CN118139975A - 用于改善神经肌肉接头形态和功能的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本公开提供了通过向受试者施用有效抑制受试者中的15‑PGDH活性和/或降低受试者中的15‑PGDH水平的量的15‑PGDH抑制剂来改善、增强和/或恢复受试者中的神经肌肉接头形态和/或功能的方法。本文所述的方法可用于治疗患有神经源性肌病、老年诱发的肌肉质量损失、遗传性神经肌肉萎缩病症，或创伤后或损伤后等状况的受试者。

Description

用于改善神经肌肉接头形态和功能的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年10月19日提交的美国临时申请号63/257,264的优先权，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

关于在联邦资助的研究和开发下进行的发明权声明

本发明是在国家卫生研究院授予的合同AG020961和AG069858的政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。

背景技术

去神经支配是与年龄和神经源性相关的肌病的标志。神经肌肉接头(NMJ)是在肌肉纤维和脊髓的下部运动神经元之间的专门的突触，其支配和控制肌肉运动。乙酰胆碱受体(AChR)是NMJ的主要成分。它们在肌肉纤维的表面(NMJ的突触后隔室)组织成分支和网络样结构，并且负责从神经系统向肌肉的信号传输。数种病症如衰老、神经肌肉传递障碍、废用和肌肉营养不良会导致神经肌肉接头的片段化。目前没有能够改善、增强和/或恢复NMJ的形态和/或功能和/或诱导和/或促进在患有NMJ退化的受试者中形成NMJ的治疗干预。

发明内容

本领域仍然需要有效的策略来改善、增强和/或恢复NMJ的形态和/或功能，和/或诱导和/或促进NMJ的形成，用于治疗包括神经源性肌病和由于肌肉去神经支配而引起的老年诱导的肌肉质量损失的病症。本公开满足该未满足的需要并且还提供其它优点。

在一个方面，本公开提供了在患有NMJ退化的受试者中改善、增强和/或恢复神经肌肉接头(NMJ)形态和/或功能，和/或诱导和/或促进NMJ形成的方法，方法包括：向受试者施用有效抑制受试者中的15-PGDH活性和/或降低受试者中的15-PGDH水平的量的15-PGDH抑制剂。从而改善、增强和/或恢复受试者的NMJ形态和/或功能，和/或诱导和/或促进NMJ的形成。

在一些实施方案中，方法导致突触前运动神经元和突触后乙酰胆碱受体(AChR)并置和/或连通性增加。在一些实施方案中，方法导致在NMJ处的片段化AChR簇的数目减少。在一些实施方案中，方法导致缺少运动神经元的NMJ的数目减少。在一些实施方案中，方法导致运动神经元轴突的起泡减少。在一些实施方案中，方法导致运动神经元的细胞凋亡减少。在一些实施方案中，方法导致NMJ形态增强和/或神经信号对肌肉的功能传导增强。

在一些实施方案中，方法导致在NMJ处富含AChR的囊泡的数目减少。在一些实施方案中，方法导致AChR在NMJ处的表达和/或定位增加。在一些实施方案中，方法导致AChR降解减少。在一些实施方案中，方法导致AChR稳定性增加。

在一些实施方案中，方法导致NMJ处运动神经元轴突末端的线粒体形态改善、增强和/或恢复。在一些实施方案中，方法导致NMJ处运动神经元突触终端的改善、增强和/或恢复。在一些实施方案中，方法导致受试者中骨骼肌质量和/或神经肌肉功能的改善、增强和/或恢复。在一些实施方案中，受试者患有肌肉去神经支配和/或部分肌肉去神经支配。

在一些实施方案中，受试者患有神经源性肌病、老年诱导的肌肉质量损失、遗传性神经肌肉萎缩病症、神经创伤或损伤、肌肉创伤或肌肉损伤，或其任何组合。在一些实施方案中，遗传性神经肌肉萎缩病症是脊髓性肌萎缩(SMA)、迪谢内肌营养不良(DMD)或肌萎缩性侧索硬化(ALS)。在一些实施方案中，受试者已经或已经经历选自以下的一种或多种：急性外周神经损伤、肌肉废用、具有神经源性和自身免疫性的涉及靶纤维或管状聚集体形成的肌病，和血管性肌病。

在一些实施方案中，急性外周神经损伤选自：挫伤性损伤、压迫性减压损伤、神经切断、肉毒杆菌毒性、由于腱切断术引起的损伤，以及运动损伤。在一些实施方案中，压迫性减压损伤选自：水肿、腕管综合征、贝克囊肿，以及重复任务损伤。在一些实施方案中，肌肉废用选自：骨折后的固定、长期卧床休息、手术后的恢复、呼吸机的恢复、太空飞行，以及久坐的生活方式。在一些实施方案中，具有神经源性和自身免疫性的涉及靶纤维或管状聚集体形成的肌病选自：迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、中央轴空病、远端运动轴索神经病变、多灶性运动神经病、肌萎缩侧索硬化症、进行性脊肌萎缩症、多发性硬化、共济失调、强直性肌营养不良、神经源性淀粉样变性、近端管状聚集性肌病、类风湿性关节炎、干燥综合征，以及重症肌无力。在一些实施方案中，重症肌无力选自：先天性重症肌无力、偶发性重症肌无力，以及Lambert-Eaton肌无力综合征。

在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂选自：小分子化合物、阻断抗体、纳米抗体和肽。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂选自：SW033291和(+)-SW209415。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂是具有15-PGDH抑制活性的噻唑烷二酮类似物。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂选自：反义寡核苷酸、microRNA、siRNA和shRNA。

在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，受试者年龄小于30岁。在一些实施方案中，受试者年龄至少30岁。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂降低或阻断15-PGDH表达。

在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂降低或阻断15-PGDH的酶活性。

在一些实施方案中，方法独立于肌细胞增殖。

在一些实施方案中，施用包括系统性施用或局部施用。

从以下详细描述和附图中，本公开的其它目的、特征和优点对于本领域技术人员将是显而易见的。

附图说明

图1A至图1D显示了15-PGDH的小分子抑制通过增加肌肉质量和力量而导致老化的肌肉功能的改善。图1A显示了肌肉组织裂解物中的类花生酸水平(n＝8年轻veh，n＝9年轻SW，n＝8老年veh，n＝6老年SW)。图1B显示了在载体和SW治疗的老年肌肉的肌肉组织中测定的15-PGDH特异性酶活性，所述老年肌肉相对于载体治疗进行了归一化(n＝4每年龄组)。图1C显示了用载体或SW治疗的年轻和老年小鼠的腓肠肌(GA，左侧)和胫骨前肌(TA，右侧)重量。图1D显示了足屈强直力(作为力矩的绝对值)。

图2A至图2D显示了一个月的15-PGDH抑制在老年小鼠中改善、增强和/或恢复NMJ形态。图2A显示了在年轻(左)，老年(31个月)载体治疗(中图)和老年(31个月)SW治疗(右图)小鼠中用荧光团缀合的银环蛇毒素(BTX)复染的AChR的代表性共聚焦图像。图2B显示了神经肌肉接头中每个AChR簇的片段数。年轻组、老年载体治疗和老年SW治疗组分别为n＝132个、138个和217个NMJ。使用单向ANOVA然后使用图基多重对比在实验组之间进行统计分析。图2C的上图显示了来自年轻组(左图)、老年载体治疗组(中图)和老年SW治疗组(右图)的AChR簇的最大z投影共聚焦图像。图2C下图显示了富含AChR的囊泡用黄色圆圈标记。图2D显示了每个AChR簇的BTX+囊泡的条形图定量。至少分析了20个簇。年轻组、老年载体组和老年SW治疗组分别为n＝20个、31个和41个AChR。使用单向ANOVA然后使用图基多重对比在实验组之间进行统计分析。

图3A至图3C显示了15-PGDH抑制改善、增强和/或恢复老年小鼠中远端轴突和NMJ中的MN相关线粒体的形态。图3A显示了年轻组(左图)、老年载体组(中图)和老年SW治疗组(右图)的NMJ的代表性电子显微照片。轴突末端以黄色虚线圆圈表示。PNS：突触后核。图3B显示了年轻组(左图)、老年载体组(中图)和老年SW治疗组(右图)中的远端轴突的代表性电子显微照片，显示了MN相关线粒体的形态和电子密度。图3C显示了远端轴突中线粒体区域的定量。每个条件下至少从2只动物中获取12个轴突进行成像和分析。

图4A至图4F显示了15-PGDH基因表达在成年去神经支配肌肉和出生后10天的SMA小鼠中显著增加。图4A至图4D显示了成年野生型小鼠中去神经支配的腓肠肌中肌肉重量(图4A)、15-PGDH(图4B)、MuRF1(trim63)(图4C)和肌生长抑制素(图4D)mRNA表达的纵向分析。图4E至图4F显示了出生后第10天时在SMAΔ7小鼠胫骨前肌中15-PGDH(图4E)和肌生长抑制素(图4F)mRNA表达分析。图4A至图4D中的图是Ehmsen等人的再分析。(SciData,6(1):179(2019))，并且图4E至图4F中的图是对McCormack等人发表的数据的再分析(J CachexiaSarcopenia Muscle,12(4):1098-1116(2021))。

图5A至图5H显示了15-PGDH在去神经支配肌肉纤维中上调。图5A描绘了实验方案。图5B显示了在坐骨神经横切后14天，在对照(左图)和去神经支配的(右图)腿中的整块趾长伸肌(EDL)肌肉对神经丝(NF：红色)和α-蛇毒素(BTX；灰色)进行免疫染色的代表性图像。图5C显示了坐骨神经横切14天后对照(左图)和去神经支配的(右图)胫骨前肌(TA)横切面的代表性CODEX免疫荧光图像，以共同检测15-PGDH(黄色)、细胞膜(WGA，蓝色)、神经丝(小图；NEFH，红色)，和α整合素(小图；a7-int，蓝色)。小图是图5C中白色虚线正方形的放大区域，突出显示TA神经束。图5D显示了经历单侧坐骨神经横切14dpi的小鼠的对照(CTL)和去神经支配(DN)腓肠肌中15-PGDH的代表性蛋白质印迹图像。图5E显示了15-PGDH免疫印迹定量的条形图，相对于总蛋白进行了归一化(n＝5只小鼠，数据表示为平均值±均值标准误差)。图5F显示了单侧坐骨神经横切后14天来自4只小鼠对照(黑色)和去神经支配(红色)腿的腓肠肌裂解物中15-PGDH酶活性的动力学测量。图5G左图显示了通过LC-MS/MS分析的13,14-二氢-15-酮PGE2(PGEM)丰度在经历单侧坐骨神经横切的年轻小鼠的对照和去神经支配的腓肠肌中的代表性色谱图。图5H右图显示了通过LC-MS/MS定量的腓肠肌中PGEM的条形图定量(n＝4只小鼠，数据表示为神经横切后14天的平均值±均值标准误差)。*P<0.05，**P<0.01。

