CN118165089A - 籼稻氮高效利用等位基因OsNLP4-indica与其编码蛋白、及其自然变异SNPs位点突变提高植物氮素利用率的应用 - Google Patents

籼稻氮高效利用等位基因OsNLP4-indica与其编码蛋白、及其自然变异SNPs位点突变提高植物氮素利用率的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了籼稻氮高效利用等位基因OsNLP4‑indica与其编码蛋白、及其自然变异SNPs位点突变提高植物氮素利用率的应用。所述籼稻氮高效利用等位基因OsNLP4‑indica，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用基因编辑创造OsNLP4‑indica单倍型突变或应用杂交转育和转基因的手段异源表达OsNLP4‑indica，将在培育氮肥高效吸收和利用植物(特别是水稻、玉米、小麦、高粱、大豆等农作物)中发挥重要的作用，具有广阔的应用前景。

Description

籼稻氮高效利用等位基因OsNLP4-indica与其编码蛋白、及其 自然变异SNPs位点突变提高植物氮素利用率的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体涉及籼稻氮高效利用等位基因OsNLP4-indica与其编码蛋白、及其自然变异SNPs位点突变提高植物NUE的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是我国主要的粮食作物之一，产量占全国粮食总产量的25％。但是产量的背后离不开化肥大量的施用，特别是氮肥。据国家统计局数据分析，过去四十年，我国的年平均氮肥施用量达到2000万吨。大量施用氮肥在给农民造成经济负担的同时，也给生态环境带来严重的负面影响。通过提高水稻NUE大幅度“减肥”，增加水稻产量已成为现代农业亟需解决的问题。
亚洲栽培稻分为籼稻和粳稻两大类。近年来随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，优质粳米市场需求呈刚性增长，国内优质粳米供需矛盾日益突出。籼改粳已成为我国水稻产业发展的一个主要方向。然而，目前生产上推广的粳稻品种NUE普遍偏低，在中等偏下肥力种植区域难以实现高产。因此，迫切需要培育氮高效高产粳稻新品种。
NIN-LIKE PROTEIN(NLP)转录因子是植物氮素初期应答的主要调控因子。水稻OsNLPs作为氮素响应的关键调控因子，广泛调控氮素同化相关基因，显著提高水稻产量和NUE。本发明发现，OsNLP4编码区的4个SNPs在籼稻和粳稻群体间保守分化，使得OsNLP4-indica对靶基因NREs的结合能力比OsNLP4-japonica更强。携带有OsNLP4-indica片段的氮高效高产粳稻优良株系，有助于解决粳稻品种低肥力条件下产量低的困境。
发明内容
为实现上述目的，本发明涉及的内容包括如下各项：
1.OsNLP4-indica等位基因，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据项目1所述的等位基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.OsNLP4等位或同源基因，所述基因的核苷酸序列在相应位置包含OsNLP4-indica等位基因的下述SNPs：
1)SNP1(303A)
2)SNP2(531T)
3)SNP3(569G)
4)SNP4(763A)。
4.根据项目3所述的等位或同源基因，所述基因编码的氨基酸序列与OsNLP4-indica等位基因编码的氨基酸序列相比包含下述氨基酸替换：
1)101位的Arg
2)190位的Ser
3)255位的Thr。
5.一种提高植物氮素利用率的基因编辑方法，包括如下步骤：通过基因编辑技术在野生型植物或者植物细胞中的OsNLP4等位或同源基因编辑为1-4任一项所述的基因，得到基因编辑植株。
6.根据项目5所述的方法，与未编辑的对照植株相比，所述基因编辑植株具有提高的NUE，表现为如下1)-4)中的至少一种：
1)植物单株分蘖数增加；
2)植物每穗粒数增加；
3)植物产量增加；
4)植物NUE增加。
7.根据项目5或项目6所述的方法，所述植物为水稻、玉米、小麦、高粱、大豆、苜蓿和拟南芥，其中，优选为水稻。
8.根据项目5-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述OsNLP4等位或同源基因为OsNLP4-japonica等位基因，其编码的OsNLP4-japonica同源蛋白的氨基酸序列如以下中的任一项所示：
1)所述OsNLP4-japonica同源蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示；
2)所述OsNLP4-japonica同源蛋白为SEQ ID NO.3限定的氨基酸序列具有80％以上同源性具有相似生物学功能的蛋白质。
9.一种构建近等基因系植物的方法，包括如下步骤：将含有项目1-4任一项所述的基因的供体亲本与受体亲本进行杂交，再与受体亲本4次回交，得到了与受体亲本相比NUE提高的含有项目1-4任一项所述的基因近等基因系植物。
10.根据项目9所述的方法，其特征在于，供体亲本为籼稻品种，优选9311；受体亲本为粳稻品种，优选秀水134。
11.根据项目9或项目10所述的方法，其特征在于：
所述的NUE提高体现在如下1)-4)中的至少一种：
1)植物单株分蘖数增加；
2)植物每穗粒数增加；
3)植物产量增加；
4)植物NUE增加。
12.一种培育具有提高的NUE的转基因植物的方法，包括如下步骤：将项目1-4任一项所述的基因或其活性片段或重组表达载体导入植物细胞，得到转基因植株，提高了项目1-4任一项所述的基因或其活性片段在转基因植株中的表达。
13.根据项目12所述的方法，该方法还包括在导入植物细胞之前将项目1-4任一项所述的基因针对所述植物的密码子应用进行密码子优化的步骤。
14.与根据项目12或项目13所述的方法，未导入所述基因或其活性片段或所述重组表达载体的对照植株相比，所述转基因植株具有提高的NUE，体现在如下1)-4中的至少一种：
1)植物单株分蘖数增加；
2)植物每穗粒数增加；
3)植物产量增加；
4)植物NUE增加。
15.根据项目12-14中任一项所述的方法，所述植物为水稻、玉米、小麦、高粱、大豆、苜蓿和拟南芥，其中，优选为水稻。
