CN118169381A - 一种检测血清总游离巯基的试剂盒及其应用与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测血清总游离巯基的试剂盒及其应用与方法，属于血清总游离巯基检测技术领域。所述试剂盒包括以下含量成分：0.05～1.0mmol/L的磷酸钠缓冲液和1～2.5mmol/L 2,2'‑二硫二吡啶(DTDP)工作液。本发明使用磷酸钠缓冲液、DMSO、吐温80解决了DTDP在水溶液中的溶解性问题，进而实现快速检测血清总游离巯基的目的，而且利用本发明的试剂盒检测血清总游离巯基的结果可靠、精密度高。
Description
技术领域
本发明属于血清总游离巯基检测技术领域，尤其涉及一种检测血清总游离巯基的试剂盒及其应用与方法。
背景技术
巯基是生物体内重要的还原性物质，参与机体的多种生化反应，与酶活性、药物代谢、毒性解毒和能量代谢密切相关。许多疾病均可引起机体巯基含量的明显改变，因此血清总游离巯基含量测定有重要的临床意义。
血清总游离巯基检测的经典方法是Ellman法，使用的反应底物(或称衍生剂)为5,5’二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5’-Dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，下文简称DTNB)。Ellman法的基本原理是DTNB与血清中游离巯基在碱性条件下反应，生成产物TNB，该物质在412nm处有最大吸收，吸收强度与样品中-SH的浓度呈正比关系。
以Ellman法为基础的比色法目前尚无上市产品，主要应用在氧化应激和衰老相关的研究中。实验室通常的做法是：75μL血清以0.1M Tris缓冲液(pH 8.2)按1:4比例稀释，转移至微孔板中。以Sunrise微孔板读取计检测412nm处的背景吸光度和630nm处的参比吸光度。然后加入10μL 3.8mmol/LDTNB磷酸缓冲液(0.1M磷酸盐，pH 7.0)。室温静置孵育20min，在412nm和630nm再次读取吸光度。校准品：L-半胱氨酸Tris溶液(0.1M Tris，10mM EDTA，pH8.2)，浓度范围：15.6～1000μM。虽然该方法在总游离巯基的人群检测中应用较广泛，但孵育时间长、操作繁琐、易引入较大手工误差。
Costa Carolina等人研究了以DTNB为衍生剂的自动化检测方法，该方法的B液(试剂2)溶剂为纯甲醇。甲醇具有挥发性且毒性较大，以此为基础的检测方法不利于在临床中广泛应用。且DTNB生成TNB的反应是一个可逆反应，显色产物TNB在自动生化仪的37℃孵育环境下稳定性不佳，会随着反应时间的增加而可逆生成DTNB，影响检测结果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测血清总游离巯基的试剂盒及其应用与方法，利用该试剂盒能够快速检测血清中总游离巯基，检测结果可靠。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测血清总游离巯基的试剂盒，所述试剂盒包括以下含量成分：
0.05～1.0mmol/L的磷酸钠缓冲液和1.0～2.5mmol/L 2,2'-二硫二吡啶工作液。
优选的，所述磷酸钠缓冲液与2,2'-二硫二吡啶工作液的体积比为180～220:35～45。
优选的，所述2,2'-二硫二吡啶工作液是将2,2'-二硫二吡啶、DMSO溶液与磷酸钠缓冲液混合制备得到。
优选的，所述磷酸钠缓冲液的pH值为6.0～7.5。
优选的，所述磷酸钠缓冲液含有0.15～0.25mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na·2H2O)和体积比0.01～0.1％的吐温80。
本发明还提供了一种上述试剂盒在制备检测血清总游离巯基产品中的应用。
本发明还提供了一种检测血清总游离巯基的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：
将待测样本与上述的磷酸钠缓冲液混合孵育4分钟后，检测吸光度值A1，然后加入上述2,2'-二硫二吡啶工作液，孵育17分钟后，检测吸光度值A2，根据样本吸光度A＝A2-0.84×A1，根据样本吸光度A值大小判断血清中总游离巯基含量高低。
优选的，所述孵育温度为35～40℃。
优选的，所述检测波长为340nm。
