CN118147049A - 一种表达ceacam1的通用型细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种表达CEACAM1的通用型细胞及其制备方法。所述通用型多能细胞能在不改变干细胞更新及分化特性的同时，显著减少或逃逸免疫系统的识别和攻击，尤其是T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等的攻击。

Description

一种表达CEACAM1的通用型细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程与干细胞技术领域，具体涉及一种表达CEACAM1的通用型细胞及其制备方法。
背景技术
干细胞是一类具备自我更新能力以及向特定功能体细胞分化能力的细胞，依据干细胞特性的程度差异，主要将干细胞分为：全能干细胞、多能干细胞和成体干细胞。诱导性多能干细胞(iPSC)具有无限增殖、自我更新和分化到各种类型细胞的潜力，在治疗癌症、神经相关、心血管等疾病具有重要应用前景。但是免疫不相容和移植细胞遭受的免疫排斥等关键问题阻碍了移植异体功能细胞进行治疗的临床应用。
人主要组织相容性复合体(MHC)，即人白细胞抗原(HLA)，是导致免疫不相容的主要原因。MHC由一系列基因组成，可分为I类、II类和III类。MHC-I基因在几乎所有的组织细胞类型中表达，表达“非己”MHC-I类分子的移植细胞将刺激CD8+T细胞的活化而被消除。CD4+辅助T细胞识别“非己”细胞的MHC-II基因，从而进行免疫排斥，而III类分子不参与免疫活动。
近年已有报道通过敲除B2M、CIITA等基因，可以实现MHC-I和MHC-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T细胞/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型多能干细胞。
目前已报道在破坏MHC-I和MHC-II类基因表达的基础上，可以使细胞表达HLA-E/G等非经典HLA-I类分子，或表达PD-L1、CTLA4-Ig、CD47、CD24等免疫抑制检查点蛋白，可有效逃逸NK细胞的杀伤(WO2021041316 A1)。
发明内容
在一方面，本发明提供一种低免疫原性多能干细胞，其包含：与亲本多能干细胞相比降低的内源主要组织相容性I类抗原(MHC-I)功能；与亲本多能干细胞相比降低的内源主要组织相容性II类抗原(MHC-II)功能；和与亲本多能干细胞相比降低的对NK细胞杀伤的敏感性，其中所述降低的对NK细胞杀伤的敏感性是由增加的蛋白的表达引起的，所述蛋白选自HLA-G蛋白、CTLA4-Ig蛋白、HMGB1蛋白、CEACAM1蛋白或其组合。
在一实施方案中，所述降低的对NK细胞杀伤的敏感性是由增加的CEACAM1蛋白的表达引起的。
在一些实施方案中，所述MHC-I功能通过降低MHC-I类蛋白或MHC-I转录调节因子的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过降低B2M蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述B2M蛋白为人B2M蛋白，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有90％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述MHC-II功能通过降低MHC-II类蛋白或MHC-II转录调节因子的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过降低CIITA蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述CIITA蛋白为人CIITA蛋白，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有90％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CEACAM1蛋白为人CEACAM1蛋白，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有90％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，所述低免疫原性多能干细胞包含：使内源B2M蛋白活性降低的一个或多个改变；使内源CIITA蛋白活性降低的一个或多个改变；和在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的CEACAM1蛋白表达的一个或多个改变。
在一实施方案中，所述低免疫原性多能干细胞包含：使内源B2M基因的两个等位基因失活的一个或多个改变；使内源CIITA基因的两个等位基因失活的一个或多个改变；和在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的CEACAM1基因表达的一个或多个改变。
在另一方面，本发明还提供一种产生本发明的低免疫原性多能干细胞的方法，所述方法包括：降低所述多能干细胞中内源主要组织相容性I类抗原(MHC-I)功能；降低所述多能干细胞中内源主要组织相容性II类抗原(MHC-II)功能；和增加降低所述多能干细胞对NK细胞杀伤的敏感性的蛋白的表达，其中所述蛋白选自HLA-G蛋白、CTLA4-Ig蛋白、HMGB1蛋白、CEACAM1蛋白或其组合。
在一实施方案中，增加降低所述多能干细胞对NK细胞杀伤的敏感性的CEACAM1蛋白的表达。
在一实施方案中，所述方法包括：降低所述多能干细胞中B2M蛋白的活性；降低所述多能干细胞中CIITA蛋白的活性；和增加所述多能干细胞中CEACAM1蛋白的表达。
在一实施方案中，所述方法包括：消除所述多能干细胞中B2M基因的两个等位基因的活性；消除所述多能干细胞中CIITA基因的两个等位基因的活性；和增加所述多能干细胞中CEACAM1基因的表达。
在一实施方案中，通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术降低所述多能干细胞中B2M蛋白的活性。
在一实施方案中，通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术降低所述多能干细胞中CIITA蛋白的活性。
在一实施方案中，通过转基因的表达增加CEACAM1蛋白的表达。
在一优选实施方案中，通过合成编码CEACAM1蛋白的核酸序列，以构建至慢病毒载体中，再通过慢病毒载体，将至少一个拷贝的在启动子控制下的CEACAM1基因引入所述多能干细胞中增加CEACAM1蛋白的表达。
在一实施方案中，所述编码CEACAM1蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:4所示的核酸序列或与SEQ ID NO:4所示的核酸序列具有至少80％相同性的核酸序列。
在另一方面，本发明还提供本发明的低免疫原性多能干细胞或本发明的方法制备的低免疫原性多能干细胞在制备用于预防或治疗需要细胞移植的疾病的药物中的用途。
附图说明
图1示出B2M及CIITA双敲除细胞系(DKO)的B2M基因的敲除策略和通过PCR进行B2M基因敲除验证的结果。
图2示出B2M及CIITA双敲除细胞系(DKO)的CIITA基因的敲除策略和通过PCR进行CIITA基因敲除验证的结果。
图3示出qPCR检测B2M/CIITA双等位基因敲除的克隆DKO的B2M和CIITA在RNA水平的表达的结果。
图4示出蛋白印迹检测B2M/CIITA双等位基因敲除的克隆DKO的B2M蛋白水平的结果。
图5示出使用IFN-γ刺激WT及DKO细胞以检测H1细胞表面的HLA I/II型分子的FACS检测结果。
图6示出B2M/CIITA双等位基因敲除的克隆DKO的核型检测结果。
图7A、图7B和图7C示出DKO细胞中干性基因的表达的检测结果。图7A为通过免疫荧光检测WT和DKO细胞中干性基因POU5F1和NANOG的蛋白水平的结果；图7B为通过RT-qPCR检测WT和DKO细胞中干性基因POU5F1、NANOG和SOX2在RNA水平上的表达的结果；图7C为通过流式细胞术检测WT和DKO细胞表面干性基因SSEA-4和Tra1-81的表达的结果。
图8示出通过苏木精伊红染色检测B2M/CIITA双等位基因敲除的DKO细胞在体内形成畸胎瘤并分化出内中外三胚层的细胞的分化能力的结果。
图9示出通过RTCA检测WT和DKO细胞的免疫逃逸功能的结果。其中上方三张图为通过RTCA检测NK细胞对WT和DKO细胞的杀伤率的结果，即WT和DKO细胞对NK细胞的免疫逃逸功能的检测结果；下方三张图为通过RTCA检测T细胞对WT和DKO细胞的杀伤率的结果，即WT和DKO细胞对T细胞的免疫逃逸功能的检测结果。
图10示出慢病毒载体pGC-EF1a载体的结构示意图。
图11A和图11B示出验证DKO+CD47细胞中CD47过表达的结果。图11A为通过FACS检测DKO+CD47细胞系中CD47表达水平的结果；图11B为通过qPCR检测DKO+CD47细胞系中CD47表达水平的结果。
图12示出通过RTCA检测WT和DKO+CD47细胞的免疫逃逸功能的结果。
图13示出通过NK细胞杀伤性实验检测表达不同候选靶点蛋白的通用型细胞对NK细胞的免疫逃逸功能的结果。
图14示出通过qPCR检测构建的DKO+CEACAM1细胞系中CEACAM1 mRNA的过表达水平的结果。
图15示出通过免疫荧光检测构建的DKO+CEACAM1细胞系中干性基因OCT4、NANOG、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81的蛋白水平的结果。
图16示出通过流式细胞术检测构建的DKO+CEACAM1细胞系中细胞表面干性基因SSEA-4、TRA-1-60、Tra1-81和OCT4的表达水平的结果。
图17示出通过免疫荧光检测构建的DKO+CEACAM1细胞系的三胚层分化能力的结果。
图18示出DKO+CEACAM1细胞系的畸胎瘤形成能力的检测结果。
图19A-图19D示出通过RTCA检测构建的DKO+CEACAM1细胞系对不同免疫细胞的逃逸功能的结果。图19A和图19B为通过RTCA检测的NK细胞对DKO+CEACAM1细胞杀伤性实验的结果，其中图19B为多次杀伤统计图；图19C和图19D为通过RTCA检测的T细胞+NK细胞对DKO+CEACAM1细胞杀伤性实验的结果，其中图19D为多次杀伤统计图。
图20示出构建的DKO+CEACAM1细胞系在和NK细胞共培养24小时后的细胞状况。
图21A和图21B示出通过Elispot检测构建的DKO+CEACAM1细胞系在和NK细胞共培养24小时后IFN-γ斑点分泌的结果，其中图21B为IFN-γ斑点频率的统计直方图。
图22示出通过FACS检测构建的DKO+CEACAM1细胞系中的NK细胞活性指标CD107a的表达的结果。
图23A和图23B示出通过RTCA检测构建的DKO+CEACAM1细胞系的分化细胞对NK细胞的逃逸功能的结果，其中图23B为多次杀伤统计图。
具体实施方案
一般定义和术语
本文引用的所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书和指南等，无论上文或下文，均整体援引加入本文。本文中的任何内容均不应理解为承认本公开无权先于这样的公开。
