12只动物的平均值±SEM(在两个体内实验中n＝10，每个治疗组有5只动物)。对每只动物进行一式两份测试。使用90μg皮质匀浆通过ELISA测定IL-6水平。“Sham+媒介物”组中的IL-6水平被视为100％。100％为43.94pg IL-6/μg蛋白质。ANOVA，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01。

图31为示出以下小鼠组中在TBI之后11天的皮质中乙酰胆碱酯酶(AchE)活性(mU/mL)的图：Sham组；TBI+媒介物；以及TBI+500mg/kg Pg油。结果呈现为对每个治疗组中的一只动物进行一式两份测试所得到的平均值±S.D.。使用100μg皮质匀浆。

图32为示出以下小鼠组中在TBI之后30天的皮质中脂质过氧化(μM MDA)的图：Sham；以及TBI+0mg/kg、200mg/kg或500mg/kg Pg油。结果呈现为平均值±SEM。对每个实验组中的四只小鼠进行测试。对每只小鼠重复测试4次。使用190μg皮质蛋白质。ANOVA，随后进行Tukey-Kramer多重比较检验。***p<0.001。

图33为示出以下小鼠组中在TBI之后30天的皮质和海马中磷酸化CREB/总CREB的比率的图：TBI+媒介物；以及TBI+Pg油。结果呈现为平均值±S.D.。一个体内实验，3只至4只小鼠/组。学生t检验*p<0.05。

具体实施方式

本发明基于以下出人意料的发现：在闭合性头部损伤(TBI的动物模型)之前或之后用从植物香叶天竺葵(Pg)中提取的精油饲喂小鼠，显著改善了它们在即时(短期)和长期行为测试中的学习和记忆表现并降低它们的焦虑，以及皮质和海马的各种生化参数。

因此，在其第一方面，本发明提供了一种用于治疗、预防或改善受试者的创伤性脑损伤症状的药物或营养组合物，该组合物包含从香叶天竺葵中提取的精油以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

如本文所用，术语“药物组合物”是指包含香叶天竺葵(Pg)精油的组合物，其中所述组合物作为药物提供。如本文所用，术语“营养组合物”是指包含香叶天竺葵(Pg)精油的组合物，其中所述组合物作为食品补充剂、营养添加剂、食品或饮料提供。在一些实施例中，通过加入活性化合物(例如，香茅醇)，从而提高组合物中活性化合物(例如，香茅醇)的浓度，来富集本发明的组合物。

如本文所用，术语“香叶天竺葵(Pg)”是原产于南非但现在可见于世界各地的天竺葵属物种。

术语“香叶天竺葵(Pg)精油”或“香叶天竺葵(Pg)油”在本文中可互换使用并且是指Pg植物叶子的提取物。精油可使用本领域已知的任何方法从植物叶子中提取，例如使用蒸汽蒸馏或水蒸气蒸馏设备(参见例如Elmann等人[9]或[10]，其通过引用并入本文)。蒸馏设备的非限制性实例为水蒸气蒸馏Clevenger设备系统。

从植物香叶天竺葵中提取的精油是一种确定的植物化学物质混合物[参见例如11、12]。在一个实施例中，精油的含量可通过气相色谱-质谱法(GC-MS)来鉴定。精油含量的非限制性实例提供于实例1表1中。其特征在于低分子量分子(约150)。由于精油组分的低分子量和亲脂性，它们可以穿过血脑屏障并且影响脑中的过程和细胞。

Pg的精油被FDA定义为GRAS(一般认为安全)，因此在食品行业中消费和使用是安全的。

术语“治疗”、“预防”或“改善”为常规使用的，并且是指为了对抗、减轻、减少、缓解或改善受试者的创伤性脑损伤或其任何症状而对受试者进行管理或护理。该术语还涵盖对处于TBI风险中的受试者的预防性治疗。该术语涵盖受试者的创伤性脑损伤或其任何症状的任何减少，如例如通过脑损伤的认知、生理、放射学(例如，通过磁共振成像(MRI))和/或临床指标的测量结果所证明的。

如本文所用，术语“创伤性脑损伤(TBI)”是指由外力诸如对头部的直接冲击(打击、碰撞或震击)、快速加速、爆炸波或到达脑组织的颅骨穿透所引起的大脑正常功能的破坏。TBI可能与指示正常大脑功能发生改变的特征性认知、情绪、身体、社交和行为症状相关联：意识丧失或下降、记忆丧失(遗忘症)、局灶性神经功能缺损(诸如肌无力)、视力丧失、言语变化和/或精神状态改变(诸如定向障碍、思维迟缓、难以集中注意力、睡眠障碍、焦虑、情绪障碍和/或社会交往)。

TBI的损伤严重程度可为轻度(例如，脑震荡)、中度或重度，具体取决于大脑损伤的程度。轻度病例可能导致精神状态或意识短暂改变，随后完全恢复。重度病例可能导致永久性残疾、长期意识丧失、昏迷或甚至死亡。

如以下实例中所示，用本发明的Pg油治疗遭受闭合性头部损伤的小鼠(作为创伤性脑损伤的模型)的小鼠引起创伤后短期和长期认知功能的显著改善。

因此，本发明还提供了一种用于改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的药物或营养组合物，该组合物包含从香叶天竺葵中提取的精油以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

如本文所用，术语“改善”是指遭受TBI的受试者中发生的认知减退的任何改善、消除、补救或减缓。改善可表现为例如学习、记忆或集中注意力的能力增强。文献中已知多种测试用于评定遭受TBI的受试者的认知功能。可采用这些测试中的任一者来评定受试者的认知状态或功能的改善，并且由医师自行决定选择最合适的工具。非限制性实例包括主要用于检测轻度认知障碍的MoCA(蒙特利尔认知评定)测试、主要用于发现更严重的认知障碍的MMSE(简易精神状态检查)测试、Mini-Cog评估等。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于改善遭受创伤性脑损伤的受试者的长期认知功能的药物或营养组合物，该组合物包含从香叶天竺葵中提取的精油以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

如本文所用，术语“长期”是指治疗不仅在创伤后立即影响认知功能，而且在更长时间段内影响认知功能的能力。该术语可以指创伤后几个月，例如但不限于两个月、六个月、九个月、12个月或更长时间。

本发明的组合物可以按原样施用，或者可以掺入到食品、饮料(例如，果汁)中或与常用的食品添加剂例(如，玉米糖浆)组合。

在一个实施例中，本发明的组合物为通过饲喂施用的营养组合物。

在其他实施例中，本发明的组合物为能够根据良好医疗实践施用和给药的药物组合物。例如，可通过任何合适的途径将药物组合物引入体内，这些途径包括口服、腹膜内、皮下、经皮、局部、肌内、关节内、结膜下或黏膜(例如，鼻内)或眼内施用。组合物可以全身施用，或可以局部施用。可通过使用用于将活性剂量保留在植入部位的植入物来促进局部施用。活性剂可以被调配成立即活性，或者可以被调配成缓释。

