CN118147057A - 一种人源骨髓类器官及其构建方法和应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明提供了一种人源骨髓类器官及其构建方法和应用，所述构建方法包括以下步骤：从人脂肪组织通过酶消化法提取微血管片段；动态培养制备预血管化的软骨组织：机械法制备人微粒脂肪组织，向生物反应器内按照预定比例加入人微粒脂肪组织和微血管片段，加入培养基，以进行动态培养，得到预血管化自聚集脂肪组织；将预血管化的软骨组织移植至目标动物的皮下，预定时间后，预血管化的软骨组织在目标生物体内发育为具备具有特定功能的人源化骨髓类器官。本发明提供的构建方法所得人源骨髓类器官具有完整的骨内膜龛、血管龛和造血细胞龛三大结构组分和维护人造血干细胞的生理功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体地，涉及一种人源骨髓类器官及其构建方法和应用。
背景技术
血液系统中的各种细胞均分化自造血干细胞，骨髓作为重要的造血器官，为造血干细胞提供了生长发育的空间环境，其功能是维持造血干细胞自我更新和分化的生理功能。骨髓龛复杂精细的结构为其发挥生理功能提供保障。结构上，骨髓可以分为三大部分，骨内膜龛、血管龛和造血细胞龛。骨内膜龛是位于骨组织内部衬里的微环境，包括成骨细胞、破骨细胞、骨内膜等部分；血管龛是骨髓组织中纷繁交错的血管结构，包括血管窦、小动脉以及其中的血管内皮细胞、血管周细胞等；造血细胞龛是骨髓组织中丰富的细胞成分，主要包括造血成分，即各类造血细胞(造血干细胞、造血祖细胞、淋巴细胞、髓系细胞、巨核细胞、红细胞等等)和支持造血细胞如间充质干细胞。骨髓微环境中各个组分动态平衡的失控，是良恶性血液系统疾病发生与发展的重要机制。研究骨髓微环境中的成分与造血干细胞的相互作用关系，可以为正常生理造血、血液疾病、实体瘤的骨转移等重大医学领域提供富有价值的启示。然而，体外环境难以模拟骨髓中复杂精细的血管系统、免疫细胞、细胞因子等组分的生理结构和功能。因此，构建人来源的骨髓类器官被认为是研究人类骨髓微环境的最佳选择和迫切需要。
本技术领域现有方法中，常基于“种子细胞+生物支架”的原则，常规的种子细胞是从人的骨髓组织中分离的骨髓间充质干细胞(BMSC)，将种子细胞在体外传代扩增后，接种于生物支架，在体外或体内诱导其软骨化或骨化。这种组织构建的方法是基于“细胞”层面的。这种方式构建的人源化的骨髓类器官主要存在以下问题：(1)提取BMSC需要通过骨髓穿刺的方法抽吸人体的骨髓，这种操作创伤很大，每次获得的骨髓体积很少，并且抽吸得到的患者骨髓可能含有恶性血液细胞，不适合后续实验培养；(2)BMSC等干细胞在体外经过反复酶解、传代扩增等操作后，其多向分化能力都会逐渐丢失，即越来越多的细胞丧失了分化成软骨/骨的能力，导致构建骨髓类器官的效率低下；(3)提取种子细胞、体外传代扩增、接种生物支架等操作耗时耗力，实验过程复杂繁琐，实验经济成本高，操作过程容易引入外源污染。
本技术领域现有方法中，利用脂肪组织直接构建骨髓龛模型时，直接将脂肪组织经过体外诱导分化和裸鼠体内发育为骨髓龛模型，但，现有方法中构建所得骨髓龛模型仍存在以下问题：(1)缺乏天然骨髓组织的完整结构，骨髓包括骨内膜龛、血管龛和造血细胞龛三大结构部分，而现有方法中构建所得骨髓龛模型在结构上仅具有外部的骨组织和内部的部分血液细胞，缺乏成骨细胞、破骨细胞和血液/免疫细胞(如造血干/祖细胞、髓系细胞等)，且血管化程度低，即血管结构单一、血管密度稀疏，远低于正常骨髓组织中的血管密度；(2)无法模拟骨髓的生理功能，骨髓的主要生理功能在于维持造血干/祖细胞的自我更新和多向分化能力，由于结构不完整，现有方法构建所得骨髓龛模型在免疫缺陷鼠体内无法募集人源的造血干细胞，即仅有初步的结构，不具备骨髓的生理功能，无法真正运用到后续研究和临床转化之中；(3)操作繁琐，耗时耗力。