除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学相关术语均为相应领域内广泛使用的术语(参见，例如，Molecular Cloning:ALaboratoryManual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor 1989)。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，表述“包括”、“包含”、“含有”和“具有”是开放式的，表示包括所列举的元素、步骤或组分但不排除其他未列举的元素、步骤或组分。表述“由……组成”不包括未指定的任何元素、步骤或组分。表述“基本上由……组成”是指范围限于指定的元素、步骤或组分，加上不显著影响要求保护的主题的基本和新颖性质的任选存在的元素、步骤或组分。应当理解，表述“基本上由……组成”和“由……组成”涵盖在表述“包含”的含义之内。
如本文所用，除非上下文另外指明，单数形式的表述“一个”、“一种”或“这个”包括复数指代。术语“一个或多个”或者“至少一个”涵盖1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个。
本文中值的范围的列举仅为了用作单独提到落在所述范围内的每个不同值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值如其在本文中单独列举地加入本说明书。除非明确指出相反，在本文示出的数值或范围均由“约”修饰，表示所列举或声称的数值或范围±20％、±10％、±5％或±3％。
除非另外指明，本文所述的方法步骤中，诸如1)、2)…，i)、ii)..，a)、b)、…的标识仅作为区分的示例，并不表示所述的方法步骤以这样的顺序进行。
术语“多能细胞”是指能够在保持未分化状态的同时自我更新和增殖并且可以在适当条件下被诱导分化成特化细胞类型的细胞。
如本文所用，术语“多能干细胞”具有分化成如下三个胚层中任何一个的潜力：内胚层(例如胃连接、胃肠道、肺等)、中胚层(例如肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖组织等)或外胚层(例如表皮组织和神经系统组织)。如本文所用的术语“多能干细胞”还包括“诱导性多能干细胞”或“iPSC”，一种衍生自非多能细胞的多能干细胞。示例性人多能干细胞系包括H1人多能干细胞系和H9人多能干细胞系。另外的示例性多能干细胞系包括可通过NationalInstitutes of Health HumanEmbryonic Stem Cell Registry和Howard HughesMedicalInstitute HUES集合获得的那些(如Cowan CA,et al.Derivation of embryonicstem-cell lines from human blastocysts.N Engl J Med.2004Mar 25；350(13):1353-6.所述)。
如本文所用，术语“全能”是指细胞形成完整生物体的能力。例如，在哺乳动物中，只有受精卵和第一卵裂期卵裂球是全能的。在一实施方案中，本文所述的多能干细胞不具有全能性，也不会形成完整生物体。
如本文所用，术语“通用型细胞”是指利用基因编辑技术改造异体细胞以消除免疫排斥，实现通用化的细胞。
细胞可以来自例如人或非人哺乳动物。示例性的非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、豚鼠、仓鼠、羊、猪、马、牛和非人灵长类动物。在一些实施方案中，细胞来自成年人或非人哺乳动物。在一些实施方案中，细胞来自新生儿人、成年人或非人哺乳动物。
如本文所用，术语“免疫排斥”或“免疫不相容”是指异体的细胞、组织或器官在移植给受体之后会受到受体本身的免疫细胞的攻击，从而无法保证其正常的生理功能。人主要组织相容性复合体(MHC)，即人白细胞抗原(HLA)，是导致“免疫排斥”或“免疫不相容”的主要原因。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指任何动物，例如驯养动物、动物园动物或人。“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，如狗、猫、鸟、牲畜或人。“受试者”和“患者”的具体实例包括但不限于具有与肝脏、心脏、肺、肾、胰腺、脑、神经组织、血液、骨骼、骨髓等相关的疾病或病症的个体(特别是人)。
本文的“低免疫原性多能干细胞”是指多能干细胞，其保留其多能干细胞的特征，并且当转移到同种异体宿主中时产生降低的免疫排斥反应。在优选的实施方案中，低免疫原性多能干细胞不产生免疫应答。因此，“低免疫原性”是指与免疫改造之前的亲本(“WT”)干细胞的免疫应答相比，显著降低或消除的免疫应答。例如，相对于未进行免疫改造的野生型细胞，这种低免疫原性细胞可能约2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或大于99％更不易被产生免疫排斥。
术语“主要组织相容性复合体(MHC)”涉及发生在所有脊椎动物中的基因复合体。MHC蛋白或分子在正常免疫反应中在淋巴细胞和抗原呈递细胞之间的信号传导中发挥的功能。人MHC，也称为HLA即人白细胞抗原，位于第6号染色体上，包括MHC-I和MHC-II。
术语“MHC-I”或“MHC I类”涉及主要组织相容性复合物I类蛋白或基因。在人MHC-I区域内，有HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、CD1a、CD1b和CD1c亚区。MHC I类蛋白存在于几乎所有细胞表面，包括大多数肿瘤细胞。MHC-I蛋白负载有抗原，这些抗原通常来源于内源性蛋白或细胞内存在的病原体，然后呈递给细胞毒性T淋巴细胞(CTL，也称为CD8+T细胞)。T细胞受体能够识别和结合与MHC-I类分子复合的肽。每个细胞毒性T淋巴细胞表达一个独特的T细胞受体，能够结合特异性MHC/肽复合物。MHC I类分子主要介导内源性抗原的呈递过程。
术语“MHC-II”或“MHC II类”涉及主要组织相容性复合物II类蛋白或基因。MHC II包括5种蛋白，HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。MHC II类蛋白主要表达在B细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞上。MHC II类分子主要介导外源性抗原的呈递过程，它们呈递外源性抗原多肽分子至Th细胞(辅助性T细胞)，即刺激CD4+T细胞。
术语“MHC/肽复合物”涉及MHC I类或MHC II类分子的结合域和MHC I类或MHCII类结合肽的非共价复合物。
本文的“敲除”是指使特定基因在其所在的宿主细胞中无活性的过程，其导致不产生目的蛋白或无活性形式。如本领域技术人员所理解和下文进一步描述的，这可以通过多种不同方式实现，包括从基因中去除核酸序列，或用其他序列中断序列，改变阅读框，或改变核酸的调节成分。例如，可以去除或用“无义”序列替换目的基因的全部或部分编码区，可以去除或替换全部或部分调节序列(例如启动子)，可以去除或替换翻译起始序列等。
在本文中，术语“减少”和“降低”通常都用于表示减少统计学显著的量。然而，为了避免疑义，“减少”、“降低”包括与参考水平相比减少至少10％，例如与参考水平相比减少至少约20％或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或高达并且包括100％减少(即与参考样品相比不存在的水平)，或在10-100％之间的任何减少。
本文的“敲入”或“过表达”是指向宿主细胞添加遗传功能的过程。这导致编码的蛋白水平增加。如本领域技术人员所理解的，这可以通过几种方式实现，包括将一种或多种额外的基因拷贝添加到宿主细胞中或改变内源基因的调节组分，从而增加蛋白的表达。这可以通过修饰启动子、添加不同的启动子、添加增强子或修饰其他基因表达序列来实现。
在本文中，术语“增加”通常都用于表示增加统计学显著的量；为了避免任何疑义，术语“增加”是指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或高达并且包括100％增加或在10-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍，或者至少约3倍，或者至少约4倍，或者至少约5倍或至少约10倍增加，或在2倍至10倍或大于10倍之间的任何增加。
“β-2微球蛋白”或“β2M”或“B2M”蛋白是MHC-I类分子的组成部分。B2M蛋白在所有有核细胞(除红细胞外)中都有表达可以和MHC-I分子的α链非共价结合，附着细胞膜上，也可以释放到多种组织液内。
“CD47蛋白”或“整合素相关蛋白(Integrin-associated protein,IAP)”是一种重要的自我信号，它能够通过与免疫细胞上的配体信号调节蛋白α(SIRPα)的N末端结合，进而抑制巨噬细胞的吞噬作用，引起免疫逃逸。
“MHC-II反式激活蛋白(CIITA)蛋白”是调控MHC-II表达的关键分子，机体主要通过控制CIITA的表达来调节MHC II基因的表达水平。
“癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)蛋白(也称为C-CAM和CD66a)”是癌胚抗原(CEA)家族中癌胚抗原相关细胞黏附分子(CEACAM)亚家族成员。CEACAM家族成员参与细胞间识别并调节细胞过程，其范围从组织结构和新血管形成的成形到胰岛素稳态和T细胞增殖的调节。CEACAM1在肿瘤细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞和某些巨噬细胞中表达。肿瘤上的CEACAM1表达促进CEACAM1介导的T和NK细胞的抑制。而免疫系统细胞上的CEACAM1表达会在免疫抑制和免疫细胞耗竭中发挥作用。
如本文所用，术语“同基因”是指宿主生物和细胞移植物的遗传相似性或同一性，其中具有免疫相容性；例如不产生免疫应答。
如本文所用，术语“同种异体”是指宿主生物和细胞移植的遗传差异，其中产生免疫应答。
如本文所用，术语“B2M-/-”是指二倍体细胞在两条染色体中都具有失活的B2M基因。
如本文所用，术语“CIITA-/-”是指二倍体细胞在两条染色体中都具有失活的CIITA基因。
如本文所用，术语“多肽”指包含通过肽键共价连接的两个以上氨基酸的聚合物。“蛋白”可以包含一条或多条多肽，其中多肽之间通过共价或非共价方式相互作用。除非另有说明，“多肽”和“蛋白”可以互换使用。
在细胞的上下文中，“野生型”是指在自然界中发现的细胞。然而，在多能干细胞的背景下，如本文所用，它还指不经历基因编辑程序以实现低免疫原性的多能干细胞，例如，本文所述的亲本多能干细胞(WT)。
如本文所用，关于序列的术语“％相同性”是指在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。两个序列之间的差异可以分布在待比较序列的局部区域(区段)或整个长度上。通常在对区段或“比较窗口”最佳比对之后，确定两个序列之间的相同性。最佳比对可以手动进行，或者借助于本领域已知算法，包括但不限于SmithandWaterman,1981,Ads App.Math.2,482和Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443描述的局部同源性算法，Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444描述的相似性搜索方法，或使用计算机程序，例如Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA进行。例如，可以利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站公共可用的BLASTN或BLASTP算法确定两个序列的百分比相同性。