在又一些进一步的实施例中，本发明的组合物可任选地进一步包含药学上可接受的载剂、赋形剂、添加剂、稀释剂和佐剂中的至少一者。

更具体地，根据本发明的用于治疗有此需要的受试者的药物组合物(其可以方便地以单位剂型存在)可根据制药行业中众所周知的常规技术来制备。此类技术包括将活性成分与药物载剂或赋形剂混合的步骤。一般而言，通过使本发明的活性成分与液体载剂或细分散的固体载剂或两者均匀且紧密地结合，然后如果需要，使产物成形来制备制剂。

组合物可以配制成许多可能的剂型(诸如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、鼻喷雾剂、滴鼻剂、软凝胶、栓剂、贴剂和灌肠剂)中的任一者。

Pg油提取物可通过与适当的媒介物溶液(例如，油性溶液，包括但不限于任何植物来源的精油或中链甘油三酯(MCT))混合以稀释至所需的最终浓度。在一个实施例中，在橄榄油中稀释Pg。如下文实例部分中所用，术语“媒介物”是指作为不包含活性剂的对照给予动物的橄榄油。

除了上文特别提到的成分之外，制剂还可以包括考虑到所讨论的制剂类型的本领域中常规的其他药剂。

更进一步，本发明的组合物及其任何组分可以作为单次日剂量或多次日剂量施用。

可以在创伤后立即施用组合物，持续约5天至约四周之间或更长时间的治疗期。在一个实施例中，在创伤后立即每天或每两天或三天一次施用组合物，持续10天至14天的时间段。在一个实施例中，在创伤之后立即开始(即在几分钟或几小时内)或在创伤后一天，提供总共在5次与15次之间的治疗。本领域技术人员将认识到首次治疗越早给予越好。因此，在具体实施例中，向受试者提供总数为5次、或6次、或7次、或8次、或9次、或10次、或11次、或12次、或13次、或14次、或15次或更多次的每日治疗。在具体实施例中，治疗期包括在8次与12次之间的每日治疗。在另一具体实施例中，治疗期包括9次每日治疗。在一些实施例中，可以在创伤后在约一个月与约一年之间向受试者给予一个或多个另外的治疗期。在一个实施例中，该另外的治疗期包括在约两周的时间段内给予在8次与12次之间的每日治疗。在一个实施例中，该另外的治疗期在损伤后9个月给予，并且包括在约两周的时间段内给予的约9次每日治疗剂量。在一个实施例中，“每日治疗”是指每天施用一次Pg油。在其他实施例中，“每日治疗”是指每天施用两次或三次Pg油。

在另一实施例中，组合物作为对处于颅脑损伤或TBI风险中的受试者(例如，士兵、警察、消防员或运动员)的预防性治疗来施用。在具体实施例中，受试者在预期的风险事件前几天开始接受在1天与5天之间的每日治疗。在一个实施例中，受试者在风险事件前两天开始接受总共三次的每日治疗。

在另一实施例中，组合物经施用无限制的时间段(也称为长期施用)，例如持续一年、两年或更长时间。在一个实施例中，在初始强化治疗期后，组合物可每周给予一次，持续所需的时间长度(例如，一年、两年或更长时间)，在本文中也称为“慢性治疗”。例如，组合物可作为经常食用的食品补充剂来给予。

本发明的组合物可单独施用，或者与其他活性剂组合施用。在某些实施例中，另外的活性剂包括但不限于香茅醇、3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(TTF)或类固醇。

本发明的组合物可与其他类型的治疗组合，这些治疗包括行为疗法、康复疗法、饮食限制和药物干预。

在另一方面，本发明提供了一种治疗、预防或改善TBI症状的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的香叶天竺葵精油。

术语“施用”意指通过有效实现所需结果的任何手段或途径向受试者递送组合物，包括例如口服、肠胃外、肠内、腹膜内、局部、透皮(例如，使用任何标准贴剂)、皮下、静脉内、动脉内、肌内、颊面、舌下、眼、鼻、通过气雾剂、通过吸入、直肠、阴道和鞘内。

在一些实施例中，本发明的组合物每天、或每两天或三天一次以在约1mg/kg至50mg/kg之间的量向人类受试者施用，具体取决于受试者的身体状况、疾病的严重程度、施用模式等。在具体实施例中，本发明的组合物每天、或每两天或三天一次以约16mg/kg(其大约对应于小鼠中200mg/kg的量)或约40mg/kg(其大约对应于小鼠中500mg/kg的量)向人类受试者口服施用。在一个实施例中，本发明的组合物每天或每两天或三天一次以约41mg/kg的量向人类受试者施用。在一个实施例中，本发明的组合物每天、或每两天或三天一次以在约1mg/kg与5mg/kg之间(例如，1.6mg/kg或4.1mg/kg)的量经鼻内向人类受试者口服施用。在一个实施例中，本发明的组合物每天、或每两天或三天一次以在约0.1％与10％之间(单位吸入体积的精油％)的量通过吸入向人类受试者口服施用。组合物可在任何合适的时间(例如，餐前或餐后、活动前、睡觉前以及在一天中的不同时间(例如，在早晨、在晚上等))施用。

在另一方面，本发明提供了一种用于治疗、预防或改善受试者的创伤性脑损伤的症状的药物或营养组合物，该组合物包含分离的香茅醇以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

在另一方面，本发明提供了一种治疗、预防或改善TBI的症状的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的分离的香茅醇。

在一些实施例中，包含分离的香茅醇的组合物每天、或每两天或三天一次以在约1mg/kg至15mg/kg之间的量向人类受试者施用。在具体实施例中，本发明的组合物每天、或每两天或三天一次以约4mg/kg(其大约对应于小鼠中50mg/kg的量)或约10mg/kg(其大约对应于小鼠中125mg/kg的量)经口服向人类受试者施用。在一个实施例中，治疗期包括在约10天与16天的时期内进行在5次与15次之间的治疗，例如在14天的时期内进行9次治疗。

在另一实施例中，组合物经施用无限制的时间段(也称为长期施用)，例如持续一年、两年或更长时间。在一个实施例中，在初始强化治疗期后，组合物可每周给予一次，持续所需的时间长度(例如，一年、两年或更长时间)，在本文中也称为“慢性治疗”。

