CN118150528A - 小型相位干涉表面等离子体共振检测系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小型相位干涉表面等离子体共振检测系统及方法，所述系统包括一台倒置荧光显微镜主体框架，激光器发射光源之后依次连接的微流体系统光路检测系统，差动相位干涉成像光学系统，两台高性能CCD相机及具有图像处理功能的计算机，所述的微流体系统光路检测系统，差动相位干涉成像光学系统和两台高性能CCD相机均与所述计算机的控制系统连接。本发明的检测系统同时具备了角度扫描式的高灵敏度和光强检测式的高检测通量，与现有商品化SPR分子相互作用检测分析仪相比，具有明显的技术优势。

Description

小型相位干涉表面等离子体共振检测系统及方法
技术领域
本发明专利属于生物检验检测技术领域，尤其涉及一种小型相位干涉表面等离子体共振检测系统及方法。
技术背景
表面等离子体共振（SurfacePlasmonResonance，SPR）是一种物理光学现象。利用光在玻璃界面处发生全内反射时的隐失波，可以激发金属膜表面的自由电子振荡产生表面等离子波。发生SPR时，光波的能量因转移到表面等离子波而发生大幅度衰减。当金属表面介质的折射率发生微小的变化时，会改变金属表面等离子波的模场分布，从而使得反射光的光强和相位发生变化。在实际应用中，通常使用化学性质稳定的金作为激发SPR的金属材料。如果在金膜表面上固定探针分子，构建传感芯片，那么就可以以表面折射率变化的形式来测量分子的相互作用。只要待测样品分子与探针分子结合，金膜表面的介质折射率随之改变，就会引起反射光的强度和相位发生变化。实时记录反射光的强度或相位变化，如同一台摄像机那样实时记录分子相互作用的全过程。从光强或相位的变化中可获得相互作用过程的动态信息，解析得到分子相互作用的特异性、亲和力以及动力学特性等参数。
SPR亲和生物传感器是一种采用SPR传感法进行信号转换的传感器，其基本原理如下所示在金属表面上的生物识别元件识别并捕获样品中存在的分析物分子，从而引起金属表面产生局部折射率的变化，并通过SPR传感法进行测量。最后将信号进行解析，获得与分析物分子相关的有用信息。此种传感器的优势在于，它采用了免标记的测量方式，并且可以进行实时观测。其主要应用于生物技术、医学诊断、药物筛选和食品安全等领域。
SPR传感技术具有无需标记、灵敏度高、能够实时动态监测等特点，已经成为分子相互作用检测的金标准。自1983年Liedberg等人首次利用SPR传感器检测了IgG蛋白与其抗原的相互作用以来，SPR传感技术已经广泛用于药物筛选与开发、食品安全（微生物、添加剂检测等）、公共安全（病毒、毒品、酒精检测）、环境监测（重金属离子检测）、临床诊断（血糖、肿瘤标志物等体外诊断、个体化医疗）等领域。
PR的折射率分辨率指标是指SPR传感方法可以分辨的最小的折射率改变，这是目前国际上表征SPR传感器性能的核心指标。而动态范围指的是SPR传感器可以稳定检测的折射率范围。现有的SPR传感器已经能够实现多种药物筛选等类型的研究检测，但面对实际环境和微量样本，目前的SPR系统还不能很好地满足这些要求。
目前的SPR的生物分子检测研究尚且存在如下一些问题：
（1）SPR传感方法通量不够高，不能满足生物芯片的检测需要高通量的需求。单点探测的机制不能实现多类型生物标志物的单样本检测，逐点探测方式虽然能够实现针对生物芯片的二维检测，但检测时间很长，不能达到快速高通量的要求。
（2）生物标志物检测的灵敏度指标仍需提高。目前，光强型二维SPR传感方法、Otsuki小组和Beusink小组的光谱型与角度谱型二维SPR传感方法一次能够检测生物芯片表面的一片区域，具有较高的信息通量。但是其检测机理本身限制了折射率分辨率指标的提高。要实现对于生物芯片的微量高灵敏度检测，折射率分辨率指标仍然有待提高。