16.项目1-4任一项所述的基因在提高植物氮素利用率中的应用。
具体地，涉及以下方面：
本发明的一个目的是提供一种籼稻氮高效利用等位基因OsNLP4-indica与其编码蛋白、及其自然变异SNPs位点突变提高植物NUE的应用。
上述应用中，所述氮高效利用等位基因OsNLP4-indica的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其特征在于：与粳稻等位基因OsNLP4-japonica的核苷酸序列存在保守的4个SNPs：SNP1(303A)，SNP2(531T)，SNP3(569G)，SNP4(763A)，其中SNP2属同义突变。
上述应用中，所述氮高效利用等位基因OsNLP4-indica的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示的多肽，其特征在于：
1)与粳稻等位基因OsNLP4-japonica的氨基酸序列存在保守的3个氨基酸替换：101Arg，190Ser，255Thr；
2)OsNLP4-indica蛋白对靶基因NREs的结合能力相比OsNLP4-japonica明显增强。
本发明的另一个目的是提供一种提高植物NUE的基因编辑方法。
上述提高植物NUE的基因编辑方法，包括如下步骤：通过基因编辑技术在野生型植物或者植物细胞中的OsNLP4基因编辑为OsNLP4-indica等位基因，得到基因编辑植株。
上述方法中，与未编辑的对照植株相比，所述基因编辑植株具有提高的NUE，体现在如下方面中的至少一种：
1)植物单株分蘖数增加；
2)植物每穗粒数增加；
3)植物产量增加；
4)植物NUE增加。
上述方法中，所述的氨基酸序列，其特征在于：
1)所述蛋白质OsNLP4-japonica氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示；
2)所述OsNLP4-japonica同源蛋白为SEQ ID NO.3限定的氨基酸序列具有80％以上同源性具有相似生物学功能的蛋白质。
上述方法中，所述的植物为水稻、玉米、小麦、高粱、大豆、苜蓿和拟南芥等作物，其中，优选为水稻。
本发明的第三个目的是提供一种构建近等基因系植物的方法。
上述构建近等基因系植物的方法包括如下步骤：将供体亲本与受体亲本进行杂交，再与受体亲本4次回交，得到近等基因系植物。近等基因系植物与受体亲本相比，NUE显著提高。
其中，术语“近等基因系”是指，除某个别基因外，其他基因都相同的两个遗传材料，经过饱和回交形成的除目的形状有差异，其他遗传背景完全相同的遗传品系。
上述方法中，所述的供体亲本为籼稻品种，优选9311。受体亲本为粳稻品种，优选秀水134。
上述方法中，所述的NUE提高体现在如下方面中的至少一种：
1)植物单株分蘖数增加；
2)植物每穗粒数增加；
3)植物产量增加；
4)植物NUE增加。
本发明的最后一个目的是提供一种培育具有提高的NUE的转基因植物的方法。
上述培育具有提高的NUE的转基因植物的方法包括如下步骤：将1所述的基因或其活性片段或重组表达载体导入植物细胞，得到转基因植株，其中1所述的基因或其活性片段在转基因植株中过表达。
上述方法中，所述载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导方法转化到植物细胞或组织中。
上述方法还包括在导入植物细胞之前将1所述的基因针对所述植物的密码子应用进行密码子优化的步骤。
上述方法中，与未导入所述基因或其活性片段或所述重组表达载体的对照植株相比，所述转基因植株具有提高的NUE，体现在如下方面中的至少一种：
1)植物单株分蘖数增加；
2)植物每穗粒数增加；
3)植物产量增加；
4)植物NUE增加。
上述方法中，所述的植物为水稻、玉米、小麦、高粱、大豆、苜蓿和拟南芥等作物，其中，优选为水稻。
此外，本发明将自身启动子驱动的OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica分别导入模式植物拟南芥中，得到转基因拟南芥细胞，由所述转基因拟南芥细胞产生表达所述分离的核苷酸序列的转基因拟南芥植株，与导入OsNLP4-japonica的转基因拟南芥相比，所述导入OsNLP4-indica的转基因拟南芥具有提高的氮利用率。这一结果表明本发明提供的OsNLP4-indica基因在模式植物中的功能保守，为该基因在不同农作物育种方面提供了有力证据。
实验证明，携带OsNLP4-indica等位基因的粳稻近等基因系和转基因植物的产量和NUE都显著提高，表明籼稻氮高效利用等位基因OsNLP4-indica在培育氮肥高效利用植物中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1中a为OsNLP4基因在籼稻和粳稻群体间保守分化的4个SNPs示意图；b为OsNLP4等位基因SNPs在不同水稻群体间分布的频率。
图2中a为近等基因系NIL和双亲本氯酸盐敏感性实验示意图；b和c为受体亲本秀水134和NIL(NIL-1,NIL-2)之间的15N-硝酸盐和15N-铵盐吸收速率比较；d为总氮含量；e为秀水134和NIL在田间正常施肥条件下的株型示意图；f-h分别为秀水134和NIL田间在正常施肥条件下的单株分蘖数(f)，小区产量(g)和NUE(h)。实验结果为平均值±标准差，不同字母表示由Tukey检验的单因素方差分析得到的显著性(P<0.05)。
图3中a为受体亲本秀水134与NIL在不同硝酸盐浓度水培条件下的生长比较；b为秀水134与NIL在不同硝酸盐浓度水培条件下的单株鲜重；c为田间不同施肥条件下受体亲本秀水134与NIL的株型比较；d为田间不同施肥条件下秀水134与NIL的单株产量示意图；e-g分别为田间不同施肥条件下秀水134与NIL的单株分蘖数(e)，小区产量(f)和NUE(g)。实验结果为平均值±标准差，不同字母表示由Tukey检验的单因素方差分析得到的显著性(P<0.05)。