本发明还提供了一种定量检测血清总游离巯基的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：
按照上述检测血清总游离巯基的方法，以L-半胱氨酸为校准品，测定不同浓度的L-半胱氨酸吸光度值，计算出校准品吸光度，然后以浓度为横坐标，以校准品吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性标准曲线方程；
将待测样本按照上述检测血清总游离巯基的方法，计算出样本吸光度，根据线性标准曲线方程，得到待测样本中总游离巯基的浓度。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种检测血清总游离巯基的试剂盒及其应用与方法，本发明使用磷酸钠缓冲液、DMSO、吐温80解决了DTDP在水溶液中的溶解性问题，进而实现快速检测血清总游离巯基的目的，而且利用本发明的试剂盒检测血清总游离巯基的结果可靠、精密度高。
附图说明
图1为利用本发明试剂盒检测血清总游离巯基的方法流程图；
图2为9次检测吸光度均值与浓度的直线拟合图，其中红色表示9次吸光度检测的误差；
图3为以DTNB为衍生剂在pH7.5、pH8.0和pH9.0三种条件下吸光度信号随反应时间的变化图；
图4为利用本发明的试剂盒在pH6.5、pH7.0和pH7.5三种条件下吸光度信号随反应时间的变化图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测血清总游离巯基的试剂盒，所述试剂盒包括以下含量成分：
0.05～1.0mmol/L的磷酸钠缓冲液和1.0～2.5mmol/L 2,2'-二硫二吡啶工作液。
在本发明中，所述2,2'-二硫二吡啶简称DTDP，利用DTDP检测血清总游离巯基的原理为：DTDP与血清中游离的巯基(-SH)反应，生成产物2-硫代吡啶酮(2-thiopyridone，2-TP)，2-TP在340nm处有吸收，吸收强度与样品中-SH的浓度呈正比关系。DTDP+R-SH→R-S-S-吡啶+2-TP。
在本发明中，所述磷酸钠缓冲液与2,2'-二硫二吡啶工作液的体积比优选为180～220:35～45，进一步优选为190～210:37～42，更优选为200:40。所述磷酸钠缓冲液有两个作用：第一、DTDP与游离巯基的反应及反应速度受到pH影响，血清样本检测的反应信号随着pH增加而加快(见图4)，故所述磷酸钠缓冲液的pH值优选为6.0～7.5，进一步优选6.5～7.0，更优选为6.5；第二、本发明研究发现，pH是解决DTDP溶解性的关键因素之一，当pH≥7.5时浓度为1.0mmol/L的DTDP工作液在2～8℃保存24小时后出现DTDP晶体析出的现象，而在低于pH7.5时，即便DTDP工作液浓度达到2.5mmol/L，在2～8℃放置2周依然保持澄清透明状态。所述磷酸钠缓冲液含有0.15～0.25mmol/L EDTA-2Na·2H2O和体积比0.01～0.1％的吐温80，进一步优选的是含有0.2mmol/L EDTA-2Na·2H2O和体积比0.05％的吐温80。所述0.01～0.1％的吐温80是占磷酸钠缓冲液总体积的0.01～0.1％。所述含有0.2mmol/LEDTA-2Na·2H2O和体积比0.05％的吐温80的0.1mmol/LpH6.5磷酸钠缓冲液的制备方法优选为：
0.1mmol/L磷酸氢二钠溶液(Na2HPO4溶液)配制：称取35.8gNa2HPO4·12H2O、74.5mgEDTA-2Na·2H2O和0.5mL吐温80，加1000mL纯水溶解；
0.1mmol/L磷酸二氢钠溶液(NaH2PO4溶液)配制：称取15.6gNaH2PO4·2H2O、74.5mgEDTA-2Na·2H2O和0.5mL吐温80，加1000mL纯水溶解。
取316mL磷酸氢二钠溶液和684mL磷酸二氢钠溶液混合，即得到1000mL 0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液。
在本发明中，所述2,2'-二硫二吡啶工作液是将2,2'-二硫二吡啶、DMSO溶液与磷酸钠缓冲液混合制备得到。所述DMSO为二甲基亚砜。本发明通过联合使用DMSO、吐温80和pH6.5～7.0的缓冲液解决了DTDP在水溶液中的溶解性问题，使得该物质可以在自动生化分析仪上良好应用。一个化学反应，反应物和底物的溶解性是该反应能完全进行的基础。对于在临床使用的自动分析方法来说，除了要考虑溶解性还要考虑试剂在使用中的安全性。本发明不仅解决了DTDP的溶解性问题，还使用了毒性较低的DMSO，极大提高了未来该试剂盒在临床应用的可行性。此外，本发明所用的DTDP与-SH的反应是非可逆的，在反应到达终点后能保持稳定，保证了结果的可靠性。