（3）需要小型化、便捷化的仪器系统以适应多种检测场合。目前SPR系统仍多用于实验室作为研究仪器，其光路系统与微流控系统的复杂性限制了其小型化，并且对样本与生物芯片等的预处理等使其操作稍显繁琐，不能满足非实验室场合的实时快检需求，尚需将仪器系统小型化与自动化、智能化。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种小型相位干涉表面等离子体共振检测系统及方法，通过将表面等离子体共振传感技术与微流控技术相结合，以相位成像的方式提高了系统检测灵敏度，并进行二维面阵成像，系统高通量，高精度，配置简单，操作简便，体积小型化以及快速识别分子等特点，实现对生物小分子标志物检测，以及对超低浓度的蛋白分子的检测，并且可满足非实验室场合实时、无标记进行生物分子检测。
本发明是这样实现的：一种小型相位干涉表面等离子体共振检测系统，包括激光器发射光源之后的微流体系统光路检测系统，差动相位干涉成像光学系统，可进行二维面阵成像的高性能CCD相机及具有图像处理功能的计算机，所述的微流体系统光路检测系统，差动相位干涉成像光学系统和所述的高性能CCD相机均与所述计算机的控制系统连接；
所述的微流体系统光路检测系统包括激光器之后依次连接的第一全反射棱镜，偏振片B，四分之一波片，伽利略结构的扩束镜，聚焦透镜，分束镜，高NA值显微物镜，传感芯片，所述的传感芯片是由玻璃棱镜和其上附着的金膜B所组成的一体式传感芯片，所述的激光器采用半导体激光器，可沿X轴和Y周移动；
所述的差动相位干涉成像光学系统包括：第二全反射棱镜，至少两个成像透镜，二分之一波片B，偏振分束器B，所述偏振分束器B发出的光成像在所述的高性能CCD相机上 。
进一步的，所述的高性能CCD相机设置两台。
一种基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法，基于任意一项所述的小型相位干涉表面等离子体共振检测系统，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）所述激光器发出经过光纤耦合和准直后的光，通过所述第一全反射棱镜，得到偏振方向可调的线偏振准直光束；
2）所述的线偏振准直光束通过所述计算机控制的四分之一波片进行相位调整：两个快轴方向正交的四分之一波片被交替定位在光路中，从而使准直光的P偏振分量和S偏振分量之间的相位差被交替调制成为90°或-90°；
3）经过相位调制的准直光入射到所述传感芯片的玻璃棱镜与金膜B之间的界面上，激发其表面等离子体共振，光从该界面反射；
4）反射光通过偏振片，使其中的P偏振分量和S偏振分量发生干涉，产生干涉图像；
5）干涉图像经所述成像透镜成像在所述的高性能CCD相机的靶面上，采集所述靶面上的成像干涉图像；
6）计算机调控所述二分之一波片B进行P和S分量的方向偏转，交替采集附加90°和-90°相位差后产生的成像干涉图像；
7）利用所采集到的附加90°和-90°相位差的相邻的2帧成像干涉图像；
8）模数转换，将差分放大电路输出的温度误差信号转换成数字信号。
进一步的，检测过程中，微流体池固定在所述传感芯片表面并压紧，所述微流体池和传感芯片表面间形成溶液流动空间，所需试剂和样本溶液按检测设定程序注入其中。
进一步的，扩束后的光斑直径约为26mm，利用矩形光阑，将光斑限定为18×16mm2的矩形，所述传感芯片尺寸设计为22mm×28mm，其中心11×11mm2的区域为传感区域，检测通量为400传感点（20×20），传感点直径为350μm，传感点间的中心距为500μm，传感区面积约11mm×11mm。