图4中a为野生型DJ、OsNLP4-indica转基因水稻(OsNLP4indica)、OsNLP4-japonica(OsNLP4japonica)转基因水稻在不同硝酸盐浓度长期水培条件下的株型比较；b为野生型DJ、OsNLP4-indica转基因水稻(OsNLP4indica)、OsNLP4-japonica(OsNLP4japonica)转基因水稻在不同硝酸盐浓度长期水培条件下的单株产量示意图；c-d分别为野生型DJ、OsNLP4-indica转基因水稻(OsNLP4indica)、OsNLP4-japonica(OsNLP4japonica)转基因水稻在不同硝酸盐浓度长期水培条件下的单株产量(c)和NUE(d)。实验结果为平均值±标准差，不同字母表示由Tukey检验的单因素方差分析得到的显著性(P<0.05)。
图5为针对OsNLP4-japonica的3个SNP位点设计的引导编辑pegRNA示意图。其中pegRNA表示引导编辑中的向导RNA，RT sequence表示转录模板序列，PBS表示引物结合序列。红色标记的碱基表示碱基替换的具体位点信息。
图6中a为EMSA实验检测OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica结合NRE顺式元件的能力。使用生物素标记的OsNiR-NRE基因顺式元件片段作为探针，未标记的片段作为竞争性探针。体外表达带有MBP标签的OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica蛋白对NRE探针进行凝胶阻滞迁移实验；b为瞬时双荧光素酶实验测定蛋白质OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica对于含有NRE元件靶基因的转录调控。效应基因OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica受CaMV 35S启动子控制，来自OsNiR启动子的NRE顺式元件被融合到LUC基因作为报告载体。采用瞬时双荧光素酶报告法检测萤火虫LUC和REN荧光素酶活性，并计算LUC:REN比值，REN的活性为内参。实验结果为平均值±标准差，不同字母表示由Tukey检验的单因素方差分析得到的显著性(P<0.05)。
图7中a为不同物种NLP蛋白的进化关系图；b为不同物种NLP蛋白氨基酸序列的序列比对，其中突出显示OsNLP4蛋白在籼稻和粳稻群体间分化的SNPs位点；c为拟南芥野生型col-0、OsNLP4-indica转基因株系(OsNLP4indica-1、OsNLP4indica-2)和OsNLP4-japonica转基因株系(OsNLP4japonica-1、OsNLP4japonica-2)在土壤中生长3周的表型示意图；d为拟南芥野生型col-0、OsNLP4-indica转基因株系(OsNLPindica-1、OsNLPindica-2)和OsNLP4-japonica转基因株系(OsNLP4japonica-1、OsNLP4japonica-2)在土壤中生长3周的地上部分生物量。实验结果为平均值±标准差，不同字母表示由Tukey检验的单因素方差分析得到的显著性(P<0.05)。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
实施例1、OsNLP4在籼稻和粳稻群体间的自然变异。
为了探究氮高效利用基因OsNLP4(Rice NIN-LIKE PROTEIN 4plays a pivotalrole in nitrogen use efficiency.Plant Biotechnol J.19(3):448-461)在水稻自然群体的变异情况，我们通过RiceVarMap v2.0(https://ricevarmap.ncpgr.cn/)分析了4726份亚洲栽培稻种质资源中OsNLP4基因的核苷酸多态性。结果表明，OsNLP4的编码区在籼稻和粳稻群体间存在4个保守分化的SNPs。其中编码区303位的SNP1(A>C)，569位的SNP3(G>A)和763位的SNP4(A>G)，导致了籼稻和粳稻亚种间氨基酸的变异(Arg101>Ser101，Ser190>Asn190，Thr255>Ala255)(图1a)。OsNLP4-indica基因型的SNP1、SNP3和SNP4核苷酸类型，在2749份籼稻品种中所占比例分别为92.0％、95.3％和95.4％，而在1512份粳稻品种中仅占0.6％、0.9％和0.9％(图1b)。另外，通过RiceSuperPIRdb(http://www.ricesuperpir.com/)对28份普通野生稻(Oryza rufipogon)、11份非洲栽培稻(Oryzaglaberrima)及其10份短舌野生稻(Oryza barthii)种质资源的分析，发现OsNLP4-indica基因型的SNP1核苷酸类型，在普通野生稻、非洲栽培稻和短舌野生稻品种中所占比例仅占7.1％、0％和0％，而OsNLP4-indica基因型的SNP3和SNP4核苷酸类型在普通野生稻、非洲栽培稻和短舌野生稻品种中所占比例分别为89.3％、100％和100％(图1b)。以上结果表明OsNLP4在籼稻和粳稻驯化过程中受到人工选择，也暗示OsNLP4-indica在粳稻育种进程中没有被应用过，在粳稻氮高效利用改良方面具有巨大潜力(图1b)。
实施例2、OsNLP4-indica近等基因系(NIL)的构建与氮素利用能力的测定。
以籼稻品种9311为供体亲本，以粳稻品种秀水134为受体亲本进行近等基因系的构建。将9311与秀水134连续回交4次，获得BC4F2，使用分布于第9染色体上的PCR多态性标记对回交后代进行鉴定，以得到含有OsNLP4-indica的NIL。
我们首先对受体亲本秀水134，供体亲本9311和含有OsNLP4-indica的染色体单片段代换系SSSL95以及近等基因系NIL进行了氯酸盐敏感性实验。实验方法如下：水稻幼苗在仅以2mM硝酸钾为唯一氮源的木村营养液中培养4天，后转移到含有2mM氯酸钾(替换2mM硝酸钾)的营养液中培养4天，再用含有2mM硝酸钾的营养液恢复生长2天，观察和统计幼苗的死亡率。
木村水培培养基配方如下：NH4NO3 80mg/L，NaH2PO4·2H2O 93.6mg/L，K2SO452.4mg/L，CaCl2·2H2O 44.2mg/L，MgCl2·6H2O 122mg/L，Fe·EDTA19mg/L，H3BO3 3.01mg/L，MnSO4·5H2O 2.17mg/L，ZnSO4·7H2O 0.21mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.024mg/L，CuSO4·5H2O0.075mg/L。2mM硝酸钾水培培养基配方是在木村培养基基础上，去除培养基中的NH4NO3，额外添加KNO3至需要的浓度，作为唯一氮源。