例如，现有方法中，体外增殖培养结束后，需要使用活检钻孔器在脂肪组织上钻取小团块样本用于下一步实验。人工钻取的操作耗时耗力，使用大量的一次性钻孔器械，平均单次实验成本高，且机械切割组织对组织内部干细胞损伤较大，降低细胞的活性。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种人源骨髓类器官及其构建方法和应用，所述构建方法利用脂肪组织直接构建具有完备结构和功能的人源化骨髓类器官的方法，避免了目前现有方法中提取、扩增、接种干细胞的步骤，构建所得人源骨髓类器官可用于正常生理造血、血液疾病、实体瘤的骨转移等重大医学问题领域的研究。
本发明第一方面提供了一种人源骨髓类器官的构建方法，包括以下步骤：
步骤(1)从人脂肪组织通过酶消化法提取微血管片段；
步骤(2)动态培养制备预血管化的软骨组织：机械法制备人微粒脂肪组织，向生物反应器内按照预定比例加入人微粒脂肪组织和微血管片段，加入培养基，以进行动态培养，得到预血管化自聚集脂肪组织；
步骤(3)将预血管化的软骨组织移植至目标动物的皮下，预定时间后，预血管化的软骨组织在目标生物体内发育为具备具有特定功能的人源化骨髓类器官。
在本发明的一实施方式中，步骤(1)所述序贯提取法提取微血管片段具体包括：
(a)获取人脂肪组织漂洗收集与胶原酶溶液等体积混合，在预定条件下振荡，离心；
(b)离心后收集上层未消化的脂肪组织，加入PBS缓冲液重悬下层的微血管片段；
(c)将收集到的上层未消化脂肪组织重新与胶原酶溶液等体积混合，振荡，离心；
(d)重复多次步骤(b)(c)；
(e)混合多次获得的微血管片段悬液，离心，除去上清液，获得微血管片段。
在本发明的一实施方式中，所述序贯提取法提取微血管片段具体还包括：步骤(e)中离心前，通过滤网对微血管片段悬液进行过滤。
在本发明的一实施方式中，所述滤网的孔径为40-600微米。
在本发明的一实施方式中，振荡条件为30-37℃、50-500rpm下匀速振荡3-15分钟。
在本发明的一实施方式中，步骤(a)-(e)中离心条件均为50-1000g下离心1-5分钟。
在本发明的一实施方式中，步骤(2)所述生物反应器为旋转式或摇摆式生物反应器。
在本发明的一实施方式中，步骤(2)动态培养获取自聚集微粒脂肪组织，所述动态培养包括动态增殖培养、动态促血管化培养和动态分化培养。
在本发明的一实施方式中，所述动态增殖培养中使用的增殖培养基的组成如下：
-MEM+2-20％FBS+0-5％PSG+0-5％HEPES+0-5％谷氨酰胺+FGF-2(1-20ng/mL)+PDGF(1-20ng/mL)+地塞米松(0.5-5)×10-7mol/L+抗坏血酸(0.5-5)×10-5mol/L；所述动态促血管化培养中使用的促血管化培养基的比例如下：1-10％PSG、1-10％ HEPES、(0.5-2)％ITS、ECGS(1-300ng/mL)。
在本发明的一实施方式中，所述增殖培养和促血管化培养的灌注速率为0.1-2mL/min。
在本发明的一实施方式中，所述动态增殖培养和动态促血管化培养的培养时间分别为1-4周和1-4周。
在本发明的一实施方式中，所述动态分化培养中使用的分化培养基的组成如下：DMEM+2-20％ HSA+0-5％PSG+0-5％HEPES+0-5％谷氨酰胺+0-5％ITS+0-5％亚油酸+地塞米松(0.5-5)×10-7mol/L+抗坏血酸(0.5-5)×10-5mol/L+BMP-6(1-20ng/mL)+TGF-β3(1-20ng/mL)+SB431542(1-20μmol/L)。
在本发明的一实施方式中，所述分化培养基的灌注速率为0.1-2mL/min。
在本发明的一实施方式中，所述动态分化培养时间为2-10周。
在本发明的一实施方式中，所述微粒脂肪组织的粒径为1-6mm。
在本发明的一实施方式中，步骤(2)制备微粒脂肪组织具体包括以下步骤：