在一个实施例中，本发明的组合物每天、或每两天或三天一次以在约0.1mg/kg与1.5mg/kg之间(例如，0.4mg/kg或1.0mg/kg)的量经鼻内向人类受试者口服施用。

实例

实例1

Pg精油的制备

植物材料生产：将来自Newe Ya'ar活植物收集的Pg品种无性繁殖(通过切茎生根)并且在Newe Ya'ar研究中心的实验田中种植。通过滴灌系统完成灌溉施肥。

精油生产：蒸汽蒸馏是在精油中试工厂中使用Clevenger设备系统进行的。将30kg新鲜叶和茎在130L容器中蒸馏2.0h。萃取后，将油冷却并且与水相分离。收集精油，并且将其避光储存于4℃至6℃，以免快速氧化。

精油分析：使用配备自动进样器Combi PAL(CTC Analytic,CH-zwingen)和Rtx-5SIL MS毛细管柱(95％二甲基/5％二苯基聚硅氧烷，30m×0.25mm内径×0.25Pm膜厚)的气相色谱-质谱仪(GC/MS)(安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托)对精油的挥发性化合物进行定性和定量分析。挥发性化合物的鉴定是基于使用MSDChem软件(安捷伦)与NIST/WILEY谱库进行的质谱图比较以及相对保留指数。

Pg油的两种单独制备物(命名为ND-4100和ND-4482)的组成如表1所示。

表1

实例2

在闭合性头部损伤(CHI)的动物模型中测试Pg精油治疗对短期和长期认知功能的功效

动物和伦理声明

本研究获得舍巴医疗中心(Sheba Medical Center)机构动物伦理委员会的批准，并且符合美国国家研究委员会实验动物护理和使用指南的指导原则(NIH批准号OPRR-A5011-01)。体重为20克至25克的雄性C57BL/6JOlaHsd小鼠(8周龄至9周龄)购自以色列Envigo，并且用于所有实验中。将小鼠维持在受控的12小时(h)光照/12h黑暗周期下，随意提供食物和水。

闭合性头部损伤(CHI)模型

试验性CHI通过使用改良的落体撞击装置来诱导(Chen等人[13]；Flierl等人[14])。简言之，在3％异氟烷麻醉和补充氧气下(如对捏爪失去反应所确认的)，进行中线纵切口并且暴露颅骨。将聚四氟乙烯尖锥(直径2mm)倒置放置在中线外侧2mm和中冠状面前囟后2mm处。将头部固定在适当位置，并且使95克重物从预先设定的高度自由落体到锥体上，导致左半球局部损伤。自由落体重物的高度由小鼠的体重和所需的CHI严重程度决定。在本实验中，选择6.5cm至7cm的自由落体来诱导中度神经系统损伤(损伤后1小时的NSS为6至7)。Sham小鼠经麻醉并且经受与上文所述相同的皮肤切口，无进一步创伤。在小鼠经过CHI并且从麻醉中恢复(约2min内)后，对其用95:5氧气:CO2供氧30sec(经由面罩)，然后将其放回其家笼。在CHI后1h，对NSS进行评估。将严重程度评分为9或10的小鼠排除在研究之外。损伤后，用安乃近(500mg，在250ml饮用水中)镇痛1d。对表现出呼吸暂停的动物进行仔细监测，并在恢复足够的氧合后将其放回笼中。

Pg油治疗：

将小鼠分为7个不同的组：

·损伤后，将TBI小鼠(受到创伤的小鼠，即在闭合性头部损伤(CHI)模型中遭受创伤性脑损伤(TBI)的小鼠)用500mg/Kg Pg油治疗2周

·TBI小鼠在受伤后用200mg/Kg Pg油治疗2周

·TBI小鼠在受伤前用200mg/Kg Pg油治疗3天并且在受伤后治疗2周

·TBI小鼠在受伤后用200mg/Kg Pg油治疗2周，加每周一次一剂，持续1年

·仅用媒介物溶液治疗的TBI小鼠(TBI+媒介物)

·Sham：无头部创伤并且未接受媒介物治疗的小鼠

·无头部创伤、用媒介物治疗的小鼠。

对于200mg/Kg和500mg/Kg处理组，将Pg油提取物用橄榄油稀释至最终浓度分别为26mg/ml和52mg/ml。在治疗期期间每天将Pg油新鲜稀释在玻璃小瓶中，并且通过经口管饲以200μl的当量体积作为媒介物溶液施用。

对所有实验组进行随访并且进行以下测试：

(i)神经功能缺损评分：

根据神经行为评分(称为神经功能缺损评分(NSS))评估小鼠的功能状态，该评分由评定反射、警觉性、协调性和运动能力的多项测试组成。该评分为10分制，其基于某些反射的存在以及执行运动和行为任务的能力，诸如横木行走、平衡木和自发运(Beni-Adani等人,2001[15]；Flierl等人,2009[14])。动物因未能执行任务而获得一分，因此NSS随着功能障碍的严重程度增加而增加。在CHI后1小时获得的NSS反映了损伤的初始严重程度(Tsenter等人,2008[16])。

(ii)认知评估，包括以下行为测试：

巴恩斯迷宫(BM)和探索策略：

BM测试基于小鼠在暴露于环境干扰时隐藏的本能，并且用于测试空间学习和记忆。迷宫由周边有孔的升高的圆形平台和小的黑色隐藏目标箱组成。强光和嫌恶的噪声(85dB)迫使动物逃离开放的平台表面以寻找暗室(21×22×21cm)“目标箱”所在的洞。动物房周围放置具有不同颜色和形状的视觉线索。将小鼠放置在迷宫中心的圆柱形黑色出发室下。10sec后，提起该腔室，打开蜂鸣器，并且使小鼠探索迷宫3min。当小鼠到达目标箱或经过3min后，试验结束。进入目标箱后，立即关闭蜂鸣器，并且使小鼠在其中停留1min。动物每天经过4次试验，持续4天，其中试验间的间隔为15min。回忆测试(探针)如下进行：在最后一次习得训练期后24h和七天，对小鼠进行3min探索试验，其中逃生通道未从设备上移除。进行探索试验的方式与习得试验类似。