本发明还提供了一种上述试剂盒在制备检测血清总游离巯基产品中的应用。
本发明还提供了一种检测血清总游离巯基的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：
将待测样本与上述的磷酸钠缓冲液混合孵育4分钟后，检测吸光度值A1，然后加入上述2,2'-二硫二吡啶工作液，孵育17分钟后，检测吸光度值A2，根据样本吸光度A＝A2-0.84×A1，根据样本吸光度A值大小判断血清中总游离巯基含量高低。
在本发明中，所述孵育温度优选为35～40℃，进一步优选为36～38℃，更优选为37℃。所述检测波长优选为340nm。本发明的上述方法能够准确、快速的检测血清中总游离巯基含量高低。
本发明还提供了一种定量检测血清总游离巯基的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：
按照上述检测血清总游离巯基的方法，以L-半胱氨酸为校准品，测定不同浓度的L-半胱氨酸吸光度值，计算出校准品吸光度，然后以浓度为横坐标，以校准品吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性标准曲线方程；
将待测样本按照上述检测血清总游离巯基的方法，计算出样本吸光度，根据线性标准曲线方程，得到待测样本中总游离巯基的浓度。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料成分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在以下实施例中，所述EDTA-2Na·2H2O为乙二胺四乙酸二钠，购自福晨(天津)化学试剂有限公司，批号20211101。
实施例1
一种检测血清总游离巯基的试剂盒，所述试剂盒由200μL 0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液和40μL 1.5mmol/L 2,2'-二硫二吡啶(DTDP)工作液组成。
所述0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液(命名为A液)的制备方法：
(1)0.1mmol/L磷酸氢二钠溶液(Na2HPO4溶液)配制：称取35.8gNa2HPO4·12H2O、74.5mg EDTA-2Na·2H2O和0.5mL吐温80，加1000mL纯水溶解。
(2)0.1mmol/L磷酸二氢钠溶液(NaH2PO4溶液)配制：称取15.6gNaH2PO4·2H2O、74.5mg EDTA-2Na·2H2O和0.5mL吐温80，加1000mL纯水溶解。
(3)取316mL磷酸氢二钠溶液和684mL磷酸二氢钠溶液混合，即得到1000mL0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液。
所述1.5mmol/L DTDP工作液(命名为B液)的制备方法为将0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液、12mmol/L DTDP贮备液与DMSO溶液按照体积比为6:1:1混合均匀即得。
所述12mmol/L DTDP贮备液称取2643.72mg DTDP，溶解于1L DMSO溶液中，混匀即得。
实施例2
一种检测血清总游离巯基的试剂盒，所述试剂盒由180μL 0.1mmol/LpH6.0的磷酸钠缓冲液和35μL 1.5mmol/L 2,2'-二硫二吡啶(DTDP)工作液组成。
所述0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液(命名为A液)的制备方法：
(1)0.1mmol/L磷酸氢二钠溶液(Na2HPO4溶液)配制：称取35.8gNa2HPO4·12H2O、74.5mg EDTA-2Na·2H2O和0.5mL吐温80，加1000mL纯水溶解。
(2)0.1mmol/L磷酸二氢钠溶液(NaH2PO4溶液)配制：称取15.6gNaH2PO4·2H2O、74.5mg EDTA-2Na·2H2O和0.5mL吐温80，加1000mL纯水溶解。