(1)收集人脂肪组织，漂洗1-3次，剪碎，在500-2000g的离心条件下离心1-5min，去除上层油脂和下层肿胀液部分，收集中间脂肪层于注射器内；
(2)准备另外一个注射器，通过脂肪切割器将该注射器与收集有中间脂肪层的注射器连通，来回推注两个注射器10-50次，然后在500-2000g的离心条件下离心1-5min，去除上层的油脂层，下层为微粒脂肪组织。
本发明第二方面提供了一种人源骨髓类器官，采用上述构建方法构建所得。
本发明第三方面提供了人源骨髓类器官在制备研究正常生理造血系统、血液系统疾病、实体瘤的骨转移和血液疾病与肿瘤疾病的药物筛选动物模型中应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明提供的构建方法中，利用脂肪组织直接构建功能化的人源骨髓类器官，通过将微粒脂肪组织和序贯提取法提取所得微血管片段加入至生物反应器进行动态培养，大大提升了脂肪组织的分化效率和血管化程度，最终所得人源骨髓类器官具有完整的骨内膜龛、血管龛和造血细胞龛三大结构组分和维护人造血干细胞的生理功能。
2、本发明提供的构建方法中，通过序贯提取所得微血管片段，相较于传统的一贯式提取法，从相同体积的脂肪组织中提取的微血管片段更多，微血管片段活性更高，微血管片段中的血管内皮细胞和脂肪干细胞的含量更高，有助于促进微粒脂肪组织的血管化(具体见实施例1)。
3、本发明提供的构建方法中，通过生物反应器动态培养微粒脂肪组织和序贯提取法提取所得微血管片段，促进了微粒脂肪组织和MVF的均匀融合，减少了微粒脂肪组织的坏死，提高了微粒脂肪组织的自聚集效率和分化效率，显著缩短了培养时间。
4、本发明中，通过生物反应器在特定灌注速率和灌注时间下进行动态培养，可以使微粒脂肪组织和MVF的混合物自发聚集为圆形小颗粒，体现出促进微粒脂肪组织自聚集的作用；此外，通过控制灌注速率和脂肪组织块体积，对圆形小颗粒的粒径大小进行控制，得到直径1-6mm左右的圆形软骨颗粒，使得不同粒径的圆形软骨颗粒能够满足不同应用场景需求；不同粒径的软骨颗粒募集所得细胞数量不同，根据类器官具体使用目的及应用场景的选择特定粒径的软骨颗粒。
5、本发明中构建所得人源骨髓类器官植入小鼠体内后所得模型，在应用时，人的白血病细胞、肿瘤细胞等会优先进入小鼠体内的人源骨髓类器官，从而稳定的长期存活，而不是进入小鼠自体骨髓，为正常生理造血、血液疾病、实体瘤的骨转移等重大医学问题领域的研究提供了良好的模型。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为MVF的序贯式提取法和一贯式提取法的流程图；
图2为序贯式提取法和一贯式提取法进行前后的脂肪含量统计图；
图3为序贯式提取法和一贯式提取法获得的MVF在倒置显微镜下的照片；
图4为序贯式提取法和一贯式提取法获得的MVF的数量统计图；
图5为序贯式提取法和一贯式提取法获得的MVF的活/死细胞染色图；
图6为序贯式提取法和一贯式提取法获得的MVF的活细胞和死细胞比例统计图；
图7为MVF的流式细胞术分群代表图；
图8为序贯式提取法和一贯式提取法获得的MVF中的各类细胞比例统计图；
图9为制备完成即刻的微粒脂肪组织和经过生物反应器培养后自聚集形成的微粒脂肪组织颗粒；
图10为实验组和对照组制备的软骨颗粒的番红-固绿染色和II型胶原免疫组化染色图；
图11为实验组和对照组制备的软骨颗粒的最大横截面软骨面积占总面积的比例统计图；
图12为实验组和对照组制备的软骨颗粒的VEGF免疫组化染色图；
图13为实验组和对照组制备的软骨颗粒的VEGF免疫组化染色强度统计图；
图14为实验组和对照组得到的骨髓类器官的HE染色图；
图15为实验组和对照组得到的骨髓类器官的最大横截面骨髓腔面积占总面积的比例统计图；
图16为实验组和对照组得到的骨髓类器官的Osterix免疫组化染色图和TRAP染色图；