结果表明，携带OsNLP4-indica的粳稻株系相比秀水134，表现出更高的氯酸盐敏感性(图2a)，暗示OsNLP4-indica促进粳稻硝酸盐的吸收。
接下来，我们通过15N吸收实验进一步比较NIL和秀水134的氮素转运速率。实验方法如下：在15N-硝酸盐吸收试验中，水稻幼苗在木村培养基上生长10天后，将其放入0.1mMCaSO4中1min，以去除幼苗表面可能沾有的硝酸盐，再将幼苗转移到以5mM K15NO3为唯一氮源的水培培养基中培养24h，最后再将幼苗放入0.1mM CaSO4中洗涤1min。整株幼苗在70℃的高温下充分干燥并研磨成粉。对于15N-铵盐吸收试验中，除将5mM 15N-KNO3替换为1mM15N-NH4Cl和1mM KNO3外，处理方法与上述相同。15N含量由连续流同位素比质谱仪(DELTAVAdvantage)和元素分析仪(EA-HT,Thermo Fisher Scientific,Inc.，Bremen,Germany)共同检测分析。
结果表明，携带OsNLP4-indica的NIL相比秀水134，表现出更高的硝酸盐和铵盐转运能力(图2b,c)。总氮含量的测定结果也证实了这一点。将在2mM硝酸钾为唯一氮源的木村培养基中生长18天的水稻幼苗，70℃高温干燥至恒重，研磨，并使用NC分析仪(Vario ELIII model,Elementar,Hanau,Germany)进行分析。结果表明近等基因系NIL相比秀水134具有更高的总氮含量(图2d)。
常规管理的田间(2021年，安徽合肥)产量评估表明，近等基因系NIL的分蘖数相比秀水134明显增多，产量和NUE分别显著增加了25％和27％(图2e-h)，在农业生产上具有很高的应用价值。
实施例3、OsNLP4-indica近等基因系NIL与受体亲本秀水134氮素利用效率的比较。
将OsNLP4-indica近等基因系NIL与受体亲本秀水134分别处于不同浓度的硝酸盐(0.02mM、0.2mM、2mM)水培条件下生长18天，水培培养基配方见实例2。对OsNLP4-indica近等基因系NIL相比受体亲本秀水134的生长状态和生物量进行测定。结果表明：NIL相比受体亲本在不同硝酸盐浓度条件下都表现出更好的生长状态和更高的生物量(图3a,b)。
在大田种植条件下，比较不同施肥条件下OsNLP4-indica近等基因系NIL与受体亲本秀水134的株型，单株产量，单株分蘖数，小区产量和NUE。
田间施氮肥方法和种植方法如下：受体亲本和NIL的材料于2023年5月至2023年10月种植于长兴(浙江)，尿素作为唯一氮肥，低氮(LN)田施氮量为90kg N/ha，正常氮(NN)田施氮量为180kg N/ha，高氮(HN)田施氮量为360kg N/ha，每个小区面积为3.4m2，种植方法为8株/行×10株/列，每次实验设置4个小区作为重复。
结果表明：无论是在LN、NN和HN条件下，NIL较受体对照在株型，单株产量和单株分蘖数等方面均表现出显著的增加，使得小区产量在LN、NN和HN条件下分别显著提高了21.1％、25.7％和20.2％，NUE分别显著提高了20.8％、24.9％和20.1％(图3c-g)。
实施例4、OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica转基因株系的构建和氮素利用效率的比较。
1、自身启动子驱动的OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica表达载体的构建
采用高通量构建载体的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统：DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)，将分别从籼稻9311和粳稻DJ基因组中扩增得到的包含3000bp启动子序列的OsNLP4基因的cDNA，利用GatewayR BP ClonaseTMII Enzyme Mix试剂盒(Invitrogen，Cat.No.11789-020)通过GatewayTM克隆技术重组克隆到pCB308R(High-throughput binary vectors for plantgene function analysis.Journal of Integrative Plant Biol.49(4):556-567)的attR1和attR2之间，将经测序鉴定表明含有籼稻9311和粳稻DJ OsNLP4 cDNA和3000bp启动子序列的pCB308R重组载体分别命名为pCB308R-OsNLP4-indica和pCB308R-OsNLP4-japonica。
2、OsNLP4转基因植物的获得和鉴定
将上述构建的重组表达载体采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA,1994,Plant Journal 6：271-282)导入水稻品种DJ中。待转基因植株长大后，剪取叶子提DNA，并设计引物对其进行PCR，筛选出转入OsNLP4基因的阳性植物，单株收种，直至T2代检测出纯合植株。取在木村培养基上生长的纯合株系通过qRT-PCR鉴定各株系中OsNLP4基因的表达量。具体操作如下：取OsNLP4转基因株系和野生型7天大的小苗，抽取总RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模版，以ACTIN1基因作为内参，采用大连宝生物工程公司生产的Q-PCR试剂盒(TakaraPremix ExTaqTMII)进行qRT-PCR。从构建的OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica转基因水稻株系中各选择1个OsNLP4表达量没有差异的株系，命名为OsNLP4indica和OsNLP4japonica，用于后续实验。
3、不同硝酸盐浓度长期水培实验
将野生型DJ、OsNLP4-indica转基因水稻(OsNLP4indica)、OsNLP4-japonica转基因水稻(OsNLP4japonica)的种子发芽后移栽到充满蛭石的花盆中(花盆尺寸:15×15×15cm3)。每个盆栽种植一株，每个基因型每个处理30盆。植株在含有不同硝酸盐浓度(LN：1mM；HN：5mM)水培条件下生长(配方见实例2)，直至成熟。每个处理每次浇灌营养液10L。在整个生育期，每隔12天灌溉12次。植株在温室中保持12小时光照(30℃)/12小时黑暗(28℃)循环。