(3)取316mL磷酸氢二钠溶液和684mL磷酸二氢钠溶液混合，即得到1000mL0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液。
所述1.5mmol/L DTDP工作液(命名为B液)的制备方法为将0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液、12mmol/L DTDP贮备液与DMSO溶液按照体积比为6:1:1混合均匀即得。
所述12mmol/L DTDP贮备液称取2643.72mg DTDP，溶解于1L DMSO溶液中，混匀即得。
实施例3
一种检测血清总游离巯基的试剂盒，所述试剂盒由220μL 0.1mmol/LpH6.0的磷酸钠缓冲液和45μL 1.5mmol/L 2,2'-二硫二吡啶(DTDP)工作液组成。
所述0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液(命名为A液)的制备方法：
(1)0.1mmol/L磷酸氢二钠溶液(Na2HPO4溶液)配制：称取35.8gNa2HPO4·12H2O、74.5mg EDTA-2Na·2H2O和0.5mL吐温80，加1000mL纯水溶解。
(2)0.1mmol/L磷酸二氢钠溶液(NaH2PO4溶液)配制：称取15.6gNaH2PO4·2H2O、74.5mg EDTA-2Na·2H2O和0.5mL吐温80，加1000mL纯水溶解。
(3)取316mL磷酸氢二钠溶液和684mL磷酸二氢钠溶液混合，即得到1000mL0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液。
所述1.5mmol/L DTDP工作液(命名为B液)的制备方法为将0.1mmol/LpH6.5的磷酸钠缓冲液、12mmol/L DTDP贮备液与DMSO溶液按照体积比为6:1:1混合均匀即得。
所述12mmol/L DTDP贮备液称取2643.72mg DTDP，溶解于1L DMSO溶液中，混匀即得。
实施例4
一种利用实施例1的试剂盒检测血清总游离巯基的方法，步骤如下：
(1)将10μL的待测样本与200μLA液混合，37℃孵育4分钟后，利用日立7180全自动生化分析仪检测340nm波长下的吸光度A1，A1为样本本底的吸光度；
(2)然后加入40μL B液混合，37℃孵育17分钟后，利用日立7180全自动生化分析仪检测340nm波长下的吸光度A2，A2为总吸光度。
样本实际吸光度(A)＝A2-0.84×A1。
其中，0.84＝210μL/250μL，用于将A1的反应体积校正到250μL。
本发明利用实施例1的试剂盒检测血清总游离巯基的方法的流程图见图1。
实施例5
L-半胱氨酸是小分子巯基物质，在本发明中作为校准品。
一种利用实施例1的试剂盒定量检测血清总游离巯基的方法，步骤如下：
(1)将浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L的L-半胱氨酸水溶液(校准品)分别按照实施例4的方法进行检测计算不同浓度下的样本实际吸光度，然后以浓度为横坐标，以样本实际吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性标准曲线方程式；
(2)将待测样本按照实施例4的方法进行检测计算样本实际吸光度，根据线性标准曲线方程式，得到待测样本的浓度。
按照本实施例的步骤(1)连续检测3天，每天重复检测3次，得到线性标准曲线，见图2。
图2结果表明，9次检测结果的重复性好，直线拟合的相关性大于0.95。检测范围为：0～1.2mmol/L。
实施例6
本发明试剂盒检测血清总游离巯基的精密度的测定
采用实施例5所述的方法，连续三天检测高、中、低值血清的样本，其中，高、中、低值血清中总游离巯基的含量分别为0.355mmol/L、0.442mmol/L和0.509mmol/L，每天重复检测3次，结果见表1。
表1不同血清样本检测精密度
表1结果表明，利用本发明的试剂盒检测血清样本中的总游离巯基批内变异小于1％，批间变异小于2％，即表明本发明试剂盒检测总游离巯基的精密度高。
实施例7
1、加样回收率的测定
取混合血清450μL分别加入50μL生理盐水、50μL 1.0、2.0、3.0或4.0mmol/L的L-半胱氨酸标准溶液混合约90min后，按照实施例5的方法检测血清中总游离巯基的浓度，计算回收率，结果见表2。