图17为实验组和对照组得到的骨髓类器官的CD31和α-SMA免疫荧光染色图；
图18为实验组和对照组得到的骨髓类器官单个视野平均血管数目的统计图；
图19为实验组和对照组得到的骨髓类器官内细胞的流式细胞术分析代表图；
图20为实验组和对照组得到的骨髓类器官内细胞的人源嵌合率的统计图；
图21为实验组和对照组得到的骨髓类器官内细胞的集落形成个数的统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例中相关术语解释如下：
MVF：微血管片段，是小动脉、毛细血管和小静脉的功能片段，由平滑肌细胞与内皮细胞组成，可从脂肪组织中大量分离，且保有天然微血管的特征，如能分泌血管生成因子等。
PBS：生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。
α-MEM：MEM属于最低必须培养基，含有13种必需胺基酸与8种维生素。成分简单，可广泛用于动物细胞株和大部分贴附型哺乳类动物细胞。α-MEM比MEM含有更多胺基酸、丙酮酸与维生素，多用于培养不易养活的细胞或是间质干细胞
DMEM：一种常用的，富含营养物质的培养基，适用于多种哺乳动物细胞的体外培养。它含有多种必需氨基酸、维生素和无机盐，可以提供细胞生长所需的养分和环境，促进细胞的增殖和分化。
FBS：胎牛血清
PSG：青霉素-链霉素-谷氨酰胺
HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸
ITS：胰岛素-转铁蛋白-锌
HSA：人血清白蛋白
PDGF：血小板源性生长因子
FGF-2:成纤维细胞生长因子2
TGF-β3：转化生长因子β3
BMP-6：骨形态发生蛋白6
ECGS：内皮细胞生长添加剂，一种内皮细胞体外培养不可缺少的补充物质，可以优化细胞的体外生长环境，促进内皮细胞的正常增殖和生长。
HE染色：石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
II型胶原：一种高分子蛋白质，丝状的胶原蛋白纤维与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成网状结构，产生一定的机械强度。主要由软骨细胞产生，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织。
番红-固绿染色：一种常用的染色方法，可直观反映关节软骨、软骨下骨和骨组织的结构。软骨呈红色，纤维组织和骨组织呈绿色。
VEGF：血管内皮生长因子，促进血管内皮生长，促进血管通透性增加，促进血管内皮的迁移、增殖和血管形成。
Osterix：一种新发现的与成骨细胞分化和骨形成有关的转录因子，只在发育的骨组织中特异性表达。
TRAP：抗酒石酸酸性磷酸酶，是检测骨组织中破骨细胞的特异性染色，使得破骨细胞呈红色。
CD31：血小板-内皮细胞黏附分子，主要血管内皮细胞间紧密连接处。
α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白
免疫组化：应用免疫学基本原理即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及相对定量的研究方法。
流式细胞术：用于对悬浮于流体中的微小颗粒如细胞进行计数和分选。可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
集落形成实验(CFU)：检测培养细胞增殖能力的有效方法之一。原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代形成一个细胞群体，称为集落。
实施例1一贯式提取和序贯式提取MVF的对比
一、一贯式提取法：
(a)从抽脂手术获取的人脂肪组织，经过生理盐水漂洗3次后，收集上层脂肪组织；