结果证明：无论是在LN还是HN条件下，OsNLP4-indica转基因水稻较DJ和OsNLP4-japonica转基因水稻在单株产量和NUE等方面均显著提高(图4)，表明OsNLP4的自然变异确实导致了籼稻和粳稻NUE的差异。
实施例5、OsNLP4-japonica的引导编辑(Prime Editor)。
引导编辑是一种基于“搜索和替换”的基因组编辑方式。引导编辑的搜索功能是基于改造的向导RNA(pegRNA)，pegRNA中除了单导RNAs(sgRNAs)外，在其3′-端还有一段引物结合序列(PBS)和转录模板序列(RT)。本实例首先根据OsNLP4-japonica基因组序列中3个SNPs的位点信息设计pegRNA，具体序列如图5所示。接着，将扩增好的pegRNA嵌入到朱健康教授课题组开发的引导编辑器载体Sp-PE2(Precision genome engineering in riceusing prime editing system.Plant Biotechnology Journal.18:2167-2169)中。引导编辑蛋白由Cas9切口酶和逆转录酶融合而成。Cas9切口酶在pegRNA上的sgRNA序列指引下，切割DNA单链，pegRNA3′-端的引物结合序列可以与切割断点前的互补序列识别配对，逆转录酶以pegRNA上PBS序列后的人工设计的模板序列为模板进行逆转录，将目标序列直接聚合到切口的DNA链上。通过这套系统，可以在无需引入双链断裂和外源DNA模板的情况下，有效地产生精确的碱基转换。最后，通过测序将目标位点碱基精准替换的阳性植株筛选出来，筛纯扩繁用以后续表型鉴定等试验。
实施例6、OsNLP4-indica蛋白与OsNLP4-japonica蛋白对NRE结合能力的比较。
为了验证OsNLP4编码区的自然变异是否会改变其对NRE元件的结合能力，我们采用凝胶迁移实验(EMSA)和双荧光素酶报告基因系统两种生化手段进行验证。
我们首先采用EMSA实验分析OsNLP4-indica蛋白与OsNLP4-japonica蛋白结合NRE元件的能力是否有差异。通过将OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica的CDS片段构建进pET30a表达载体((SEQ ID NO.4))中，然后将载体转化进大肠杆菌Rosseta菌株(DE3)进行蛋白表达，从而获得了MBP-OsNLP4-indica融合蛋白、MBP-OsNLP4-japonica融合蛋白和MBP蛋白。同时对OsNiR启动子上的NRE顺式元件片段进行人工合成，并在其DNA末端标记生物素作为目标探针(NRE probe)(LP：TCTCAGCATCTGCCCTTTTGAATTCGCCAAGAGCC(SEQ ID NO.5)；RP：GGCTCTTGGCGAATTCAAAAGGGCAGATGCTGAGA(SEQ ID NO.6))。使用相同序列的未标记生物素片段作为竞争性探针。EMSA使用Thermo Scientific公司的化学发光EMSA试剂盒(cat#20148)进行。每个反应在0.5×TBE缓冲液中上样到2％的天然琼脂糖凝胶上进行电泳。检测结果使用CCD摄像系统(GE Healthcare,Image Quant LAS 4000)。通过EMSA对OsNLP4-indica蛋白和OsNLP4-japonica蛋白与NRE顺式元件片段的结合情况进行分析，如图6a所示，OsNLP4-indica蛋白结合NRE顺式元件的能力比OsNLP4-japonica蛋白更强。
接着，我们利用双荧光素酶系统对OsNLP4-indica蛋白和OsNLP4-japonica蛋白与OsNiR启动子上的NRE顺式元件的调控作用进行了实验分析。通过将OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica的CDS序列构建入表达载体pAN580中，将OsNiR的启动子上的NRE顺式元件构建进LUC系统载体pGreenⅡ-0800载体(该载体采用Gateway Technology高通量构建载体的方法，具体参考文献：汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统：DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)中后，将这些载体瞬转入水稻原生质体中进行表达，12-18h后用试剂盒(Vazyme，cat#DL101-01)检测LUC与REN值并算出比值来分析结果，如图6b所示，OsNLP4-indica蛋白对含有NRE顺式元件的靶基因的转录激活能力比OsNLP4-japonica蛋白更强。
实施例7、OsNLP4基因的进化分析及OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica转基因拟南芥的构建。
1、OsNLP4基因的同源比对以及进化分析
我们通过MAGE11.0软件对OsNLP4基因编码蛋白的进化分析发现，该基因在水稻、拟南芥、玉米、高粱、苜蓿和二穗短柄草等物种中均存在其同源基因，保守性较高(图7a)。前期多项研究也表明NLP基因在水稻、玉米、拟南芥、苜蓿、大麦等物种中具有相似的功能(Rice NIN-LIKE PROTEIN 4plays a pivotal role in nitrogen use efficiency.PlantBiotechnol J.19(3):448-461；Overexpression of the Maize ZmNLP6 and ZmNLP8 CanComplement the Arabidopsis Nitrate Regulatory Mutant nlp7 by RestoringNitrate Signaling and Assimilation.Front.Plant Sci.8:1703；Barleytranscription factor HvNLP2 mediates nitrate signaling and affects nitrogenuse efficiency.Journal of Experimental Botany 73(3):770-783；NIN interactswith NLPs to mediate nitrate inhibition of nodulation in Medicagotruncatula.Nat.Plants 4(11):942-952；Nuclear retention of the transcriptionfactor NLP7 orchestrates the early response to nitrate inplants.Nat.Commun.4:1713)。
