CN118150562A - 一种基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，属于分子检测技术领域。所述多功能探针器件为具有单侧尖端的n通道纳米移液器，n≥1，集成光纤通道、纳米间隙电极对、纳米流体通道中的一种或多种；光纤通道为其中一通道内设置光纤，并在尖端沉积光波导材料与光纤耦合；纳米间隙电极对为对称的两通道内填充导电材料，并在尖端形成具有纳米间隙的电极对；纳米流体通道为通道保持通畅。纳米流体通道和电学采集设备组成量化递送系统；纳米间隙电极对和交流电源组成可控提取系统；光纤通道与共聚焦显微成像组件组成光学超分辨显微成像系统。本发明利用多功能探针器件将各功能模块集成，实现单细胞内可控分子递送和内含物实时采样表征。

Description

一种基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统。

背景技术

单细胞水平分子尺度研究对理解生命体的生物过程和分子基础至关重要，有助于揭示细胞异质性、细胞活性和受控分化过程，有助于了解癌症、神经退行性等疾病机制，以及开发新的诊断技术和治疗药物。对多细胞生物来说，大部分功能来源于细胞内部和细胞之间的空间组织和动态行为，且细胞群在亚细胞和单分子水平上存在异质性。然而，传统分析方法通常只能获得分子或细胞群体的平均信息，可能会导致细胞间元素含量或生物分子表达差异性等关键信息的丢失，从而很难准确反映个体细胞行为。因此，为了更全面、深刻地理解和认识细胞过程和分子基础，需要借助单细胞甚至亚细胞水平上的分子实时精准调控与测量技术。

单细胞操纵和测量技术是当前世界重要的前沿研究领域之一，受到国际科学界和高新技术仪器公司的广泛关注与重视，被认为是发展精准医学技术以及解决主要医疗挑战的关键。

目前，微纳米移液管或流体力显微镜针尖抽取策略是常见的微流体操作方式，可抽取微量的细胞质流体的非特异性抽吸步骤，即利用微创穿刺到细胞的特定空间位置，进而提取出微量细胞质液。微流体技术因其具备在有限体积中操纵微量流体的能力，已被广泛用于细胞培养、分离、筛选、裂解和分析，具有以下特点：①微流体通道具有精确可控的封闭微环境，有利于分子的装载与递送；②尺度的一致性使得细胞样品容易固定于微流体通道，实现较为精确的定位；③易于与机械、电子电路、光学和其他组件集成，从而可实现捕获、成像和/或执行穿刺等功能；④因其连续流体特性，可将样品冲入和冲出细胞研究区域，从而可实现细胞研究的高通量。

此外，光学显微成像技术广泛应用于单细胞分析和研究，特别是荧光超分辨技术，其可借助荧光标记物揭示细胞成分、分子的空间分布，或生化过程的时间动力学。然而，目前传统的光学超分辨显微技术仍存在着一定局限性，单一的光学技术目前无法对细胞中分子精确操作，难以执行单分子递送与捕获。

为了弥补单分子操纵能力的欠缺，光学成像系统融合微纳流体探针及分子操纵平台是单细胞研究中普遍采用的策略。其中，结合介电泳技术的光学显微操纵平台近年来也被研究用于细胞内分子的可控提取和转移。由于与扫描探针显微镜完全兼容，这种纳米镊介电泳分子捕获技术可用于同一细胞或组织的多个时间点和空间采样，从而进行基因组、基因表达和单个细胞器分析研究，但也存在分子水平操纵和测量能力不足，且需荧光标记等限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于单细胞分子水平实时定位、量化递送和原位提取的单细胞分子精准操纵技术和仪器化平台，实现单细胞内可控分子递送和内含物实时采样表征，以及在相关疾病细胞模型中仪器化功能应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，包括分别与多功能探针器件连接形成的单分子量化递送系统、单分子可控提取系统、高空间分辨定位系统中的一个或多个系统组合；

所述多功能探针器件为具有单侧尖端的n通道纳米移液器，n≥1，集成光纤通道、纳米间隙电极对、纳米流体通道中的一种或多种；所述光纤通道为其中一通道内设置光纤，并在尖端沉积光波导材料与光纤耦合形成；所述纳米间隙电极对为对称的两通道内填充导电材料，并在尖端形成具有纳米间隙的电极对；所述纳米流体通道为通道保持通畅，其尖端处为纳米孔；

本发明提供的多功能探针器件可以为纳米流体通道、纳米电极对或纳米光波导的结构，也可以为兼容其中任意两种或三种的结构。该器件由石英多孔毛细管(即管内含单通道或多孔通道，单孔内径小于1毫米)经激光拉制、导电材料填充以及光波导材料沉积等过程制备获得。

进一步的，本发明提供的光电集成纳米探针是以纳米孔、电极对、微纳光纤为核心组装的器件，包括多通道纳米流体通道、纳米间隙电极对以及位于纳米间隙电极对两侧的纳米光波导器件。