(b)将洗涤后的脂肪与0.15％胶原酶溶液等体积混合，即胶原酶终浓度，在37℃，150rpm条件下匀速振荡15分钟。离心混悬液(300g，3分钟)，去上层液体，加入PBS缓冲液重悬底部沉淀的MVF，通过无菌的500微米滤网，在300g的离心条件下离心3分钟，去上清液，用PBS缓冲液重悬沉淀，即得到一贯式提取的MVF。
二、序贯式提取法：
(a)从抽脂手术获取的人脂肪组织，经过生理盐水漂洗3次后，收集上层脂肪组织；
(b)第1次消化：将洗涤后的脂肪与0.15％胶原酶溶液等体积混合，即胶原酶终浓度，在37℃，150rpm条件下匀速振荡5分钟。在300g的离心条件下离心3分钟，将离心后上层未消化的脂肪收集到新的离心管中待第2次消化，加入PBS缓冲液重悬底部沉淀的MVF；
(c)第2次消化：将步骤(b)中离心后收集所得上层未消化的脂肪与0.15％胶原酶溶液等体积混合，在37℃、150rpm条件下匀速振荡5分钟，在300g的离心条件下离心3分钟，收集离心后上层未消化的脂肪，加入PBS缓冲液重悬底部沉淀的MVF；
(d)将步骤(c)中离心后收集所得上层未消化的脂肪与0.15％胶原酶溶液等体积混合，在37℃、150rpm条件下匀速振荡5分钟，在300g的离心条件下离心3分钟，去上清，加入PBS缓冲液重悬底部沉淀的的MVF；
(e)将步骤(b)、(c)、(d)中消化所得微血管片段悬液混合均匀，通过无菌的500微米滤网，去除较大的组织块，在300g的离心条件下离心3分钟，去上清液，用PBS缓冲液重悬沉淀，即得序贯提取的MVF。图1为传统的一贯式提取法和序贯式提取法的流程图。
三、实验检测
1、计算两种方法消化前后的脂肪体积，统计分析显示，在消化时长总和均为15分钟的情况下，序贯式提取比一贯式提取能消耗更多的脂肪，对于脂肪的利用效率显著更高(图2)。
2、在倒置显微镜下观察两种方法提取的MVF的形态(图3，白色箭头所示为MVF)并计数，统计分析表明，在消化时长总和均为15分钟的情况下，序贯式提取比一贯式提取法获得的MVF数量显著更高(图4)。
3.对两种方法提取的MVF进行活/死细胞染色(图5，活细胞为绿色，死细胞为红色)，并对活细胞和死细胞的比例进行统计分析，结果表明，序贯提取法得到的MVF中活细胞比例显著高于一贯式提取法(图6)。
4.对两种方法提取的MVF进行流式细胞术分析，如图7所示，MVF中含有内皮细胞、间充质干细胞、周细胞。统计分析可知，序贯提取法得到的MVF中内皮细胞、间充质干细胞和周细胞比例均显著高于一贯式提取法(图8)。
实施例2自聚集微粒脂肪组织的体外培养
一、实验组的制备：
1.微粒脂肪组织的制备
(a)从抽脂手术获取的人脂肪组织，经过生理盐水漂洗3次后，收集上层脂肪组织；
(b)将上述上层脂肪组织用剪刀剪碎，1600g离心3min，去除上层油脂和下层肿胀液部分，收集中间脂肪层于20mL注射器内；
(c)使用无菌脂肪切割器将两个20mL注射器连接起来，来回推动两个注射器35次，获取微粒脂肪组织；
(d)微粒脂肪组织经1600g离心3min，去除上层的油脂层，下层为微粒脂肪组织混合物。
2.序贯提取法提取MVF
同实施例1中步骤。
3.自聚集微粒脂肪组织的动态培养
在无菌条件下，将3mL制备好的微粒脂肪组织转移到旋转式生物反应器内，按2.0×105个MVF/mL微粒脂肪组织的比例加入MVF，并加入10mL培养基，以0.47mL/min的灌注速率灌注培养基进行动态培养。培养基每周更换2次。在培养2周后，微粒脂肪组织随着培养基的灌注，逐渐自发的聚集为直径4mm左右的圆形颗粒。
其中培养基和相应的培养时间分别是：动态增殖培养基2周，动态促血管培养1周，动态分化培养基3周。分化培养结束后，形成实验组的软骨颗粒。
其中，所述动态增殖培养中使用的增殖培养基的组成如下：α-MEM+10％ FBS+1％PSG+1％ HEPES+FGF-2(10ng/mL)+PDGF(10ng/mL)+地塞米松(10-7mol/L)+抗坏血酸(10- 5mol/L)，所述动态增殖培养基的灌注速率为0.47mL/min；