进一步的，实验时在芯片的金膜B表面滴上去离子水，从标定的零点开始移动激光光源竖直方向的位移台，在移动过程中随之调整所述的高性能CCD相机使亮斑大致位于靶面中心，移动适当距离，使得两幅干涉图像有较大对比度后，用所得的图像进行成像质量的评估。
进一步的，前镜焦距35mm，后镜面焦距24mm，放大倍数0.7，像方畸变≤0.1%。本发明的有益效果：
（1）通过将表面等离子体共振传感技术，以相位成像的方式提高了系统检测灵敏度，并进行二维面阵成像，本发明检测系统高通量，高精度，配置简单，操作简便，体积小型化以及快速识别分子等特点，实现对生物小分子标志物检测，以及对超低浓度的蛋白分子的检测，并且可满足非实验室场合实时、无标记进行生物分子检测。
（2）本发明的小型相位干涉表面等离子体共振检测系统同时具备了角度扫描式的高灵敏度和光强检测式的高检测通量，与现有商品化SPR分子相互作用检测分析仪相比，具有明显的技术优势。此外，国外的SPR产品单价在200万元～300万元/台左右，而本发明的SPR系统单价可控制在150万元/台以内，具有较大的成本优势。
下面结合附图说明和具体实施方式对本发明做进一步阐释。
附图说明
图1是差动干涉成像光路示意图；
图2是本发明算解理论详解示意图；
图3是本发明系统连接示意图；
图4是本发明检测系统组成结构框图；
图5是本发明高性能CCD相机成像效果图；
图6是本发明图像互相关算法流程框图；
图7是本发明RIRF分布图；
图8是本发明反射光强竖直位移图；
图9是本发明反射光强水平位移图；
图10是本发明划痕边缘行元素RIRF；
图11是本发明划痕边缘列元素RIRF；
图12是本发明图像的采集与处理程序框图。
图中：
01偏振片A，02棱镜，03二分之一波片A，04透镜，05偏振分束器A，06 CCD相机，07金膜A；
1激光器，2第一全反射棱镜，3偏振片B，4 四分之一波片，5扩束镜，6聚焦透镜，7分束镜，8显微物镜，80后焦面，9传感芯片，91玻璃棱镜，92金膜B，10第二全反射棱镜，11成像透镜，12二分之一波片B，13偏振分束器B，14高性能CCD相机，141 相机CCD1，142 相机CCD2，15计算机。
具体实施方式
实施例一：
根据目前四种SPR传感法的比较可知，相位法相对于光强法的灵敏度要更高。原理如图1所示，入射光经过偏振片A 01，进入棱镜02激发SPR后从所述棱镜02的另一面出射，首先通过一块二分之一波片A 03，然后通过用于成像的透镜04和偏振分束器05，最后两束偏振方向正交的光束分别产生偏振干涉后成像于两个CCD相机06的靶面上。通过采集两个CCD相机06所得到的干涉图像进行解算，就能得到反射光中P偏振分量的反射率和相位信息，最终可用于表征金膜A 07表面待测介质的折射率变化。
这一方法能有效提高检测灵敏度的原因在于其使用了光束双分后的互补干涉成像，并且使用差动解算用于表征折射率。如图2（a）所示，将二分之一波片A 03的波片快轴方向与X轴正向（即S偏振方向）夹角固定为22.5°，根据二分之一波片原理，反射光中的P分量和S分量将绕二分之一波片A 03的波片快轴旋转对称，最后得到与X轴正向夹角为±45°的偏振分量P’和S’；光束最终通过偏振分束器05后，沿X轴的偏振分量被反射，沿Y轴的偏振分量被透射，如图2（b）所示。由于P’和S’在两个方向上的投影相等，但反射光中的投影分量同向，而透射光中投影分量反向，因此两束光产生偏振干涉后的对比度很高，利用差动解算得到一个表征折射率的参数就能有效提高装置灵敏度。