进一步的，所述纳米移液器由石英多孔毛细管经激光拉制形成，其尖端外径为80～300纳米，纳米通道尖端孔径为20～50纳米。

本发明提供的探针尖端直径仅为百纳米级，远远小于细胞平均直径，由于其细直径和均匀的几何形状，具有较小的侵入性，可实现对细胞的无损穿刺操作。

本发明中纳米间隙电极对由导电材料在对称的纳米通道中沉积形成，所述导电材料可以为但不限于碳材料。

进一步的，所述导电材料为碳材料，通过有机气体热解炭化技术在对称的两纳米通道内沉积碳材料，并在尖端形成两个共面碳电极。通过优化纳米玻璃管拉制及炭化参数，可获得直径在20纳米～50纳米范围内的碳电极，并控制电极间隙在20纳米-50纳米。优选的，有机气体采用丁烷气体。

进一步的，所述光纤为微纳光纤，利用微纳米加工技术，在另一玻璃管通道中引入微纳光纤，并在纳米通道尖端通过电沉积或化学沉积金属银或其他材料，实现纳米光波导材料与纳米光纤在玻璃管中的有效融合，提高光的能量传输效率，从而可将光导入探针尖端，构建针尖集成的“纳米光源”。

进一步的，所述多功能探针器件中光纤通道的制备方法包括：先将二氧化硅标准单模光纤插入石英多孔毛细管的其中一孔道，再经激光拉制形成具有单侧尖端的带有光纤的纳米移液器，然后通过电沉积或化学沉积在纳米通道尖端沉积金属银；或者，先将二氧化硅单模光纤拉伸制成微纳光纤，再插入到纳米移液器的注有银反应液的纳米孔道中，发生还原反应使得金属银与光纤耦合。

通过优化纳米波导结构设计和工艺，调控其纳米结构的形貌和尺寸，匹配纳米通道和纳米间隙电极对的相对位置，从而获得光电集成的纳米探针器件。

所述单分子量化递送系统包括多功能探针器件中的纳米流体通道、与纳米流体通道连通的微量注射器、与纳米流体通道尾端连接的Ag/AgCl电极，以及连接Ag/AgCl电极和多功能探针器件导电电极的电学采集设备。

所述Ag/AgCl电极为光洁的银丝采用恒电流极化在银丝表面镀一层氯化银形成。具体的，银丝作为阳极(工作电极)，铂丝作为阴极(对电极和参比电极)，电解液为0.1M HCl或饱和KCl溶液，设置恒电流参数10mA/cm²，运行时间1min。

所述单分子量化递送系统功能实现主要是基于纳米流体通道对分子检测与输运能力。其工作原理为：根据目标物的电性，利用电学采集设备施加一定电压，目标分子向导电电极方向移动，从纳米流体通道经过尖端的纳米孔，此时会引起电流改变，实时监测电流变化，控制目标分子精确递送。

本发明提供的单分子量化递送系统除了实现将纳米流体通道内的目标分子递送至外界，还可以实现将外界的目标分子提取至纳米流体通道内，具体的，根据目标物的电性，施加相反的偏压，使得外界的目标物通过纳米孔进入纳米流体通道内。

所述电学采集设备包括电学放大器和模数转化器；基于多功能纳米探针器件中的纳米流体通道，利用高性能电学放大器(MD 200B)和模数转化器作为基本电学信号检测平台，设计电阻反馈和电容反馈电路，通过准确测量分子通过纳米通道时的各项数据参数，建立单分子与电学信号的内在关联。

具体的，微量电流检测设备的原理主要是通过电流检测电阻器(分流器)和电流检测放大器，将微弱的电流信号放大到可以被检测和测量的程度。分流器实际上是一个阻值很小的电阻。当有直流电流通过分流器时，会在电阻两端产生电压。这个电压降会显示在电流表上的直流读数中。因此，通过测量分流器两端的电压，就可以计算出流过电路的电流量。为了提高检测灵敏度和准确性，分流电阻器通常与运算放大器或差分放大器配对组成电学放大器，将分流电阻器两端产生的低电压转换为更适合模数转换器进行转换的较大电压。

模数转换器(Analog-to-Digital Converter，ADC)是一种将连续变量的模拟信号转换为离散的数字信号的器件。在本发明中是将实时产生的电信号转为控制芯片能够处理的数字信号。

采集电学信号时，以Ag/AgCl电极为工作电极，多功能探针器件的其中一个导电电极为参比电极。本发明利用多功能探针的自身导电电极进行单分子测量，无需引入额外参比电极，可降低对细胞损伤。

进一步的，所述单分子量化递送系统还包括用于负载待递送功能分子的DNA分子载体。利用分子载体(molecular carrier)负载待递送的功能分子，借助纳米流体通道的单分子测量和输运能力，实现细胞中单分子水平上的可量化递送。优选的，分子载体采用长链核酸，核酸分子本身带有负电荷的磷酸基团，在偏置电压下，向阳极移动。利用长链的DNA分子载体负载待递送的功能分子，可以降低分子穿越纳米孔时的速度，放大功能分子产生的信号，提高量化递送的准确性。更为优选，分子载体采用大于20kb的λ-DNA分子。

所述单分子可控提取系统包括多功能探针器件中的纳米间隙电极对以及与之连接的交流电源。本发明利用集成于探针器件的纳米间隙电极，结合交流电场的调制，实现介电泳“纳米镊”功能。

通过研究交流电场的持续时间、峰值电压和频率等对介电泳捕获的影响，结合细致理论和实验研究，调节和控制介电泳力的大小和方向，控制分子在纳米间隙电极中的捕获与释放，从而发展成为高稳定性、高灵敏、反应快的分子纳米镊平台。