其中，所述动态促血管培养中使用的促血管培养基的组成如下：α-MEM+10％FBS+1％ PSG+1％ HEPES+1％ITS+ECGS(10ng/mL)。
其中，所述动态分化培养中使用的分化培养基的组成如下：DMEM+1％ HSA+1％PSG+1％ HEPES+1％ ITS+0.5％亚油酸+地塞米松(10-7mol/L)+抗坏血酸(1mol/L)+BMP-6(10ng/mL)+TGF-β3(10ng/mL)+SB431542(10μmol/L)，所述动态分化培养基的灌注速率为0.47mL/min。
二、对照组的制备
(1)微粒脂肪组织的制备：同步骤一实验组中所描述的微粒脂肪组织的制备。
(2)微粒脂肪组织的静态培养：在无菌6孔板中每孔加入2mL微粒脂肪组织和3mL增殖培养基(培养基为每周更换2次)，置入普通细胞培养箱中静态培养2周后，用无菌组织环钻将微粒脂肪组织切割为直径4mm的圆形颗粒，在促血管培养基中培养1周，在分化培养基中静态培养3周，形成对照组的软骨颗粒，对照组全程不加入MVF，也不采用动态培养的方式。
三、实验检测
1、对实验组所得软骨颗粒和对照组所得软骨颗粒进行番红-固绿染色、II型胶原免疫组化染色。
结果如图3和图4所示，由图3可知，实验组和对照组的软骨颗粒中均含有番红固绿染色为红色(图3)和II型胶原染色为红色(图3)的软骨组织成分，但是实验组中软骨区域所占总组织区域面积比例显著大于对照组(图3、图4)。这表明，实验组的培养方法相较于对照组，在相同的培养时间下，能更加高效的促进脂肪组织分化为软骨组织。
2、VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
VEGF免疫组化学染色结果显示，实验组VEGF染色阳性，而对照组为阴性(图5)，且实验组VEGF染色强度显著高于对照组(图6)。这表明，实验组的培养方法相较于对照组，在相同的培养时间下，能产生更多的VEGF的蛋白，这对于软骨颗粒在后续体内实验中形成高度血管化的骨髓类器官具有非常重要的作用。
实施例3骨髓类器官的结构鉴定
在无菌条件下，将实施例2中得到的实验组和对照组软骨颗粒分别植入4周雌性重度免疫缺陷小鼠的背部皮下，经过8周后处死小鼠，取出植入物，实验组和对照组软骨颗粒分别在体内发育为实验组骨髓类器官和对照组骨髓类器官。对实验组和对照组骨髓类器官进行苏木精-伊红染色法(HE染色)，用黄色虚线标注出其骨髓腔的位置(图7)，结果显示，实验组骨髓类器官中骨髓腔区域比例显著大于对照组(图7、图8)。实验组骨髓类器官中含有丰富的骨、骨髓细胞和少量脂肪组织，而对照组骨髓类器官大部分为脂肪组织空泡，骨髓腔区域很小(图7)。
成骨细胞和破骨细胞是骨髓类器官中骨内膜龛的重要组成成分。用Osterix和TRAP染色分别标记骨髓类器官中的成骨细胞和破骨细胞。结果显示，实验组的骨髓类器官中存在大量Osterix和TRAP染色阳性(图9中黑色箭头所示)的细胞，而对照组的骨髓类器官中未见明显阳性的成骨细胞和破骨细胞。这表明，实验组骨髓类器官具有完整的骨内膜龛结构，而对照组骨髓类器官的骨内膜龛结构欠完整。
血管龛是骨髓类器官的重要结构组分，骨髓类器官的功能是募集造血干祖细胞并且维持其功能，血管的密度直径决定了骨髓类器官能否发挥功能。用α-SMA和CD31分别标记骨髓类器官内的血管平滑肌细胞和血管内皮细胞(图10所示，红色为α-SMA，绿色为CD31，蓝色为细胞核)，结果显示，实验组骨髓类器官中的血管密度显著高于对照组(图10、图11)。这表明，实验组骨髓类器官具有丰富的血管和完整的血管龛结构，而对照组骨髓类器官的血管密度低，血管龛结构不完整。
实施例4骨髓类器官的功能鉴定