图6A至图6E显示了去神经支配后15-PGDH上调。图6A显示了坐骨神经横切后14天对照(左图)和去神经支配的(右图)胫骨前肌横切面的代表性CODEX免疫荧光图像。平滑肌肌动蛋白(SMA；绿色)染色血管，CD31(红色)染色内皮细胞，CD45(灰色)染色所有免疫细胞，以及DAPI(蓝色)复染细胞核。图6B显示了来自经历单侧坐骨神经横切以显现15-PGDH14dpi的3只年轻小鼠的对照(上排)和去神经支配的(下排)TA肌肉横截面的CODEX图像。图像被伪彩色治疗以表示15-PGDH的免疫活性为黄色。图6C显示了作为Ponceau S染色在图5D中呈现的15-PGDH蛋白质印迹的加载对照。图6D显示了在接受单侧坐骨神经横切的年轻小鼠的对照和去神经支配的腓肠肌中通过LC-MS/MS分析的PGE2和PGD2丰度的代表性色谱图。图6E显示了神经横切后14天通过LC-MS/MS(n＝4只小鼠)定量的腓肠肌中PGE2的条形图定量。数据以平均值±均值标准误差呈现。

图7A至图7J显示了15-PGDH是去神经支配后持续自噬反应的一部分。图7A显示了去神经支配作用相关基因CD11b(Itgam，红色)；MuRF1(Trim63，橙色)；FoxO3(绿色)；15-PGDH(Hpgd，蓝色)；和NCAM1(紫色)的归一化mRNA表达模式的时间过程。半透明的误差带显示了每个基因的均值标准误差。图7B显示了富集了图7A中突出显示的去神经支配基因的每个时间上不同的基因集(簇)的基因本体术语。图7C显示了去神经支配的GA肌肉的单核分析的实验方案。图7D显示了在UMAP嵌入中绘制的去神经支配的GA肌肉的单核分析中发现的细胞类型的注释。每种颜色表示通过基于基因表达的聚类识别的细胞类型。图7E显示了在对侧腿(上图)中发现的细胞核的细胞类型组成相对于去神经支配腿(下图)的核密度估计。图7F显示了在每个核中检测到的15-PGDH(Hpgd)的表达水平。图7G显示了与15-PGDH表达在肌细胞核中正相关(r>0.5；上集)或负相关(r<-0.3；下集)的基因的基因本体(GO)术语富集。图7H显示了在每个核中检测到的LC3A(Map1lc3a)的表达水平。图7I显示了在每个核中检测到的Parkin(Prkn)的表达水平。图7J显示了在每个核中检测到的VDAC1(Vdac1；上图)的表达水平和丙酮酸脱氢酶(Pdha1；下图)的表达水平。在图7D、图7F、图7H和图7J中，每个点表示核。

图8显示了去神经支配后的时间调控的遗传程序。时间过程基因集富集分析揭示了坐骨神经横断(SNT)后差异表达基因的25个时间动态(簇)。顶部热图显示了在对侧腿和去神经支配腿中在实验时间点(SNT后0天、1天、3天、7天、14天、21天、30天、90天)上每个簇内基因的平均标准化表达模式。下面的热图显示了在每个簇中富集的基因的基因本体(生物过程)术语。显示了每个簇的按Log10组合分数(log(P值)*(Z分数))排序的前10个术语。

图9A至图9F显示去神经支配后骨骼肌的单核分析。图9A显示了在UMAP嵌入中绘制的去神经支配的GA肌肉的单核分析中发现的细胞类型的广泛层面注释。每种颜色表示通过基于基因表达的聚类识别的细胞类型。图9B显示了通过图9A所示的每个广泛细胞类型注释的质量控制的被分析核的计数。图9C显示了分析的核的UMAP嵌入，显示了来自对侧(蓝色)或去神经支配的(红色)腿的GA肌肉的来源。图9D显示了每个细胞类型簇(来自图7D)的前5个标记基因的热图。标记基因按照它们所在的簇分组。每行是核，由细胞类型簇排序。图9E显示了15-PGDH(Hpgd)在肌细胞核子集(肌纤维类型和在NMJ和MTJ的特化核)中表达的小提琴图。图9F显示通过皮尔森相关系数(r)排序的15-PGDH相关基因。对应于曲线拐点的r>0.5的基因被认为是正相关的。r<-0.3的那些被认为是负相关的。

图10A至图10E显示了老年小鼠和人神经源性肌病的肌纤维中的15-PGDH聚集体。图10A的上图显示了老年侧腓肠肌的代表性CODEX免疫荧光图像，以观察肌纤维亚型(I型：蓝色，IIa型：绿色，IIb型：红色)和肌纤维细胞外基质(ECM)(层粘连蛋白；灰色)。图10A的下图显示了在上图中显示的相同区域的代表性CODEX免疫荧光图像，其被染色以可视化15-PGDH(黄色)和抗肌萎缩蛋白(DMD；蓝色)。图10B显示了在年轻(灰色条)和老年(蓝色条)比目鱼肌(缓慢收缩)、腓肠肌(混合纤维类型)和趾长伸肌(快速收缩)肌肉中的15-PGDH相对蛋白质表达的定量(每个点代表单个小鼠，数据表示为平均值±均值标准误差)。图10C显示了老年腓肠肌横截面的代表性免疫荧光图像，其被免疫染色以可视化15-PGDH(红色)和自噬标记物LC3A(绿色)。细胞核用DAPI(蓝色)复染。肌纤维用白色虚线描绘。图10D显示了老年腓肠肌横截面的代表性免疫荧光图像，免疫染色以可视化15-PGDH(红色)和线粒体膜离子通道VDAC1(绿色)。肌纤维基底膜用小麦胚芽凝集素(灰色)复染。肌纤维用白色虚线描绘。图10E显示了来自诊断为神经源性肌病的患者的肌肉活检连续横截面的代表性图像，其免疫染色以可视化左图：15-PGDH(红色)；中间图：LC3A(绿色)，15-PGDH(红色)，WGA(ECM，灰色)和DAPI(细胞核，蓝色)；右图：线粒体膜离子通道VDAC1(绿色)，线粒体酶丙酮酸脱氢酶PDHA(红色)，WGA(ECM，灰色)和DAPI(细胞核，蓝色)。NS：不显著，*P<0.05，****P<0.0001。

图11A至图11F显示了经历神经源性重塑的纤维中的15-PGDH。图11A显示了老年比目鱼肌(左图)和趾长伸肌(EDL)(右图)肌肉的代表性免疫荧光图像，所述肌肉被免疫染色以可视化肌纤维亚型(I型：蓝色，IIa型：灰色，IIb型：红色)和肌纤维基底膜(层粘连蛋白；绿色)。图11B显示了年轻(灰色条)和老年(蓝色条)比目鱼肌和EDL肌中的去神经支配纤维(总计百分比)的定量(每个点代表一只小鼠，数据表示为平均值±均值标准误差)。图11C显示了来自年轻和老年比目鱼肌(顶部)，腓肠肌(中部)和趾长伸肌(底部)肌肉裂解物的代表性15-PGDH免疫印迹。用丽春红S染色作为总蛋白加样对照。图11D显示了老年腓肠肌中神经细胞粘附分子(NCAM，绿色)染色的代表性免疫荧光图像，表明去神经支配纤维。肌纤维基底膜用层粘连蛋白(红色)染色。图11E显示了老年腓肠肌纤维中泛素结合蛋白p62(自噬标记，品红)染色的代表性免疫荧光图像。肌纤维肌膜用抗肌萎缩蛋白(黄色)染色。图11F显示了老年腓肠肌纤维中泛素染色(青色)的代表性免疫荧光图像。肌纤维基底膜用层粘连蛋白(灰色)染色。NS：不显著。**P<0.01，***P<0.001。

图12A至图12F显示了15-PGDH抑制增强神经挤压的恢复。图12A显示了实验方案。图12B显示了经历单侧坐骨神经横切14dpi的小鼠的受伤腿的趾长伸肌中的神经肌肉接头的代表性共聚焦图像。小鼠每天用SW或载体作为对照(veh)腹膜内治疗，如图12A所示。用突触前运动神经元(神经丝+突触囊泡，红色)和荧光团-缀合的α-蛇毒素(BTX，绿色)的抗体的混合物免疫染色整块数组织以可视化突触后AChR。细胞核用Hoechst(蓝色)复染。箭头(白色)指示缺乏突触前(红色)信号的去神经支配的NMJ。图12C显示了在经历单侧坐骨神经挤压14dpi的小鼠的同侧EDL肌肉中去神经支配纤维百分比的条形图定量。如图12A所示，小鼠每天用载体(蓝色)或SW(红色)腹膜内治疗。图12D显示了在载体(蓝色)和SW治疗的(红色)小鼠(各n＝4)的神经挤压损伤后第3天、第7天和第14天通过神经刺激诱导的足屈强直力(对侧(对照)腿的百分比)。图12E显示了在神经挤压后14天在载体(蓝色)和SW(红色)治疗的小鼠中的腓肠肌(GA)和比目鱼肌(Sol)重量。图12F显示了在神经挤压损伤后14天的载体(蓝色)和SW治疗的(红色)小鼠中的肌肉比力(相对于肌肉重量归一化的足屈强直力)。dpi：损伤后的天数，veh：载体，*P<0.05，**P<0.01，图12C-12F中的数据表示为平均值±均值标准误差。

图13A至图13E显示了外周神经损伤增加脊柱15-PGDH活性。图13A显示了经历单侧坐骨神经挤压损伤后14天的小鼠的腰髓对IBA1染色的拼接免疫荧光图像，表明损伤后同侧但非对侧的腹角运动神经元周围的小胶质细胞的积累。小图：在黄色框中勾勒的区域的放大区域。图13B左图显示了用Iba1(绿色)和15-PGDH(红色)免疫染色的坐骨神经横截面的共聚焦图像。图13B右图显示了左图的放大区域，表明Iba1+小胶质细胞中15-PGDH染色的共定位。图13C显示了来自年轻未治疗的(对照)或损伤的(经历坐骨神经挤压后14天)小鼠的脊髓裂解物的15-PGDH免疫印迹。Gapdh用作加样对照。图13D显示了图13C中免疫反应带的光密度测定。测定15-PGDH与Gapdh的比率被确定并绘制为平均值±均值标准误差(每个n＝4)。图13E显示了对照和受伤小鼠(每个n＝4)的腰髓中15-PGDH特异性活性的动力学测量。

图14A至图14E显示了用15-PGDH抑制治疗的神经挤压损伤后肌肉重量和功能的详细表征。图14A显示了坐骨神经挤压手术后第0天和第14天用载体(蓝色)和SW治疗的小鼠的体重的条形图定量。图14B显示了在神经挤压后14天，在载体(蓝色)和SW(红色)治疗的小鼠中对侧未损伤腿(左腿)的腓肠肌(GA)和比目鱼肌(Sol)重量(n＝4个载体和n＝3个SW)。图14C显示了在载体(Veh，蓝色)和SW治疗的(SW，红色)小鼠(n＝4，每个值显示为相对于载体治疗的小鼠的平均值归一化的百分比)中的神经挤压损伤后第14天通过神经刺激诱导的对侧未损伤腿(左腿)的足屈强直力。图14D至图14E显示了在经历单侧坐骨神经挤压7dpi(图14D)和14dpi(图14E)的小鼠的对照和受伤腿中足屈强直力的条形图定量。蓝色条代表载体治疗的小鼠，红色条代表SW治疗的小鼠。实心条表示对照腿，而对角线图案表示损伤腿。数据以所有条形图的平均值±均值标准误差表示。dpi：损伤后的天数，veh：载体，DN：去神经支配的，ns：不显著，**P<0.01。