通过确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用这个数目除以比较的位置数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将这个结果乘以100，获得％相同性。在一些实施方案中，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的区域给出相同性程度。在一些实施方案中，对参考序列的整个长度给出相同性程度。可以用本领域已知的工具进行确定序列相同性的比对，优选利用最佳序列比对，例如，利用Align，利用标准设置，优选EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5。
在本文中，“核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸及其衍生物。如本文所用，“核糖核苷酸”是核糖核酸(RNA)的构成物质，由一分子碱基，一分子五碳糖，一分子磷酸组成，其是指在β-D-呋喃核糖(β-D-ribofuranosyl)基团的2’位置具有羟基的核苷酸。而“脱氧核糖核苷酸”是脱氧核糖核酸(DNA)的构成物质，也由一分子碱基，一分子五碳糖，一分子磷酸构成，其是指在β-D-呋喃核糖(β-D-ribofuranosyl)基团的2’位置的羟基被氢取代的核苷酸，是染色体的主要化学成分。“核苷酸”通常由代表其中碱基的单字母来指代：“A(a)”指含有腺嘌呤的脱氧腺苷酸或腺苷酸，“C(c)”指含有胞嘧啶的脱氧胞苷酸或胞苷酸，“G(g)”指含有鸟嘌呤的脱氧鸟苷酸或鸟苷酸，“U(u)”指含有尿嘧啶的尿苷酸，“T(t)”指含有胸腺嘧啶的脱氧胸苷酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用，用于指脱氧核糖核苷酸的聚合物(脱氧核糖核酸，DNA)或核糖核苷酸的聚合物(核糖核酸，RNA)。“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可以互换使用，用来表示多核苷酸中核苷酸的排序。本领域人员应当理解，DNA编码链(有义链)与其编码的RNA可以看作具有相同的核苷酸序列，DNA编码链序列中的脱氧胸苷酸对应其编码的RNA序列中的尿苷酸。
如本文所用，术语“表达”包括核苷酸序列的转录和/或翻译。因此，表达可以涉及转录物和/或多肽的产生。术语“转录”涉及将DNA序列中的遗传密码转录为RNA (转录物)的过程。术语“体外转录”指在不含细胞的系统中(例如在适当的细胞提取物中)体外合成RNA，特别是mRNA(参见，例如Pardi N.,Muramatsu H.,Weissman D.,KarikóK.(2013).In:Rabinovich P.(eds)Synthetic Messenger RNA and Cell MetabolismModulation.Methodsin Molecular Biology(Methods and Protocols),vol 969.HumanaPress,Totowa,NJ.)。可以用于产生转录物的载体又称为“转录载体”，其中包含转录所需的调控序列。术语“转录”涵盖“体外转录”。
如本文所用，“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，比如基因，cDNA或者mRNA都能作为模板去合成其他生物过程中的多聚物和大分子，只要已经有明确的核苷酸序列或者有明确的氨基酸序列。因此一个基因编码蛋白是指基因的mRNA通过转录和翻译在细胞中或其它生物系统中产生蛋白。
除非另有说明，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。
多能干细胞
在一方面，本发明提供一种低免疫原性多能干细胞，所述低免疫原性多能干细胞包含：
与亲本多能干细胞相比降低的内源主要组织相容性I类抗原(MHC-I)功能；
与亲本多能干细胞相比降低的内源主要组织相容性II类抗原(MHC-II)功能；和
与亲本多能干细胞相比降低的对NK细胞杀伤的敏感性。
在本文中，亲本多能干细胞指免疫改造之前的，未经历基因编辑程序以实现低免疫原性的亲本(在本文中又称为“WT”)多能干细胞。
在一些实施方案中，降低的对NK细胞杀伤的敏感性是由增加的涉及母胎耐受、肿瘤免疫逃逸或肿瘤微环境调节因子的蛋白的表达引起的。
在一实施方案中，降低的对NK细胞杀伤的敏感性是由增加的蛋白的表达引起的，所述蛋白选自人类白细胞抗原-G(HLA-G)蛋白、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4-Ig(CTLA4-Ig)蛋白、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)蛋白、癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)蛋白或其组合。
在一特别优选的实施方案中，降低的对NK细胞杀伤的敏感性是由增加的CEACAM1蛋白的表达引起的。
如本领域技术人员所理解的，功能的降低可以通过多种方式实现，包括从基因中去除核酸序列、用其他序列中断序列、或改变核酸的调节组分。例如，可以去除或用“无义”序列替换目的基因的全部或部分编码区，可以进行移码突变，可以去除或替换调节序列例如启动子的全部或部分，可以删除或替换翻译启动序列等。
如本领域技术人员所理解的，可以使用本领域已知的和如下所述的技术测量多能干细胞中MHC I(当细胞来源于人细胞时HLA I)功能的降低；例如，使用结合HLA复合物的标记抗体的FACS技术；例如，使用市售的HLA-A、HLA-B、HLA-C抗体，其结合人主要组织相容性HLA I类。可以使用本领域已知的和如下所述的技术测量多能干细胞中MHC II(当细胞来源于人细胞时HLA II)功能的降低；例如，使用结合HLA复合物的标记抗体的FACS技术；例如，使用市售的HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP抗体，其结合人主要组织相容性HLA II类。
在一些实施方案中，所述MHC-I功能通过降低MHC-I类蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I类蛋白包含人类白细胞抗原-A(HLA-A)蛋白、人类白细胞抗原-B(HLA-B)蛋白或人类白细胞抗原-C(HLA-C)蛋白。
在一些实施方案中，所述MHC-I功能通过降低MHC-I转录调节因子的活性而降低。在一些优选的实施方案中，所述MHC-I的转录调节因子可以选自：β2微球蛋白(B2M)、抗原加工相关转运体1(TAP1)、抗原加工相关转运体2(TAP2)、抗原加工相关转运体(TAP)相关糖蛋白(Tapasin)或NOD样受体家族半胱天冬酶募集结构域5(NLRC5)中的一个或多个。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过降低HLA-A蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过敲除编码所述HLA-A蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过降低HLA-B蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过敲除编码所述HLA-B蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过降低HLA-C蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过敲除编码所述HLA-C蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过降低TAP1蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过敲除编码所述TAP1蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过降低TAP2蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过敲除编码所述TAP2蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过降低Tapasin蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过敲除编码所述Tapasin蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过降低NLRC5蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过敲除编码所述NLRC5蛋白的基因而降低。
在一优选实施方案中，所述MHC-I功能通过降低B2M蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述B2M蛋白为人B2M蛋白，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，所述MHC-I功能通过敲除编码所述B2M蛋白的基因而降低。
在一些实施方案中，所述MHC-II功能通过降低MHC-II类蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II类蛋白包含人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)蛋白、人类白细胞抗原-DQ(HLA-DQ)蛋白或人类白细胞抗原-DP(HLA-DP)蛋白。
在一些实施方案中，所述MHC-II功能通过降低MHC-II转录调节因子的活性而降低。在一些优选的实施方案中，所述MHC-II的转录调节因子可以选自：MHC-II反式激活蛋白(CIITA)、调节因子X相关锚蛋白(RFXANK)、调节因子X5(RFX5)、调节因子X相关蛋白(RFXAP)中的一个或多个。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过降低HLA-DR蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过敲除编码所述HLA-DR蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过降低HLA-DQ蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过敲除编码所述HLA-DQ蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过降低HLA-DP蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过敲除编码所述HLA-DP蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过降低RFXANK蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过敲除编码所述RFXANK蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过降低RFX5蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过敲除编码所述RFX5蛋白的基因而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过降低RFXAP蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过敲除编码所述RFXAP蛋白的基因而降低。