在无菌条件下，将实施例2中得到的实验组软骨颗粒和对照组软骨颗粒分别植入6周雌性重度免疫缺陷小鼠的背部皮下，经过10周后，每只小鼠尾静脉注射4×105人CD34+细胞，12周后，取实验组骨髓类器官和对照组骨髓类器官中的细胞成分进行流式细胞术分析(图12)和集落形成实验。
定义人源细胞嵌合率＝(人CD45+细胞)/(人CD45+细胞+小鼠CD45+细胞)×100％。流式细胞术结果显示，实验组骨髓类器官中的人源细胞嵌合率显著高于对照组骨髓类器官(图12、图13)。
从实验组和对照组骨髓类器官中提取细胞，并用免疫磁珠分选出人CD34+细胞，进行集落形成实验，计算每2×104个细胞经过14天可形成集落的总数，结果显示，实验组骨髓类器官中的人CD34+细胞与对照组骨髓类器官中的人CD34+细胞相比，在相同的起始细胞数目、培养条件和培养时间下，可形成的击落总数显著提高(图14)。以上结果表明，实验组骨髓类器官与对照组相比，在小鼠体内能更多的募集人源造血细胞，且更好的维护募集得到的人CD34+造血干祖细胞的功能。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
Claims (18)
1.一种人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)从人脂肪组织通过酶消化法提取微血管片段；
步骤(2)动态培养制备预血管化的软骨组织：机械法制备人微粒脂肪组织，向生物反应器内按照预定比例加入人微粒脂肪组织和微血管片段，加入培养基，以进行动态培养，得到预血管化自聚集脂肪组织；
步骤(3)将预血管化的软骨组织移植至目标动物的皮下，预定时间后，预血管化的软骨组织在目标生物体内发育为具备具有特定功能的人源化骨髓类器官。
2.根据权利要求1所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述序贯提取法提取微血管片段具体包括：
(a)获取人脂肪组织漂洗收集与胶原酶溶液等体积混合，在预定条件下振荡，离心；
(b)离心后收集上层未消化的脂肪组织，加入PBS缓冲液重悬下层的微血管片段；
(c)将收集到的上层未消化脂肪组织重新与胶原酶溶液等体积混合，振荡，离心；
(d)重复多次步骤(b)(c)；
(e)混合多次获得的微血管片段悬液，离心，除去上清液，获得微血管片段。
3.根据权利要求2所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，所述序贯提取法提取微血管片段具体还包括：步骤(e)中离心前，通过滤网对微血管片段悬液进行过滤。
4.根据权利要求2所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，所述滤网的孔径为40-600微米。
5.根据权利要求2所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，振荡条件为30-37℃、50-500rpm下匀速振荡3-15分钟。
6.根据权利要求2所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，步骤(a)-(e)中离心条件均为50-1000g下离心1-5分钟。
7.根据权利要求1所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述生物反应器为旋转式或摇摆式生物反应器。
8.根据权利要求1所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，步骤(2)动态培养获取自聚集微粒脂肪组织，所述动态培养包括动态增殖培养、动态促血管化培养和动态分化培养。