对于探索试验，记录首次到达逃生箱的延迟时间。

进行巴恩斯迷宫测试：

1)在第14天至第17天之间(2周)，加上受伤后第18天和第25天的回忆测试，总共6轮。

2)在第54天至第57天之间(2个月)，加上受伤后第58天和第65天的回忆测试，总共2轮。

3)在第183天至第186天之间(6个月)，加上受伤后第187天和第194天的回忆测试，总共2轮。

4)在第277天至第280天之间(9个月)，加上受伤后第281天和第288天的回忆测试，总共1轮。

使用Ethovision XP10软件(诺达思，荷兰)分析所采集的视频，以便随后评估用于定位目标箱的策略。简言之，小鼠利用一系列不同的搜索策略(从随机搜索(st.1)、随机和系列搜索(st.2)、连续搜索(st.3)和空间搜索(st.4))以学习目标箱的位置。当试验开始后，小鼠立即转向“正确”象限(其包括目标箱和两侧的两个相邻孔)，从而确定空间搜索(st.4)。当小鼠在不知道确切位置的情况下通过以连续方式一个接一个地探索洞来寻找目标箱时，将其确定为连续搜索(st.3)。当小鼠既不知道目标箱的位置，也不使用有效的搜索策略(诸如连续搜索)来定位目标箱时，将其确定为随机搜索(st.1)。这些小鼠通常在活动场中随意游荡。最后，当小鼠使用连续搜索并且在活动场上随机移动时，将其确定为随机搜索和连续搜索(st.2)。策略的分配是由盲态试验员进行的。这4种策略基于Fox等人(1998)[17]和Pitts(2018)[18]所述的方法并且进行了一些修改。定位目标箱所需的策略和时间代表小鼠学习能力的效率。

新物体识别测试：

进行新物体识别(NOR测试)以评定创伤后23d的短期记忆。在测试第一天，将小鼠放入测试笼(尺寸为60×25×40cm的容器)中适应1h。第二天，将它们放回同一个测试笼中，其中有两个具有相似的尺寸、表面复杂性和材料的相同物体。在总计5min期间，手动记录每只小鼠探索物体所花费的累计时间，4小时后，将每只小鼠重新放入笼中，其中熟悉的物体中的一者被替换为新的物体。与熟悉的物体相比，正常小鼠在探索新物体上花费的时间相对更多，证明了它记忆和区分新物体和熟悉物体的能力。当小鼠鼻子指向物体的方向并且小鼠正在积极地探索该物体、直接触碰该物体或靠近该物体时，确定该物体已被探索。将玩具用作NOR物体(玩具车和玩偶)。“旧”物体和“新”物体在形状、颜色、质地和材料(塑料和陶瓷)上存在显著差异，但在尺寸(每个物体约5X5X5 cm)或表面复杂性上无显著差异。记录探索每个物体(新物体或熟悉物体)所花费的时间，并且作为占总计5min时间的百分比。

对以下7个组进行NOR测试：TBI+200mg/Kg Pg油n＝20；TBI+200mg/KgPg油治疗前和治疗后n＝7；TBI+500mg/Kg Pg油n＝38；TBI+媒介物n＝45；Sham+媒介物n＝35；以及Shamn＝21。

旷场测试：

旷场测试用于评定焦虑样行为、速度和运动。该测试基于处于焦虑状态的小鼠倾向于避开开放和暴露的区域并且保持靠近外围，而处于较低焦虑状态的动物表现出兴趣并且更自由地探索该区域的倾向。为此，将小鼠放置在正方形白色有机玻璃箱活动场(尺寸为50×50×30cm)中。将较小的中心区域定义为活动场的50％。使小鼠探索围栏10min。使用EthoVision XP10软件(诺达思，荷兰瓦赫宁根)追踪和分析行为表现，包括区域偏好(中心与外围)、速度和运动。

Y迷宫测试：

在CHI后29天，进行Y迷宫空间记忆测试以评估短期空间记忆。该迷宫被设计为三个彼此成120°角的黑色有机玻璃臂(“起始”、“其他”和“新”臂)。将小鼠放置在“起始”臂处并且使其自由探索该臂和“其他”臂5min，同时“新”臂保持闭合。2min后，将小鼠放回迷宫并且使其探索所有3个臂2min。记录在每个臂中所花费的时间。短期记忆由新颖率(NR)反映，其作为在新臂中花费的时间相对于在“其他”臂加上“新”臂中所花费的总时间的比率。使用EthoVision XP10软件(诺达思)评估在每个臂中所花费的时间。

最后，进行一项实验来评估单独使用香茅醇的效果。为此，用两种不同剂量的香茅醇[Sigma-Aldrich](125mg/kg和50mg/kg)治疗小鼠(n＝5/组)。在14天治疗期期间，小鼠在创伤后通过管饲接受9次每日治疗(每天一次或每三天一次)，并且在创伤后两周的BM测试中进行评估。基于化学分析，根据香茅醇在Pg精油中的相对百分比来确定香茅醇的剂量。

结果

小鼠在创伤(闭合性头部损伤，如上文材料与方法中所述)后24小时开始用Pg精油饲喂，持续2周，总共9次日剂量。受伤后1小时、24小时、48小时、72小时、1周、两周和一个月(30天)进行NSS评估以确定临床(尤其是运动)功能。从图1中可以看出，用Pg精油(尤其是500mg/kg剂量)治疗TBI小鼠(遭受闭合性头部损伤的小鼠，CHI)可显著降低神经功能缺损评分(NSS)。

在用精油治疗后即时和之后长达两个月内所进行的行为测试中的每一者中，发现受创伤动物的学习和记忆功能得到显著改善。

在创伤(CHI)后21天进行的旷场测试中，测试组之间的总路径(图2A)和速度(图2B)无显著差异，表明在行为研究期间无运动缺陷。

在创伤后两周(最后一次使用Pg精油治疗后3天)进行的巴恩斯迷宫(BM)测试中，发现治疗组与未治疗组的受创伤动物之间存在显著差异，其中接受治疗的小鼠的学习曲线与对照组、未受伤组(Sham和Sham+媒介物)相似，并且与未治疗的小鼠相比具有更快的学习速率(图3A)，图3A中总结的结果代表4次重复实验，其中用500mg/kg Pg精油治疗的动物接受了2个不同批次/提取物的治疗。此外，在学习后7天的回忆测试中发现显著差异(图3B)。在24小时回忆测试中，在200mg/kg的较低剂量下发现学习曲线有显著改善，但是该剂量并不影响学习后7天的记忆。在习得后24h与7天之间，在用高剂量治疗的CHI之间未发现显著差异，表明该治疗组与Sham组一样具有长期记忆(图3B)。用Pg精油治疗后立即观察到的改善在创伤后两个月(治疗完成后一个月以上)也得以维持，其中接受治疗的小鼠的学习能力得以维持，并且比未治疗的小鼠表现出更好的结果(图4A和4B)。

此外，当检查小鼠的学习策略时，显而易见的是，用Pg精油(500mg/kg)治疗的遭受颅脑损伤的小鼠的学习是基于记忆，而不是如Sham动物的学习策略中所见的随机搜索(图5)。