表2：加标回收率
注：其中混合血清浓度0.306mmol/L，加入按9：1比例加入生理盐水稀释后的样品浓度为0.277mmol/L(90.5％)，符合稀释规律。表格中“实测回收浓度”为“实测浓度”扣除0.277mmol/L的值。
表2结果表明，回收率为44.6％～68.0％，随着加标浓度的增加而降低。
2、加标时间对回收率的影响
取6份混合血清(血清A～血清F)，其中血清A中加入50μL生理盐水，血清B～血清F分别加入50μL 4mmol/L的L-半胱氨酸水溶液，血清B混合后立即检测，血清C～血清F混合后分别在室温中分别放置10、20、40和60分钟后按照实施例5的方法检测，每个样本重复检测3次。取450μL生理盐水加入50μL 4mmol/L的L-半胱氨酸水溶液混合得到水溶液空白对照，结果见表3。
表3：加标时间对回收率的影响
注：表3中“-”表示不适用。
结果表明：加标后立即检测的巯基物质回收率可以达到80％，L-半胱氨酸与血清混合后放置时间越长则回收率越低(见表3)。
本发明试剂盒检测的是血清中的总游离巯基(-SH)，包括小分子巯基和蛋白巯基，其中小分子巯基包括谷胱甘肽、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸(NAC)等，在血清中占比不到10％；蛋白巯基主要是白蛋白上未形成二硫键的胱氨酸残基(Cys 34)，占90％以上。L-半胱氨酸是小分子巯基物质，在本发明中作为(几乎所有巯基检测方法)校准品。加标回收率就是用校准品添加到血清后，检测加入标准与实测标准的比例。本发明试剂盒检测方法回收率较低，其可能的原因是L-半胱氨酸加入到血清中后会迅速与血清白蛋白上的游离巯基发生反应形成二硫键(S-S)，加入标准浓度降低，本发明试剂盒检测的浓度也随之降低。这一点可以通过加标时间对回收率影响的研究说明，加入标准后立即检测的回收率大于80％，随着L-半胱氨酸在血清中混合时间增加，回收率逐渐降低，混合60分钟后低至45.5％，而生理盐水加标的空白对照检测结果为0.405mmol/L，与理论加标浓度0.400mmol/L几乎一致，回收率接近100％(表3)。
为了验证样本与标准混合后立即检测的回收率，本实施例重新选择了低、中、高值的血清，其中血清中总游离巯基的含量分别为0.354mmol/L、0.440mmol/L和0.501mmol/L，每个血清平行处理两份加标样本，按照实施例5的方法立即检测血清中总游离巯基的浓度，计算回收率。
表4加标后立即检测的回收率
注：表4中“-”表示不适用。
如表4结果表明：本发明回收率结果都能达到80％以上。
结合加标后立即检测的结果(回收率大于80％)和空白对照结果，并不是本发明试剂盒无法正确检测加入的标准，而是加入的标准在血清中的存在形式已经发生了变化，因此，本发明特异性检测血清中总游离巯基是可靠的。
实施例8
本实施例与实施例1的试剂盒区别仅在于所述A液为0.1mmol/LpH7.0的磷酸钠缓冲液。
实施例9
本实施例与实施例1的试剂盒区别仅在于所述A液为0.1mmol/LpH7.5的磷酸钠缓冲液。
实施例10
本实施例以DTNB作为衍生剂检测血清中总游离巯基，结果见图3。
DTNB作为衍生剂检测血清中总游离巯基的检测方法：
0.1mmol/LpH7.5、pH 8.0和pH 9.0的磷酸钠缓冲液(命名为C液)制备方法：
(1)0.1mmol/L磷酸氢二钠溶液(Na2HPO4溶液)配制：称取35.8gNa2HPO4·12H2O和74.5mg EDTA-2Na·2H2O，加1000mL纯水溶解。
(2)0.1mmol/L磷酸二氢钠溶液(NaH2PO4溶液)配制：称取15.6gNaH2PO4·2H2O和74.5mg EDTA-2Na·2H2O，加1000mL纯水溶解。
(3)取42mL磷酸氢二钠溶液和8mL磷酸二氢钠溶液混合，即得到50mL0.1mmol/LpH7.5的磷酸钠缓冲液。
(4)取47.4mL磷酸氢二钠溶液和2.6mL磷酸二氢钠溶液混合，即得到50mL0.1mmol/LpH8.0的磷酸钠缓冲液。
(5)取50mL磷酸氢二钠溶液即为0.1mmol/LpH9.0的磷酸钠缓冲液。
1.0mmol/L DTNB工作液(命名为D液)的制备方法为将0.1mmol/LpH7.5的磷酸钠缓冲液、10mmol/L DTNB贮备液按照体积比为9:1混合均匀即得。同理可以制备pH8.0和pH9.0的DTNB工作液。
所述10mmol/L DTNB贮备液称取3963.5mg DTNB，溶解于1L无水乙醇溶液中，混匀即得。