图15A至图15G显示了15-PGDH抑制在老年小鼠中改善、增强和/或恢复NMJ。图15A显示了实验方案。图15B显示了用载体(上图)或SW(下图)治疗的老年小鼠的EDL肌肉中NMJ的代表性共聚焦图像。对整块肌肉组织进行免疫染色以可视化突触前运动神经元(红色)和突触后AChR(绿色)。细胞核用蓝色复染。图15C至图15E显示来自载体治疗的(蓝色，n＝7)和SW治疗的(红色，n＝8)老年小鼠(>26个月)的EDL肌肉的NMJ中的年龄相关异常(图15C：去神经支配，图15D：片段化，图15E：轴突肿胀)的条形图定量。每个条显示平均值±均值标准误差。图15F显示了在年轻(灰色条)、老年载体治疗(蓝色)和老年SW治疗(红色)小鼠中与AChR相关的内/溶酶体囊泡的条形图定量分析。每个数据点代表来自一只小鼠的平均值。图15G显示了年轻和老年的突触后AChR的代表性油浸共聚焦图像，所述AChR用β-蛇毒素(BTX)染色。箭头指示BTX-阳性内/溶酶体囊泡。数据在图15C、图15D、图15E和图15F中表示为平均值±均值标准误差。veh：载体，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001。

图16A至图16D显示了15-PGDH抑制在老年小鼠中是神经元保护的。图16A代表性电子显微照片展示了来自年轻、老年载体治疗和老年SW治疗小鼠趾长伸肌(EDL)纵切片中的高度髓鞘化轴突，描绘了与运动神经元相关的线粒体形态。图16B显示了根据透射电子显微镜(TEM)图像对老化的载体(蓝色)和SW(红色)治疗的小鼠中的线粒体大小的定量(每个条件n＝5只小鼠)。图16C显示了用裂解的caspase-3(绿色)共免疫染色的腰髓腹角中ChAT+神经元(红色)的代表性共聚焦图像。细胞核用Hoechst蓝色复染。图16D显示了图16C所示数据的条形图量化。腰髓腹角中ChAT+细胞的百分比，与裂解的caspase 3共标记。n＝4年轻载体，n＝3老年载体，和n＝4老年SW。

图17A至图17D显示了老年腰髓中15-PGDH活性增加。图17A显示了用Iba1(小胶质细胞，绿色)和ChAT(运动神经元，红色)免疫染色的腰髓腹角的共聚焦图像，来自年轻(上图)和老年(下图)小鼠，显示老年小鼠中活化小胶质细胞形态的发生率增加。图17B至图17C显示了年轻和老年的腰髓中小胶质细胞面积和免疫反应性(平均荧光强度MFI)的定量。数据相对于年轻组平均值进行了归一化。图17D显示了年轻和受伤小鼠的腰髓中的15-PGDH特异性活性的动力学测量(每个n＝4)。

图18显示了老年小鼠中病理NMJ形态学的实例。对年轻和老年的NMJ的油浸共聚焦图像进行免疫染色以可视化突触前运动神经元(红色)和突触后AChR(绿色)。老年NMJ中的运动轴突显示轴突肿胀(星号)，而突触后AChR(绿色)显示片段化迹象(箭头)。

具体实施方式

1.引言

骨骼肌神经肌肉接头(NMJ)是运动神经元轴突和肌肉纤维之间的高度专化的突触。它将信号从中枢神经系统传递到肌肉纤维，以便启动纤维收缩。乙酰胆碱受体(AChR)以极高的密度(每平方微米10,000个分子)聚集在NMJ突触后肌纤维上，介导该信号。不管年龄如何，去神经支配会引起AChR稳定性的降低。然而，在衰老期间，AChR的稳定性降低是由于部分去神经支配和部分衰老的肌肉纤维。在衰老过程中，NMJ的不同区室，包括AChR，经历主要的形态学变化。例如，由于部分肌肉纤维去神经支配和神经源性紊乱，AChR稳定性随年龄而降低。与在年轻小鼠中发现的那些不同，部分去神经支配的老年肌肉纤维表现出片段化的AChR结构，并且还已知去神经支配的上调基因如Trim63在衰老过程中调节肌肉纤维中的AChR降解。

目前还没有改善或增强肌肉质量和再生片段化的神经肌肉接头和/或功能，和/或诱导和/或促进经历肌肉去神经支配的老年肌肉中NMJ的形成的治疗方法。运动和康复是改善骨骼肌神经支配的唯一治疗方法。尽管已经提出肌生长抑制素抑制剂来改善、增强和/或恢复营养不良和肌肉减少性肌肉中的肌肉质量，但是直接肌生长抑制素抑制疗法在数个临床试验中已经失败。本公开表明，抑制15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)可以改善、增强和/或恢复神经肌肉接头(NMJ)的形态和/或功能，和/或诱导和/或促进患有NMJ退化的受试者(例如，在老年肌肉或神经源性肌病中(例如，那些涉及肌肉去神经支配的疾病))的NMJ的形成。本文的公开内容显示15-PGDH基因和蛋白质表达，和酶活性在骨骼肌去神经支配后被上调并持续多达90天，使15-PGDH成为改善、增强和/或恢复经历肌肉去神经支配的受试者的肌肉质量的理想分子靶标，并进一步将该方法与如先前描述的抑制蛋白体功能和/或抑制肌肉生长抑制素信号传导区分开。因此，本文所述的方法可用于改善、增强和/或恢复患有NMJ变性的患者(例如患有神经源性肌病、老年诱发的肌肉质量损失(例如，肌肉减少症)、遗传性神经肌肉萎缩病症(例如，脊髓性肌萎缩(SMA))的患者)的骨骼肌质量和神经肌肉功能。其中包括迪谢内肌营养不良(DMD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS))，或创伤或损伤后等。

2.定义

如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义。

这里使用的术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”或“所述(the)”不仅包括具有一个成员的方面，而且包括具有一个以上成员的方面。例如，单数形式“一个/一种”或“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“所述药剂”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种药剂，等等。

本文所用的术语“约(about)”和“大致(approximately)”通常是指给定测量的性质或精度所测量的量的可接受的误差程度。通常，示例性误差程度在给定值或值范围的百分之20(％)内，优选在10％内，更优选在5％内。任何提及的“约X”特别地表示至少值X、0.8X、0.81X、0.82x、0.83X、0.84X、0.85X、0.86X、0.87X、0.88X、0.89X、0.9X、0.91X、0.92x、0.93X、0.94X、0.95X、0.96X、0.97X，0.98X,0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X、1.06X、1.07X、1.08X、1.09X、1.1X、1.11X、1.12X、1.13X、1.14X、1.15X、1.16X、1.17X、1.18X、1.19X，和1.2X。因此，“约X”旨在教导和提供对例如“0.98X”的权利要求限制的书面描述支持。

“15-PGDH”(15-羟基前列腺素脱氢酶)是参与多种活性前列腺素失活的酶，例如，通过催化PGE2氧化成15-酮基-前列腺素E2(15-酮基-PGE2)，或催化PGD2氧化成15-酮基-前列腺素D2(15-酮基-PGD2)。人类酶由HPGD基因(基因编号：3248)编码。该酶是短链非金属酶醇脱氢酶蛋白家族的成员。存在酶的多种异构体，例如，在人类中，可以使用本发明的方法靶向其中的任一种。例如，任何人同种型1-6(例如GenBank登录号NP_000851.2、NP_001139288.1、NP_001243236.1、NP_001243234.1、NP_001243235.1、NP_001350503.1、NP_001243230.1)都可以被靶向，同样任何与GenBank登录号NP_000851.2、NP_001139288.1、NP_001243236.1、NP_001243234.1、NP_001243235.1、NP_001350503.1、NP_001243230.1或任何其他15-PGDH酶的氨基酸序列具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的异构体也可以被靶向。

“15-PGDH抑制剂”是指能够以任何方式抑制、减少、降低、减弱、消除、排除、减慢或抵消15-PGDH的表达、稳定性或活性的任何方面的任何药剂。15-PGDH抑制剂可例如将编码15-PGDH的基因(例如人类HPGD基因)的表达的任何方面(例如转录、RNA加工、RNA稳定性或翻译)减少，例如，相比于对照，例如，在没有抑制剂的情况下，体外或体内减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。类似地，15-PGDH抑制剂可例如将15-PGDH酶的活性(例如酶活性)减少，例如相比于对照，例如，在没有抑制剂的情况下，体外或体内减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。此外，15-PGDH抑制剂可例如将15-PGDH酶的稳定性与对照相比减少，例如相比于对照，例如，在没有抑制剂的情况下，体外或体内减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。“15-PGDH抑制剂”，在本文中也称为“药剂”或“化合物”，可以是天然存在的或合成的任何分子，例如肽、蛋白质、寡肽(例如，长度为约5个至约25个氨基酸，例如，长度为约5个、10个、15个、20个或25个氨基酸)、小分子(例如，具有小于约2500道尔顿，例如小于2000道尔顿、小于1000道尔顿或小于500道尔顿的分子量的有机分子)、抗体、纳米抗体、多糖、脂质、脂肪酸、抑制性RNA(例如siRNA、shRNA、microRNA)、修饰的RNA、多核苷酸、寡核苷酸，例如反义寡核苷酸、核酸适配体、affimer、药物化合物或其它化合物。

短语“特异性结合”是指与样品中的靶标结合的分子(例如，15-PGDH抑制剂，例如小分子或抗体)比与非靶标化合物结合的分子具有更高的亲和力、更高的活性、更容易和/或更长的持续时间。在一些实施方案中，特异性结合靶标的分子(例如，15-PGDH)以比非靶标化合物高至少2倍的亲和力结合靶标，例如，高至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或更高的亲和力。例如，在一些实施方案中，特异性结合15-PGDH的分子通常以比非15-PGDH靶标高至少2倍的亲和力结合15-PGDH。

在化合物的上下文中，术语“衍生物”包括但不限于给定化合物的酰胺、醚、酯、氨基、羧基、乙酰基和/或醇衍生物。

术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指以下任一项：改善疾病或病症的一种或多种症状；在这些症状发生之前预防它们的表现；减缓或完全预防疾病或病症的进展(如可以明显表现为复发间隔时间较长、减缓或预防症状的恶化等)；增强缓解期的开始；减缓在疾病或病症的进行性-慢性阶段(包括初级和二级阶段)引起的不可逆损伤；延迟所述渐进阶段的开始；或其任何组合。

术语“施用(administer)”、“施用(administering)”或“施用(administration)”是指可用于使药剂或组合物(例如本文所述的化合物)能够递送至期望的生物作用部位的方法。这些方法包括但不限于肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内、动脉内、血管内、心内、鞘内、鼻内、皮内、玻璃体内等)、经粘膜注射、口服施用、作为栓剂施用和局部施用。本领域技术人员将知道用于施用治疗有效量的本文所述的化合物以预防或减轻与疾病或病症相关的一种或多种症状的其它方法。

术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或“有效量”是指足以产生有益或期望的临床效果的化合物(例如，15-PGDH抑制剂)的量。治疗有效量或剂量可以基于每个患者个体的因素，包括但不限于患者的年龄、大小、疾病或病症的类型或程度、疾病或病症的阶段、给药途径、所使用的补充疗法的类型或程度、进行中的疾病过程和所需治疗类型(例如，相对于常规治疗)。如本文所述的药物化合物或组合物的治疗有效量可最初从细胞培养物和动物模型估计。例如，在细胞培养方法中测定的IC50值可用作动物模型的起始点，而在动物模型中测定的IC50值可用于在人中找到治疗有效剂量。