进一步的，所述交流电源的频率为10kHz-100kHz，峰峰值电压为5V-15V。

本发明建立无损伤细胞内含物快速捕获与提取，实现细胞的实时快速采样分析。此外，结合分子修饰以及优化条件，实现亚细胞区域内细胞质以及细胞器的可控提取。进一步结合先进质谱仪和实时核酸扩增等技术实现细胞内含物的精确分析，从而实现细胞中分子动态信息的实时“活检”分析。

所述高空间分辨定位系统包括光纤共聚焦显微成像系统和远场成像系统，所述光纤共聚焦显微成像系统由多功能探针器件中的光纤通道和与光纤连接的共聚焦显微成像组件组成。

具体的，所述共聚焦显微成像组件包括激光器、聚焦透镜、二向色镜Ⅰ、光栅、宽场探测器Ⅰ，所述光纤通过光纤转接头与二向色镜Ⅰ连接。其中，激光器提供激光光源；聚焦透镜对激光光束进一步汇聚；二向色镜Ⅰ进行光谱分光；激光通过光纤转接头进入光纤，该结构中光纤既是光源输入端，也是信号接受端；二向色镜Ⅰ分光，残余的激光被二向色镜反射，不会被探测到；光栅对获得的信号光进行调制；所述宽场探测器可以是光电倍增管(PMT)或是雪崩光电二极管(APD)，将光信号转换电信号。

上述结构的工作原理为：激光器发出激光束，通过聚焦透镜汇聚后经过二向色镜Ⅰ进入光纤，激光照射样品所产生光信号，被光纤重新收集后送往二向色镜Ⅰ，透过光栅到达宽场探测器Ⅰ形成电信号，电信号经处理后形成共聚焦图像。

激光从光纤输出可以有更好的聚焦，激发效果更佳，所需激光功率更低，对样品的影响更小。光纤作为信号接收端可以对信号有更好的收集效果，减少杂散光影响，能提高检测灵敏度和信噪比。

作为本发明的一种具体实施方式，将光纤探针取代传统共聚焦显微镜的物镜部分，其他部分保持一致。

本发明提供的多功能探针器件可将可见光引入活细胞内区室中，实现精准定位。光学输出限制在多功能探针器件尖端，提供高度定向和局部照明，将其整合到光学装置中使得光谱分析小型化，所需的照明量小、对细胞的伤害小。

本发明引入远场成像系统的目的是定位多功能探针器件的位置。所述远场成像系统，包括照明光源、二向色镜Ⅱ、物镜、管镜、反射镜和宽场探测器Ⅱ。工作原理为：照明光源发出的光经过二向色镜Ⅱ发射，经过物镜聚焦照射到样品上，产生的光又经过物镜、二向色镜Ⅱ、管镜、反射镜，通过宽场探测器Ⅱ形成样品的远场成像，得到待测样品的大致形貌和多功能探针器件的位置。

作为本发明的一种具体实施方式，远场成像系统采用传统的远场光学显微镜组件。

利用以上光学成像系统与纳米探针器件的结合，可实现单细胞中多功能探针的高空间分辨定位与跟踪，兼容于单细胞单分子操纵系统中的光学显微成像。

本发明通过集成器件与光学显微成像技术的融合，利用微纳光纤以及金或银纳米材料耦合引入远场光源，在亚百纳米尺度的探针尖端实现宽场、远场、无标记细胞中显微成像。

所述单分子操纵仪器系统还包括载物台和控制系统，所述载物台用于放置待处理样本；所述控制系统包括光源控制器、电学与光学信号探测控制器、探针固定及多轴位移控制器，均与计算机相连。

所述光源控制器与高空间分辨定位系统中激光器和照明光源电连接，控制其开关。

所述电学与光学信号探测控制器与所述电学采集设备、交流电源、宽场探测器电连接。

探针固定及多轴位移控制器由操纵杆和多轴位移控制器组成，多功能探针固定安装在操纵杆一端，多轴位移控制器与操纵杆另一端相连，通过多轴位移控制器实现探针的三维准确移动。

根据各硬件的软件开发接口，编写控制程序，确保各个模块正常工作，实现系统实验数据的处理与图像重建，并通过统一的软件界面进行同步控制和信号采集、数据传输及存储，实现仪器系统的可控化。

本发明具备的有益效果：

本发明提供的光电集成多功能探针器件结构高度紧凑，电极对尺寸和间距可调，且兼容纳米流体通道和微纳光波导。基于自主研制的多功能探针，建立纳流体通道的单分子测量与递送技术，实现单分子在细胞内的可控量化递送；建立基于针尖集成的纳米间隙电极的介电泳纳米镊技术，实现细胞内分子快速采样提取；基于光学输出限制在多功能探针器件尖端，实现高空间分辨定位。本发明利用多功能探针集成各功能模块，实现系统集成，搭建了一套新型的单细胞单分子操纵仪器平台。