在一优选实施方案中，所述MHC-II功能通过降低CIITA蛋白的活性而降低。
在一实施方案中，所述CIITA蛋白为人CIITA蛋白，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，所述MHC-II功能通过敲除编码所述CIITA蛋白的基因而降低。
在一优选实施方案中，使用CRISPR技术敲除基因。在一些情况下，CRISPR技术用于将小的缺失/插入引入基因的编码区，使得不产生功能性蛋白，通常是移码突变的结果，其导致终止密码子的产生，使得产生截短的、非功能性蛋白。
可以使用本领域已知的技术测量多能干细胞中MHC-I(当细胞来源于人细胞时为HLA-I)功能和MHC-II(当细胞来源于人细胞时为HLA-II)功能的成功降低，例如使用蛋白抗体的蛋白印迹、FACS技术、RT-PCR、qPCR技术等。
在一些实施方案中，降低的对NK细胞杀伤的敏感性是由多能干细胞中的CEACAM1蛋白表达增加引起的。这通过几种方式完成，如本领域技术人员所理解的，可以使用“敲入”或转基因技术。在一些情况下，CEACAM1表达增加是由一种或多种CEACAM1转基因引起的。
因此，在一些实施方案中，在诱导型或组成型启动子的控制下将CEACAM1基因的一个或多个拷贝添加至多能干细胞。在一些实施方案中，如本文所述或本领域已知的使用慢病毒构建体。如本领域已知的，CEACAM1基因可以在合适的启动子的控制下整合到宿主细胞的基因组中。
在一实施方案中，所述增加的CEACAM1蛋白表达是由CEACAM1转基因引起的。
在一实施方案中，所述CEACAM1蛋白为人CEACAM1蛋白，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
可以使用已知技术测定足够的CEACAM1蛋白表达的存在，例如实施例中描述的那些，例如使用蛋白印迹、ELISA测定或FACS测定。通常，在此上下文中的“足够”意指多能干细胞表面上CEACAM1蛋白表达的增加，其沉默NK细胞的杀伤。
在又一方面，本发明还提供一种低免疫原性多能干细胞，其包含：
使内源B2M蛋白活性降低的一个或多个改变；
使内源CIITA蛋白活性降低的一个或多个改变；和
在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的蛋白表达的一个或多个改变，所述蛋白选自HLA-G蛋白、CTLA4-Ig蛋白、HMGB1蛋白、CEACAM1蛋白或其组合。
在一实施方案中，所述低免疫原性多能干细胞包含：
使内源B2M蛋白活性降低的一个或多个改变；
使内源CIITA蛋白活性降低的一个或多个改变；和
在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的CEACAM1蛋白表达的一个或多个改变。
在一实施方案中，所述低免疫原性多能干细胞包含：
使内源B2M基因的两个等位基因失活的一个或多个改变；
使内源CIITA基因的两个等位基因失活的一个或多个改变；和
在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的CEACAM1基因表达的一个或多个改变。
如本文所用，术语“改变”或“遗传改变”是指引起细胞，例如本文所述的多能干细胞的变化，其可以例如通过修饰基因组或引入新的基因片段实现。在本文中，修饰基因组是指修饰细胞内或无细胞条件下的核酸序列以产生改造的多能细胞和多能干细胞。示例性的“改变”或“遗传改变”的技术包括但不限于同源重组、敲入、ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)、CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)/Cas9以及其他位点特异性核酸酶技术。这些技术使得能够在所需的基因座位点处进行双链DNA断裂。这些受控的双链断裂促进特定基因座位点的同源重组。该过程集中于用核酸内切酶靶向核酸分子的特定序列，例如染色体，所述核酸内切酶识别并结合序列并在核酸分子中诱导双链断裂。通过易错的非同源末端连接(NHEJ)或通过同源重组(HR)修复双链断裂。示例性的“改变”或“遗传改变”的技术还包括引入基因表达修饰分子，所述基因表达修饰分子包括但不限于siRNA、shRNA、microRNA、反义RNA、反义寡核苷酸ASO(antisense oligonucleotides)或抗miRNA寡核苷酸AMO(Anti-miRNAoligonucleotides)。
本领域技术人员应当理解，可以使用许多不同的技术来改造本发明的多能细胞和多能干细胞，以使其变得低免疫原性。
通常，这些技术可以单独使用或组合使用。例如，使用CRISPR技术降低改造细胞中活性B2M和/或CIITA蛋白的表达，并用病毒技术(例如慢病毒)敲入CEACAM1基因。此外，本领域技术人员应当理解，这些基因可以使用不同的技术以不同的顺序操作。
在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能降低内源主要组织相容性I类抗原(MHC-I)功能。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能降低内源主要组织相容性II类抗原(MHC-II)功能。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能降低对NK细胞杀伤的敏感性。
在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能使内源B2M蛋白活性降低。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能使内源CIITA蛋白活性降低。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能增加CEACAM1蛋白表达。
在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能使内源B2M基因的两个等位基因失活。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能使内源CIITA基因的两个等位基因失活。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能增加CEACAM1基因表达。
在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能使内源B2M蛋白表达受抑制。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能使内源CIITA蛋白表达受抑制。
在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能使内源B2M蛋白表达受干扰。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能使内源CIITA蛋白表达受干扰。
在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能使内源B2M蛋白表达降低。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能使内源CIITA蛋白表达降低。
在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能敲除内源B2M蛋白。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞所包含的一个或多个改变能敲除内源CIITA蛋白。
在一实施方案中，使用本领域已知的成簇规律间隔短回文重复序列/Cas(“CRISPR”)技术改变所述多能干细胞，使内源B2M蛋白活性降低。
在一实施方案中，使用本领域已知的成簇规律间隔短回文重复序列/Cas(“CRISPR”)技术改变所述多能干细胞，使内源CIITA蛋白活性降低。
在一实施方案中，使用本领域已知的成簇规律间隔短回文重复序列/Cas(“CRISPR”)技术改变所述多能干细胞，使内源B2M基因的两个等位基因失活。
在一实施方案中，使用本领域已知的成簇规律间隔短回文重复序列/Cas(“CRISPR”)技术改变所述多能干细胞，使内源CIITA基因的两个等位基因失活。
测试基因是否已经失活的测定法是已知的并在本文中描述。在一个实施方案中，该测定是用针对B2M蛋白或CIITA蛋白的抗体探测细胞裂解物的蛋白印迹。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)证实存在失活改变。
在一实施方案中，使用本领域已知的病毒技术可用于在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的CEACAM1基因的表达。所述病毒技术包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和仙台病毒载体的使用。在一些实施方案中，将编码CEACAM1蛋白的核酸序列导入所述细胞的选定位点；所述细胞的选定位点是AAVS1、CCR5等安全港基因位点。如本文所用，“安全港基因位点”是指能用于基因安全敲入并能保证转入基因的正常稳定表达的位点。
在一优选实施方案中，使用慢病毒载体在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的CEACAM1基因的表达。
在一实施方案中，所述低免疫原性多能干细胞为人多能干细胞。
在一实施方案中，所述B2M蛋白为人B2M蛋白，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，所述CIITA蛋白为人CIITA蛋白，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，所述CEACAM1蛋白为人CEACAM1蛋白，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，所述低免疫原性干细胞包含：
与亲本多能干细胞相比降低的内源主要组织相容性I类抗原(MHC-I)功能；
与亲本多能干细胞相比降低的内源主要组织相容性II类抗原(MHC-II)功能；和
与亲本多能干细胞相比降低的对NK细胞杀伤的敏感性。
在一实施方案中，所述低免疫原性多能干细胞引发的T细胞应答，其低于由亲本多能干细胞引发的T细胞应答，所述亲本多能干细胞不包含所述使B2M和CIITA蛋白活性降低的改变以及所述引起增加的CEACAM1蛋白表达的改变。在一实施方案中，所述T细胞应答是通过实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)测定T细胞对所述低免疫原性多能干细胞或亲本多能干细胞的杀伤性来测量的。
在一实施方案中，所述低免疫原性多能干细胞引发的天然杀伤(NK)细胞应答，其低于由B2M/CIITA双等位基因敲除的克隆DKO细胞引发的NK细胞应答，所述DKO细胞包含所述使B2M和CIITA蛋白活性降低的改变但不包含所述引起增加的CEACAM1蛋白表达的改变。在一实施方案中，所述NK细胞应答是通过测定与所述低免疫原性多能干细胞或DKO细胞体外孵育的NK细胞的IFN-γ水平来测量的。在一实施方案中，所述NK细胞应答是通过实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)测定NK细胞对所述低免疫原性多能干细胞或DKO细胞的杀伤性来测量的。