有趣的是，虽然各物种中NLP蛋白的同源性很高，但是OsNLP4-indica单倍型的3个位点氨基酸类型(籼稻和粳稻OsNLP4自然变异位点R101、S190和T255)，在粳稻以及其它物种的NLP蛋白中很少出现，属于稀有变异，表明利用该稀有变异在改良其它植物NUE中具有广阔的应用前景(图7b)。
2、OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica转基因拟南芥的构建
为了验证上述猜想，我们将实例4所述构建的重组表达载体pCB308R-OsNLP4-indica和pCB308R-OsNLP4-japonica用电转化法转入根癌农杆菌系GV3101::pMP90(该菌株由美国ISU大学Oliver D.J.教授惠赠，也可参见Koncz C,Schell J(1986)The promoterof TL-DNA gene 5controls the tissue-specific expression of chimeric genescarried by a novel type of Agrobacterium binary vector.Mol Gen Genet 204:383–396.)，再用浸花转化方法(floral dip method)(Steven J,Clough and Andrew F.Bent(1998)Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal 16(6),735–743.)转化从拟南芥野生型植株Col-0。收到T0代种子后铺到含50mg/L除草剂(glufosinateammonium，商用名为Liberty，法国Aventis作物科学公司)的MS培养基上筛选转入OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica基因的阳性拟南芥植物。抗除草剂的T1阳性苗移植到土壤中生长直至成熟，单株收取T2代种子。T2代种子种下去单株收种，鉴定纯合株系。取在除草剂上全萌的纯合株系,以UBQ5基因作为内参,通过qRT-PCR鉴定各拟南芥株系中OsNLP4基因的表达量。各选择两个在拟南芥野生型背景下过量表达OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica基因的转基因株系，即OsNLP4japonica-1、OsNLP4japonica-2和OsNLPindica-1、OsNLPindica-2(四个株系之间OsNLP4的表达量没有明显差异)用于后续实验。
将野生型拟南芥、OsNLP4-indica转基因株系(OsNLPindica-1、OsNLPindica-2)和OsNLP4-japonica转基因株系(OsNLP4japonica-1、OsNLP4japonica-2)种子萌发后移栽到土壤中生长3周。植株在生长室中保持16小时光照(22℃)/8小时黑暗(22℃)循环。结果如图7所示，与拟南芥野生型相比，OsNLP4-indica转基因株系和OsNLP4-japonica转基因株系生物量都显著增加。而相比OsNLP4-japonica转基因株系，OsNLP4-indica转基因株系具有更明显的生长优势，生物量更高。这些数据表明OsNLP4-indica和OsNLP4-japonica的功能的分化在双子叶植物拟南芥中保守，也暗示着通过NLP基因编辑改良其它单双子叶作物氮高效高产的可行性，具有重大潜力。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
序列表：
SEQ ID NO.1:OsNLP4-indica-CDS
ATGGAAGAGGGAGACCCCCAGCCCAGCATCTCCTTGGCACGCACTCCGTCGGAAGGCGCGGCGGCGGCAGTCGACTTGGATCTCCTTGAGCAGCTTCTCTCAGCCGACAACGCCTGGCTTGAAGTGGCAGCAAACACTTCACGCTCACCCAACTTCTTTGCTACCCCCTCCAACTGCTTGACAGATGCTTCGGTCGCCACCACCACACCTGCAAATTCATGGTGGATTCAGCCGAGCGGTGCAAGCACCTCAGTTCGGGAACGGTTTGACCAAGCTCTAGCTTACATCAGGGAGACACAGAGAGACGCCGATGTGCTTGTGCAGCTCTGGGTGCCAGTCAAGGGCAACGATGGTCAGCTGGTGTTGACGACGAGCGGGCAGCCATTCACTCTCGATCAGAGGTCCAATAGCCTCATACAGTTCAGGGAGGTTTCGACAAAGTACCAGTTCTCTGCAGATGTTGCTTCAGGTTCCTCACCTGGGCTACCAGGGAGGGTGTTCATCGGTAGGCTTCCTGAATGGTCACCAGATGTTCGATACTTCACCAGCTATGAGTACCCTAGGATCAGCCATGCACAATATTTGGATGTCCACGGGACGATGGGGCTGCCGGTGTTTGAGAGGGGGAACTACTCATGCTTAGGTGTCATCGAGTTGATCATGACCAAGCAGAAGCTCAACTTCACCTCCGAGCTCAATACCATTTGCAGTGCTCTCCAGGCAGTTAACCTGACAAGCACAGAAGTTTCAAGCATTCCGCGCACAAAGCTTAACAGTGCTTCCTACAAAGATGCTTTACCAGAGATACTAGAAGTCCTGAGAGCAGCCTGCATCACCCACAAGCTACCATTAGCTCAGACCTGGGTCACATGTGCTCAACAAGGAAAGCGGGGCAGTCGCCATTCTGACGAGAACTACAAGTACTGCATTTCCACCATTGATGCAGCATGCTATGTGAATGAACCCCGGATGCAGAGCTTCCACGAGGCCTGCTCCGAACACCACCTGCTACGGGGGCAGGGGGTTGCAGGGAAAGCCTTCACCACAAACCAGCCATGCTTCCTACCAGATATTGGATCCTCCACTAAACTGGAGTACCCATTGTCTCACCATGCTAAGATTTTCAATTTAAAAGGTGCAGTGGCAATCCGATTGCGTTGCACGCGCACAGGGATTGCCGACTTTGTGCTAGAGTTCTTTCTGCCAACTGACTGTGAAGTACTTGAGGAGCAGAAGGCAGTGCTGGACTCATTATCAGGCACCATGAGAAGTGTTTGCCAAACTTTACGTGTTGTTACTGACAAGGAGATGGAGGATGAGGCCATGAGAGAAATGAATGAGCTGAACTCATTTAGTCCTCGGGGCAAGAACAAAGTTGAGGAGTTATCCTTTGGAGACAACACAAGAGGGGATAGAGAGGAGGCATCTTGGACAACCTTAGTAGGGACTTCACAGAAAGGATCAGATTTAGCTGAATTGCATACACATGGAATGTTATCACATGGAGGGCATGGTTCATCTCAAGCTGGTGATCAAACAAGTAAAGAAGGTAGCAAAGTGAAAAGGCGTACAAAGACGGAGAAGACCGTGAGCTTGCAGGTCCTTCGGCAGTACTTTGCTGGGAGCCTGAAGGATGCAGCAAAGAGCCTTGGAGTGTGCCCAACCACCCTGAAAAGAATATGCAGGCAGCATGGCATAAACCGCTGGCCATCACGGAAGATAAAGAAAGTAGACCATTCTCTAAGGAAACTGCAGCAAATCATTGATTCAGTTCATGGAGCAGAGACAGCTTTCCAGCTTAACACCCTCTACAAGGACCTCACAAACACCTCTGTATCATCTGACAACAATTTGTCAGGAAGTGTCACAGTTCCTCTGGCTAACCAGAACAATCTAGACTTTGAAATGCACCAACACCACAGGTTAAGCAGCAATATTCCATCGACTTCACTCTCACACTCATCATGCAGCCAAAGTTCCGATTCAAGCCCTTCCTGCAGTGGAGGAGCAACAAAACATTCACCCCAGGTTGGAGCTGATCAGGTGAGGTCAGGATGTCTTCCACAACATAGCCCTGTCCAGACTCTGCAAACAGAAGCTGCTTCAATAAATGAACATTTCTCAGGTCAGGAAGCACCAATAGATCTCTTACAGGATGTTGCTGAAAAGGCAAATGGTGAACAGCACATGTCTCAAAGTCCATCATCCCCCAAGCAGACTGCAAATGTAGGTATGAGAGTAAAGGTCACTTTTGGCTCAGAAAAGGTGAGGTTCAGATTGAAACCTGAGTGTGACTTTCAAGAACTGAAGCAGGAGATATCAAAACGTCTGAGTATAGCAGACATGAATTCCTTGATTGTAAAGTATTTGGATGACGATTCAGAATGGGTCTTGATGACATGTGATGCAGATTTACACGAGTGTTTTCATGTTTATAAACTAGCAGATATCCAAACAATCAAGATTTCAGTTCATCTGGCTGCTAGTCCAACAACAAGGATCACCATTGGTCACACTGGTTTCTCATGA
SEQ ID NO.2:OsNLP4-indica氨基酸序列
MEEGDPQPSISLARTPSEGAAAAVDLDLLEQLLSADNAWLEVAANTSRSPNFFATPSNCLTDASVATTTPANSWWIQPSGASTSVRERFDQALAYIRETQRDADVLVQLWVPVKGNDGQLVLTTSGQPFTLDQRSNSLIQFREVSTKYQFSADVASGSSPGLPGRVFIGRLPEWSPDVRYFTSYEYPRISHAQYLDVHGTMGLPVFERGNYSCLGVIELIMTKQKLNFTSELNTICSALQAVNLTSTEVSSIPRTKLNSASYKDALPEILEVLRAACITHKLPLAQTWVTCAQQGKRGSRHSDENYKYCISTIDAACYVNEPRMQSFHEACSEHHLLRGQGVAGKAFTTNQPCFLPDIGSSTKLEYPLSHHAKIFNLKGAVAIRLRCTRTGIADFVLEFFLPTDCEVLEEQKAVLDSLSGTMRSVCQTLRVVTDKEMEDEAMREMNELNSFSPRGKNKVEELSFGDNTRGDREEASWTTLVGTSQKGSDLAELHTHGMLSHGGHGSSQAGDQTSKEGSKVKRRTKTEKTVSLQVLRQYFAGSLKDAAKSLGVCPTTLKRICRQHGINRWPSRKIKKVDHSLRKLQQIIDSVHGAETAFQLNTLYKDLTNTSVSSDNNLSGSVTVPLANQNNLDFEMHQHHRLSSNIPSTSLSHSSCSQSSDSSPSCSGGATKHSPQVGADQVRSGCLPQHSPVQTLQTEAASINEHFSGQEAPIDLLQDVAEKANGEQHMSQSPSSPKQTANVGMRVKVTFGSEKVRFRLKPECDFQELKQEISKRLSIADMNSLIVKYLDDDSEWVLMTCDADLHECFHVYKLADIQTIKISVHLAASPTTRITIGHTGFS
SEQ ID NO.3:OsNLP4-japonica氨基酸序列