附图说明

图1为多功能光电集成探针器件示意图，左上角图片为纳米移液器尖端实物图。

图2为测试多功能光电集成探针器件量化递送的示意图。

图3为基于纳米流体通道的单分子可控递送技术原理与方案示意图(a)以及单链DNA分子存在下隧穿电极的电导-时间变化图(b)。

图4为测试多功能光电集成探针器件单分子水平可控提取的示意图。

图5为结合细胞宽场成像与微纳光纤共聚焦光谱测量的高空间分辨定位技术原理及示意图。a为系统组成示意图，插图为光电集成探针剖面图，光亮部分表示微纳光纤插入探针一个纳米通道中，并在探针尖端与波导材料有效耦合，其可实现探针尖端的局域光场照明；b为a的局部放大图。

图6为细胞远场成像与光纤共聚焦光谱测量系统结构示意图。

图7为多功能探针器件的远场成像图片。

图8为本发明基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统各模块示意图。

图9为本发明基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统总体结构示意图。

图10为图9中操作台面上的结构组成示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：光电集成的多功能纳米探针器件的制备(方法1)

如图1所示，光电集成的多功能纳米探针器件包括具有单侧尖端的四通道纳米移液器，尖端处纳米通道的孔径为20-60纳米。四通道中的其中对称的两通道内通过有机气体热解炭化技术沉积石墨，并在尖端形成两个共面石墨电极11，控制电极间隙在20纳米-50纳米；另外一通道内设置有光纤12，纳米通道尖端沉积有光波导材料(金属银)，与光纤耦合；最后一通道保持通畅，作为纳米流体通道13，其尖端处为纳米孔。

制备过程具体如下：

步骤一、拉制带有纳米光纤的纳米移液器

通过两步法拉制清洗后的细管，所述细管为四通道细石英玻璃管，外径为1.5mm，内径为1.10mm，长度为100mm。所述清洗步骤为：用18.2MΩ·cm超纯水冲洗干净细管，放入等离子清洗机中清洗表面杂物，清洗30分钟。

拉制采用P-2000激光拉制仪：第一步，将二氧化硅标准单模光纤(Corning公司的SMF-28)从细管底部插入，施加激光束加热细玻璃管的中间部位，加热同时进行拉制，拉制参数设定为Heat：940，Filament：3，Velocity：50，Delay：170，Pull：100；第二步，参数设定为Heat：960，Filament：2,Velocity：40,Delay：145,Pull：190。拉制程序结束，形成两个相同的具有单侧尖端的带有光纤的纳米移液器。

步骤二、在纳米移液器尖端制备碳纳米电极

将步骤一制备的纳米移液器中需要保持通畅的纳米通道和纳米光纤通道的尾端用橡皮泥堵住。将处理后的纳米移液器尖端置于石英毛细管中，通入0.2m³/min的氩气。纳米移液器的另一端连接一根橡胶管，并通入0.2m³/min的丁烷气体。用丁烷焰对石英毛细管进行预加热，并沿着石英毛细管移动丁烷焰以调节火焰位置直至纳米移液器的尖端呈亮黄色。保持预热状态10秒后，沿着纳米移液器从尖端向末端方向移动丁烷焰，加热探针30秒，在纳米移液器尖端形成碳纳米电极。完成后，将尾端堵塞的橡皮泥去除。

所述步骤二中的纳米移液器均在使用当天制作，并保存在密封的培养皿中。

步骤三、采用电化学沉积在纳米移液器尖端上沉积金属与光纤结合

具体的，将金属丝从步骤二处理过的纳米移液器的尾端插入与碳电极紧密连接，并用硅胶固定，同时纳米通道和光纤通道仍旧保持通畅，不插入金属丝。使用恒电位仪，将纳米移液器尖端浸入电镀液(具体成分为：3mM AgNO₃、10mM KNO₃)中，用恒定电位程序进行一定时间的银的电沉积。

所述的恒定电位程序具体为：Ag/AgCl线作为参比电极，Pt片作为对电极，两个碳纳米电极作为工作电极，恒定电位设置为电位一：-200mV，电位二：-220mV，电位差为20mV。

所述金属丝为铜丝，直径0.2mm。

所述的Ag/AgCl线为新制的，外径0.125mm。

所述的银的电沉积时间为20-50秒。

器件制备完成后，保存于18.2MΩ·cm超纯水中。

实施例2：光电集成的多功能纳米探针器件的制备(方法2)

步骤一、微纳光纤的制备

将二氧化硅单模光纤作为预制棒，使用酒精灯加热至熔融状态，同时保持适当的拉伸速度，拉制得到细光纤。再将细光纤缠绕在蓝宝石棒的尖端，加热蓝宝石棒熔融细光纤，再次拉伸，得到微纳光纤。

步骤二、拉制的纳米移液器

通过两步法拉制清洗后的细管，所述细管为四通道细玻璃管，外径为1.5mm，内径为1.10mm，长度为100mm。所述清洗步骤为：用18.2MΩ·cm超纯水冲洗干净细管，放入等离子清洗机中清洗表面杂物，清洗30分钟。

拉制采用P-2000激光拉制仪：第一步，施加激光束加热细玻璃管的中间部位，加热同时进行拉制，拉制参数设定为Heat：920，Filament：3，Velocity：30，Delay：170，Pull：80；第二步，参数设定为Heat：950，Filament：2,Velocity：20,Delay：145,Pull：180。拉制程序结束，形成两个相同的具有单侧尖端的纳米移液器。