图6A显示了创伤后六个月在BM中测试的小鼠的结果。简而言之，小鼠在受伤后接受CHI治疗，并且接受200mg/Kg Pg精油治疗2周，加上每周一次的一个剂量作为后续(FU)治疗。从图6A中可以看出，接受初始治疗和后续治疗的小鼠的表现明显好于CHI+媒介物组。

图6B显示了小鼠在完成学习后24小时(24h)和7天(7d)进行BM回忆测试(自创伤起6个月的回忆，以及最后一次用Pg精油治疗后5.5个月的回忆)的结果。从图6B中可以看出，受伤后2周接受200mg/Kg Pg精油初始治疗加每周一次的一个剂量作为后续(FU)治疗的小鼠在两个时间点(即学习完成后的24小时和7天)的表现明显好于CHI+媒介物组。

图6C显示了创伤后12个月(一年)小鼠的BM测试结果。简而言之，小鼠在受伤后接受CHI治疗，并且接受200mg/Kg Pg精油治疗2周，加上每周一次的一个剂量作为后续(FU)治疗。从图6C中可以看出，接受初始治疗和后续治疗的小鼠的表现明显好于CHI+媒介物组。图6D显示了在创伤后12个月对这组小鼠进行的BM回忆测试的结果。从图6D中可以看出，与CHI+媒介物组相比，接受初始治疗和后续治疗的小鼠具有显著更好的记忆表现。1年结果表明，使用Pg精油的治疗可在长时间段内进行，并且其效应得以维持并且仍然显著。未观察到因长期使用(1年)而导致的毒性作用或死亡。

另一组小鼠接受初始治疗期，并且在CHI后9个月接受第二治疗期。简而言之，小鼠经历CHI并且在受伤后用500mg/Kg Pg油治疗2周。创伤后九个月，小鼠接受500mg/Kg Pg的额外治疗，持续两周。

图7A显示了这些小鼠在创伤后九个月(接受第二个治疗期后)的BM测试结果。从图7A中可以看出，治疗对学习能力无显著影响。

图7B显示了小鼠在完成学习后24小时(24h)和7天(7d)进行BM回忆测试(自创伤起9个月的回忆，以及最后一次用Pg精油治疗后8.5个月的回忆，在接受第二个治疗期后立即回忆)的结果。如图7B中可以看出，经治疗的小鼠的表现明显好于CHI+媒介物组。学习完成7天后的效果尤其显著。

这些结果表明对记忆能力具有令人印象深刻的影响。

在创伤后23天进行的新物体识别(NOR)测试中，发现接受治疗的小鼠的记忆能力得到显著改善，在熟悉的物体被新物体替代后4小时，接受治疗的小鼠在新物体上花费的时间的百分比明显高于看起来对熟悉的物体无任何记忆的未经治疗的小鼠。在200mg/kg和500mg/kg的测试剂量下均观察到了这种效应(图8)。经过2周的额外治疗后，在受伤后7个月或9个月时未被注意到这些效应。

创伤后一个月和最后一次用Pg精油治疗后18天进行的Y迷宫测试中的平均偏好指数(PI)。

在创伤后一个月(治疗完成后两周)进行的空间记忆测试(Y迷宫测试)中显示，接受500mg/kg剂量治疗的小鼠在Y迷宫测试中的表现明显优于未经治疗的小鼠。接受较低剂量(200mg/kg)的小鼠也比未经治疗的小鼠表现更好，但程度不太显著(图9)。

为了评估香茅醇的效果，对小鼠进行巴恩斯迷宫(BM)习得测试，该测试在创伤后2周和最后一次用香茅醇(125mg/kg或50mg/kg)治疗后3天进行。在两种剂量下，均发现接受治疗的动物的学习曲线有显著改善(图10A)，并且仅在高剂量下的长期记忆测试中发现显著的效应(在学习完成后24小时(24h)和7天(7d)进行的BM回忆测试(回忆2周)(图10B)。

实例3

测试用Pg精油治疗的功效-生化参数

在行为实验完成后，将小鼠处死，并且对它们的大脑进行组织学和生化分析，以检查脑损伤初期和中期阶段出现的各种炎症特征。

组织学分析：病灶面积、侧脑室大小和海马细胞计数：

受伤后30d，Sham组、治疗组和媒介物对照小鼠经过深度麻醉，并且用冰冷的盐水灌注。快速取出大脑并且冷冻于-80℃，并且切成10μm的冠状切片，在前卤+1.78mm与前卤-2.54mm之间间隔开200μm。采集代表损伤区和远侧区的区域。将切片用苏木精-伊红(H&E)染色。简言之，将切片用4％PFA固定10min，洗涤，并且用苏木精(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)染色约5min，在自来水中冲洗，然后在0.3％酸性酒精中冲洗，直至背景变成无色，在自来水中洗涤，用伊红(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)染色约2min，洗涤，封固并且覆盖。使用0.5mm光学显微镜镜头捕获整个半球的图像，用于病灶和脑室测量，并且使用放大200倍的镜头捕获海马面积和细胞计数。使用ImageJ软件(国家卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达)测量目的区域(ROI)。

在CHI后30d测量侧脑室面积。通过旋转并且将对侧半球图像放置在同侧半球图像后面，并且用ImageJ软件(国家卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达)追踪和测量切片的左上角(同侧皮质)，来测量受伤后30d的受损组织(病灶面积)的百分比。通过将受伤区域的大小除以整个大脑的面积来计算病灶面积。

图11A和11B分别显示了病灶面积和左脑室容积的定量结果。使用单向ANOVA未发现各组之间存在显著差异。

受伤后30d，通过使用每个海马(同侧和对侧)的更高放大倍数的显微镜图像(放大200倍)对海马细胞进行计数。从4至5个不同切片/小鼠捕获不同区域的三张图像：CA1、CA3和DG(齿状回)。标记ROI(即CA1、CA3和DG的细胞核层)，并且使用ImageJ软件(NIH)测量面积。为了对海马神经元的数量进行计数，使用ImageJ软件(NIH)首先过滤大于20μm²的细胞核并且排除明显较小的神经胶质细胞核，然后对ROI中的神经元细胞核进行计数。TBI+200mg/Kg Pg油n＝6；TBI+500mg/Kg Pg油n＝7；TBI+媒介物n＝8；Sham+媒介物n＝6；以及Sham n＝6。

图12A至12C显示了左半球海马不同区域中的神经元细胞计数：CA1(图12A)、DG(齿状回)(图12B)和CA3(图12C)。

图13A至13C显示了右半球海马不同区域中的神经元细胞计数：CA1(图13A)、DG(齿状回)(图13B)和CA3(图13C)。

显然，治疗引起大脑中与认知功能相关的神经元数量增加。不希望受理论的约束，由于更具保护性的环境和/或源自干细胞的细胞增殖，根据较高的细胞数量可以推断出较高的细胞存活率。有趣的是，受损半球和未直接受到创伤影响的第二半球的细胞数量均较高，这表明不仅原发性损伤可以得到改善，而且由例如炎症引起的继发性损伤也可能得到改善。由于Pg治疗为全身性施用的，因此病变区域以及远侧区均受到治疗的影响。