产生本发明的低免疫原性多能干细胞的方法
本发明还提供一种产生本发明的低免疫原性多能干细胞的方法，所述方法包括：降低所述多能干细胞中内源主要组织相容性I类抗原(MHC-I)功能；降低所述多能干细胞中内源主要组织相容性II类抗原(MHC-II)功能；和增加降低所述多能干细胞对NK细胞杀伤的敏感性的蛋白的表达，其中所述蛋白选自HLA-G蛋白、CTLA4-Ig蛋白、HMGB1蛋白、CEACAM1蛋白或其组合。
在一优选实施方案中，增加降低所述多能干细胞对NK细胞杀伤的敏感性的CEACAM1蛋白的表达。
在一些实施方案中，所述方法包括：降低所述多能干细胞中B2M蛋白的活性；降低所述多能干细胞中CIITA蛋白的活性；和增加所述多能干细胞中CEACAM1蛋白的表达。
在一实施方案中，所述方法包括：消除所述多能干细胞中B2M基因的两个等位基因的活性；消除所述多能干细胞中CIITA基因的两个等位基因的活性；和增加所述多能干细胞中CEACAM1基因的表达。
在一些实施方案中，可以通过如上所述的“改变”或“遗传改变”的技术降低所述多能干细胞中B2M蛋白的活性。在一些实施方案中，可以通过如上所述的“改变”或“遗传改变”的技术降低所述多能干细胞中CIITA蛋白的活性。所述技术例如，引入基因表达修饰分子、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术或同源重组技术。在一优选实施方案中，所述基因表达修饰分子包含siRNA、shRNA、microRNA、反义RNA、反义寡核苷酸ASO(antisenseoligonucleotides)或抗miRNA寡核苷酸AMO(Anti-miRNA oligonucleotides)。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和至少一种至两种核糖核酸(例如gRNA)，所述核糖核酸能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与所述靶基序杂交。在一些实施方式中，CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和单个核糖核酸或至少一个核糖核酸(例如gRNA)对，所述核糖核酸能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与所述靶基序杂交。
在一些实施方式中，Cas蛋白包含一个或多个氨基酸取代或修饰。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸取代包含保守氨基酸取代。在一些情况下，取代和/或修饰可以防止或降低蛋白水解降解和/或延长细胞中多肽的半衰期。在一些实施方式中，Cas蛋白可以包含肽键置换(例如脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲等)。在一些实施方式中，Cas蛋白可以包含天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，Cas蛋白可以包含可选的氨基酸(例如D-氨基酸、β-氨基酸、高半胱氨酸、磷酸丝氨酸等)。在一些实施方式中，Cas蛋白可以包含修饰以包括部分(例如聚乙二醇化、糖基化、脂化、乙酰化、封端等)。
在一些实施方式中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白。示例性Cas核心蛋白包括但不限于Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas9。在一些实施方式中，Cas蛋白包含大肠杆菌(E.coli)亚型的Cas蛋白(也称为CASS2)。大肠杆菌亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cse1、Cse2、Cse3、Cse4和Cas5e。在一些实施方式中，Cas蛋白包含Ypest亚型的Cas蛋白(也称为CASS3)。Ypest亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csy1、Csy2、Csy3和Csy4。在一些实施方式中，Cas蛋白包含Nmeni亚型的Cas蛋白(也称为CASS4)。Nmeni亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csn1和Csn2。在一些实施方式中，Cas蛋白包含Dvulg亚型的Cas蛋白(也称为CASS1)。Dvulg亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csd1、Csd2和Cas5d。在一些实施方式中，Cas蛋白包含Tneap亚型的Cas蛋白(也称为CASS7)。Tneap亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cst1、Cst2、Cas5t。在一些实施方式中，Cas蛋白包含Hmari亚型的Cas蛋白。Hmari亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csh1、Csh2和Cas5h。在一些实施方式中，Cas蛋白包含Apern亚型的Cas蛋白(也称为CASS5)。Apern亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5和Cas5a。在一些实施方式中，Cas蛋白包含Mtube亚型的Cas蛋白(也称为CASS6)。Mtube亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5。在一些实施方式中，Cas蛋白包含RAMP型Cas蛋白。示例性RAMP型Cas蛋白包括但不限于Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5和Cmr6。
在一些实施方式中，Cas蛋白是化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方式中，Cas蛋白是金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方式中，Cas蛋白是嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方式中，Cas蛋白是脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方案中，Cas蛋白是齿垢密螺旋体(Treponema denticola)Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方案中，Cas蛋白是来自任何细菌种的Cas9蛋白或其功能部分。Cas9蛋白是II型CRISPR系统的成员，所述II型CRISPR系统通常包括反式编码的小RNA(tracrRNA)、内源核糖核酸酶3(rnc)和Cas蛋白。Cas9蛋白(也称为CRISPR相关核酸内切酶Cas9/Csn1)是包含1368个氨基酸的多肽。
在一实施方案中，通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术降低所述多能干细胞中B2M蛋白的活性。
在一实施方案中，通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术消除所述多能干细胞中B2M基因的两个等位基因的活性。
在一实施方案中，通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术降低所述多能干细胞中CIITA蛋白的活性。
在一实施方案中，通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术消除所述多能干细胞中CIITA基因的两个等位基因的活性。
在一实施方案中，通过对内源基因座的修饰增加CEACAM1蛋白的表达。在一些实施方案中，通过如上所述的“改变”或“遗传改变”的技术对内源基因座进行修饰。所述技术例如，基因敲入、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术或同源重组技术。
在一实施方案中，通过转基因的表达增加CEACAM1蛋白的表达。可以使用本领域已知的转基因表达技术增加CEACAM1蛋白的表达，包括但不限于病毒技术、Piggybac转座子技术、Sleeping Beauty转座子技术。
在本文中，可以使用公知的重组技术来产生如本文所述的表达构建体。在某些实施方案中，编码目的蛋白的核酸序列可以与表达构建体中的一个或多个调节核苷酸序列可操作地连接。调节核苷酸序列通常适合宿主细胞和待治疗的受试者。本领域已知多种类型的合适表达载体和合适的调节序列用于多种宿主细胞。通常，一种或多种调节核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。本文所用的表达构建体可以使用本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，或组合多于一种启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以在细胞中存在于附加体(例如质粒)上，或者表达构建体可以插入染色体中。在一个具体实施方案中，表达载体包括选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。某些实施方案包括表达载体，其包含与至少一种调节序列可操作地连接的编码目的蛋白的核苷酸序列。用于本文的调节序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。在某些实施方案中，设计表达载体用于选择待转化的宿主细胞、期望表达的目的蛋白、载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力或由载体编码的任何其他蛋白如抗生素标志物的表达。在一些实施方案中，所述启动子为EF1a启动子。
病毒技术可用于在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的CEACAM1基因的表达。所述病毒技术包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和仙台病毒载体的使用。
在一优选实施方案中，通过合成编码CEACAM1蛋白的核酸序列，以构建至慢病毒载体中，再通过慢病毒载体，将至少一个拷贝的在启动子控制下的CEACAM1基因引入所述多能干细胞中增加CEACAM1蛋白的表达。
在一实施方案中，将编码CEACAM1蛋白的核酸序列导入所述多能干细胞基因组的选定位点。在一优选实施方案中，所述选定位点是AAVS1、CCR5等安全港基因位点。如本文所用，“安全港基因位点”是指能用于基因安全敲入并能保证转入基因的正常稳定表达的位点。
在一实施方案中，所述CEACAM1蛋白为人CEACAM1蛋白。
在一实施方案中，所述编码CEACAM1蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:4所示的核酸序列或与SEQ ID NO:4所示的核酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列。
预防或治疗
本发明进一步提供了本发明的低免疫原性多能干细胞或本发明的方法制备的低免疫原性多能干细胞在制备用于预防或治疗需要细胞移植的疾病的药物中的用途。