术语“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猿类、人类、农场动物或供人类消费的牲畜，例如猪、牛和绵羊，以及体育运动动物和宠物。受试者还包括脊椎动物，例如鱼和家禽。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述天然核苷酸具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，特定的核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)、等位基因、直系同源基因，SNP和互补序列以及明确指出的序列。在具体的实施方案中，使用修饰的RNA分子，例如，具有某些化学修饰的mRNA，以允许当引入细胞时增加稳定性和/或翻译，如下文更详细描述的。应当理解，本发明方法中使用的任何RNA，包括核酸抑制剂如siRNA或shRNA，可以带有化学修饰以增强例如稳定性和/或效力，例如，如Dar et al.,Scientific Reports6:article no.20031(2016)所述，并且如在crdd.osdd.net/server/sirnamod/处可访问的数据库中所示。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所有三个术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。

3.15-PGDH抑制剂

在本发明的方法中可以使用以任何方式减少、降低、抵消、减弱、抑制、阻断、下调或消除15-PGDH的表达、稳定性或活性(例如酶活性)的任何药剂。抑制剂可以是小分子化合物、肽、多肽、核酸、抗体(例如阻断抗体或纳米抗体)，或以任何方式减少、降低、抵消、减弱、抑制、阻断、下调或消除15-PGDH的表达、稳定性和/或活性(例如15-PGDH的酶活性)的任何其它分子。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂包含小分子化合物、阻断抗体、纳米抗体和肽。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂是SW033291和/或(+)-SW209415，和/或具有15-PGDH抑制活性的噻唑烷二酮类似物(例如，如在“Synthesis and Biological Evaluation ofNovel Thiazolidinedione Analogues as 15-Hydroxyprostaglandin DehydrogenaseInhibitors”,Wu etal.,J.Med.Chem.2011,54,14,5260–5264中描述的任何15-PGDH抑制剂；其关于15-PGDH抑制剂的公开内容以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂选自反义寡核苷酸、microRNA、siRNA或shRNA。

在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性将PGE2水平提高至类似于年轻小鼠的水平。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性增加足底屈曲力。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性促进肌肉质量。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性加速恢复并改善、增强或恢复外周神经损伤后的运动神经元功能。

在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性诱导和/或促进NMJ的形成。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性促进肌肉-神经元连接。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性增加神经元中的线粒体的数目和/或改善神经元中的线粒体形态。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性减少神经损伤中的去神经支配。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性降低神经元中的细胞凋亡标记物，例如裂解的caspase-3。

在一些实施方案中，15-PDGH蛋白和/或活性的抑制改善、增强和/或恢复神经-肌肉连接(NMJ)的形态和/或功能。在一些实施方案中，NMJ的形态的改善包括改善乙酰胆碱受体(AChR)的形态，其被描述为完整的形态并且未被片段化。在一些实施方案中，NMJ的形态的改善包括突触后纤维中AChR稳定性的改善、增强和/或恢复。在一些实施方案中，NMJ的形态的改善包括减少富含AChR的囊泡的数目，例如，内体囊泡和/或溶酶体囊泡。在一些实施方案中，NMJ的形态的改善包括神经元中线粒体的形态的改善、增强和/或恢复。在一些实施方案中，神经元包括运动神经元。在一些实施方案中，使用电子显微镜分析检查NMJ的形态的改善。在一些实施方案中，检查运动神经元的轴突末端以研究NMJ的形态的改善。

在一些实施方案中，15-PDGH蛋白和/或活性的抑制导致在NMJ处的片段化乙酰胆碱受体(AChR)簇的数目减少。在一些实施方案中，15-PDGH蛋白和/或活性的抑制导致缺少运动神经元的存在的NMJ的数目减少。在一些实施方案中，15-PDGH蛋白和/或活性的抑制导致运动神经元轴突的起泡减少。在一些实施方案中，15-PDGH蛋白和/或活性的抑制导致运动神经元的细胞凋亡减少。在一些实施方案中，15-PDGH蛋白和/或活性的抑制导致增强的NMJ形态(例如，如通过互连的AChR形态(例如，蝴蝶脆饼形)在肌纤维上测定的)。在一些实施方案中，15-PDGH蛋白和/或活性的抑制导致NMJ处富含AChR的囊泡的数目减少。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性导致在NMJ处AChR的表达和/或定位增加。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性导致AChR降解减少。在一些实施方案中，15-PDGH蛋白和/或活性的抑制导致AChR稳定性增加。在一些实施方案中，15-PDGH蛋白和/或活性的抑制导致NMJ处运动神经元轴突末端的线粒体形态的改善、增强和/或恢复。在一些实施方案中，15-PDGH蛋白和/或活性的抑制导致NMJ处运动神经元突触末端的改善、增强和/或再生。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性导致受试者的骨骼肌质量和/或神经肌肉功能改善、增强和/或恢复。

在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性减少肌肉萎缩标记物(例如，萎缩基因、泛素连接酶MuRF1(Trim63)和FBXO32(Atrogene-1)以及TGF-β信号传导)的分解代谢调节剂。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性减少自噬和线粒体自噬。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性减少自噬标记物，例如LC3A(Map11c3a)、自噬体标记物p62和泛素，和/或线粒体自噬标记物，例如parkin(Prkn)。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性改善、增强和/或恢复线粒体形态和/或数量。

在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性调节和/或增加和/或减少与肽基-赖氨酸脱乙酰化相关的基因的表达，例如Hdac4、细胞凋亡，例如失巢凋亡，或NMJ发展。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性改善和/或诱导与线粒体活性或氧化磷酸化相关的基因。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性减少与p53信号传导、细胞衰老、FoxO信号传导、TGFβ信号传导和/或自噬相关的基因。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性减少去神经支配标记物NCAM1。在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性增加线粒体膜标记物(例如，电压依赖性阴离子通道(VDAC1)和线粒体糖酵解酶丙酮酸脱氢酶(PDHA1))的表达。

在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性对包含神经元的NMJ细胞、和/或施万细胞、和/或小胶质细胞、和/或肌肉纤维具有间接影响。

在一些实施方案中，抑制15-PDGH蛋白和/或活性改善NMJ处运动神经元突触的异常。

在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂将15-PGDH的活性、稳定性或表达相对于对照水平，例如，在没有抑制剂的情况下，在体内或体外，降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％。至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或更多。

抑制剂的功效可例如通过测量15-PGDH酶活性来评估，例如使用标准方法，例如在15-PGDH酶、NAD(+)和PGE2存在下在适当的反应缓冲液中孵育候选化合物，并监测NADH的产生(参见，例如Zhang et al.,(2015)Science 348:1224)，或通过使用多种可用试剂盒中的任一种，例如荧光PicoProbe 15-PGDH活性测定试剂盒(BioVision)，或通过使用在例如EP2838533 B1中描述的方法和/或指标中的任一种。

抑制剂的功效也可以例如通过检测减少的多核苷酸(例如，mRNA)表达来评估，其可以使用常规技术分析，例如RT-PCR、实时RT-PCR、半定量RT-PCR、定量聚合酶链式反应(qPCR)、定量RT-PCR(qRT-PCR)、多重分支DNA(bDNA)测定、微阵列杂交或序列分析(例如，RNA测序(“RNA-Seq”))。定量多核苷酸表达的方法描述于例如Fassbinder-Orth,Integrative and Comparative Biology,2014,54:396-406；Thellin et al.,Biotechnology Advances,2009,27:323-333；和Zheng et al.,Clinical Chemistry,2006,52:7(doi:10/1373/clinchem.2005.065078)。在一些实施方案中，实时或定量PCR或RT-PCR用于测量生物样品中多核苷酸(例如mRNA)的水平。参见，例如Nolan et al.,Nat.Protoc,2006,1:1559-1582；Wong et al.,BioTechniques,2005,39:75-75。用于测量基因表达的定量PCR和RT-PCR测定也可商购(例如，基因表达测定，ThermoFisherScientific)。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂减少或阻断15-PGDH表达。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂减少或阻断15-PGDH的酶活性。

在一些实施方案中，如果编码15-PGDH的多核苷酸的表达水平与参考值相比(例如，在没有抑制剂的情况下的值，在体外或体内)降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，则认为15-PGDH抑制剂是有效的。在一些实施方案中，如果编码15-PGDH的多核苷酸的表达水平与参考值相比降低至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，至少10倍或更多，则认为15-PGDH抑制剂是有效的。

15-PGDH抑制剂的有效性也可以通过检测蛋白质表达或稳定性来评估，例如使用本领域技术人员已知的常规技术如免疫测定、二维凝胶电泳和定量质谱。蛋白质定量技术通常描述于“Strategies for Protein Quantitation,”Principles of Proteomics,2ndEdition,R.Twyman,ed.,Garland Science,2013。在一些实施方案中，蛋白质表达或稳定性通过免疫测定检测，例如但不限于酶免疫测定(EIA)，例如酶倍增免疫测定技术(EMIT)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、IgM抗体捕获ELISA(MAC ELISA)和微粒酶免疫测定(MEIA)；毛细管电泳免疫测定(CEIA)；放射免疫测定(RIA)；免疫放射测定(IRMA)；免疫荧光(IF)；荧光偏振免疫测定(FPIA)；和化学发光测定(CL)。如果需要，这些免疫测定可以是自动化的。免疫测定也可与激光诱导的荧光结合使用(参见，例如Schmalzing et al.,Electrophoresis,18:2184-93(1997)；Bao,J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.,699:463-80(1997))。

为了确定在15-PGDH抑制剂存在下15-PGDH蛋白水平是否降低，该方法包括将在抑制剂存在下的蛋白(例如15-PGDH蛋白)水平与参考值(例如在没有抑制剂存在下的水平)进行比较。在一些实施方案中，如果15-PGDH蛋白的水平与参考值相比降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，则15-PGDH蛋白在抑制剂存在下降低。在一些实施方案中，如果15-PGDH蛋白的水平与参考值相比降低至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍，至少10倍或更多，则15-PGDH蛋白在抑制剂存在下降低。

小分子

在特定的实施方案中，15-PGDH通过施用小分子抑制剂而被抑制。可以使用任何小分子抑制剂，15-PGDH的表达、稳定性或活性(例如在不存在抑制剂的情况下的表达、稳定性或活性)相对于对照减少例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或更多。在特定的实施方案中，可以使用能够在体外或体内减少15-PGDH的酶活性的小分子抑制剂。可用于本发明方法的小分子化合物的非限制性实例包括EP 2838533 B1中公开的小分子，其全部公开内容通过引用并入本文。小分子尤其可以包括EP 2838533 B1的表2中公开的小分子，即SW033291、SW033291异构体B、SW033291异构体A、SW033292、413423、980653、405320、SW208078、SW208079、SW033290、SW208080、SW208081、SW206976、SW206977、SW206978、SW206979、SW206980、SW206992、SW208064、SW208065、SW208066、SW208067、SW208068、SW208069、SW208070及其组合、衍生物、异构体或互变异构体。在具体的实施方案中，使用的15-PGDH抑制剂是SW033291(2-(丁基亚磺酰基)-4-苯基-6-(噻吩-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-3-胺；PubChem CID：3337839)。