步骤三、在纳米移液器尖端制备碳纳米电极(与实施例1步骤二相同)

将步骤二制备的纳米移液器中需要保持通畅的纳米通道和需要设置微纳光纤的通道的尾端用橡皮泥堵住。将处理后的纳米移液器尖端置于石英毛细管中，通入0.2m³/min的氩气。纳米移液器的另一端连接一根橡胶管，并通入0.2m³/min的丁烷气体。用丁烷焰对石英毛细管进行预加热，并沿着石英毛细管移动丁烷焰以调节火焰位置直至纳米移液器的尖端呈亮黄色。保持预热状态10秒后，沿着纳米移液器从尖端向末端方向移动丁烷焰，加热探针30秒，在纳米移液器尖端形成碳纳米电极。完成后，将尾端堵塞的橡皮泥去除。

所述步骤三中的纳米移液器均在使用当天制作，并保存在密封的培养皿中。

步骤四、微纳光纤与纳米移液器耦合

在步骤三处理后的纳米移液器中需要设置微纳光纤的纳米通道注入20μL银反应液，将步骤一制备的微纳光纤插入纳米通道，与反应液充分接触，使用15W的柱状低压汞灯(波长＝253.7nm)照射，使银在纳米通道和微纳光纤上发生还原，使得微纳光纤与纳米移液器耦合。如图6所示。

所述反应液具体制备流程为：将0.6mL 10mM NaBH₄加入20mL溶液(0.25mM AgNO₃，0.25mM柠檬酸三钠)中，并剧烈搅拌30秒后，静置2小时得到种子液。然后，将0.1mL产生的种子液加入3mL溶液(1mM AgNO₃，2mM聚乙烯基吡咯烷酮(MW＝58000))中，得到反应液。

步骤五、纳米移液器连接外加金属线

具体的，将金属丝从步骤二处理过的纳米移液器的尾端插入，并用硅胶固定，同时纳米通道和光纤通道仍旧保持通畅，不插入金属丝。

实施例3：不同金属介质与不同波长输入光的耦合效率的比较

1、本实施例按照实施例1提供的方法制备不同金属介质的光电集成多功能纳米探针器件。其中，步骤三中以金作为沉积金属，具体为：

具体的，将金属丝从步骤二处理过的纳米移液器的尾端插入，并用硅胶固定，同时纳米通道和光纤通道仍旧保持通畅，不插入金属丝。使用恒电位仪，将纳米移液器尖端浸入电镀液(具体成分为：4.4mM NH₄AuSO₃、52mM(NH₄)₂SO₃)中，用恒定电位程序进行一定时间的金的电沉积。

所述的恒定电位程序具体为：Ag/AgCl线作为参比电极，Pt片作为对电极，两个碳纳米电极作为工作电极，恒定电位设置为电位一：-700mV，电位二：-720mV，电位差为20mV。

所述的Ag/AgCl线为新制的，外径0.125mm。

所述的金的电沉积时间为20-50秒。

器件制备完成后，保存于18.2MΩ·cm超纯水中。

2、将多功能纳米探针器件中的纳米光纤通过光纤耦合器与光源连接。光源输出的光通过光纤耦合器进入光电集成的多功能纳米探针器件，使用校正过的CCD(DS-5Mc，Nikon)观察、拍摄纳米探针尖端金属介质与光纤的耦合，再通过对光学显微镜照片上的光斑强度进行分析以估算出耦合效率。

具体来说，在无背景照明、CCD未饱和的情况下，得到耦合的光学显微镜照片使用图像处理软件(比如photoshop)以一定大小的选区将光斑全部截取出来并转换成灰度值，将灰度值累加就可以近似作为输出光的强度并在此基础上计算出耦合效率。

对不同金属介质的探针在输入不同波长的光源进行测试，将耦合前与耦合后的输出总光强进行了比较，计算得到耦合效率。结果如表1所示。

表1.不同金属介质与不同波长输入光的耦合效率

金属介质	波长(nm)	耦合效率
			金	650	65
金	785	55
			银	650	82
银	785	70
			银	830	92

由上表可知，对于银介质而言，830nm波长的激光耦合效率最高，可以达到最佳的激光能量利用效率。因此本发明采用银介质，和830nm波长的激光照射。

实施例4：单分子水平量化递送

1、带有递送蛋白的DNA分子载体制备过程包括：

步骤1：将12.5μLλ-DNA(15.8nM，New England Biolabs，48.5kb)与12.5μL 1.6μM待运送的递送蛋白和25μL无核酸酶水(Thermo Scientific)混合，λ-DNA：递送蛋白混合比例约为1:100。

步骤2：使用PCR退火装置(TC-3000,TECHNE)运行杂交程序。首先将混合物加热至75℃保持5分钟，然后以1℃/min的速率逐渐冷却至15℃，最后保持在4℃。

步骤3：添加3.6μL T4 DNA连接酶(400units/μL，NEB)和6μL 10×T4连接酶反应缓冲液(NEB)，连接步骤2所得产物。连接在22℃下进行2小时，然后在65℃下灭活15分钟。

步骤4：将2.5μLApa I(NEB)和7μL 10×rCutSmart缓冲液(NEB)添加到步骤3所得混合物中，并在25℃下孵育30分钟，然后在65℃下灭活20分钟。所得产物在凝胶分离前保存在冰箱中。