免疫组织化学

在CHI后30d，还对脑切片进行染色，以使用各种细胞标志物进行免疫组织化学评估。简言之，将切片用4％PFA固定10min，用PBST洗涤，并且用10％正常驴血清(NDS，Abcam，英国剑桥)封闭1h，洗涤，并且在2％NDS中的包含神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP，1:1000；Dako，丹麦格洛斯楚普)、星形胶质细胞标志物CREB(1:1000，Abcam，英国剑桥)、神经丝(NF)(抗神经丝1:1000，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)、离子钙结合接头分子1(Iba-1，1:500，Abcam，英国剑桥)、CD206(1:100，美国加利福尼亚州圣克鲁斯)的抗体中暴露45min。将Dylight 488(1:300,Abcam)和Cy3(1:1000，Jackson ImmunoResearch，美国宾夕法尼亚州西格罗夫)用作二抗。为避免阳性伪影，使用赫斯特染色使细胞核显色。在荧光显微镜下平均捕获3张图像/大脑区域/侧面/小鼠，对每种抗体的暴露时间相同。使用ImageJ软件(NIH)测量特定ROI中的平均荧光值。对于GFAP染色：TBI+200mg/Kg Pg油n＝4；TBI+500mg/Kg Pg油n＝7；TBI+媒介物n＝7；Sham+媒介物n＝3；以及Sham n＝4。对于NeuN和NF染色：TBI+500mg/Kg Pg油n＝5；TBI+媒介物n＝3；Sham+媒介物n＝1；以及Sham n＝2。

图14显示了使用星形胶质细胞标志物GFAP在同侧皮质中的星形胶质细胞染色。如图所示，在用Pg治疗和用媒介物治疗的小鼠中，在损伤附近的皮质中，CHI后的GFAP染色均升高。

NeuN染色(其鉴别神经元细胞体，从而可以直接对神经元细胞进行计数)对于同侧皮质如图15所示，并且对于对侧皮质如图16所示。

NF200(神经丝)染色(其鉴别神经元轴突)对于同侧皮质如图17所示，并且对于对侧皮质如图18所示。

转录因子CREB主要在神经元中表达，并且在神经元可塑性和大脑长期记忆形成中具有明确的作用。它已被证明在空间记忆的形成中是不可或缺的。图19A显示了同侧皮质的CREB染色，并且图19B显示了对侧皮质的CREB染色。

不希望受理论的约束，这些组织学结果显示了Pg治疗的有益效果，其可以作为在TBI之后用Pg治疗的动物中发现的认知表现改善的基础。

小胶质细胞形态的共聚焦显微镜和定量

使用TCS SP8 Leica共聚焦显微镜(Leica，德国)采集图像。将相同的设置应用于同一实验中的所有图像。所有分析均使用开源ImageJ/Fiji软件进行。对于小胶质细胞形态分析，使用Iba-1阳性细胞。在能够鉴别单个细胞的区域中选择单个小胶质细胞。扣除背景并且应用阈值后，将图像转换为二进制，然后骨架化(图20A显示了Sham手术小鼠中的代表性小胶质细胞；图20B显示了受伤小鼠中的代表性小胶质细胞)。利用ImageJ/Fiji软件中的分形分析FracLac插件和Summarize骨架功能对每个细胞中的平均分支长度和平均端点数量进行定量(如Young和Morrison，2018年所述)。利用每个单独细胞的值获得每种条件和实验的组平均值和标准偏差。在ImageJ/Fiji软件中开发一个宏以自动完成分析。

对于Sham手术小鼠、受伤小鼠(CHI+媒介物)以及用500mg/kg Pg精油治疗的受伤小鼠，图20C显示了分支长度，并且图20D显示了端点数量。治疗减少了分支长度和端点数量，表明炎症反应转变为“保护”型小胶质细胞，即M2小胶质细胞。M1小胶质细胞诱导炎症和神经毒性，而M2小胶质细胞则诱导抗炎反应和神经保护作用。这些结果得到CD206阳性/Iba-1阳性染色的进一步支持(参见下一段)。CD206被广泛视为代表性M2小胶质细胞标志物。

CD206+和Iba1+双阳性小胶质细胞的细胞计数：

将相同的设置应用于所有图像。为鉴别创伤后同侧皮质中小胶质细胞的表型，使用Iba1对CD206(M2标志物)进行双重染色。使用ImageJ软件(NIH)对同时也是Iba1+的CD206+细胞进行手动计数，除以Iba1+细胞总数并且转换为百分比。

对于Sham手术小鼠、受伤小鼠(CHI+媒介物)以及用500mg/kg Pg精油治疗的受伤小鼠，图21A显示了左侧皮质病变区域的Iba-1+细胞的总数，并且图21B显示了双重细胞染色细胞(Iba-1+和CD206+)的百分比。该分析是在CHI后30天采集的脑切片上进行的。

从图21A中可以看出，正如预期的那样，病变区域周围的炎症反应升高，如小胶质细胞的数量所表示的。Pg治疗显著减少了病变皮质中小胶质细胞的数量。此外，治疗组中双重阳性细胞(iba-1阳性CD206阳性)的数量显著升高，表明M2小胶质细胞数量增加。因此，总而言之，这些结果表明Pg治疗将炎症反应免疫调节至保护性特征，而非有害和神经毒性作用。

小胶质细胞吞噬作用：

体外测试了Pg油对小胶质细胞吞噬作用的影响。使用pHrodo生物颗粒对吞噬作用进行实时活细胞定量。基于pHrodo的系统利用吞噬体的酸性环境来定量分析吞噬作用，当pHrodo生物颗粒被小胶质细胞吞噬并且进入酸性吞噬体中时，观察到荧光大幅增加。在实验之前24h，将BV2细胞(每孔10,000个细胞)接种于含有1％FBS的DMEM中。实验时，将培养基切换为EMEM，并且将10μg pHrodo红色大肠杆菌生物颗粒(Sartorius)加载到96孔板的每个孔中，并且用首先在DMSO中稀释的20μg/ml Pg油进行处理或不进行处理。利用Incucyte设备(Sartorius)、10倍物镜每30min拍摄一次照片。