本发明的低免疫原性多能干细胞或本发明的方法制备的低免疫原性多能干细胞可以诱导分化成不同的细胞，其可以用于不同的预防或治疗目的，以预防或治疗不同的疾病。如本领域技术人员应当理解，分化方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。例如，可以将细胞悬浮分化，然后制成凝胶基质形式，例如基质胶、明胶或纤维蛋白/凝血酶形式，以促进细胞存活。通常可以通过评估细胞特异性标志物的存在来如本领域已知的那样确定分化。例如，可以在一定分化条件下将细胞分化为心肌细胞、神经细胞、胶质细胞、内皮细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、造血祖细胞、间充质细胞、胰岛细胞、软骨细胞、视网膜色素上皮细胞、肾细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞或上皮细胞。
在一些实施方案中，所述疾病为癌症，所述癌症包含实体肿瘤和血液肿瘤。在一些实施方案中，所述实体肿瘤包含小细胞肺癌、乳腺癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、卵巢癌或黑色素瘤。在一些实施方案中，所述血液肿瘤包含急性白血病、慢性白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征或多发性骨髓瘤。
在一实施方案中，所述疾病包含再生障碍性贫血。
在一实施方案中，所述疾病包含先天免疫缺陷性疾病。
在一些实施方案中，所述疾病为自身免疫性疾病，其包含系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或I型糖尿病。
在一些实施方案中，所述疾病为神经退行性疾病，其包含帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓损伤、视网膜变性疾病、脑卒中、亨廷顿病或肌萎缩性侧索硬化症。
在一些实施方案中，所述疾病为心血管疾病，其包含动脉粥样硬化、高血压、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、心肌梗塞、心力衰竭、主动脉瘤或外周动脉疾病。
在一些实施方案中，所述疾病为代谢相关疾病，其包含II型糖尿病、坏血症、低血糖症、高血脂或骨质疏松。
有益效果
本发明的多能干细胞以及本发明的方法制备的低免疫原性多能干细胞可以呈现出优异的效果，例如但不限于：(1)具有良好的自我更新和分化能力；(2)能逃逸T细胞杀伤；(3)能逃逸NK细胞杀伤；和/或(4)所分化的细胞也能逃逸NK细胞的杀伤；从而表现出优异的应用潜力。
实施例
通过参考以下实施例进一步描述本发明。应当理解，这些实施例仅作为示例，而不对本发明构成限制。以下材料和仪器均是可商购的或根据本领域公知的方法制备。以下实验均按照制造商的说明书或根据本领域公知的方法和步骤进行。
实施例1.构建B2M及CIITA双敲除细胞系(DKO)
1.1构建B2M及CIITA双敲除细胞系(DKO)
以下实施例选用人多能干细胞系H1(Wicell，WA01)或H9(Wicell，WA09)进行目标细胞系的构建，所用的细胞培养和基因敲除试剂如表1所示。
表1.细胞培养和基因敲除试剂
具体操作如下：
1)在Matrigel包被的6孔板上正常使用添加有Y-27632的mTeSR1培养基培养人多能干细胞至80％密度。使用TrypLE消化后加入DMEM/F12中和，计数。吸取2×106细胞于EP管中，离心后弃上清。
2)根据Neon转染系统(ThermoFisher)100μL电转体系，加入15μg TrueCutTMCas9Protein+3μg gRNA(B2M-gRNA1+B2M-gRNA2+CIITA-gRNA1+CIITA-gRNA2)组成核糖核蛋白复合物(RNP)体系，混匀后在室温下放置20min。
3)用100μL RNP电转体系重悬细胞，并用Neon转染系统进行电转，电转参数为
使用CRISPR/CAS9敲除内质网中β-2-微球蛋白(B2M)，使细胞表面MHC-I不能形成功能性分子，从而逃逸同种异体CD8+T细胞的杀伤；逃逸CD4+T细胞的杀伤则是通过敲除MHC-II基因转录的正调节因子CIITA，而降低MHC-II类分子表达。
B2M的CRISPR/CAS9基因敲除策略以及所用gRNA序列和鉴定引物如图1和表2所示，使用B2M-gRNA1和B2M-gRNA2(EasyEdit sgRNA，金斯瑞)对B2M外显子区段进行两端直接敲除，然后分别使用B2M-F1/R1和B2M-F2/R2两对PCR引物进行基因组序列的敲除验证。
另外，CIITA的CRISPR/CAS9基因敲除策略以及所用gRNA序列和鉴定引物如图2和表2所示，使用CIITA-gRNA1和CIITA-gRNA2(EasyEdit sgRNA，金斯瑞)对CIITA外显子区段进行两端直接敲除，然后分别使用CIITA-F1/R1和CIITA-F2/R2两对PCR引物进行基因组序列敲除验证。
表2gRNA序列和鉴定引物1200V，30ms，1pause。迅速添加提前预热的培养基至电转后细胞，再均匀接种于1孔包被了Matrigel的6孔板中。
4)每天更换新鲜mTeSR1培养基。待单细胞生长起来，挑取单个克隆于48孔板内，待克隆扩增后，收取基因组样品进行PCR检测基因编辑情况，PCR结果如图1和2所示。PCR阳性克隆送公司做Sanger测序进一步验证。
5)扩增培养及冻存鉴定阳性的B2M/CIITA双等位基因敲除的克隆DKO。
1.2检测DKO的B2M和CIITA的RNA水平的表达情况
使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2(诺唯赞，RC112-01)提取细胞总RNA，然后根据制造商说明使用HiScript III RT SuperMix for qPCR(诺唯赞，R323-01)将RNA反转为cDNA。
使用qPCR检测B2M/CIITA双等位基因敲除的克隆DKO的B2M和CIITA在RNA水平的表达情况，所用引物如下所示。
B2M-F:AAGATGAGTATGCCTGCCGT
B2M-R:ATGCGGCATCTTCAAACCTC
CIITA-F:CCTGGAGCTTCTTAACAGCGA
CIITA-R:TGTGTCGGGTTCTGAGTAGAG
使用Roche 480II仪器，反应体系如下：
Pre-incubation，95℃，30s。
Amplification，95℃10s，60℃30s，40个循环数。
Melting curve和Cooling为默认程序。
qPCR结果如图3所示，相对于未经处理的野生型人多能干细胞，B2M/CIITA双等位基因敲除的克隆DKO的B2M和CIITA在RNA水平的表达近乎没有，确定成功敲除B2M和CIITA。
1.3检测DKO的B2M的蛋白水平的表达情况
使用蛋白印迹(Western-Blot)检测B2M/CIITA双等位基因敲除的克隆DKO的B2M蛋白水平的表达情况(B2M抗体的货号为ab75853；内参抗体GAPDH的货号为ab181602，都购自Abcam)。
蛋白印迹结果如图4所示，相对于野生型人多能干细胞，DKO中的B2M蛋白显著下降，确定成功敲除B2M蛋白。
1.4检测DKO的HLA-I/II类分子
使用IFN-γ(PeproTech,Cat#300-02)刺激WT及DKO以检测H1细胞表面的HLA I/II型分子，其具体检测方法如下：
细胞铺板，第二天换液时将含有IFN-γ的培养基加入到细胞中，作用48h后将细胞消化后使用流式细胞仪(Agilent Technologies，NovoCyte)检测HLA-I/II的表达情况。
流式检测结果如图5所示，其中左侧HLA-ABC检测HLA-I类分子；右侧HLA-DR，DQ，DP检测HLA-II类分子；T细胞为检测的阳性对照。观察到B2M/CIITA双等位基因敲除的克隆DKO不能响应IFN-γ的刺激而表达HLA-I/II类分子，证明DKO HLA-I和HLA-II功能降低。
1.5DKO的核型检测
对获得的B2M/CIITA双等位基因敲除的阳性克隆(DKO)进行核型检测，其具体检测方法如下：
用胰蛋白酶处理固定于载玻片上的染色体标本，再用Giemsa染液染色。根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征，将分裂中期染色体进行染色体数目和形态结构的分析，以确定其核型是否与正常核型一致。
核型检测结果如图6所示，DKO核型正常，与正常核型相比无明显变化。
实施例2.DKO细胞系的干性和免疫功能
本实施例进一步检测在敲除B2M/CIITA双等位基因后，多能干细胞的干性和免疫功能是否发生变化。
2.1DKO细胞中干性基因的表达
通过免疫荧光检测WT和DKO细胞中干性基因POU5F1和NANOG的蛋白水平，通过RT-qPCR检测WT和DKO细胞中干性基因POU5F1、NANOG和SOX2在RNA水平上的表达情况，以及通过流式细胞术检测WT和DKO细胞表面干性基因SSEA-4和Tra1-81的表达情况，其具体检测方法如下：
免疫荧光检测：将WT或DKO细胞铺板在12孔板中，待细胞长到60-80％的密度后吸弃培养基，加入4％多聚甲醛进行固定。细胞破膜后使用POU5F1和NANOG的一抗在4℃过夜孵育，洗去一抗后室温孵育带有荧光标记的二抗，随后使用荧光显微镜(NikonTs2R-FL)进行拍照。
RT-qPCR检测：
使用Roche 480II仪器，反应体系如下：
Pre-incubation，95℃，30s。
Amplification，95℃10s，60℃30s，40个循环数。
Melting curve和Cooling为默认程序。
其中间充质干细胞(MSC)为干性基因表达的阴性对照。
流式细胞术：
收下细胞后在EP管中4℃避光孵育抗体30min，然后根据抗体信息选择合适的荧光采集通道，上机检测荧光。所有抗体均来自BD Biosciences。
免疫荧光检测结果如图7A所示，WT和DKO细胞在蛋白水平都表达干性基因POU5F1和NANOG，并且DKO细胞中的干性基因POU5F1和NANOG的表达与WT细胞相比无明显差异。RT-qPCR的检测结果如图7B所示，WT和DKO细胞在RNA水平表达干性基因POU5F1、NANOG和SOX2，并且DKO细胞中的干性基因POU5F1、NANOG和SOX2的表达与WT细胞相比无明显差异。流式细胞术检测结果如图7C所示，WT和DKO细胞表面均高表达干性基因SSEA-4(WT 100％与DKO99.98％)和Tra1-81(WT 96.75％与DKO 99.13％)。
2.2 DKO细胞的分化能力
本实施例检测DKO细胞的分化能力。具体检测方法如下：在免疫缺陷小鼠(SCIDBeige，维通利华)皮下注射100μL含5x105 DKO细胞的悬液，待畸胎瘤体积大于1.5cm3后取出，并进行石蜡切片和苏木精伊红染色。
染色结果如图8所示，B2M/CIITA双等位基因敲除的DKO细胞可以在体内形成畸胎瘤并分化出内中外三胚层的细胞，DKO细胞具有正常的三胚层分化能力。
2.3 DKO细胞的免疫功能
通过使用xCELLigence RTCA Instrument进行T细胞及NK细胞的杀伤性实验以检测DKO细胞免疫功能的变化。杀伤性实验所用的试剂如表3所示。
使用含有人IL-2的Essential 8培养基重悬相同量的WT和DKO细胞系，并接种于用基质胶包被的96孔E-plates，加入活化的T细胞(XC11228，购自SAILYBIO)或NK细胞(XC11013，购自SAILYBIO)进行杀伤检测。T细胞在使用前将进行CD3、CD4和CD8流式检测，NK细胞在使用前将进行CD16和CD56流式检测，确保使用的T细胞及NK细胞的功能。RTCA检测数据使用xCELLigence软件进行分析，计算杀伤率和逃逸功能。