基于上述原理，本发明一种小型相位干涉表面等离子体共振检测系统，主体框架是一台倒置荧光显微镜，设计思路是将现有的入射汞灯拆除，改造为激光光源并连接入射光路，将原有的物镜替换为高NA值的新物镜，激光器发射光源之后依次连接微流体系统光路检测系统，差动相位干涉成像光学系统，重新设计载物台，载物台设计专用工装和夹具，并且配合辅助位移台，使得能够放置特定的检测芯片；将原有的CCD相机拆除，并在像面处使用高性能CCD相机进行成像，通过计算机控制系统调控各光学元件和进行图像处理。
具体的，所述的小型相位干涉表面等离子体共振检测系统，如图1至图4所示，包括激光器1发射光源之后的微流体系统光路检测系统，差动相位干涉成像光学系统，可进行二维面阵成像的高性能CCD相机及具有图像处理功能的计算机，所述的微流体系统光路检测系统，差动相位干涉成像光学系统和所述的高性能CCD相机均与所述计算机的控制系统连接。
所述的微流体系统光路检测系统包括激光器1之后依次连接的第一全反射棱镜2，偏振片B 3，四分之一波片4，伽利略结构的扩束镜5，聚焦透镜6，分束镜7，高NA值显微物镜8，传感芯片9；
所述的差动相位干涉成像光学系统包括：第二全反射棱镜10，至少两个成像透镜11，二分之一波片B 12，偏振分束器B 13，所述偏振分束器B 13发出的光成像在所述的高性能CCD相机14上，所述的传感芯片9是由玻璃棱镜91和其上附着的金膜B 92所组成的一体式传感芯片；
所述的激光器1采用半导体激光器，固定设置在可沿X轴和Y周移动的激光器位移台上。
光束从所述的半导体激光器1中射出，经过偏振片B 3起偏以及四分之一波片4进行相位补偿，然后通过扩束镜5对光束直径进行放大。从扩束镜5出射的平行光束通过聚焦透镜6和分束镜7聚焦于显微物镜8的后焦面80上一点，此时光束通过显微物镜8的折射以平行光的形式入射到传感芯片9的下表面，反射光则通过显微物镜8的另一侧接收进入相位干涉成像系统光路。其原理是通过二分之一波片进行P和S分量的方向偏转，然后经过成像透镜11及偏振分束器B 13将两幅干涉图像成像在高性能CCD相机14上，并最后由计算机15进行图像的分析解算。所述成像透镜11为辅助成像的透镜，可以是多个，本实施例设置了两个所述成像透镜11，分别防放置在所述二分之一波片B 12的两侧。
本发明的相位干涉成像系统光路，所述显微物镜8的工作距离0.11mm，后焦面80位置为-25mm，放大倍数60，数值孔径1.5，进行物镜等效结构设计采用反向设计方式进行设计，并用zemax自动优化结构。因为系统的可调节自由度很多，每种自由度对反射光线造成的偏移结果也不是同向的，可以对每一级光路确定具体指标，达到该指标后视为该级调试完成不再移动，再调整下一级光路。经过完整的光路调整之后，所述的高性能CCD相机14上接收到的光斑的图像质量有所提高，光斑较为均匀，也没有出现明显的干涉、衍射条纹等。RIRF图像中光斑范围内光强大小也比较均匀，从而能够保证在使用这个仪器做检测的时候，不会因为光斑质量而对SPR检测结果造成影响，如图1至图12所示。
为了实现成像系统的功能，需要对系统进行准确的定位安装，对应各个元件所起的作用，对其安装提出了如下要求：
1）二分之一波片B 12：安装平面与入射光束传播方向垂直，在安装平面内可旋转，并能根据要求以确定的角度固定；
2）成像透镜11：安装平面与入射光束传播方向垂直；
3）偏振片B 3：安装平面与入射光束传播方向垂直，在安装平面内固定，不可旋转和移动；
4）高性能CCD相机14：安装平面与入射光束传播方向垂直，能沿光传播方向移动，确保成像质量。在安装平面内不可旋转，但能进行平移，其原因是当增大所述传感芯片处光线的入射角度时，入射光和反射光都会远离主光轴，最终成像也会远离所述高性能CCD相机14的靶面中心甚至超出成像范围，因此需要对所述的高性能CCD相机进行平面内的移动。