在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂是噻唑烷二酮衍生物(例如，亚苄基噻唑烷-2,4-二酮衍生物)，例如(5-(4-(2-(噻吩-2-基)乙氧基)亚苄基)噻唑烷-2,4-二酮)、5-(3-氯-4-苯基乙氧基亚苄基)噻唑烷-2,4-二酮、5-(4-(2-环己基乙氧基)亚苄基)噻唑烷-2,4-二酮、5-(3-氯-4-(2-环己基乙氧基)苄基)噻唑烷-2,4-二酮、(Z)-N-苄基-4-((2,4-二氧代噻唑烷-5-亚基)甲基)苯甲酰胺，或Choi et al.(2013)Bioorganic&Medicinal Chemistry21:4477-4484；Wu et al.(2010)Bioorg.Med.Chem.18(2010)1428-1433；Wu et al.(2011)J Med.Chem.54:5260-5264；或Yu et al.(2019)Biotechnology and BioprocessEngineering 24:464-475中公开的任何化合物，其全部公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂是COX抑制剂或化学预防药剂，例如环格列酮(CID：2750)，或Cho et al.(2002)Prostaglandins.Leukotnenes and Essential Fatty Acids 67(6):461-465中公开的任何化合物，其全部公开内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂是含有苯并咪唑基团的化合物，例如(1-(4-甲氧基苯基)-1H-苯并[d]咪唑-5-基)(哌啶-1-基)甲酮(CID：3474778)，或含有三唑基团的化合物，例如3-(2,5-二甲基-1-(对甲苯基)-1H-吡咯-3-基)-6,7,8,9-四氢-5H-[1,2,4]三唑并[4,3-a]-氮杂卓(CID：71307851)，或Duveau et al.(2015)(“Discovery of two smallmolecule inhibitors,ML387 and ML388,of human NAD+-dependent15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase”，发表于来自NIH分子文库计划的探针报告[网络])中公开的任何化合物，其全部公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂是1-(3-甲基苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)(哌啶-1-基)甲酮(CID：4249877)或Niesen et al.(2010)PLoS ONE 5(11):e13719中公开的任何化合物，其全部公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂为2-((6-溴-4H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基硫基)甲基)苄腈(CID：3245059)、哌啶-1-基(1-间甲苯基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)甲酮(CID：3243760)或3-(2，5-二甲基-1-苯基-1H-吡咯-3-基)-6,7,8,9-四氢-5H-[1,2,4]三唑并[4,3-a]氮杂卓(CID：2331284)，或Jadhav et al.(2011)(“Potent and selectiveinhibitors of NAD+-dependent 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase(HPGD)”，发表于来自NIH分子文库计划的探针报告[网络])中公开的任何化合物，其全部公开内容以引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂是TD88或Seo et al.(2015)Prostaglandins.Leukotrienes and Essential Fatty Acids 97:35-41，或Shao et al.(2015)Genes&Diseases 2(4):295-298公开的任何化合物，其全部公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂是EEAH(菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)的乙醇提取物)或Karna(2017)Pharmacogn Mag.2017Jan；13(Suppl 1):S122-S126中公开的任何化合物，其全部公开内容通过引用并入本文。

抑制性核酸

在一些实施方案中，药剂包含抑制性核酸，例如反义DNA或RNA、小干扰RNA(siRNA)、microRNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)。在一些实施方案中，抑制性RNA靶向的序列与15-PGDH多核苷酸中的靶向序列相同或基本上相同(例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％同一)(例如包含至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、或至少100个连续核苷酸，例如20个至500个、20个至250个、20个至100个、50个至500个或50个至250个连续核苷酸的15-PGDH编码多核苷酸序列(例如，人HPGD基因，基因编号：3248，包括其任何转录物变体，例如，如在GenBank登录号中列出的：NM_000860.6、NM_001145816.2、NM_001256301.1、NM_001256305.1、NM_001256306.1、NM_001256307.1或NM_001363574.1)。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括使用shRNA或siRNA治疗受试者，例如患有神经源性肌病、老年诱导的肌肉质量损失、遗传性神经肌肉萎缩病症或肌肉创伤或肌肉损伤的受试者。shRNA是具有发夹弯的人工RNA分子，其可用于通过其在细胞中产生的siRNA来沉默靶基因表达。参见，例如Fire et al.,Nature 391:806-811,1998；Elbashir etal.,Nature 411:494-498,2001；Chakraborty et al.,Mol Ther Nucleic Acids 8:132-143,2017；以及Bouard et al.,Br.J.Pharmacol.157:153-165,2009。在一些实施方案中，治疗受试者(例如，患有神经源性肌病、老年诱导的肌肉质量损失、遗传性神经肌肉萎缩病症或肌肉创伤或肌肉损伤)的方法包括向受试者施用治疗有效量的经修饰的RNA或载体，所述经修饰的RNA或载体包含编码能够与15-PGDH mRNA的一部分杂交的shRNA或siRNA的多核苷酸(例如，在任一GenBank登录号中列出的人15-PGDH编码多核苷酸序列的一部分：NM_000860.6、NM_001145816.2、NM_001256301.1、NM_001256305.1、NM_001256306.1、NM_001256307.1或NM_001363574.1)。在一些实施方案中，载体还包括本领域已知的适当表达控制元件，包括例如启动子(例如诱导型启动子或组织特异性启动子)、增强子和转录终止子。

在一些实施方案中，药剂是15-PGDH特异性micorRNA(miRNA或miR)。micorRNA是一种小的非编码RNA分子，其在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用。miRNA与mRNA转录本内的互补序列碱基配对。结果，mRNA转录本可以通过一种或多种机制被沉默，例如mRNA链的切割，通过缩短其poly(A)尾而使mRNA去稳定，以及通过核糖体将mRNA转录本翻译成蛋白质的效率降低。

在一些实施方案中，药剂可以是反义寡核苷酸，例如RNA酶H依赖性反义寡核苷酸(ASO)。ASO是单链的、化学修饰的寡核苷酸，其结合靶mRNA中的互补序列并通过RNA酶H介导的靶RNA的切割和通过核糖体的空间阻断抑制翻译来降低基因表达。在一些实施方案中，寡核苷酸能够与15-PGDH mRNA的一部分(例如，任一GenBank登录号中列出的编码人15-PGDH的多核苷酸序列的一部分：NM_000860.6、NM_001145816.2、NM_001256301.1、NM_00l256305.1、NM_001256306.1、NM_001256307.1或NM_001363574.1)。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度约为10个至30个核苷酸(例如，10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个、24个、26个、28个或30个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸与其结合的mRNA转录物的部分具有100％的互补性。在其它实施方案中，DNA寡核苷酸与其结合的mRNA转录本的部分具有小于100％的互补性(例如，95％、90％、85％、80％、75％或70％互补性)，但仍可形成稳定的RNA:DNA双链体，用于RNA酶H切割mRNA转录物。

合适的反义分子、siRNA、miRNA和shRNA可以通过寡核苷酸合成的标准方法生产，或通过向合同研究组织或供应商提供被靶向的多核苷酸序列来订购这些分子。这些通用术语的反义分子的制备和部署可以使用在当代参考文献中描述的标准技术来完成：例如，N.S.Templeton的Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,4^thedition；J.Laurence和M.Franklin的Translating Gene Therapy to the Clinic:Techniques and Approaches,1^st edition；D.O.Azorsa和S.Arora的High-ThroughputRNAi Screening:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)；以及N.Ferrari和R.Segui的Oligonucleotide-Based Drugs and Therapeutics:Preclinicaland Clinical Considerations。

抑制性核酸还可以包括RNA适配体，其是与蛋白质结合的短的合成的寡核苷酸序列(参见，例如，Li et al.,Nuc.Acids Res.(2006),34:6416-24)。它们以对靶分子的高亲和力和特异性著称，并且具有比抗体小(通常小于6kD)的额外优势。具有所期望的特异性的RNA适配体通常选自组合文库，并且可以使用本领域已知的方法进行修饰以减少对核糖核酸酶的易损性。

抗体

在一些实施方案中，药剂是抗15-PGDH抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体是阻断抗体(例如，与靶结合并直接干扰靶功能(例如，15-PGDH酶活性)的抗体)。在一些实施方案中，抗体是中和抗体(例如，与靶结合并消除靶的下游细胞效应的抗体)。在一些实施方案中，抗体结合人15-PGDH。

在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗体是抗原结合片段，例如F(ab')₂、Fab'、Fab、scFv等。术语“抗体或抗原结合片段”也可包括具有双重或多重抗原或表位特异性的多特异性和杂合抗体。

在一些实施方案中，抗15-PGDH抗体包含本文公开的抗体序列的重链序列或其部分，和/或轻链序列或其部分。在一些实施方案中，抗15-PGDH抗体包含本文公开的抗15-PGDH抗体的一个或多个互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，抗15-PGDH抗体是是纳米抗体或单结构域抗体(sdAb)，包括单个单体可变抗体结构域，例如单个VHH结构域。

为了制备结合15-PGDH的抗体，可以使用本领域已知的许多技术。参见，例如，Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor et al.,Immunology Today 4:72(1983)；Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985)Cole etal.,pp77-96；Coligan,Current protocols in immunology(1991)；Harlow&Lane，Antibodies,A Laboratory Manual(1988)；以及Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2nd ed.1986))。在一些实施方案中，通过用抗原免疫动物(例如小鼠、兔或大鼠)以诱导抗体应答来制备抗体。在一些实施方案中，抗原与佐剂(例如弗氏佐剂)缀合施用。在一些实施方案中，在初次免疫后，可给予一次或多次随后的加强注射的抗原以提高抗体产生。免疫后，收集抗原特异性B细胞，例如从脾和/或淋巴组织。为了产生单克隆抗体，将B细胞与骨髓瘤细胞融合，随后筛选骨髓瘤细胞的抗原特异性。

编码目的抗体的重链和轻链的基因可以从细胞中克隆，例如，编码单克隆抗体的基因可以从杂交瘤中克隆并用于产生重组单克隆抗体。编码单克隆抗体重链和轻链的基因文库也可以由杂交瘤或浆细胞制备。另外，噬菌体或酵母展示技术可用于识别特异性结合所选抗原的抗体和异质性Fab片段(参见，例如，McCafferty et al.,Nature348:552-554(1990)；Marks et al.,Biotechnology 10:779-783(1992)；Lou et al.,PEDS23:311(2010)；以及Chao et al.,Nature Protocols 1:755-768(2006))。或者，可使用基于酵母的抗体呈递系统分离和/或识别抗体和抗体序列，例如Xu et al.,Protein Eng Des Sel,2013,26:663-670；WO2009/036379；WO2010/105256；以及WO2012/009568所公开的。重链和轻链基因产物的随机组合产生具有不同抗原特异性的大量抗体池(参见，例如，Kuby,Immunology(第三版1997))。用于生产单链抗体或重组抗体的技术(美国专利号4,946,778，美国专利号4,816,567)也适于产生抗体。

抗体可以使用任何数量的表达系统产生，包括原核和真核表达系统。在一些实施方案中，表达系统是哺乳动物细胞，例如杂交瘤，或CHO细胞。许多这样的系统可广泛地从商业供应商获得。在抗体包括VH区域和VL区域的实施方案中，VH区域和VL区域可以使用单一载体表达，例如在双顺反子表达单元中，或在不同启动子的控制下。在其它实施方案中，VH区域和VL区域可以使用单独的载体表达。

在一些实施方案中，抗15-PGDH抗体包括一个或多个亲合性成熟的CDR、重链和/或轻链序列。对于嵌合抗体，制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。例如，可以制备嵌合抗体，其中来自一种物种如小鼠的抗原结合区域(重链可变区和轻链可变区)与另一种物种如人的效应区(恒定区)融合。作为另一个实例，可以制备“类别转换”嵌合抗体，其中抗体的效应区被不同免疫球蛋白类别或亚类的效应区取代。