步骤5：使用琼脂糖凝胶电泳程序分离DNA纳米探针。

2、本实施例按照实施例1提供的方法制备光电集成的多功能纳米探针器件。

如图2所示，从纳米探针器件尾端的纳米通道入口插入新制的Ag/AgCl电极，利用微量注射器从纳米通道尾端入口加入带有递送蛋白的DNA分子载体(200pM)和电解液(10μL)。将纳米探针尖端插入电解液，并与电学采集设备相连接，其中碳电极作为参比电极，Ag/AgCl电极作为工作电极。电解液具体成分为10mM LiClO₄、5mM MgCl₂、10mM Tris-HCl和1mMEDTA(pH＝8)。

由于DNA分子载体本身带有负电荷的磷酸基团，在偏置电压下，会向着阳极移动。保持-300mV的偏压，可以实时观察到每一个递送蛋白所产生的信号。如图3所示，每一个峰值的出现可视为一个递送蛋白。当递送数量达到时，可以停止施加偏压，进而暂停递送。

检测原理：当外加电学采集设备设定一定电压时，分子就会从纳米流体通道经过纳米孔，进入测试池。功能分子在通过纳米孔时会引起电流的改变，实时监测电流变化，控制目标物质精确递送。

本实施例利用长链的DNA分子载体负载待递送的功能分子，降低分子穿越纳米孔时的速度，放大功能分子产生的信号，提高量化递送的准确性。

使用不同长度的λ-DNA进行纳米孔测试(电解液具体成分为10mM LiClO₄、5mMMgCl₂、10mM Tris-HCl和1mM EDTA(pH＝8))，在-300mV的偏压下，单个信号峰的持续时间结果如表2所示。

表2.不同长度λ-DNA的信号峰持续时间

λ-DNA长度(kb)	单个信号峰平均持续时间(ms)
		10	2
20	4
		48.5	6

可以发现较长的λ-DNA的单个信号峰平均持续时间更长，能够更清晰地显示出通过的λ-DNA产生的信号，从而更准确地计数。

实施例5：介电泳捕获目标物

1、本实施例按照实施例1提供的方法制备光电集成的多功能纳米探针器件。

2、将纳米探针器件的两个碳电极端与交流电源相连接，提供交流电场，实现介电泳捕获目标物。

介电泳(Dielectrophoresis，DEP)是一种物理现象，描述的是位于非均匀电场中的中性微粒由于介电极化的作用而产生的平移运动。利用非均匀电场对介电粒子产生的力，通过调整电场的参数(如频率、强度等)，可以控制不同介电性质的粒子在电场中的运动，从而实现对特定粒子的捕获。

如图4所示，将纳米探针尖端插入含有提取物的溶液，控制电源的交流频率f_AC和V_pp，达到对提取物的捕获效果。其中f_AC为10kHz-100kHz，V_pp为5V-15V，持续时间为5s-120s，具体数值根据提取物的大小、浓度等调节。

以荧光标记的小球(直径40nm)为例，当交流电源(f_AC＝100kHz，V_pp＝10V)打开时，可以从荧光显微镜下看到明显的荧光小球信号出现在电极尖端，表明DEP成功实现了捕获的效果。

捕获到的目标物可以富集在尖端，实现了目标物局部浓度的提升，提高了检验灵敏度。捕获到的目标物也可以通过纳米孔提取出来。

实施例6：纳米通道提取目标物

类似实施例4，根据目标物的电性，通过施加相反的偏压，使得溶液中的目标物通过纳米孔进入纳米通道内。

本实施例以游离的DNA为例。从纳米探针器件尾端的纳米通道入口插入新制的Ag/AgCl电极，利用微量注射器从纳米通道尾端入口加入电解液(10μL)。将纳米探针尖端插入含有游离λ-DNA分子(48.5kb，100nM)的电解液，并与电学采集设备相连接，其中碳电极作为参比电极，Ag/AgCl电极作为工作电极。电解液具体成分为10mM LiClO₄、5mM MgCl₂、10mMTris-HCl和1mM EDTA(pH＝8)。保持+300mV的偏压，可以看到DNA分子穿过纳米孔所产生的信号，表明电解液中游离的DNA分子经过纳米孔，进入了纳米通道。

实施例7：高空间分辨定位

1、本实施例按照实施例1提供的方法制备光电集成的多功能纳米探针器件。

2、如图5和图6所示，纳米探针器件的光纤连接光纤共聚焦系统，本实施例将光纤探针取代传统共聚焦显微镜的物镜部分，其他部分保持一致，组成部件包括激光器51、聚焦透镜52、二向色镜Ⅰ53、光栅54、宽场探测器Ⅰ55，连入纳米探针器件1光纤通道的光纤12通过光纤转接头与二向色镜53连接。用于激发样品信号的激光器发出激光束，通过聚焦透镜汇聚后经过二向色镜进入光纤，入射于待观察的标本内部焦点处。激光照射所产生光信号，被光纤重新收集后送往二向色镜，透过光栅到达宽场探测器(通常是光电倍增管(PMT)或是雪崩光电二极管(APD))，变成电信号后送入计算机，形成待观察的标本的共聚焦图像。