所述的二分之一波片B 12安装在Φ25mm精密笼式旋转安装座上，如图5所示，随后对安装座进行旋转和固定，所述的安装座则通过四周的圆孔用底部笼杆与底部安装座连接。所述成像透镜11则安装在旋转安装座中通过螺纹与所述二分之一波片B 12的安装座相连。
偏振片B 3置于螺纹安装座中与所述的高性能CCD14相机连接，高性能CCD相机14再通过顶部笼杆固定到转接板上。转接板则通过中心的螺纹连接件与XY位移台相连接，XY位移台最终插入下方的底部笼杆中固定。装置中多维旋转安装座的作用是营造黑暗环境，防止杂光进入高性能CCD相机14影响成像。在高性能CCD相机14的安装平面内，通过XY位移台实现相机的二维平移。沿光传播方向，首先通过与转接板相连的笼杆实现相机位置的粗调，再通过与XY位移台之间的螺纹连接件进行相机位置的微调与固定。
在所述传感芯片9安装完成后，所述的显微物镜8与传感芯片9下表面的距离即固定。为了确保所述聚焦透镜6出射的光束聚焦在所述显微物镜8的后焦面80，需要再对所述聚焦透镜6的位置进行调节。在调节聚焦透镜6的位置时，无法直接在显微物镜8的后焦面80用分划板进行测量，考虑将显微物镜8固定，测量显微物镜8的出射光。根据物镜成像原理，当聚焦透镜6准确将光束聚焦在后焦面80，则显微物镜8出射光应是准直光束，因此只要测量从显微物镜8出射的光束是否准直即可。实际安装时，装置的整体调试并不是调试好入射光路和成像光路即可，而必须按照如下顺序严格进行：
1）安装所述检测系统的入射光路和成像光路各元件：包括首先安装入射光路中的半导体激光器1的直角调整架，方便在后方放置分划板进行调整测量，再安装所述扩束镜5调整所述聚焦透镜6间距，此时可直接将剪切干涉仪置于载物台上进行测量，最后再依次安装剩余光学元件，并将需要位置调整的光学元件也暂时固定；
2）安装传感芯片9并固定在载物台上：调整、确定所述显微物镜8与所述芯片9之间的距离；此时保持激光光源关闭，采用所述传感芯片9上方倒置的显微物镜8自带光源进行照明，调节显微物镜8位置直至在显微物镜8的目镜中观察到清晰的像。为了方便观察，可在所述传感芯片9的金膜B 92表面划上几道细痕，此时调高性能CCD相机14沿光束传播方向的位置，直到通过高性能CCD相机14也能成清晰的像，将高性能CCD相机14位置固定；
3）关闭显微物镜8自带光源，采用所述激光器1发射的光源照明，所述显微物镜8固定在之前成像的位置保持不动，而将传感芯片9的安装座拆除，此时缓慢调节入射光路中所述的聚焦透镜6的位置，直到从显微物镜8中出射准直光束为止，固定聚焦透镜6的位置不动，最后再将传感芯片9及其安装座重新安装固定即可；I1、I2
4）测试实验，通过调节所述激光器1光源平行移动而控制入射光的入射角度，移动光源后需要调整高性能CCD相机14在垂直光束传播平面内的位置，保证亮斑在高性能CCD相机14靶面的中心，其余所有元件均保持原有位置固定不动。
对图像信息进行差动解算前先引入一个表征折射率的相关因子RIRF（RefractiveIndexRelatedFactor），其计算公式为：
其中I 1 、I 2 分别为通过偏振分束器的分束和互补的两束干涉光的光强，根据矩阵光学的理论计算，可以得到RIRF值的具体值：
其中α为偏振分束器的方向，|rs|、|rp|分别为在传感芯片处发生反射时，S偏振光和P偏振光的反射系数，而、/>则是发生反射时S和P偏振光的相位变偏振光的相位变化。由于激发SPR时，S偏振光的参数|rs|和/>基本保持不变，因此RIRF的值取决于待测介质折射率发生改变时，引起的P偏振光的反射系数和相位变化，建立偏振光的反射系数和相位变化，建立一定关系后即可用RIRF值对折射率进行表征。