9.根据权利要求8所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，所述动态增殖培养中使用的增殖培养基的组成如下：α-MEM+2-20％FBS+0-5％PSG+0-5％HEPES+0-5％谷氨酰胺+FGF-2(1-20ng/mL)+PDGF(1-20ng/mL)+地塞米松(0.5-5)×10-7mol/L+抗坏血酸(0.5-5)×10-5mol/L；所述动态促血管化培养中使用的促血管化培养基的比例如下：1-10％PSG、1-10％HEPES、(0.5-2)％ITS、ECGS(1-300ng/mL)。
10.根据权利要求9所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，所述增殖培养和促血管化培养的灌注速率为0.1-2mL/min。
11.根据权利要求9所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，所述动态增殖培养和动态促血管化培养的培养时间分别为1-4周和1-4周。
12.根据权利要求8所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，所述动态分化培养中使用的分化培养基的组成如下：DMEM+2-20％HSA+0-5％PSG+0-5％HEPES+0-5％谷氨酰胺+0-5％ITS+0-5％亚油酸+地塞米松(0.5-5)×10-7mol/L+抗坏血酸(0.5-5)×10-5mol/L+BMP-6(1-20ng/mL)+TGF-β3(1-20ng/mL)+SB431542(1-20μmol/L)。
13.根据权利要求12所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，所述分化培养基的灌注速率为0.1-2mL/min。
14.根据权利要求12所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，所述动态分化培养时间为2-10周。
15.根据权利要求1-14任一项所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，所述微粒脂肪组织的粒径为1-6mm。
16.根据权利要求1所述的人源骨髓类器官的构建方法，其特征在于，步骤(2)制备微粒脂肪组织具体包括以下步骤：
(1)收集人脂肪组织，漂洗1-3次，剪碎，在500-2000g的离心条件下离心1-5min，去除上层油脂和下层肿胀液部分，收集中间脂肪层于注射器内；
(2)准备另外一个注射器，通过脂肪切割器将该注射器与收集有中间脂肪层的注射器连通，来回推注两个注射器10-50次，然后在500-2000g的离心条件下离心1-5min，去除上层的油脂层，下层为微粒脂肪组织。
17.一种人源骨髓类器官，其特征在于，采用如权利要求1-16任一项所述的构建方法构建所得。
18.权利要求17所述的人源骨髓类器官在制备研究正常生理造血系统、血液系统疾病、实体瘤的骨转移和血液疾病与肿瘤疾病的药物筛选动物模型中应用。
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|---|---|---|---|
| CN202410191955.3A CN118147057A (zh) | 2024-02-21 | 2024-02-21 | 一种人源骨髓类器官及其构建方法和应用 |
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| CN202410191955.3A Pending CN118147057A (zh) | 2024-02-21 | 2024-02-21 | 一种人源骨髓类器官及其构建方法和应用 |
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2024
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