在一些实施方案中，抗15-PGDH抗体包括一个或多个人源化的CDR、重链和/或轻链序列。对于人源化抗体，制备人源化抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号8,095,890。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。作为人源化的替代方法，可以产生人抗体。作为非限制性实例，可以产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫后能够在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完全所有组成成分。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。在这样的种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致抗原攻击后产生人抗体。参见，例如，Jakobovits et al.,Proc.Natl.ACad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362：255-258(1993)；Bruggermann et al.,Year inImmun,7:33(1993)；以及美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807。

在一些实施方案中，产生抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、纳米抗体或双特异抗体)。已经开发了各种技术用于生产抗体片段，例如完整抗体的蛋白水解消化(参见，例如，Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Meth.,24:107-117(1992)；以及Brennan etal.,Science,229:81(1985))和使用重组宿主细胞生产片段。例如，可以从抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可以直接从大肠杆菌细胞中回收Fab'-SH片段，并化学偶联以形成F(ab')₂片段(参见，例如，Carter et al.,BioTechnology,10:163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab')₂片段可以直接从重组宿主细胞培养物中分离。用于产生抗体片段的其它技术对本领域技术人员来说是显而易见的。

测定结合亲和力和结合动力学的方法是本领域已知的。这些方法包括但不限于固相结合测定(例如ELISA测定)、免疫沉淀、表面等离子体共振(例如Biacore^TM(GE医疗，皮斯卡塔韦，新泽西州))、动力学排除测定(例如KinExA)、流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、生物层干涉测量(例如，Octet^TM(FortéBio,Inc.，门洛帕克，加利福尼亚州))，和蛋白质印迹分析。

肽

在一些实施方案中，药剂是肽，例如，结合和/或15-PGDH抑制的酶活性或稳定性的肽。在一些实施方案中，药剂是肽适配体。肽适配体是被选择或工程化以结合特定靶分子的人工蛋白。通常，肽包括一个或多个由蛋白质支架展示的可变序列的肽环。肽适配体的选择可以使用不同的系统进行，包括酵母双杂交系统。肽适配体也可以从通过噬菌体展示和其他表面展示技术(例如mRNA展示、核糖体展示、细菌展示和酵母展示)构建的组合肽文库中选择。参见，例如，Reverdatto et al.,2015,Curr.Top.Med.Chem.15:1082-1101。

在一些实施方案中，所述药剂是affimer。Affimer是小的、高度稳定的蛋白质，通常具有约12kDa至14kDa的分子量，其以与抗体相似的特异性和亲和力结合它们的靶分子。通常，affimer显示两个肽环和一个N-末端序列，它们可以以与单克隆抗体相似的方式随机结合不同的高亲和力和特异性的靶蛋白。通过蛋白质支架稳定两个肽环限制了肽可能具有的可能构象，与游离肽的文库相比，这增加了结合亲和力和特异性。在本领域中描述了affimer和制备affimer的方法。参见，例如，TIEDE et al.,eLife,2017,6:e24903。Affimer也是可商购的，例如来自Avacta Life Sciences。

载体和修饰RNA

在一些实施方案中，使用合适的载体将提供15-PGDH抑制活性的多核苷酸(例如核酸抑制剂如siRNA或shRNA，或编码15-PGDH抑制的多肽的多核苷酸)引入细胞，例如组织细胞。可用于本公开的递送载体的实例是病毒载体、质粒、外泌体、脂质体、细菌载体或纳米颗粒。在一些实施方案中，使用载体(如病毒载体)将本文所述的15-PGDH抑制剂(例如核酸抑制剂或编码多肽抑制剂的多核苷酸)中的任一种引入细胞，例如组织细胞。合适的病毒载体包括但不限于腺病毒相关病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂(例如核酸抑制剂或编码多肽抑制剂的多核苷酸)以表达盒的形式提供，通常重组产生，具有与编码抑制剂的多核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些情况下，启动子是在所有或大多数组织类型中指导基因表达的通用启动子；在其它情况下，启动子是在被靶向的组织的细胞中特异性地指导基因表达的启动子。

在一些实施方案中，使用经修饰的RNA将15-PGDH的核酸或蛋白质抑制剂引入受试者，例如引入受试者的组织。本领域已知RNA的各种修饰在引入受试者细胞时增强例如RNA(例如编码15-PGDH多肽抑制剂的shRNA或mRNA)的翻译、效力和/或稳定性。在特定的实施方案中，使用修饰的mRNA(mmRNA)，例如编码15-PGDH的多肽抑制剂的mmRNA。在其它实施方案中，使用包括15-PGDH表达的RNA抑制剂的修饰的RNA，例如siRNA、shRNA或miRNA。可以使用的RNA修饰的非限制性实例包括抗反向帽类似物(ARCA)(例如长度为100个至250个核苷酸的polyA尾)用来自已知的稳定mRNA的序列替换3'UTR中的富含AU的序列，以及包括修饰的核苷和结构，例如假尿苷，例如N1-甲基假尿苷、2-硫苷、4'-硫代RNA、5-甲基胞苷、6-甲基腺苷、酰胺3键、硫酸酯键、肌苷、2'-脱氧核糖核苷酸、5-溴-尿苷和2'-O-甲基化核苷。可以使用的化学修饰的非限制性列表可以在例如在线数据库crdd.osdd.net/server/sirnamod/中找到。可使用任何已知的方法将RNA引入体内细胞，所述方法尤其包括物理干扰、通过阳离子载体产生RNA胞吞作用、电穿孔、基因枪、超声、纳米颗粒、缀合物或高压注射。修饰的RNA也可以通过直接注射引入，例如在柠檬酸盐缓冲盐水中。还可以使用自组装的阳离子脂质体或多聚体递送RNA，所述脂复合物或多聚复合物是通过带负电荷的RNA和阳离子脂质或聚合物(例如阳离子脂质体、多聚体、聚阳离子和树枝状聚合物)之间的电荷相互作用自发产生的。也可以使用聚合物，例如聚-L-赖氨酸、聚酰胺胺和聚乙烯亚胺、脱乙酰壳多糖和聚(β-氨基酯)。参见，例如，Youn et al.(2015)Expert Opin Biol Ther,Sep 2；15(9):1337-1348；Kaczmarek et al.(2017)Genome Medicine 9:60；Gan et al.(2019)Naturecomm.10:871；Chien et al.(2015)Cold Spring Harb Perspect Med.2015；5：a014035；其中每一个的全部公开内容通过引用结合到本文中。

4.施用方法

在一个方面，本公开提供了在患有NMJ退化的受试者中改善、增强和/或恢复神经肌肉接头(NMJ)形态和/或功能，和/或诱导和/或促进NMJ形成的方法，该方法包括：向受试者施用有效抑制受试者中的15-PGDH活性和/或降低受试者中的15-PGDH水平的量的15-PGDH抑制剂，从而改善、增强和/或恢复受试者的NMJ形态和/或功能，和/或诱导和/或促进NMJ的形成。在一些实施方案中，方法导致突触前运动神经元和突触后AChR并置和/或连通性增加。在一些实施方案中，方法导致在NMJ处的片段化乙酰胆碱受体(AChR)簇的数目减少。在一些实施方案中，方法导致缺乏运动神经元的数目减少。在一些实施方案中，方法导致运动神经元轴突的起泡减少。在一些实施方案中，方法导致运动神经元的细胞凋亡减少。在一些实施方案中，方法导致增强的NMJ形态，和/或增强的神经信号对肌肉的功能传导。在一些实施方案中，方法导致在NMJ处富含AChR的囊泡的数目减少。在一些实施方案中，方法导致AChR在NMJ处的表达和/或定位增加。在一些实施方案中，方法导致AChR降解减少。在一些实施方案中，方法导致AChR稳定性增加。在一些实施方案中，方法导致NMJ处运动神经元轴突末端的线粒体形态改善、增强和/或恢复。在一些实施方案中，方法导致NMJ处运动神经元突触末端的改善、增强和/或恢复。在一些实施方案中，方法导致受试者中骨骼肌质量和/或神经肌肉功能的改善、增强和/或恢复。

本文所述的化合物可在受试者中局部施用或系统施用。在一些实施方案中，化合物可例如通过腹膜内、肌内、动脉内、口服、静脉内、颅内、鞘内、脊柱内、病灶内、鼻内、皮下、脑室内、局部和/或吸入施用。在一个实例中，化合物例如通过肌内注射施用。在一些实施方案中，施用包括系统施用或局部施用。

在一些实施方案中，化合物根据急性方案施用。在某些情况下，将化合物施用于受试者一次。在其它情况下，化合物在一个时间点施用，并在第二个时间点再次施用。在其它情况下，在短时间内(例如，2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、1个月或更长)以间歇剂量将化合物重复(例如，每天一次或两次)施用于受试者。在一些情况下，化合物施用之间的时间为约1天、2天、3天、4天、5天、6天、一周、2周、3周、4周、一个月或更长。在其它实施方案中，化合物在期望的时间段内根据慢性方案连续或长期施用。例如，可以施用化合物，使得化合物的量或水平在选定的时间段内基本上恒定。

在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂施用至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少31天、至少32天、至少33天、至少34天、至少35天、至少36天、至少37天、至少38天、至少39天、至少40天、至少41天、至少42天、至少43天、至少44天、至少45天、至少46天、至少47天、至少48天、至少49天、至少50天、至少51天、至少52天、至少53天、至少54天、至少55天、至少56天、至少57天、至少58天、至少59天、至少60天或至少61天。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂施用至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月、至少15个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少19个月、至少20个月、至少21个月、至少22个月、至少23个月、至少24个月或至少25个月。

在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂施用约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天、约31天、约32天、约33天、约34天、约35天、约36天、约37天、约38天、约39天、约40天、约41天、约42天、约43天、约44天、约45天、约46天、约47天、约48天、约49天、约50天、约51天、约52天、约53天、约54天、约55天、约56天、约57天、约58天、约59天、约60天，或约61天。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂施用约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月、约21个月、约22个月、约23个月、约24个月或约25个月。

在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂施用至多10天、至多11天、至多12天、至多13天、至多14天、至多15天、至多16天、至多17天、至多18天、至多19天、至多20天、至多21天、至多22天、至多23天、至多24天、至多25天、至多26天、至多27天、最多28天、最多29天、最多30天、最多31天、最多32天、最多33天、最多34天、最多35天、最多36天、最多37天、最多38天、最多39天、最多40天、最多41天、最多42天、最多43天、最多44天、最多45天、最多46天、最多47天、最多48天、最多49天、最多50天、最多51天、最多52天、最多53天、最多54天、最多55天、最多56天、最多57天、最多58天、最多59天、最多60天或最多61天。在一些实施方案中，15-PGDH抑制剂施用至多1个月、至多2个月、至多3个月、至多4个月、至多5个月、至多6个月、至多7个月、至多8个月、至多9个月、至多10个月、至多11个月、至多12个月、至多13个月、至多14个月、至多15个月、至多16个月、至多17个月、至多18个月、至多19个月、至多20个月、至多21个月、至多22个月、至多23个月、至多24个月或至多25个月。

可以通过本领域中常用的方法将化合物施用于受试者。引入的化合物的量可以考虑诸如性别，年龄，体重，疾病或病症的类型、病症的阶段和产生预期结果所需的量的因素。通常，为了施用用于治疗目的的化合物，以药理学有效剂量给予细胞。“药理学有效量”或“药理学有效剂量”是足以产生期望的生理效果或能够实现期望的结果的量，特别是用于治疗病症或疾病，包括减轻或消除病症或疾病的一种或多种症状或表现的量。