在激发SPR后，当待测介质折射率n=n0时，反射光强满足条件I1=I2。根据数值模拟计算得到，折射率在n0左右一定范围时，RIRF与之呈现很好的线性，且此时的灵敏度也达到最高。因此在实际检测时，检测范围应选择在n0附近的折射率区间。通过光束偏移器的作用，最终在高性能CCD相机上成像的效果如图4所示。
将图像读取后，差动解算前，先对图像进行预处理，将图像中边缘较暗的部分舍弃，保留靶面所在的位置，然后将图像从中间进行分割，得到两幅图案相同但明暗有别的图像数据。根据RIRF的计算公式，将两幅图像对应像素处的光强值带入计算即可得到，图像互相关算法流程框图如图6所示。
由于两幅图像的分割并不能做到完美对称，在带入计算之前，需要两幅图像进行“对齐”，保证带入计算的两个像素点是理论计算中光强互补的两个对应点。首先对分割得到的两幅图案的图像采用已有的图像互相关算法计算像素偏移量，对偏移量进行补偿，然后将两个图像的每一个像素点的光强值带入计算RIRF值，得到整张图像的RIRF分布，如图7所示。
由上述RIRF的计算公式得到，其值的大小与光源的光强无关，因此可以看到整个图像中RIRF的值分布较为均匀，不会如原始图像一样受光源照射时出现的中心量而四周暗的情况（如图5所示），这样就有效提升了检测范围。成像质量不受光源强度影响，因此不用对光源的功率进行稳定控制，可以将激光器置于稳定频率的模式，保证出射激光的波长稳定。在实际检测中，为了对折射率进行表征，可对图像中的RIRF求平均值，且更倾向于选择靠近中心的区域。区域范围越小，RIRF的测量值受噪声影响也越大，因此考虑选择一个较大的中心区域对RIRF值取平均。
由于位移台并非显微镜自带的，因此需要对其坐标零点进行标定，即找到一个激光器固定的位置，使其出射的光束与后方元件的主光轴重合。实验测定零点的位置按照如下步骤进行：
1)根据目测找到激光器零点的大致位置，选取两侧的合适区间作为测量范围，测量范围内的位移间隔按照原理中心时取大间隔，靠近中心时取小间隔的原则确定。
2)固定其中一个位移台，将另一位移台移动至所选测量范围的最小位移处，并按照所确定的间隔依次移动该位移台并用高性能CCD相机进行成像，此时需保持与所述的高性能CCD相机相连的位移台处在位移零点处。
3)在每一个位移处的高性能CCD相机图像用MATLAB读取并进行分割对准后，将两个图像的光强矩阵的每个元素进行平方和相加再开根号的处理，这样即得到每个像素处的反射光的总光强。对新得到的反射光强矩阵求平均值，并拟合出相对于光源位移量的曲线，找到曲线的顶点即对应该位移台控制移动方向上的零点。
4)此时将标定了零点的位移台进行固定，用另一位移台重复相同的实验步骤，得到在这一移动方向上的零点，并将位移台固定。此时两个位移台的位置即是激光光源的零点位置。实验中，移动竖直位移台时得到光斑在面内的移动过程如下：初始时光斑中心区域位于视场最右端。最终得到竖直位移台的零点为5.66mm，水平位移台的零点为5.33mm。通过计算拟合后得到的反射光强竖直、水平位移图，如图8、图9所示。
进行成像分辨率测试实验时同样采用带划痕的传感芯片进行成像，最终得到一副带有划痕的RIRF分布图。在RIRF图上，找到一行元素，使得其所在的行穿过图像中的划痕，然后提取出该列元素，并且选择在划痕的边缘附近，绘制出RIRF随像素坐标变换的图像，用RIRF图像在划痕边缘的半高宽来表征系统的横向分辨率。同样，选取穿过划痕的一列元素，通过RIRF图在划痕边缘处的半高宽即可表征系统的纵向分辨率。选取的行列元素在划痕边缘处的RIRF分布图如图10、图11所示。
