CN118165874A

CN118165874A - 一种高密度培养阿克曼氏菌的方法

Info

Publication number: CN118165874A
Application number: CN202410377348.6A
Authority: CN
Inventors: 凌雪萍; 吴海艇; 吴月美; 游西熙
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Filing date: 2024-03-29
Publication date: 2024-06-11

Abstract

本发明公开了一种高密度培养阿克曼氏菌的方法，包括：将阿克曼氏菌株接种于种子培养基中，经两次复苏后接种于发酵罐培养；在发酵罐培养中使用三阶段碳源浓度控制，第一阶段在培养的0‑20.5h，碳源浓度14‑16g/L；第二阶段在培养的20.5‑31h，当发酵罐内碳源浓度降低至0.5‑8g/L时，开始进行碳源指数补料；第三阶段在培养的31‑34h，当发酵罐内碳源浓度大于8g/L时，继续维持指数补料至发酵罐内碳源浓度至20‑25g/L，此时停止指数补料，菌体消耗剩余碳源直至发酵达到最高生物量，所述碳源为葡萄糖。该方法可提升阿克曼氏菌的生物量，在5L发酵罐中生物量OD₆₀₀达到22。

Description

一种高密度培养阿克曼氏菌的方法

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种高密度培养阿克曼氏菌的方法。

背景技术

阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)是一种革兰氏阴性菌，于2004年首次在人类粪便中分离发现。相比于其他的益生菌，阿克曼氏菌的发现和研究还在起步阶段。HyoShin Yoon等人通过蛋白质液相色谱发现一种由阿克曼氏菌分泌的蛋白质，命名为P9，通过小鼠实验证明P9蛋白能够诱导胰高血糖素-1(GLP-1)的分泌以及脂肪组织的产热。HubertPlovier等人在研究发现阿克曼氏菌能减少小鼠肥胖的基础上，发现经过巴氏灭菌灭活的阿克曼氏菌具有更好的功效并成功分离出功能蛋白Amuc_1100。目前阿克曼氏菌的研究主要聚焦在代谢机理以及功能益生机制，从分子生物的角度去探究阿克曼氏菌的功能和机理。

但是不可忽视的是，阿克曼氏菌的体外培养优化和高密度发酵会为阿克曼氏菌的工业化生产和应用带来巨大的帮助。阿克曼氏菌体外培养的研究相对较少，通常是在厌氧瓶中使用BHI培养基或黏蛋白培养基，通过添加L-半胱氨酸/半胱氨酸盐以及曝气的方式去除氧气，对阿克曼氏菌进行体外厌氧培养。2021年，Zhitao Li等构建一个体外仿生肠反应器用来对阿克曼氏菌动态培养，使用BHI-猪胃黏蛋白生物量达到1.92g/L，相比静态培养提高44.36％，而使用人源黏蛋白生物量最高达2.89g/L。2021年，Xinyue Liu等使用添加0.5％猪胃黏蛋白的BHI培养基，OD₆₀₀约为0.22。但是黏蛋白培养基成本过高以及分离纯化黏蛋白复杂的操作。2023年，荷兰瓦赫宁根大学以32g/L豌豆蛋白胨以及混合碳源总浓度150mM(葡萄糖：GlcNA＝3:1)，在0.7L发酵罐中pH维持在7.0，最终生物量OD₆₀₀＝15。然而阿克曼氏菌高密度发酵的研究在国内目前是一个空白。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种高密度培养阿克曼氏菌的方法，通过优化培养基组成降低培养成本，并通过三阶段碳源调控的策略对阿克曼氏菌进行高密度发酵，从而提升阿克曼氏菌的生物量。

本发明的实施例提出了一种高密度培养阿克曼氏菌的方法，其包括以下步骤：

(1)将阿克曼氏菌株接种于种子培养基中，经两次复苏后接种于发酵罐培养；

(2)在发酵罐培养中使用三阶段碳源浓度控制，第一阶段在培养的0-20.5h，碳源浓度14-16g/L；第二阶段在培养的20.5-31h，当发酵罐内碳源浓度降低至0.5-8g/L时，开始进行碳源指数补料；第三阶段在培养的31-34h，当发酵罐内碳源浓度大于8g/L时，继续维持指数补料至发酵罐内碳源浓度至20-25g/L，此时停止指数补料，菌体消耗剩余碳源直至发酵达到最高生物量，所述碳源为葡萄糖。