表3.杀伤性实验所用试剂
名称 货号(Cat No.) 规格 厂家
PE anti-human CD4 980804 500μl/管 Biolegend
APC anti-human CD8 980904 500μl/管 Biolegend
FITC anti-human CD3 300440 500次 Biolegend
APC anti-human CD16 301012 100次 Biolegend
PE anti-human CD56(NCAM) 318306 100次 Biolegend
human IL-2 202-1L-050/CF 50μg R&D
Y-27632 2HCl S1049 5mg Selleck
基质胶 354277 5ml Gibco
Essential 8TM培养基 A1517001 500ml Gibco
E-Plate VIEW 96PET 300601030 6块/盒 Agilent
RTCA结果如图9所示，WT细胞因为有HLA-I的表达而逃逸NK细胞的杀伤，但会被T细胞杀伤。DKO细胞能逃逸T细胞杀伤，同时对NK细胞的杀伤更为敏感。
实施例3.DKO+CD47细胞系的构建及免疫功能验证
3.1DKO+CD47细胞系的构建
本实施例使用慢病毒载体在实施例1获得的DKO细胞中过表达CD47(NM_198793)，所述CD47的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
将编码CD47蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:6)构建在由EF1a启动，且带嘌呤霉素筛选标记的慢病毒载体中(pGC-EF1a)，pGC-EF1a载体的结构如图10所示。具体操作方法如下：
慢病毒载体用BamHI/NheI酶切，并将编码CD47蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:6)连接至慢病毒载体，连接成功后采用Sanger测序验证插入序列正确性并进行病毒包装。转染慢病毒载体至实施例1中构建的DKO细胞，24h后换液，48h后换成带嘌呤霉素的培养基进行筛选。
对构建的稳转株细胞DKO+CD47的进行流式细胞检测(CD47抗体购自FACS:Biolegend，货号：323108)和qPCR检测。qPCR引物为CD47-F：AGAAGGTGAAACGATCATCGAGC；CD47-R：CTCATCCATACCACCGGATCT。检测结果如图11A和11B所示，构建的DKO+CD47细胞系中，CD47的表达水平显著高于WT细胞。并对验证后的DKO+CD47细胞系进行细胞扩增和后续功能性检测。
3.2DKO+CD47的免疫功能的验证
使用RTCA检测过表达的DKO+CD47细胞株是否可以在逃逸T细胞杀伤的同时成功逃逸NK细胞的杀伤，具体检测方法参见实施例2.3。
RTCA检测如图12所示，NK细胞可有效杀伤DKO细胞，而WT和DKO+CD47过表达细胞可逃逸NK杀伤。
实施例4.表达涉及母胎耐受和肿瘤免疫逃逸的蛋白的通用型细胞的筛选
本领域通常利用天然免疫抑制机制改造成多能干细胞以赋予其低免疫原性，但这依赖于免疫抑制受体-配体对或特定的微环境，也依赖于它们是否存在于移植细胞和免疫细胞上，因此仅引入与天然免疫抑制机制相关的基因并不一定会带来完全的低免疫原性(Zhao,W.,et al.(2020).Strategies for Genetically Engineering HypoimmunogenicUniversalPluripotent Stem Cells.iScience 23,101162.)。本发明在引入与天然免疫抑制机制相关基因的基础上进行了大量的功能性研究，结果也确证了免疫原性变化的不可预期性。特别是，本发明惊喜地发现在引入CEACAM1基因后，免疫原性会有极大程度的降低，甚至超出了现有技术中的明星分子。
本实施例对表达不同的涉及母胎耐受和肿瘤免疫逃逸的蛋白的通用型细胞进行了筛选。共筛选了29个与母胎耐受和免疫逃逸相关的候选靶点，其中涉及母胎耐受的靶点为人类白细胞抗原-E(HLA-E)、人类白细胞抗原-G(HLA-G)、CTLA4-Ig(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)的胞外段和修饰的Ig G1抗体Fc(铰链区、恒定区2和恒定区3)组成)；涉及肿瘤表达的抑制性免疫受体(免疫检查点)的靶点为MHC I类分子相关蛋白A(MICA)、MHC I类分子相关蛋白B(MICB)、UL16结合蛋白1(ULBP1)、UL16结合蛋白2(ULBP2)、UL16结合蛋白3(ULBP3)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4-Ig(CTLA4-Ig)、C1-抑制物(C1-Inhibitor)、可溶性半乳糖苷结合凝集素9(LGALS9)、白细胞分化抗原46(CD46)、白细胞分化抗原55(CD55)、白细胞分化抗原59(CD59)、白细胞分化抗原20(CD20)、人表皮生长因子受体2(HER2)、肝纤维蛋白原相关基因1(FGL1)、肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin/CLEC4G)、半乳糖凝集素-3(Gal-3)、免疫球蛋白超家族成员3(VSIG3)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、磷脂酰丝氨酸(PtdSer/PTDSS1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)、白细胞分化抗原112(CD112/Nectin2)、白细胞分化抗原113(CD113/Nectin3)蛋白；涉及肿瘤微环境中的调节因子的靶点为色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO2)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-37(IL-37)、白细胞介素-12A(IL-12A)或白细胞介素-35B(IL-35B)蛋白。具体筛选过程如下：
直接合成编码上述候选靶点蛋白(所述29个候选靶点的氨基酸序列如表4所示)的核酸序列。核酸序列如表4所示
如实施例3.1所述，将编码上述29个候选靶点蛋白的编码序列(具体序列如表4所示)分别构建在由EF1a启动，且带嘌呤霉素筛选标记的载体(pGC-EF1a)中，pGC-EF1a载体的结构如图10所示。具体操作为：将载体用BamHI/NheI酶切，并将上述合成的编码候选靶点蛋白的核酸序列分别连接至慢病毒载体中。连接成功后采用Sanger测序验证插入序列正确性并进行病毒包装。转染慢病毒载体至实施例1中构建的DKO细胞，24h后换液，48h后换成带嘌呤霉素的培养基进行筛选。
在构建后，对29个候选靶点的稳转株进行多次NK体外杀伤性实验(n≥5)，即进行多次NK杀伤性评判的重复实验，并对多次实验进行统计，拟筛选出对NK细胞的免疫逃逸功能最优的候选新靶标。将检测结果中的相对杀伤率归一至阴性对照DKO细胞。杀伤率小于100，说明相对于细胞对NK细胞有逃逸能力，杀伤率越低说明逃逸能力越强。阳性对照为WT细胞和DKO+CD47细胞。检测结果如图13所示，DKO+HLA-G细胞系、DKO+CTLA4-Ig细胞系、DKO+HMGB1细胞系以及DKO+CEACAM1细胞系的杀伤率较低，说明有较强的免疫逃逸能力。但有且仅有DKO+CEACAM1细胞系，NK细胞对其的多次杀伤率均小于对DKO细胞的杀伤率，与NK细胞对阳性对照WT细胞(虚线处)和现有技术DKO+CD47细胞的平均杀伤率类似。这表明DKO+CEACAM1细胞为筛选得到的逃逸NK杀伤的最优通用型细胞，其效果甚至优于公知的免疫抑制的明星分子HLA-G、CTLA4-Ig等。
表4.候选靶点的氨基酸序列以及编码靶点蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:)
候选靶点 Genbank参考序列号 氨基酸序列 核酸序列
CEACAM1 NP_001703.2 3 4
HLA-E NP_005507.3 7 8
HLA-G NP_001371219.1 9 10
CTLA4-Ig NP_005205.2 11 12
MICA NP_001170990.1 13 14
MICB NP_005922.2 15 16
ULBP1 NP_079494.1 17 18
ULBP2 NP_079493.1 19 20
ULBP3 NP_078794.1 21 22
C1-抑制物 NP_000053.2 23 24
CD46 NP_758861.1 25 26
CD55 NP_000565.1 27 28
CD59 NP_000602.1 29 30
CD20 NP_690605.1 31 32
HER2 NP_004439.2 33 34
TDO NP_005642.1 35 36
IDO1 NP_002155.1 37 38
IDO2 NP_919270.3 39 40
IL-10 NP_000563.1 41 42
IL37 NP_055254.2 43 44
IL-12A NP_000873.2 45 46
IL-35B NP_005746.2 47 48
FGL1 NP_004458.3 49 50
CLEC4G NP_940894.1 51 52
Gal-3 NP_010292.1 53 54
VSIG3 NP_001015887.1 55 56
HMGB1 NP_002119.1 57 58
PtdSer(PTDSS1) NP_055569.1 59 60
CD112(NECTIN2) NP_001036189.1 60 61
实施例5.DKO+CEACAM1细胞系的构建及干性和分化能力检测
基于上述筛选结果，本实施例将进一步研究在筛选结果中对NK细胞逃逸能力最优的DKO+CEACAM1细胞系的干性功能以及分化能力的变化。
5.1 DKO+CEACAM1细胞系的构建及过表达检测
直接合成编码CEACAM1蛋白(CEACAM1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的核酸序列。核酸序列如SEQ ID NO:4所示
如实施例3.1所述，构建由EF1a启动，且带嘌呤霉素筛选标记的慢病毒载体(pGC-EF1a)中，pGC-EF1a载体的结构如图10所示。将载体用BamHI/NheI酶切，并将上述合成的CEACAM1的核酸序列连接至慢病毒载体中。连接成功后采用Sanger测序验证插入序列正确性并进行病毒包装。转染慢病毒载体至实施例1中构建的DKO细胞，24h后换液，48h后换成带嘌呤霉素的培养基进行筛选。
对构建的DKO+CEACAM1细胞系使用qPCR检测mRNA的过表达水平，DKO细胞为阴性对照，所用引物如表5所示。
表5.CEACAM1的qPCR检测引物
引物序列 具体序列
CEACAM1 F1 TCTCCAACCACACTCAGGAC
CEACAM1 R1 GGAGGCTGAAGTTGGTTGTG
检测结果如图14所示，构建的DKO+CEACAM1细胞系中有CEACAM1的高表达。5.2DKO+CEACAM1细胞系中干性基因的表达
通过免疫荧光和流式细胞术检测DKO+CEACAM1细胞系中干性基因的表达，具体检测方法参见实施例2.1。
免疫荧光检测结果如图15所示，构建的DKO+CEACAM1细胞在蛋白水平表达干性基因OCT4、NANOG、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81。