从图10、图11中得到，行元素中划痕边缘的半高宽小于11个像素，列元素中划痕边缘的半高宽小于11个像素。由于相机的像素大小为5.5μm×5.5μm，再考虑到成像光路100倍的放大倍数，计算得到系统的横向和纵向分辨率约为：5.5×11/100=0.61μm。
实施例四：
本实施例是一种基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法，基于所述的小型相位干涉表面等离子体共振检测系统，如图1至图12所示，所述方法包括如下步骤：
1）半导体激光器1发出的经过光纤耦合和准直后的光，再通过偏振片B 3，得到偏振方向可调的线偏振的准直光束；
2）使所述的线偏振准直光束通过由计算机控制的四分之一波片切换装置，所述切换装置中的两个快轴方向正交的四分之一波片被交替定位在光路中，从而使准直光的P偏振分量和S偏振分量之间的相位差被交替调制成为90°或-90°；
3）经过相位调制的准直光入射到所述传感芯片9的玻璃棱镜91与金膜B 92之间的界面上，激发其表面等离子体共振，光从该界面反射；
4）反射光通过偏振分速器B 13，使其中的P偏振分量和S偏振分量发生干涉，产生干涉图像；
5）干涉图像成像在高性能CCD相机14的靶面上，采集所述高性能CCD相机14靶面上的成像干涉图像；
6）计算机15控制二分之一波片B 12的切换机构，交替采集附加90°和-90°相位差后产生的成像干涉图像；
7）利用所采集到的附加90°和-90°相位差的相邻的2帧成像干涉图像；
8）模数转换，将差分放大电路输出的温度误差信号转换成数字信号。
检测过程中，将微流体池固定在所述传感芯片9表面并压紧，所述微流体池和所述传感芯片9表面间形成溶液流动空间，试剂和样本溶液按检测设定程序注入其中。
扩束后的光斑直径约为26mm，利用矩形光阑，将光斑限定为18×16mm2的矩形，所述传感芯片9中心11×11mm2的区域为传感区域。考虑到微流体池和传感芯片之间需密封，保证不漏液，且传感区域的流场分布应较均匀，所述传感芯片9的尺寸设计为22mm×28mm，检测通量为400传感点（20×20），传感点直径为350μm，传感点间的中心距为500μm，传感区面积约11mm×11mm。
实验时，在传感芯片的金膜B 92的表面滴上去离子水，从标定的零点开始移动激光光源竖直方向的位移台，在移动过程中随之调整所述高性能CCD相机14，使亮斑大致位于靶面中心，移动适当距离，使得两幅干涉图像有较大对比度后，用所得的图像进行成像质量的评估。调整所述高NA值显微物,8的前焦面焦距35mm，后焦面焦距24mm，放大倍数0.7，像方畸变≤0.1%。
检测开始，两个高性能CCD相机14连续采集干涉图像并传输至计算机15，计算机接收后，先将其中的相机CCD2 142采集的图像翻转，使其图像方向与另一个相机CCD1 141相同；根据系统固有的像素偏移量，结合软件补偿，将相机CCD2 142获取的图像平移，使其和相机CCD1 141的图像对准。图像对准后，计算得到即时传感面的RIRF分布图。其后，根据RIRF分布图，计算出图中每个传感点的RIRF值。程序伴随检测过程持续运行。一旦检测结束，即可将所有传感点的RIRF值随时间变化的测量曲线显示并输出，用于后续分析和动力学常数拟合。

Claims (7)

1.一种小型相位干涉表面等离子体共振检测系统，其特征在于，包括激光器发射光源之后的微流体系统光路检测系统，差动相位干涉成像光学系统，可进行二维面阵成像的高性能CCD相机（14）及具有图像处理功能的计算机（15），所述的微流体系统光路检测系统，差动相位干涉成像光学系统和所述的高性能CCD相机（14）均与所述计算机（15）的控制系统连接；