根据本发明实施例的一种高密度培养阿克曼氏菌的方法，该方法将碳源浓度的控制分为三个阶段，以降低碳源浓度过高对菌体生长的影响的同时，根据菌体生长规律指数流加葡萄糖碳源，可以确保菌体在最佳状态下进行生长和代谢，从而获得更高的生物量和产物产量，在5L发酵罐中生物量OD₆₀₀达到22，是目前已报道的最高水平；并且可以有效避免碳源浪费和发酵过程中的副产物生成，进一步提高整个发酵过程的可持续性，降低生产和操作成本，适合工业化生产。

可选地，发酵罐内培养基为胰蛋白胨35-38g/L，半胱氨酸0.7-0.9g/L，NaHCO₃ 3～5g/L，KH₂PO₄ 0.3～0.5g/L和Na₂HPO₄·12H₂O 1.3～1.4g/L。该培养基有利于减少阿克曼氏菌生长的延滞期以及促进细胞快速生长在稳定期达到较高的生物量。与传统的发酵培养基相比，该培养基具有更高的生物转化效率和更低的成本，为工业生产带来了显著的效益。

可选地，步骤(2)中，发酵罐的接种量为8-16％，发酵罐温度35-38℃，转速90-110rpm，初始pH控制在7.5-7.9。

进一步，当发酵罐pH下降至7.0时，通过蠕动泵自动将补料瓶中的碱液加入发酵罐中，控制发酵罐pH在6.5-7.2。

可选地，步骤(2)中，第二阶段的菌体比生长速率为0.05-0.3。

可选地，步骤(2)中，指数补料的公式为：F_M,tS_i＝V_MX_tV_t＝17.5*e^0.15t；式中F_M,t为葡萄糖补料速率，S_i为补料瓶中的葡萄糖浓度，X_t和V_t分别为葡萄糖流加时间t时的干细胞密度和发酵液体积，V_M为当前葡萄糖比消耗速率。

进一步，步骤(2)中，补料瓶中的葡萄糖浓度为400-800g/L。

可选地，步骤(1)为：将保种菌株接入BHI培养基中，35-38℃，90-110rpm下培养15-24h后为一级种子液，取一级种子液接种于BHI培养基中，35-38℃，90-110rpm下培养15-24h后为二级种子液，将所述二级种子液接种于发酵罐培养。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为在发酵罐中培养基初始碳源浓度为15.0g/L的细胞生长曲线；

图2为在发酵罐中培养基初始碳源浓度为35.0g/L的细胞生长曲线；

图3为在发酵罐中培养基初始碳源浓度为55.0g/L的细胞生长曲线；

图4为优化发酵罐中培养基的其他成分后的细胞生长曲线；

图5为培养基优化前使用碳源补料-分批用于阿克曼氏菌发酵罐培养的细胞生长曲线；

图6为培养基优化后使用碳源补料-分批用于阿克曼氏菌发酵罐培养的细胞生长曲线；

图7为在发酵罐中发酵罐碳源三阶段控制对阿克曼氏菌生长的影响。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1发酵罐初始碳源浓度和培养基摇瓶优化

阿克曼氏菌复苏培养基使用BHI培养基(脑心浸液培养基)。按接种量1％(v/v)将甘油低温保存的阿克曼氏菌株接种于10mL、37g/L BHI体系的顶空瓶中，培养24h后按接种量4％接种于50mL、37g/L BHI体系的血清瓶中，培养至OD₆₀₀＝0.7后，按接种量10％接种于发酵罐中。发酵罐使用3L体系，需要二级种子300mL。