检测步骤如下：将10μL的待测样本与200μL C液混合，37℃孵育5分钟后，然后加入40μL D液混合，37℃孵育5分钟，利用日立7180全自动生化分析仪检测固有程序记录405nm波长下10分钟内34个连续监测的吸光度信号，并绘制成吸光度信号与反应时间(以34个监测点代表反应时间)的关系图(图3)。
利用实施例1、实施例8和实施例9所述试剂盒按照实施例4的方法检测血清样本中的总游离巯基，结果见图4。
图4的检测方法：将10μL的待测样本与200μLA液混合，37℃孵育4分钟后，然后加入40μL B液混合，37℃孵育17分钟，利用日立7180全自动生化分析仪检测固有程序记录340nm波长下22分钟内73个连续监测的吸光度信号，并绘制成吸光度信号与反应时间(以73个监测点代表反应时间)的关系图(图4)。
需要说明的是，利用日立7180全自动生化分析仪检测时，检测反应时间约为22分钟，吸光度读取方式为2点终点法，其中第一终点读取点(即样本本底的吸光度)为第14点，第二终点读取点(即总吸光度)为第73点。(对读取点的说明：本发明所用全自动生化分析仪在22分钟内可以连续读取73个吸光度，吸光度点1～73可简写为ABS1～ABS73)
以DTNB作为衍生剂时，随着反应时间的增加，产物TNB吸光度先升高后下降(见图3)，DTDP的产物则不存在这一情况(见图4)，本发明所用的底物(或称衍生剂)DTDP与-SH的反应是非可逆的，在反应到达终点后能保持稳定，方法精密度好，更加稳健，故本发明检测结果更准确。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测血清总游离巯基的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下含量成分：
0.05～1.0mmol/L的磷酸钠缓冲液和1.0～2.5mmol/L 2,2'-二硫二吡啶工作液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸钠缓冲液与2,2'-二硫二吡啶工作液的体积比为180～220:35～45。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述2,2'-二硫二吡啶工作液是将2,2'-二硫二吡啶、DMSO溶液与磷酸钠缓冲液混合制备得到。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸钠缓冲液的pH值为6.0～7.5。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸钠缓冲液含有0.15～0.25mmol/L EDTA-2Na·2H2O和体积比0.01～0.1％的吐温80。
6.权利要求1～5任意一项所述试剂盒在制备检测血清总游离巯基产品中的应用。
7.一种检测血清总游离巯基的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：
将待测样本与权利要求1～5任意一项所述的磷酸钠缓冲液混合孵育4分钟后，检测吸光度值A1，然后加入权利要求1～5任意一项所述2,2'-二硫二吡啶工作液，孵育17分钟后，检测吸光度值A2，根据样本吸光度A＝A2-0.84×A1，根据样本吸光度A值大小判断血清中总游离巯基含量高低。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述孵育温度为35～40℃。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述检测波长为340nm。
10.一种定量检测血清总游离巯基的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：
按照权利要求7～9任意一种方法，以L-半胱氨酸为校准品，测定不同浓度的L-半胱氨酸吸光度值，计算出校准品吸光度，然后以浓度为横坐标，以校准品吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性标准曲线方程；
将待测样本按照权利要求7～9任意一种方法，计算出样本吸光度，根据线性标准曲线方程，得到待测样本中总游离巯基的浓度。
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