本文所述的化合物可以通过注射到被靶向的组织中或通过在被靶向的组织附近施用而局部施用。

在一些实施方案中，方法独立于肌肉干细胞增殖。在一些实施方案中，方法不涉及抑制肌生长抑制素。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括向患有NMJ退化(例如，由于肌肉去神经支配)的受试者施用有效抑制受试者中的15-PGDH活性和/或降低受试者中的15-PGDH水平的量的15-PGDH抑制剂。在一些实施方案中，方法导致改善的、增强的和/或再生的NMJ形态和/或功能。在一些实施例中，方法导致新NMJ的数目增加。在一些实施方案中，方法导致诱导和/或促进NMJ的形成。在一些实施方案中，方法导致突触前运动神经元和突触后AChR并置和/或连接性增加(例如，如通过存在神经丝和突触囊泡(分别为突触前运动神经元轴突和突触的标记)以及通过银环蛇毒素(BTX)绑定到肌纤维突触后肌膜上的AChR上的特征“蝴蝶脆饼”形态确定)。在一些实施方案中，方法导致在NMJ处的片段化乙酰胆碱受体(AChR)簇的数目减少。在一些实施方案中，方法导致缺乏运动神经元的存在的NMJ的数目减少。在一些实施方案中，方法导致运动神经元轴突的起泡减少。在一些实施方案中，方法导致运动神经元的细胞凋亡减少。在一些实施方案中，方法导致NMJ形态增强(例如，如通过在肌肉纤维上的互连的AChR形态(例如，蝴蝶脆饼形)所确定的)。在一些实施方案中，方法导致在NMJ处富含AChR的囊泡的数目减少。在一些实施方案中，方法导致在NMJ处AChR的表达和/或定位增加。在一些实施方案中，方法导致AChR降解减少。在一些实施方案中，方法导致AChR稳定性增加。在一些实施方案中，方法导致NMJ处运动神经元轴突末端的线粒体形态改善、增强和/或恢复。在一些实施方案中，方法导致NMJ处运动神经元突触末端的改善、增强和/或恢复。在一些实施方案中，方法导致受试者中骨骼肌质量和/或神经肌肉功能的改善、增强和/或恢复。

在一些实施方案中，本文所述的方法可用于组合治疗。在一些实施方案中，组合治疗包括施用有效抑制受试者中的15-PGDH活性和/或降低受试者中的15-PGDH水平的量的15-PGDH抑制剂与用于治疗脊髓性肌萎缩(SMA)的药剂的组合，例如，onasemnogeneabeparvovec(例如，)、利司扑兰(例如，)，或诺西那生钠(例如，)。在一些实施方案中，组合治疗包括施用有效抑制受试者中的15-PGDH活性和/或降低受试者中的15-PGDH水平的量的15-PGDH抑制剂与用于治疗迪谢内肌营养不良(DMD)的药剂(例如泼尼松、地夫可特或替普利森)的组合。

5.受试者

在一个方面，本公开提供了在患有NMJ的退化的受试者中改善、增强和/或恢复神经肌肉接头(NMJ)形态和/或功能，和/或诱导和/或促进NMJ的形成的方法。在一些实施方案中，受试者患有肌肉去神经支配和/或部分去神经支配。在一些实施方案中，受试者患有神经源性肌病、老年诱发的肌肉质量损失、遗传性神经肌肉萎缩病症、神经创伤或损伤、肌肉创伤或肌肉损伤或其任何组合。在一些实施方案中，遗传性神经肌肉萎缩病症是脊髓性肌萎缩(SMA)、迪谢内肌营养不良(DMD)或肌萎缩性侧索硬化(ALS)。

在一些实施方案中，受试者患有或已经经历选自以下的一种或多种症状：急性外周神经损伤、肌肉废用、具有神经源性和自身免疫性的涉及靶纤维或管状聚集体形成的肌病，和血管性肌病。在一些实施方案中，急性外周神经损伤选自：挫伤性损伤、压迫性减压损伤、神经切断、肉毒杆菌毒性、由于腱切断术引起的损伤和/或运动损伤。在一些实施方案中，压迫性减压损伤选自：水肿、腕管综合征、贝克囊肿，以及重复任务损伤。在一些实施例中，肌肉废用选自：骨折后的固定、长期卧床休息、手术后的恢复、呼吸机的恢复(例如，由于来自肺炎的严重肺并发症、严重COVID-19而使用呼吸机)、太空飞行，以及久坐的生活方式。

在一些实施方案中，具有神经源性和自身免疫性的涉及靶纤维或管状聚集体形成的肌病选自：迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、中央轴空病、远端运动轴索神经病变、多灶性运动神经病、肌萎缩侧索硬化症、进行性脊肌萎缩症、多发性硬化、共济失调、强直性肌营养不良、神经源性淀粉样变性、近端管状聚集性肌病、类风湿性关节炎、干燥综合征，以及重症肌无力。

在一些实施方案中，重症肌无力选自：先天性重症肌无力、偶发性重症肌无力，以及Lambert-Eaton肌无力综合征。

在一些实施方案中，受试者是人类受试者。在各种实施方案中，人类受试者是男性人类。在一些实施方案中，人类受试者是女性人类。在一些方面，人类受试者被鉴定为男人、女人或非二元性别。在一些实施方案中，人类受试者小于60岁。在一些实施方案中，人类受试者小于50岁。在一些实施方案中，人类受试者小于40岁。在一些实施方案中，人类受试者小于30岁。在各种实施方案中，人类受试者是约17岁至约60岁。在一些实施方案中，人类受试者是约17岁至约50岁。在一些实施方案中，人类受试者是约17岁至约40岁。在一些实施方案中，人类受试者是约17岁至约30岁。在各种实施方案中，人类受试者为约18岁至约60岁。在一些实施方案中，人类受试者为约18岁至约50岁。在一些实施方案中，人类受试者为约18岁至约40岁。在一些实施方案中，人类受试者为约18岁至约30岁。在各种实施方案中，人类受试者为至少15岁。在一些实施方案中，人类受试者为至少17岁。在一些实施方案中，人类受试者为至少18岁。在一些实施方案中，人类受试者为至少20岁。在一些实施方案中，人类受试者为至少25岁。

在一些实施方案中，受试者小于10岁、小于11岁、小于12岁、小于13岁、小于14岁、小于15岁、小于16岁、小于17岁、小于18岁、小于19岁、小于20岁、小于21岁、小于22岁、小于23岁、小于24岁、小于25岁、小于26岁、小于27岁、小于28岁、小于29岁、小于30岁、小于31岁、小于32岁、小于33岁、小于34岁、小于35岁、小于36岁、小于37岁、小于38岁、小于39岁、小于40岁、小于41岁、小于42岁、小于43岁、小于44岁、小于45岁、小于46岁、小于47岁、小于48岁、小于49岁、小于50岁、小于51岁、小于52岁、小于53岁、小于54岁、小于55岁、小于56岁、小于57岁、小于58岁、小于59岁，或小于60岁。在一些实施方案中，受试者小于30岁。

在一些实施方案中，至少10岁、至少11岁、至少12岁、至少13岁、至少14岁、至少15岁、至少16岁、至少17岁、至少18岁、至少19岁、至少20岁、至少21岁、至少22岁、至少23岁、至少24岁、至少25岁、至少26岁、至少27岁、至少28岁、至少29岁、至少30岁、至少31岁、至少32岁、至少33岁、至少34岁、至少35岁、至少36岁、至少37岁、至少38岁、至少39岁、至少40岁、至少41岁、至少42岁、至少43岁、至少44岁、至少45岁、至少46岁、至少47岁、至少48岁、至少49岁、至少50岁，至少51岁、至少52岁、至少53岁、至少54岁、至少55岁、至少56岁、至少57岁、至少58岁、至少59岁或至少60岁。在一些实施方案中，受试者为至少30岁。

6.药物组合物

本文所述的化合物的药物组合物可以包括药学上可接受的载体。在某些方面，药学上可接受的载体部分地由所施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法决定。因此，存在本文所述的药物组合物的多种合适的制剂(参见，例如，REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES,18TH ED.,Mack Publishing Co.,Easton，PA(1990))。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括本领域普通技术人员已知的配制药物组合物的任何标准药学上可接受的载体。因此，化合物本身(例如作为药学上可接受的盐或作为缀合物存在)可以制备成药学上可接受的稀释剂中的制剂；例如，盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇水溶液，或葡萄糖、甘露糖醇、右旋糖酐、丙二醇、油(例如植物油、动物油、合成油等)、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸钙、明胶、聚山梨醇酯80等的溶液，或作为在适当赋形剂中的固体制剂。

药物组合物通常进一步包括一种或多种适当的缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白质、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚等)、抑菌剂、螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽，使制剂与接受者的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质)、助悬剂、增稠剂、防腐剂、调味剂、甜味剂和着色化合物。

本文所述的药物组合物以与剂量制剂相容的方式以治疗有效的量施用。待施用的量取决于多种因素，包括例如个体的年龄、体重、身体活动和饮食、待治疗的病症或疾病以及病症或疾病的阶段或严重程度。在某些实施方案中，剂量的大小还可以通过伴随在特定个体中施用治疗剂的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。

然而，应当理解，用于任何特定患者的具体剂量水平和剂量频率可以变化，并且可以取决于多种因素，包括所使用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、遗传特性、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合、具体病症的严重程度和接受治疗的宿主。

在某些实施方案中，化合物的剂量可以采取固体、半固体、冻干粉末或液体剂型的形式，例如片剂、丸剂、颗粒、胶囊、粉末、溶液、混悬剂、乳液、栓剂、保留灌肠剂、霜剂、软膏、洗剂、凝胶、气雾剂、泡沫等，优选为适于简单施用精确剂量的单位剂型。

如本文所用，术语“单位剂型”是指适合作为用于人类和其它哺乳动物的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算以产生所需起效、耐受性和/或治疗效果的预定量的治疗剂，与合适的药物赋形剂(例如，安瓿)相结合。此外，可以制备更浓缩的剂型，然后可以由此制备更稀的单位剂型。因此，更浓缩的剂型将基本上包含超过例如治疗化合物的量的至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍的量。

制备这种剂型的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)。剂型典型地包括常规的药物载体或赋形剂，并且可以另外包括其它药剂、载体、佐剂、稀释剂、组织渗透增强剂、增溶剂等。合适的赋形剂可以通过本领域熟知的方法(参见，例如，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)调整为特定剂型和施用途径。

合适的赋形剂的实例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚丙烯酸如Carbopol，例如Carbopol 941、Carbopol 980、Carbopol 981等。剂型可以另外包括润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，例如甲基-羟基-苯甲酸酯、乙基-羟基-苯甲酸酯和丙基-羟基-苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸酯)；pH调节剂(例如无机酸和有机酸以及碱)；甜味剂；和调味剂。剂型还可以包括可生物降解的聚合物微珠、葡聚糖和环糊精包合复合物。

对于口服给药，治疗有效剂量可以是片剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂、溶液、糖浆、喷雾剂、含片、散剂和缓释制剂的形式。用于口服施用的合适赋形剂包括药品级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。

治疗有效剂量也可以冻干形式提供。这样的剂型可以包括用于在施用之前重构的缓冲剂，例如碳酸氢盐，或者缓冲剂可以包括在冻干剂型中用于与例如水重新配制。冻干剂型进一步可以包括合适的血管收缩剂，例如肾上腺素。冻干剂型可以在注射器中提供，任选地与用于重构的缓冲剂组合包装，使得重构剂型可以立即施用于个体。