流式细胞术结果如图16所示，DKO+CEACAM1细胞表面高表达干性基因SSEA-4、TRA-1-60、Tra1-81和OCT4，各干性基因占比分别为97.72％、96.62％、95.27％和99.78％。
5.3 DKO+CEACAM1细胞系的三胚层分化能力
使用DKO+CEACAM1细胞进行三胚层分化能力检测。为了生成中、内、外胚层细胞，需要分别使用添加有Y27632的三个胚层培养基对解离的DKO+CEACAM1单细胞进行重悬，并将适量细胞附着于基质胶包被的带有细胞爬片的孔板中。24h后，更换为预热的分化培养基，每天换液至第七天可得到中、内、外三个胚层细胞。通过免疫荧光检测三胚层标志蛋白的表达情况以检测DKO+CEACAM1细胞系的三胚层分化能力。
免疫荧光检测结果如图17所示，DKO+CEACAM1细胞在蛋白水平表达外胚层标志蛋白：PAX6和GAD1；中胚层标志蛋白：Brachyury和NCAM；内胚层标志蛋白：SOX17和FOXA2。
5.4 DKO+CEACAM1细胞系的畸胎瘤形成能力
本实施例检测DKO+CEACAM1细胞的分化能力。具体检测方法如下：向免疫缺陷小鼠(SCID Beige)皮下注射100μL含5x105 DKO+CEACAM1细胞的悬液，待畸胎瘤体积大于1.5cm3后取出，并进行石蜡切片和苏木精伊红染色。
图18示出畸胎瘤形成能力检测结果，可以看到DKO+CEACAM1细胞在体内形成畸胎瘤并分化出内中外三胚层的细胞。
实施例6DKO+CEACAM1细胞系的免疫逃逸功能
为验证DKO+CEACAM1细胞对不同免疫细胞的逃逸功能，使用NK细胞以及T细胞+NK细胞混合进行实验。
6.1使用RTCA检测DKO+CEACAM1细胞的免疫逃逸功能
通过RTCA检测DKO+CEACAM1细胞对不同免疫细胞的逃逸功能。具体检测方法参见实施例2.3。所用的PBNK细胞由PBMC(外周血单个核细胞，来自SAILYBIO)在体外培养过程中添加IL-2增加NK细胞占比后获得。检测结果如图19A-图19D所示，在RTCA检测的NK细胞杀伤性实验中，实施例1构建的DKO细胞被NK细胞完全杀伤，而WT细胞以及DKO+CEACAM1细胞成功逃逸(图19A和图19B)。而在RTCA检测的T细胞+NK细胞的混合细胞(PBNK)杀伤性实验中只有DKO+CEACAM1细胞成功逃逸，WT细胞和DKO细胞均被不同程度杀伤，其中DKO细胞被完全杀伤(图19C和图19D)。其中图19B和19D为多次杀伤统计图。
6.2使用Elispot检测NK细胞IFN-γ斑点分泌
通过Elispot检测NK细胞IFN-γ斑点分泌以测定DKO+CEACAM1细胞的免疫逃逸功能。具体操作方法如下：
将WT细胞、DKO细胞和DKO+CEACAM1细胞按照特定密度铺于6孔板，24h后弃除培养基并加入特定数量的NK细胞进行培养。24h后收集NK细胞进行后续IFN-γ分泌检测，同时观察去除NK细胞后剩余的WT细胞、DKO细胞和DKO+CEACAM1细胞，结果如图20所示，相较DKO细胞，WT细胞以及DKO+CEACAM1细胞被NK细胞杀伤的细胞更少，说明DKO+CEACAM1细胞可逃逸NK细胞杀伤的能力显著高于DKO细胞。
将24h后收集的NK细胞在包被有IFN-γ抗体的96孔板中铺板，并放置于37℃培养箱孵育24h；加入亲和抗体和链霉亲和素孵后进行IFN-γ分泌斑点的显色检测。
Elispot检测结果如图21A和图21B所示，WT细胞以及DKO+CEACAM1细胞与NK细胞共培养后刺激NK细胞分泌的IFN-γ所形成的斑点数相似，都显著低于DKO细胞，说明过表达CEACAM1可抵消B2M/CIITA敲除带来的NK细胞活化。
6.3使用FACS检测NK细胞活性指标
将WT细胞、DKO细胞、DKO+CEACAM1细胞按照特定密度铺于6孔板，24h后弃除培养基并加入特定数量的NK细胞进行共培养。24h后收集NK细胞，利用FACS检测其细胞表面激活指标CD107a(Biolegend，328620)。
FACS检测结果如图22所示，DKO+CEACAM1细胞与DKO细胞相比，均可降低NK细胞的活化。
实施例7.DKO+CEACAM1细胞的分化细胞的免疫逃逸验证
将细胞铺在基质胶上，当汇和度达到40％时更换为分化培养基并每天换液。长满后传代到0.1％明胶包被的培养皿上，每3天进行一次传代操作，期间仍需每天换液，分化周期为10天。
通过RTCA检测DKO+CEACAM1细胞的分化细胞对NK细胞的逃逸功能。具体检测方法参见实施例2.3。
结果如图23A和图23B所示，其中图23B为多次杀伤统计图。DKO细胞分化后依旧被NK细胞完全杀伤，而WT细胞的分化细胞和DKO+CEACAM1细胞的分化细胞成功逃逸NK细胞的杀伤。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表

Claims (25)

1.一种低免疫原性多能干细胞，其包含：
与亲本多能干细胞相比降低的内源主要组织相容性I类抗原(MHC-I)功能；
与亲本多能干细胞相比降低的内源主要组织相容性II类抗原(MHC-II)功能；和
与亲本多能干细胞相比降低的对NK细胞杀伤的敏感性，其中所述降低的对NK细胞杀伤的敏感性是由增加的蛋白的表达引起的，所述蛋白选自HLA-G蛋白、CTLA4-Ig蛋白、HMGB1蛋白、CEACAM1蛋白或其组合。
2.权利要求1的低免疫原性多能干细胞，其中所述降低的对NK细胞杀伤的敏感性是由增加的CEACAM1蛋白的表达引起的。
3.权利要求1或2的低免疫原性多能干细胞，其中所述MHC-I功能通过降低MHC-I类蛋白或MHC-I转录调节因子的活性而降低。
4.权利要求3的低免疫原性多能干细胞，其中所述MHC-I类蛋白包含HLA-A蛋白、HLA-B蛋白或HLA-C蛋白。
5.权利要求3的低免疫原性多能干细胞，其中所述MHC-I转录调节因子包含B2M蛋白、TAP1蛋白、TAP2蛋白、TAP相关糖蛋白或NLRC5蛋白。
6.权利要求3的低免疫原性多能干细胞，其中所述MHC-I功能通过降低B2M蛋白的活性而降低。
7.权利要求6的低免疫原性多能干细胞，其中所述B2M蛋白为人B2M蛋白，其包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。
8.权利要求1-7中任一项的低免疫原性多能干细胞，其中所述MHC-II功能通过降低MHC-II类蛋白或MHC-II转录调节因子的活性而降低。
9.权利要求8的低免疫原性多能干细胞，其中所述MHC-II类蛋白包含HLA-DR蛋白、HLA-DQ蛋白或HLA-DP蛋白。
10.权利要求8的低免疫原性多能干细胞，其中所述MHC-II转录调节因子包含CIITA蛋白、RFXANK蛋白、RFX5蛋白或RFXAP蛋白。
11.权利要求8的低免疫原性多能干细胞，其中所述MHC-II功能通过降低CIITA蛋白的活性而降低。
12.权利要求11的低免疫原性多能干细胞，其中所述CIITA蛋白为人CIITA蛋白，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。
13.权利要求1-12中任一项的低免疫原性多能干细胞，其中所述CEACAM1蛋白为人CEACAM1蛋白，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。
14.权利要求1的低免疫原性多能干细胞，其包含：
使内源B2M蛋白活性降低的一个或多个改变；
使内源CIITA蛋白活性降低的一个或多个改变；和
在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的CEACAM1蛋白表达的一个或多个改变。
15.权利要求14的低免疫原性多能干细胞，其包含：
使内源B2M基因的两个等位基因失活的一个或多个改变；
使内源CIITA基因的两个等位基因失活的一个或多个改变；和
在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的CEACAM1基因表达的一个或多个改变。
16.一种产生权利要求1-15中任一项的低免疫原性多能干细胞的方法，所述方法包括：
降低所述多能干细胞中内源主要组织相容性I类抗原(MHC-I)功能；
降低所述多能干细胞中内源主要组织相容性II类抗原(MHC-II)功能；和
增加降低所述多能干细胞对NK细胞杀伤的敏感性的蛋白的表达，其中所述蛋白选自HLA-G蛋白、CTLA4-Ig蛋白、HMGB1蛋白、CEACAM1蛋白或其组合。
17.权利要求16的方法，其中增加降低所述多能干细胞对NK细胞杀伤的敏感性的CEACAM1蛋白的表达。
18.权利要求16或17的方法，所述方法包括：
降低所述多能干细胞中B2M蛋白的活性；
降低所述多能干细胞中CIITA蛋白的活性；和
增加所述多能干细胞中CEACAM1蛋白的表达。
19.权利要求18的方法，所述方法包括：
消除所述多能干细胞中B2M基因的两个等位基因的活性；
消除所述多能干细胞中CIITA基因的两个等位基因的活性；和
增加所述多能干细胞中CEACAM1基因的表达。
20.权利要求18或19的方法，其中通过选自以下的技术降低所述多能干细胞中B2M蛋白的活性和/或降低所述多能干细胞中CIITA蛋白的活性：
引入基因表达修饰分子、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术或同源重组技术；优选地，所述基因表达修饰分子包含siRNA、shRNA、microRNA、反义RNA、反义寡核苷酸ASO或抗miRNA寡核苷酸AMO。
21.权利要求20的方法，其中通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术降低所述多能干细胞中B2M蛋白的活性；和/或
通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术降低所述多能干细胞中CIITA蛋白的活性。
22.权利要求16-21中任一项的方法，其中通过对内源基因座的修饰增加CEACAM1蛋白的表达。
23.权利要求16-21中任一项的方法，其中通过转基因的表达增加CEACAM1蛋白的表达；优选地，通过合成编码CEACAM1蛋白的核酸序列，以构建至慢病毒载体中，再通过慢病毒载体，将至少一个拷贝的在启动子控制下的CEACAM1基因引入所述多能干细胞中增加CEACAM1蛋白的表达。
24.权利要求23的方法，其中所述编码CEACAM1蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:4所示的核酸序列或与SEQ ID NO:4所示的核酸序列具有至少80％相同性的核酸序列。
25.权利要求1-15中任一项的低免疫原性多能干细胞或权利要求16-24中任一项的方法制备的低免疫原性多能干细胞在制备用于预防或治疗需要细胞移植的疾病的药物中的用途；优选地，所述疾病包含急性白血病、慢性白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤、再生障碍性贫血、先天性免疫性缺陷、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、I型糖尿病、帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓损伤、视网膜变性疾病、脑卒中、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、动脉粥样硬化、高血压、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、心肌梗塞、心力衰竭、主动脉瘤、外周动脉疾病、II型糖尿病、坏血症、低血糖症、高血脂或骨质疏松。
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