本实施例利用光纤将光学输出限制在多功能探针器件尖端，提供高度定向和局部照明，可将可见光引入活细胞内区室中，实现精准定位。

3、本实施例设置远场成像系统用于定位多功能探针器件的位置。利用传统的远场光学显微镜组件，包括照明光源41、二向色镜Ⅱ42、物镜43、管镜44、反射镜45和宽场探测器Ⅱ46。照明光源发出的光经过二向色镜发射，经过物镜聚焦照射到样品上。样品产生的光(包括反射，衍射，散射)又经过物镜、二向色镜、管镜、反射镜，通过宽场探测器形成样品的远场成像。

光学远场成像的工作原理：光学远场的成像系统通过透镜、反射镜等光学元件，将光线聚焦到特定的位置上，实现物体的放大或缩小。通过样品的远场成像得到样品的大致形貌和多功能探针的位置，如图7所示。

本实施例通过集成器件与光学显微成像技术的融合，利用微纳光纤以及金或银纳米材料耦合引入远场光源，在亚百纳米尺度的探针尖端实现宽场、远场、无标记细胞中显微成像。

实施例8：基于多功能纳米探针器件的单分子操纵仪器平台

如图8-10所示，本实施例提供了一种基于多功能探针器件的单分子操纵仪器系统，包括分别与多功能探针器件1连接形成的高空间分辨定位系统、单分子量化递送系统、单分子可控提取系统。

多功能探针器件1可由实施例1或实施例2提供的方法制备得到，如图1所示，多功能探针器件1为具有单侧尖端的多通道纳米移液器，通道个数≥4，其中对称的两通道内填充有导电碳材料，并在尖端形成纳米间隙电极对11；另外一通道内设置有光纤12，该纳米通道尖端沉积有光波导材料与光纤耦合；其余通道保持通畅，作为纳米流体通道13。

本实施例提供的单分子操纵仪器系统包括用于放置待处理样品的载物台，多功能探针器件1通过探针固定及多轴位移控制器安装设置于载物台上方，其尖端正对载物台的放置待处理样品的位置，具体的，所述探针固定及多轴位移控制器由操纵杆2和多轴位移控制器3组成，多功能探针1固定安装在操纵杆2的一端，多轴位移控制器3与操纵杆2的另一端相连，多轴位移控制器3控制操纵杆2沿X轴、Y轴、Z轴方向的移动，实现探针的三维准确移动。

所述高空间分辨定位系统包括远场成像系统4、由多功能探针器件1中的光纤通道和与光纤12连接的共聚焦显微成像组件5组成的光纤共聚焦显微成像系统。

本实施例引入远场成像系统的目的是定位多功能探针器件的位置。作为本实施例的一种具体实施方式，远场成像系统采用传统的远场光学显微镜组件，如图6所示，远场光学显微镜组件包括照明光源41、二向色镜Ⅱ42、物镜43、管镜44、反射镜45和宽场探测器Ⅱ46。工作原理为：照明光源发出的光经过二向色镜发射，经过物镜聚焦照射到载物台的待处理样品上，产生的光又经过物镜、二向色镜、管镜、反射镜，通过宽场探测器形成样品的远场成像，得到待测样品的大致形貌和多功能探针器件的位置。

本实施例将多功能探针器件1的光纤12与共聚焦显微成像组件5结合形成光纤共聚焦显微成像系统，将光学输出限制在多功能探针器件尖端，提供高度定向和局部照明。如图6所示，共聚焦显微成像组件5组成部件包括激光器51、聚焦透镜52、二向色镜Ⅰ53、光栅54、宽场探测器Ⅰ55，纳米探针器件1的光纤12通过光纤转接头与二向色镜53连接。作为本实施例的一种具体实施方式，将多功能探针器件1取代传统共聚焦显微镜的物镜部分，其他部分保持一致。上述结构的工作原理为：激光器发出激光束，通过聚焦透镜汇聚后经过二向色镜进入光纤，激光照射样品所产生光信号，被光纤重新收集后送往二向色镜，透过光栅到达宽场探测器形成电信号，电信号经处理后形成共聚焦图像。

所述单分子量化递送系统包括多功能探针器件1中的纳米流体通道13、与纳米流体通道连通的微量注射器(图中未标识，可以是外加或可拆卸部件)、与纳米流体通道尾端连接的Ag/AgCl电极，以及连接Ag/AgCl电极和碳电极的电学采集设备6；电学采集设备6与电极之间通过导线7连接。

单分子量化递送系统功能实现主要是基于纳米流体通道对分子检测与输运能力。其工作原理为：根据目标物的电性，利用电学采集设备施加一定电压，目标分子向碳电极方向移动，从纳米流体通道经过尖端的纳米孔，此时会引起电流改变，实时监测电流变化，控制目标分子精确递送。除了实现将纳米流体通道内的目标分子递送至外界，还可以实现将外界的目标分子提取至纳米流体通道内，具体的，根据目标物的电性，施加相反的偏压，使得外界的目标物通过纳米孔进入纳米流体通道内。