发酵罐初始培养基为：胰蛋白胨37g/L，NaHCO₃ 4g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1.34g/L，NH₄Cl 0.3g/L，NaCl 0.3g/L，MgCl·6H₂O 0.1g/L，CaCl₂ 0.11g/L，L-半胱氨酸0.4g/L，维生素复合溶液1mL，微量元素酸痕溶液1mL，微量元素碱痕溶液1mL。其中，酸痕量溶液成分组成：H₃BO₃ 0.618g/L，ZnCl₂ 0.682g/L，CuCl₂·2H₂O 0.170g/L，MnCl₂·4H₂O0.990g/L，CoCl₂·6H₂O 1.190g/L，NiCl₂·6H₂O 0.238g/L，加去离子水定容至1L，取上述溶液10mL，加入FeCl₂·4H₂O 0.149g/L，浓盐酸0.42mL，去离子水定容至100mL。碱痕量溶液成分组成：Na₂SeO₃·5H₂O 0.262g/L，Na₂WO·2H₂O0.330g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.242g/L，NaOH4.0g/L，加去离子水定容至1L，取上述溶液10mL，去离子水定容至100mL。

发酵罐初始碳源浓度优化：发酵罐初始碳源(葡萄糖)浓度选择15.0g/L、35.0g/L、55.0g/L、100.0g/L；发酵罐接种后取样测量不同时间点的生物量、葡萄糖浓度以及有机酸含量。生物量用紫外分光光度计测量在600nm处吸光值表示，即OD₆₀₀；葡萄糖浓度使用DNS试剂；有机酸检测使用气相色谱法。

结果如图1-4所示，图1-图3分别是对应碳源浓度为15.0g/L、35.0g/L、55.0g/L，100g/L碳源不支持菌株生长。结果表明当葡萄糖残余浓度大于等于4.0g/L时，阿克曼氏菌的生长就可能产生一定的抑制作用，主要体现在延滞期的增加。因此要实现阿克曼氏菌的高密度发酵需要维持低浓度葡萄糖进行培养，尽管55g/L葡萄糖浓度下培养生物量最高，但可以通过后期葡萄糖的流加实现，避免碳源浓度过高带来的抑制。

培养基成分优化：阿克曼氏菌种子复苏步骤如上所述，将OD₆₀₀＝0.7的二级复苏种子按接种量8％接种于50mL摇瓶中。成分优化葡萄糖浓度为15g/L，对照组Control培养基其他成分与上述发酵罐培养基一致。实验组Without inorganic salt，其他成分除去NH₄Cl，NaCl，MgCl·6H₂O，CaCl₂、微量元素酸痕、碱痕溶液外，其他成分与对照组Control一致。实验组Without inorganic salt and vitamin，在实验组Without inorganic salt的基础上进一步去除维生素复合溶液，其余成分一致。接种后测量不同时间点的生物量(OD₆₀₀)。

结果如图4所示，初始培养基中含有许多未优化的无机盐、维生素、痕量元素等成分。将这些元素统一在摇瓶中去除之后，对阿克曼氏菌生物量无太大影响。

实施例2碳源补料-分批用于阿克曼氏菌发酵罐培养：培养基优化前和培养基优化后

将摇瓶优化好的发酵培养基进行发酵罐扩大培养，阿克曼氏菌发酵罐培养基组成为胰蛋白胨37g/L，半胱氨酸0.4g/L，NaHCO₃ 4g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1.34g/L，葡萄糖浓度为15g/L。培养基与发酵罐经过121/40℃高温灭菌后，接种量按10％接种至发酵罐，发酵罐温度37℃，转速100rpm，初始pH控制在7.5-7.9。葡萄糖流加方法使用补料-分批发酵，当发酵罐内初始葡萄糖消耗后，手动流加碳源至发酵罐内葡萄糖浓度恢复15g/L。

从图5(培养基优化前)和图6(培养基优化后)中可以看出，去除无机盐、维生素、微量元素的培养基提升了发酵罐培养的最高生物量，并促进菌体生长更快进入稳定期，提高了时空产率。