图22显示了BV2小鼠小胶质细胞吞噬pHrodo红色大肠杆菌生物颗粒的时程。Pg油对小胶质细胞的吞噬活性具有显著影响。

这些结果进一步表明了使用不同测定法所得到的Pg的神经保护和抗炎效应。

统计分析：

对于统计分析，使用可商购获得的软件(StatView软件)或GraphPad Prism 9(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。治疗为自变量，并且CHI参数的结果为因变量。通过使用单向或双向方差分析及随后的Fisher氏PLSD后检验方法来检验显著性。使用重复测量ANOVA检验来评估NSS中的组主效应，并且使用BM及随后的t检验每天比较每组与媒介物对照。

海马和皮质匀浆的生化分析

对于生化分析，将大脑分成不同的脑区：右侧及左侧(损伤的同侧及对侧)皮质和海马体，并且立即冷冻于液氮中。

用于测量细胞因子和pCREB水平的皮质和海马匀浆的制备：将不同脑区的样品分别在含有[20mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM Na₂EDTA、1mM EGTA、1％Triton、2.5mM焦磷酸钠、1mMβ-甘油磷酸盐、1mM Na₃VO₄、1μg/ml亮抑酶肽]的冷裂解缓冲液(CellSignaling)中、或在根据制造商说明书由EnzChek半胱天冬酶-3试剂盒(E-13183)(包含10mM TRIS、100mM NaCl、1mM EDTA、0.001％Triton X-500)与EZBlock^TM蛋白酶抑制剂混合物(不含EDTA)(Biovision)一起制备的裂解缓冲液中均质化。皮质样品以0.065gr组织/ml的比率经历裂解，并且海马样品以0.054gr组织/ml的比例经历裂解。使用Micro-Tube均质器进行均质化。将匀浆在液氮中冷冻并且解冻三次，然后离心(10,000g，在4℃持续10分钟)，收集上清液，等分并且在-80℃冷冻。通过Bradford分析测量匀浆中的蛋白质水平。

根据制造商的说明书，使用商业ELISA试剂盒测量脑匀浆中TNF-α、IL-6、IL-1β和CREB的水平(IL-6和TNFα-法国Diaclone Research；IL-1β-加拿大R&D Systems)；Pathscanphospo-CREB和总CREB-Cell signaling，美国马萨诸塞州)。

用于酶测量的皮质和海马匀浆的制备：将皮质和海马组织在来自EnzChek半胱天冬酶-3试剂盒的裂解缓冲液中匀浆，根据制造商的说明制备20X缓冲液＝200mM TRIS，pH7.5，2M NaCl，20mM EDTA，0.2％Triton X-100)。皮质样品以0.074gr组织/ml的平均比率经历裂解，并且海马样品以0.04gr组织/ml的比率经历裂解。使用微管均质器在艾本德(Eppendorf)管中进行均质化。将匀浆在液氮中冷冻并且解冻三次，然后离心(10,000g，在4℃持续10分钟)，收集上清液，等分并且在-80℃冷冻。通过Bradford分析测量匀浆中的蛋白质水平。

使用商业试剂盒(K764，Biovision，美国加利福尼亚州)测试乙酰胆碱酯酶的酶活性。

用于测量脂质过氧化的皮质和海马匀浆的制备：在根据制造商的说明书制备并且使用氯化氢滴定至pH＝7.6的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(Cayman chemical,10010263)中，分别以0.06gr组织/ml和0.031gr组织/ml的比率将皮质和海马组织均质化。使用微管均质器在艾本德(Eppendorf)管中进行均质化。将匀浆在液氮中冷冻并且解冻三次，然后离心(1,600g，在4℃持续10分钟)，收集上清液，等分并且在-80℃冷冻。通过Bradford分析测量匀浆中的蛋白质水平。

Bradford分析：使用Bradford方法测量各种脑区和细胞裂解物中的蛋白质浓度。将BSA溶于DDW(双蒸水)中至浓度为1.4mg/ml，作为校准曲线的标准品。将20μl至30μl体积的各个样品转移至艾本德管中，加入DDW，至总体积为800μl，并且加入200μl Bradford试剂X5。将稀释的样品涡旋，然后在室温避光孵育20分钟。孵育结束时，将管再次涡旋，并且将200μl一式两份转移至96孔板中，在读板仪中在595nm波长下读数以确定蛋白质含量。

测量脂质过氧化：根据制造商的说明书，使用TBARS(硫代巴比妥酸反应物质)试剂盒(Cayman Chemicals)测量脂质过氧化。与硫代巴比妥酸(TBA)反应的化合物是脂质过氧化的副产物，并且它们可通过TBARS方法进行鉴定。该测试基于测量丙二醛(MDA)(其为脂质过氧化的常见产物)。

结果

仅分析左半球，因为这是遭受创伤的区域。

TNFα水平

如图23所示，创伤后24小时，病变皮质中促炎细胞因子TNFα的水平增加至1.6倍。用Pg油进行治疗，将这一增加幅度抑制约50％。与未受创伤的对照小鼠相比，在创伤后11天，在小鼠的皮质和海马中还观察到TNFα水平显著增加(图24)。用Pg油进行治疗，几乎完全阻止了由创伤诱导的TNFα增加。

创伤后30天，在小鼠皮质中也观察到TNFα水平显著增加(图25)。用Pg油治疗，部分抑制了由创伤诱导的TNFα增加。

IL-1β水平

用Pg油饲喂可降低创伤后11天和30天皮质中IL-1β的水平(图26A、26C)。

另外，如图26B和27所示，在创伤后48小时或11天的海马中获得了类似的结果。如图28所示，在创伤后30天用200mg/kg的较低剂量饲喂小鼠也引起皮质中的IL-1β水平降低。

IL-6水平

创伤前用Pg油饲喂可增加创伤后24小时和48小时皮质中IL-6的水平(图29和30)。

皮质中乙酰胆碱酯酶的活性

头部损伤导致神经元细胞死亡。神经元细胞死亡反映在乙酰胆碱酯酶的酶活性降低等方面。从图31中可以看出，遭受颅脑损伤的动物皮质中的酶活性低于其在未受伤的对照动物中的活性。用Pg精油饲喂可防止约50％的减少。

皮质中的脂质过氧化

从图32中可以看出，颅脑损伤导致脂质过氧化增加。用Pg油(500mg/kg)饲喂可防止约61％的创伤诱导的脂质过氧化增加。

皮质和海马中的pCREB水平

从图33中可以看出，用Pg油饲喂引起pCREB水平显著增加。

实例4

向遭受TBI的患者施用Pg精油

用本发明的Pg油治疗遭受创伤性脑损伤的患者。

该治疗是通过口服或经鼻施用并且在创伤后立即进行，随后为持续12天的治疗期，其中受试者接受总共9次治疗，每天一次或每两天或三天一次施用。施用以下剂量：5mg/kg(对于鼻内施用)和16mg/kg或40mg/kg(对于口服施用)。任选地，在受伤后9个月给予额外的40mg/kg治疗，持续两周。