所述的微流体系统光路检测系统包括激光器（1）之后依次连接的第一全反射棱镜（2），偏振片B（3），四分之一波片（4），伽利略结构的扩束镜（5），聚焦透镜（6），分束镜（7），高NA值显微物镜（8），传感芯片（9），所述的传感芯片（9）是由玻璃棱镜（91）和其上附着的金膜B（92）所组成的一体式传感芯片，所述的激光器（1）采用半导体激光器，可沿X轴和Y周移动；
所述的差动相位干涉成像光学系统包括：第二全反射棱镜（10），至少两个成像透镜（11），二分之一波片B（12），偏振分束器B（13），所述偏振分束器B（13）发出的光成像在所述的高性能CCD相机14上 。
2.根据权利要求1所述的小型相位干涉表面等离子体共振检测系统，其特征在于，所述的高性能CCD相机（14）设置两台。
3.一种基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法，基于权利要求1～2任意一项所述的小型相位干涉表面等离子体共振检测系统，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）所述激光器（1）发出经过光纤耦合和准直后的光，通过所述的第一全反射棱镜（2），得到偏振方向可调的线偏振准直光束；
2）所述的线偏振准直光束通过所述计算机控制的四分之一波片（4）进行相位调整： 两个快轴方向正交的四分之一波片（4）被交替定位在光路中，从而使准直光的P偏振分量和S偏振分量之间的相位差被交替调制成为90°或-90°；
3）经过相位调制的准直光入射到所述传感芯片9的玻璃棱镜（91）与金膜B（92）之间的界面上，激发其表面等离子体共振，光从该界面反射；
4）反射光通过偏振片，使其中的P偏振分量和S偏振分量发生干涉，产生干涉图像；
5）干涉图像经所述成像透镜（11）成像在所述高性能CCD相机（14）的靶面上，采集所述靶面上的成像干涉图像；
6）计算机（15）调控所述二分之一波片B（12）进行P和S分量的方向偏转，交替采集附加90°和-90°相位差后产生的成像干涉图像；
7）利用所采集到的附加90°和-90°相位差的相邻的2帧成像干涉图像；
8）模数转换，将差分放大电路输出的温度误差信号转换成数字信号。
4.根据权利要求3所述的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法，其特征在于，检测过程中，微流体池固定在所述传感芯片（9）表面并压紧，所述微流体池和传感芯片表面间形成溶液流动空间，所需试剂和样本溶液按检测设定程序注入其中。
5.根据权利要求3所述的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法，其特征在于，利用矩形光阑，将光斑限定为18×16mm2的矩形，所述传感芯片尺寸设计为22mm×28mm，其中心11×11mm2的区域为传感区域，检测通量为400传感点（20×20），传感点直径为350μm，传感点间的中心距为500μm，传感区面积约11mm×11mm。
6.根据权利要求3所述的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法，其特征在于，实验时在所述传感芯片（9）的金膜B（92）表面滴上去离子水，从标定的零点开始移动激光光源竖直方向的位移台，在移动过程中随之调整所述的高性能CCD相机（14）使亮斑大致位于靶面中心，移动适当距离，使得两幅干涉图像有较大对比度后，用所得的图像进行成像质量的评估。
7.根据权利要求3所述的基于SPR干涉成像的生物分子相互作用的检测方法，其特征在于，前镜焦距35mm，后镜面焦距24mm，放大倍数0.7，像方畸变≤0.1%。
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