实施例3阿克曼氏菌发酵罐培养基结合三阶段碳源控制的应用

阿克曼氏菌发酵罐培养基组成为胰蛋白胨37g/L，半胱氨酸0.4g/L，NaHCO₃ 4g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1.34g/L，葡萄糖浓度为15g/L。培养基与发酵罐经过121/40℃高温灭菌后，接种量按10％接种至发酵罐，发酵罐温度37℃，转速100rpm，初始pH控制在7.8(使用1-3M Na₂CO₃调节)。发酵罐pH下降至7.0时，使用NaOH调节发酵液pH，维持在6.5-7.2，参考专利CN 116970506 A进行调节。

发酵罐培养中使用三阶段碳源控制策略，如图7所示，第一阶段在0-20.5h，发酵罐初始葡萄糖浓度14-16g/L，随着菌体生长发酵罐内葡萄糖浓度自然降低。第二阶段20.5-31h，当发酵罐内葡萄糖浓度降低至0.5-8g/L时，开始进行碳源指数补料，碳源指数补料根据菌体生长动力学计算指数补料：F_M,tS_i＝V_MX_tV_t＝17.5*e^0.15t，F_M,t(mL/h)为葡萄糖补料速率，S_i为补料瓶中的葡萄糖浓度(500g/L)，X_t(g/L)和V_t(L)分别为葡萄糖流加时间t时的干细胞密度和发酵液体积(3L)，V_M为当前葡萄糖比消耗速率。使用蠕动泵B自动将补料瓶中的碳源补加至发酵罐，补料瓶中碳源浓度为500g/L，限定菌体生长的比生长速率为0.15。通过调整蠕动泵B的转速，可以精确控制补料速率。第三阶段在31-34h，当发酵罐内碳源浓度开始积累时(大于8g/L)，尽管此阶段菌体生长动力学不符合指数补料的动力学模型，但是仍然继续维持指数补料，补料公式与第二阶段一致，至发酵罐内碳源浓度至20-25g/L，此时停止指数补料，菌体消耗剩余碳源直至发酵达到最高生物量。整个阶段葡萄糖浓度有三个阶段的变化，0-20.5h从15g/L自然下降至0.5-8g/L，20.5-31h指数补料维持低浓度葡萄糖水平(0-8g/L)，31-34h罐体葡萄糖浓度升高20-25g/L，完成碳源三阶段调控后发酵罐生物量将达到最高水平。

在碳源控制的第二阶段使用厌氧指数补料的方法，在5L发酵罐中生物量OD₆₀₀达到22，是目前已报道的最高水平。指数补料的策略相比补料-分批发酵，操作上更加简便，不需要时刻监测培养基中剩余的残糖浓度。

综上，根据本发明的实施例，本申请通过优化发酵罐初始培养基碳源浓度，在减少菌体生长延滞期的同时有利于菌体生物量的提升，结合碳源的三阶段控制策略，显著提升发酵罐中阿克曼氏菌的最高生物量，同时不需要频繁取样监测罐体碳源浓度，减少了操作成本。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种高密度培养阿克曼氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵罐内培养基为胰蛋白胨35-38g/L，半胱氨酸0.7-0.9g/L，NaHCO₃ 3～5g/L，KH₂PO₄ 0.3～0.5g/L和Na₂HPO₄·12H₂O 1.3～1.4g/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵罐的接种量为8-16％，发酵罐温度35-38℃，转速90-110rpm，初始pH控制在7.5-7.9。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，当发酵罐pH下降至7.0时，通过蠕动泵自动将补料瓶中的碱液加入发酵罐中，控制发酵罐pH在6.5-7.2。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，第二阶段的菌体比生长速率为0.05-0.3。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，指数补料的公式为：

F_M,tS_i＝V_MX_tV_t＝17.5*e^0.15t；式中F_M,t为葡萄糖补料速率，S_i为补料瓶中的葡萄糖浓度，X_t和V_t分别为葡萄糖流加时间t时的干细胞密度和发酵液体积，V_M为当前葡萄糖比消耗速率。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，补料瓶中的葡萄糖浓度为400-800g/L。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)为：将保种菌株接入BHI培养基中，35-38℃，90-110rpm下培养15-24h后为一级种子液，取一级种子液接种于BHI培养基中，35-38℃，90-110rpm下培养15-24h后为二级种子液，将所述二级种子液接种于发酵罐培养。