采集电学信号时，以Ag/AgCl电极为工作电极，多功能探针器件的其中一个碳电极为参比电极。

所述电学采集设备包括电学放大器和模数转化器；基于多功能纳米探针器件1中的纳米流体通道13，利用高性能电学放大器(MD 200B)和数模转化器为基本电学信号检测平台，设计电阻反馈和电容反馈电路，通过准确测量分子通过纳米通道时的各项数据参数，建立单分子与电学信号的内在关联。

所述单分子可控提取系统包括多功能探针器件1中的纳米间隙电极对11以及与之连接的交流电源8。交流电源8与电极之间通过导线连接。通过研究交流电场的持续时间、峰值电压和频率等对介电泳捕获的影响，结合细致理论和实验研究，调节和控制介电泳力的大小和方向，控制分子在纳米间隙电极中的捕获与释放，从而发展成为高稳定性、高灵敏、反应快的分子纳米镊平台。

本发明中，多功能探针器件1中的一个碳电极既用于组装单分子量化递送系统，又用于组装单分子可控提取系统，因此，在实际应用中，利用导线与需要的设备连接进行系统切换组装。

单分子操纵仪器系统还包括控制系统，控制系统包括光源控制器、电学与光学信号探测控制器，均与计算机相连。光源控制器与高空间分辨定位系统中激光器51和照明光源41电连接，控制其开关；电学与光学信号探测控制器与所述电学采集设备6、交流电源8、宽场探测器电连接。根据各硬件的软件开发接口，编写控制程序，确保各个模块正常工作，实现系统实验数据的处理与图像重建，并通过统一的软件界面进行同步控制和信号采集、数据传输及存储，实现仪器系统的可控化。

本实施例基于自主研制的多功能探针，将多功能模块集成，搭建了一套新型的单细胞单分子操纵仪器平台，融合纳米流体通道、单分子电学测量、光学超分辨显微等技术，实现单细胞内可控分子递送和内含物实时采样表征，以及在相关疾病细胞模型中仪器化功能应用。

Claims (10)

1.一种基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，其特征在于，包括分别与多功能探针器件连接形成的单分子量化递送系统、单分子可控提取系统、高空间分辨定位系统中的一个或多个系统组合；

所述多功能探针器件为具有单侧尖端的n通道纳米移液器，n≥1，集成光纤通道、纳米间隙电极对、纳米流体通道中的一种或多种；所述光纤通道为其中一通道内设置光纤，并在尖端沉积光波导材料与光纤耦合形成；所述纳米间隙电极对为对称的两通道内填充导电材料，并在尖端形成具有纳米间隙的电极对；所述纳米流体通道为通道保持通畅；

所述单分子量化递送系统包括多功能探针器件中的纳米流体通道、与纳米流体通道连通的微量注射器、与纳米流体通道尾端连接的Ag/AgCl电极，以及连接Ag/AgCl电极和多功能探针器件导电电极的电学采集设备；

所述单分子可控提取系统包括多功能探针器件中的纳米间隙电极对以及与之连接的交流电源；

所述高空间分辨定位系统包括由多功能探针器件中的光纤通道和与光纤连接的共聚焦显微成像组件组成的光纤共聚焦显微成像系统，以及远场成像系统。

2.如权利要求1所述的基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，其特征在于，所述纳米移液器由石英多孔毛细管经激光拉制形成，其尖端外径为80～300纳米，纳米通道尖端孔径为20～60纳米。

3.如权利要求1所述的基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，其特征在于，所述导电材料为碳材料，通过有机气体热解炭化技术在纳米通道内沉积碳材料，控制电极间隙在20纳米～50纳米，碳电极直径为20纳米～50纳米。

4.如权利要求1所述的基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，其特征在于，所述光纤为微纳光纤，在纳米通道尖端通过电沉积或化学沉积金属银。

5.如权利要求4所述的基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，其特征在于，先将二氧化硅标准单模光纤插入石英多孔毛细管的其中一孔道，再经激光拉制形成具有单侧尖端的带有光纤的纳米移液器，然后通过电沉积或化学沉积在纳米通道尖端沉积金属银；或者，先将二氧化硅单模光纤拉伸制成微纳光纤，再插入到纳米移液器的注有银反应液的纳米孔道中，发生还原反应使得金属银与光纤耦合。

6.如权利要求1所述的基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，其特征在于，所述电学采集设备包括电学放大器和模数转化器；采集电学信号时，以Ag/AgCl电极为工作电极，多功能探针器件的其中一个导电电极为参比电极。

7.如权利要求1所述的基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，其特征在于，所述单分子量化递送系统还包括用于负载待递送功能分子的DNA分子载体。

8.如权利要求1所述的基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，其特征在于，交流电源的电场控制参数包括持续时间、峰值电压和频率。

9.如权利要求1所述的基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，其特征在于，所述共聚焦显微成像组件包括：激光器、聚焦透镜、二向色镜Ⅰ、光栅、宽场探测器Ⅰ，所述光纤通过光纤转接头与二向色镜Ⅰ连接；

所述远场成像系统包括照明光源、二向色镜Ⅱ、物镜、管镜、反射镜和宽场探测器Ⅱ。

10.如权利要求1所述的基于多功能探针的单细胞单分子操纵仪器系统，其特征在于，还包括载物台和控制系统，所述控制系统包括光源控制器、电学与光学信号探测控制器、探针固定及多轴位移控制器，均与计算机相连。