MEEGDPQPSISLARTPSEGAAAAVDLDLLEQLLSADNAWLEVAANTSRSPNFFATPSNCLTDASVATTTPANSWWIQPSGASTSVRERFDQALAYIRETQSDADVLVQLWVPVKGNDGQLVLTTSGQPFTLDQRSNSLIQFREVSTKYQFSADVASGSSPGLPGRVFIGRLPEWSPDVRYFTSYEYPRINHAQYLDVHGTMGLPVFERGNYSCLGVIELIMTKQKLNFTSELNTICSALQAVNLTSTEVSSIPRAKLNSASYKDALPEILEVLRAACITHKLPLAQTWVTCAQQGKRGSRHSDENYKYCISTIDAACYVNEPRMQSFHEACSEHHLLRGQGVAGKAFTTNQPCFLPDIGSSTKLEYPLSHHAKIFNLKGAVAIRLRCTRTGIADFVLEFFLPTDCEVLEEQKAVLDSLSGTMRSVCQTLRVVTDKEMEDEAMREMNELNSFSPRGKNKVEELSFGDNTRGDREEASWTTLVGTSQKGSDLAELHTHGMLSHGGHGSSQAGDQTSKEGSKVKRRTKTEKTVSLQVLRQYFAGSLKDAAKSLGVCPTTLKRICRQHGINRWPSRKIKKVDHSLRKLQQIIDSVHGAETAFQLNTLYKDLTNTSVSSDNNLSGSVTVPLANQNNLDFEMHQHHRLSSNIPSTSLSHSSCSQSSDSSPSCSGGATKHSPQVGADQVRSGCLPQHSPVQTLQTEAASINEHFSGQEAPIDLLQDVAEKANGEQHMSQSPSSPKQTANVGMRVKVTFGSEKVRFRLKPECDFQELKQEISKRLSIADMNSLIVKYLDDDSEWVLMTCDADLHECFHVYKLADIQTIKISVHLAASPTTRITIGHTGFS
SEQ ID NO.4:pET30a表达载体核苷酸序列
TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAGAACATCACCATcaCCATCATCACCATGCCAAAATTGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGCAGCCCTGGCAGCCGCGCAGACTAATGCGGGCAGCGAGAATCTTTATTTCCAAGGTTCTGTCGACGCGGCCGCAAGCTAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT
SEQ ID NO.5:探针NRE probe的LP核苷酸序列
TCTCAGCATCTGCCCTTTTGAATTCGCCAAGAGCC
SEQ ID NO.6:探针NRE probe的RP核苷酸序列
GGCTCTTGGCGAATTCAAAAGGGCAGATGCTGAGA

Claims (16)

1.OsNLP4-indica等位基因，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的等位基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.OsNLP4等位或同源基因，所述基因的核苷酸序列在相应位置包含OsNLP4-indica等位基因的下述SNPs：
1)SNP1(303A)
2)SNP2(531T)
3)SNP3(569G)
4)SNP4(763A)。
4.根据权利要求3所述的等位或同源基因，所述基因编码的氨基酸序列在相应位置的氨基酸与OsNLP4-indica等位基因在相应位置的编码的下述氨基酸相同：
1)101位的Arg
2)190位的Ser
3)255位的Thr。
5.一种提高植物氮素利用率(nitrogen use efficiency,NUE)的基因编辑方法，包括如下步骤：通过基因编辑技术在野生型植物或者植物细胞中的OsNLP4等位或同源基因编辑为权利要求1-4任一项所述的基因，得到基因编辑植株。
6.根据权利要求5所述的方法，与未编辑的对照植株相比，所述基因编辑植株具有提高的NUE，表现为如下1)-4)中的至少一种：
1)植物单株分蘖数增加；
2)植物每穗粒数增加；
3)植物产量增加；
4)植物NUE增加。
7.根据权利要求5或6所述的方法，所述植物为水稻、玉米、小麦、高粱、大豆、苜蓿和拟南芥，其中，优选为水稻。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述OsNLP4等位或同源基因为OsNLP4-japonica等位基因，其编码的OsNLP4-japonica同源蛋白的氨基酸序列如以下中的任一项所示：
1)所述OsNLP4-japonica同源蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示；
2)所述OsNLP4-japonica同源蛋白为SEQ ID NO.3限定的氨基酸序列具有80％以上同源性具有相似生物学功能的蛋白质。
9.一种构建近等基因系植物的方法，包括如下步骤：将含有权利要求1-4任一项所述的基因的供体亲本与受体亲本进行杂交，再与受体亲本4次回交，得到了与受体亲本相比NUE提高的含有权利要求1-4任一项所述的基因近等基因系植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，供体亲本为籼稻品种，优选9311；受体亲本为粳稻品种，优选秀水134。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于：
所述的NUE提高体现在如下1)-4)中的至少一种：
1)植物单株分蘖数增加；
2)植物每穗粒数增加；
3)植物产量增加；
4)植物NUE增加。
12.一种培育具有提高的NUE的转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求1-4任一项所述的基因或其活性片段或重组表达载体导入植物细胞，得到转基因植株，提高了权利要求1-4任一项所述的基因或其活性片段在转基因植株中的表达。
13.根据权利要求12所述的方法，该方法还包括在导入植物细胞之前将权利要求1-4任一项所述的基因针对所述植物的密码子应用进行密码子优化的步骤。
14.与根据权利要求12或13所述的方法，未导入所述基因或其活性片段或所述重组表达载体的对照植株相比，所述转基因植株具有提高的NUE，体现在如下1)-4中的至少一种：
1)植物单株分蘖数增加；
2)植物每穗粒数增加；
3)植物产量增加；
4)植物NUE增加。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，所述植物为水稻、玉米、小麦、高粱、大豆、苜蓿和拟南芥，其中，优选为水稻。
16.权利要求1-4任一项所述的基因在提高植物氮素利用率中的应用。
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