患者接受认知评估以评定治疗功效。

Claims (49)

1.一种用于治疗、预防或改善受试者的创伤性脑损伤的药物或营养组合物，所述组合物包含从香叶天竺葵中提取的精油以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

2.一种用于改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的药物或营养组合物，所述组合物包含从香叶天竺葵中提取的精油以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

3.根据权利要求2所述的药物或营养组合物，其中所述认知功能为学习能力、记忆(例如，空间记忆)或焦虑中的至少一者。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中TBI是由外力、快速加速、爆炸波或到达脑组织的颅骨穿透引起的。

5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述受试者为人。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述受试者为选自由以下项组成的组的哺乳动物：绵羊、猪、牛、山羊、马、骆驼、水牛、兔、猫、犬和灵长类。

7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈食品、饮料、食品添加剂、食品补充剂、植物药物或药物组合物的形式。

8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈片剂、胶囊、液体糖浆、鼻喷雾剂、滴鼻剂、软凝胶、栓剂、贴剂和灌肠剂的形式。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物为包含药学上可接受的载剂的药物组合物。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述药物组合物通过口服、腹膜内、皮下、经皮、局部、肌内、关节内、结膜下、鼻内或眼内施用来施用。

11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物以在约1mg/kg与50mg/kg之间的浓度施用。

12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物在所述TBI之后每天施用一次、两次、三次或更多次，或者每两天或每三天施用一次，持续约5天与四周之间或更长时间的治疗期，或者以预防性方式向处于TBI风险中的受试者施用。

13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物在每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如9次每日治疗的治疗期中施用。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物在每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如9次每日治疗的治疗期中施用，随后每周一次长期施用。

15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中在所述TBI之后约4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月之间或更长时间向所述受试者施用使用所述组合物的至少一个另外的治疗期。

16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物每天一次或每两天或三天一次，以在约5mg/kg与约50mg/kg之间的浓度口服提供，持续每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如每期9次每日治疗的治疗期。

17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物每天一次或每两天或三天一次，以在约1mg/kg与约5mg/kg之间的浓度通过鼻内施用来提供，持续每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如每期9次每日治疗的治疗期。

18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物每天一次或每两天或三天一次，以在约0.1％与约10％之间的浓度通过吸入来提供，持续每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如每期9次每日治疗的治疗期。

19.根据权利要求15所述的组合物，其中在所述TBI之后9个月向所述受试者提供一个为期两周的另外的治疗期。

20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物为缓释组合物。

21.香叶天竺葵精油提取物，其用于在治疗、预防或改善有此需要的受试者的TBI的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述香叶天竺葵精油提取物。

22.香叶天竺葵精油提取物，其用于在改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述香叶天竺葵精油提取物。

23.一种治疗、预防或改善TBI的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的香叶天竺葵精油提取物或包含香叶天竺葵精油提取物的组合物。

24.一种改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的香叶天竺葵精油提取物或包含香叶天竺葵精油提取物的组合物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述认知功能为学习能力、记忆(例如，空间记忆)或焦虑中的至少一者。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述TBI是由外力、快速加速、爆炸波或到达脑组织的颅骨穿透引起的。

27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。

28.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述受试者为选自由以下项组成的组的哺乳动物：绵羊、猪、牛、山羊、马、骆驼、水牛、兔、猫、犬和灵长类。

29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述组合物呈食品、饮料、食品添加剂、食品补充剂、植物药物或药物组合物的形式。

30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述组合物呈片剂、胶囊、液体糖浆、鼻喷雾剂、滴鼻剂、软凝胶、栓剂、贴剂和灌肠剂的形式。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述组合物为包含药学上可接受的载剂的药物组合物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述药物组合物通过口服、腹膜内、皮下、经皮、局部、肌内、关节内、结膜下、鼻内或眼内施用来施用。

33.根据权利要求23至32中任一项所述的方法，其中所述组合物以在约1mg/kg与50mg/kg之间的浓度施用。

34.根据权利要求23至33中任一项所述的方法，其中所述组合物在所述TBI之后每天施用一次、两次、三次或更多次，或者每两天或每三天施用一次，持续约5天与四周之间或更长时间的治疗期，或者以预防性方式向处于TBI风险中的受试者施用。

35.根据权利要求23至34中任一项所述的方法，其中所述组合物在每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如9次每日治疗的治疗期中施用。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述组合物在每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如9次每日治疗的治疗期中施用，随后每周一次长期施用。

37.根据权利要求23至36中任一项所述的方法，其中在所述TBI之后约4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月之间或更长时间向所述受试者施用使用所述组合物的至少一个另外的治疗期。

38.根据权利要求23至37中任一项所述的方法，其中所述组合物每天一次或每两天或三天一次，以在约5mg/kg与约50mg/kg之间的浓度口服提供，持续每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如每期9次每日治疗的治疗期。

39.根据权利要求23至38中任一项所述的方法，其中所述组合物每天一次或每两天或三天一次，以在约1mg/kg与约5mg/kg之间的浓度通过鼻内施用来提供，持续每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如每期9次每日治疗的治疗期。

40.根据权利要求23至39中任一项所述的方法，其中所述组合物每天一次或每两天或三天一次，以在约0.1％与约10％之间的浓度通过吸入来提供，持续每期包括在约8次与约12次之间的每日治疗、例如每期9次每日治疗的治疗期。

41.根据权利要求37所述的方法，其中在所述TBI之后9个月向所述受试者提供一个为期两周的另外的治疗期。

42.根据权利要求23至41中任一项所述的方法，其中所述组合物为缓释组合物。

43.一种用于治疗、预防或改善受试者的创伤性脑损伤的药物或营养组合物，所述组合物包含分离的香茅醇以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

44.一种用于改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的药物或营养组合物，所述组合物包含分离的香茅醇以及一种或多种生理学上可接受的载剂。

45.分离的香茅醇，其用于在治疗、预防或改善有此需要的受试者的TBI的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述分离的香茅醇。

46.分离的香茅醇，其用于在改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述分离的香茅醇。

47.一种治疗、预防或改善TBI的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的分离的香茅醇。

48.一种改善遭受创伤性脑损伤的受试者的认知功能的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的分离的香茅醇。

49.根据权利要求43或44所述的组合物、或根据权利要求45或46所述使用的分离的香茅醇、或根据权利要求47或48所述的方法，其中所述分离的香茅醇以在约1mg/kg与15mg/kg之间、例如4mg/kg或10mg/kg的浓度施用。