在一些实施方案中，可以向受试者共同施用另外的化合物或药物。这样的化合物或药物可以共同施用以减轻所治疗疾病的体征或症状，减少由免疫应答的诱导引起的副作用等。

7.试剂盒

本文所述的组合物的其它实施方案是包含15-PGDH抑制剂的试剂盒。试剂盒通常包含容器，其可以由多种材料(例如玻璃或塑料)形成，并且可以包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。试剂盒通常附有标签，并且包括任何书写或记录的材料，其可以是电子或计算机可读形式，提供使用试剂盒内容物的说明或其它信息。

在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种用于改善、增强和/或恢复神经肌肉接头形态和/或功能，和/或诱导和/或促进患有NMJ退化的受试者中NMJ的形成的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种用于治疗神经源性肌病、老年诱导的肌肉质量损失、遗传性神经肌肉萎缩病症和/或肌肉创伤或肌肉损伤的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含拮抗15-PGDH的表达或活性的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含抑制性核酸(例如，反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、microRNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA))或编码15-PGDH抑制多肽的多核苷酸，其抑制或15-PGDH抑制mRNA或蛋白质表达或活性，例如酶活性。在一些实施方案中，试剂盒包含修饰的RNA，例如修饰的shRNA或siRNA，或编码多肽15-PGDH抑制剂的修饰的mRNA。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括一种或多种用于表达抑制性核酸或编码15-PGDH抑制多肽的多核苷酸的质粒、细菌或病毒载体。在一些实施方案中，试剂盒包括能够与编码15-PGDH的mRNA的一部分杂交的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包括特异性结合并15-PGDH抑制蛋白的抗体(例如单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、阻断抗体或中和抗体)或其抗体结合片段。在一些实施方案中，试剂盒包括阻断肽。在一些实施方案中，试剂盒包括适配体(例如肽适配体或核酸适配体)。在一些实施方案中，试剂盒包括亲和体(affimer)。在一些实施方案中，试剂盒包括修饰的RNA。在具体的实施方案中，试剂盒包括小分子抑制剂(例如SW033291)，其结合15-PGDH或抑制其酶活性。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括一种或多种另外的治疗剂，例如，用于与拮抗15-PGDH的表达或活性的药剂联合治疗地施用的药剂。

在一些实施方案中，试剂盒进一步可以包括包含说明的指导材料(例如，实验方案)，所述指导材料用于在患有NMJ退化的受试者中实施本文所述的方法(例如，使用试剂盒用于改善、增强和/或恢复神经肌肉接头形态和/或功能，和/或诱导和/或促进NMJ的形成；和/或用于使用所述试剂盒治疗神经源性肌病，老年诱发的肌肉质量损失，遗传性神经肌肉萎缩病症和/或肌肉创伤或肌肉损伤)。虽然说明材料通常包括书面或印刷材料，但它们不限于此。本公开考虑了能够存储这样的指令并将它们传送给最终用户的任何介质。这种介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，CDROM)等。这种介质可以包括提供这种指导材料的互联网站点的地址。

实施例

本公开将通过具体实施例更详细地描述。提供以下实施例仅用于说明目的，而不旨在以任何方式限制本公开。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本上相同的结果的各种非关键参数。

实施例1.靶向前列腺素E2降解酶15-PGDH以促进脊髓性肌萎缩中的肌肉功能。

尽管脊髓性肌萎缩(SMA)中的进行性运动神经元损失现在可以通过三种不同的治疗来控制，但是大多数患者具有持续的运动缺陷，需要补充措施。阻止疾病进展是不够的。SMA患者的肌肉仍未发达，且患者治疗干预来增加他们的肌肉质量和力量，以增强他们的活动能力。本公开提供了改善、治疗或缓解可应用于SMA的衰老相关的肌肉萎缩的症状的方法。如本文所述，15-PGDH抑制导致小鼠中神经肌肉接头的重塑。如本文所述，15-PGDH的抑制可提供在去神经支配后改善、增强和/或恢复NMJ的方法或治疗。系统性15-PGDH抑制可通过改善、增强和/或恢复肌肉和运动神经元中的线粒体功能来增加肌肉质量和力量。此外，本文所述的方法具有改善患有SMA的患者的生活质量的潜力。

脊髓性肌萎缩(SMA)治疗通过应用基因治疗和剪接修饰而得到了相当大的进展。用反义寡核苷酸(Spinraza)、剪接修饰子(Risdiplam)和AAV9-SMN1基因治疗(Zolgensma)治疗通过促进运动神经元的存活而大大改善了患者的生活质量，然而，患者仍然患有动作发展指标和功能的延迟。需要增加肌肉质量和强度的治疗策略来改善SMA患者的力量、活动性和生活质量。如本文所述，15-PGDH在衰老相关的肌肉萎缩和肌肉营养不良中的抑制也可应用于疾病，例如SMA。与SMA一样，衰老中的肌肉功能障碍部分归因于神经肌肉接头的变化。因此，在基因治疗后，有益于衰老和肌肉萎缩的治疗也可以有益于SMA患者。

前列腺素E2分解代谢酶，15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)，是肌肉老化的关键调节因子，并且其抑制导致老年小鼠的肌肉质量和力量的显著增加¹。15-PGDH是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性酶，其随着肌肉老化而增加并分解代谢PGE2。图1A至图1B显示了15-PGDH活性随PGE2水平的增加而增加，而这些在老年小鼠肌肉中降低。如图1C至图1D所示，使用小分子SW033291(SW)一个月对15-PGDH进行系统性抑制，改善、增强和/或使肌肉PGE2水平恢复到年轻小鼠的生理水平，同时肌肉质量和力量增加15％至20％。令人惊奇的是，15-PGDH在年轻小鼠肌肉中的过表达会在仅1个月后导致肌肉质量和力量的损失¹。这强调了15-PGDH作为先前未认识到的“肌肉萎缩的主调节剂”的重要性。

由于去神经支配是肌肉衰老的标志，所以研究了系统性15-PGDH抑制对衰老的神经肌肉接头(NMJ)的影响。如图2A至图2D所示，一个月的15-PGDH抑制在小鼠中改善、增强和/或恢复了衰老的神经肌肉接头(NMJ)的形态。图2A显示了老年NMJ表现出包括乙酰胆碱受体(AChR)片段化的病理结构变化，图2B显示了富含AChR的内/溶酶体囊泡数量增加，表明受体降解率增加²。这些结果显示一个月的腹膜内(i.p.)SW的施用改善、增强和/或恢复了老年小鼠中AChR的完整形态并减少富含AChR的内/溶酶体囊泡的数目。

此外，图3A显示了老年NMJ的电子显微镜分析，显示运动神经元(MN)轴突末端的线粒体的再生形态。该结果强调1)NMJ富含线粒体以适应它们对神经递质释放和肌肉收缩所必需的高生物能量需求，和2)III型SMA小鼠模型中较低MN的线粒体表现出扩张和增大的形态³。图3B显示了神经支配肌肉纤维的远端轴突的超微结构分析，显示SW治疗后老年小鼠的MN中线粒体形态的改善、增强和/或恢复。

此外，对最近发表的关于长期肌肉去神经支配模型⁴和严重SMA⁵小鼠模型的研究强调，15-PGDH分别在去神经支配和SMA肌肉中的作用。图4C显示了15-PGDH基因表达早在腓肠肌(GA)去神经支配后7天就增加，并且其水平在去神经支配后90天在去神经支配的肌肉中维持不变。图4C显示了15-PGDH的肌肉基因表达的增加与如图4A所示的肌肉质量的减少同时发生。在肌肉萎缩中经典表达的基因(萎缩蛋白和肌生长抑制素)仅瞬时增加并恢复损伤前水平(MuRF1(如图4B所示)和Atrogin-1)，或者在去神经支配30天后降低到稳态水平以下(肌生长抑制素)(如图4D所示)。在出生后(PND)第10天，在SMA的δ7小鼠模型中观察到15-PGDH和肌生长抑制素的肌肉水平的类似结果。如图4E所示，当肌肉(胫骨前肌)15-PGDH水平显示显著增加时，图4F显示了在严重的δ7SMA小鼠模型中，PND10时的肌生长抑制素水平降低。总之，这些数据强调15-PGDH的肌肉水平与肌肉去神经支配相关，并且与小鼠中的肌肉健康和身体健康呈负相关。

该实施例描述了在SMA小鼠模型中使用15-PGDH抑制来增强肌肉质量和功能的新的治疗方法。在SMA的轻度III型小鼠模型(Smn1C/C)中，15-PGDH活性在一个月内的系统性降低足以改善、增强和/或恢复肌肉质量、力量和NMJ形态和线粒体生物发生。

如本文所示，15-PGDH抑制在包括衰老在内的数种肌肉萎缩病症中改善肌肉功能。最后，本文所述的方法可积极地影响生活质量，特别是在现有的SMA患者中，其中基因治疗和剪接修饰物治疗限制疾病进展但不改善、增强和/或恢复萎缩的肌肉。

参考文献

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2.Khan MM,Strack S,Wild F,Hanashima A,Gasch A,Brohm K,Reischl M,Carnio S,Labeit D,Sandri M,Labeit S,Rudolf R.Role of autophagy,SQSTM1,SH3GLB1,and TRIM63 in the turnover of nicotinic acetylcholinereceptors.Autophagy.Taylor&Francis；2014Jan1；10(1):123–136.PMID:24220501

3.Fulceri F,Biagioni F,Limanaqi F,Busceti CL,Ryskalin L,Lenzi P,Fornai F.Ultrastructural characterization of peripheral denervation in amouse model of Type III spinal muscular atrophy.JNeural Transm.2021Jun 1；128(6):771–791.

4.Ehmsen JT,Kawaguchi R,Mi R,Coppola G,A.Longitudinal RNA-Seqanalysis of acute and chronic neurogenic skeletal muscle atrophy.SciData.Nature Publishing Group；2019Sep24；6(1):179.

5.McCormack NM,Villalón E,Viollet C,Soltis AR,Dalgard CL,Lorson CL,Burnett BG.Survival motor neuron deficiency slows myoblast fusion throughreduced myomaker and myomixer expression.J Cachexia SarcopeniaMuscle.2021Aug；12(4):1098–1116.PMCID:PMC8350220。

实施例2.15-PGDH是肌肉去神经支配的标志，并且其抑制促进NMJ形成。

肌肉减少症是肌肉质量和活动性的丧失，其随衰老而发生并且与死亡率增加相关。尽管与年龄相关的肌肉萎缩的分子驱动不是很清楚，但肌纤维的部分去神经支配是与肌肉衰老相关的标志。如该实施例所示，15-PGDH作为与去神经支配纤维中的自噬和有丝分裂相关的持续遗传程序的一部分被上调。令人惊奇的是，15-PGDH在空间上位于亚细胞区室中，所述亚细胞区室在老年去神经支配纤维和人神经源性肌病中缺乏线粒体。如本文所述，15-PGDH阻碍去神经支配后的修复，因为药理学抑制加速坐骨神经挤压损伤后的运动恢复，并改善、增强和/或恢复老年小鼠的神经肌肉接头健康。15-PGDH可用作分子靶标以促进急性外周神经损伤和衰老后的肌肉神经支配，对人类慢性神经源性肌病具有潜在的治疗相关性。

前列腺素E2(PGE2)是肌肉干细胞增殖的关键调节因子，是损伤后成功的肌肉再生的必要因素(1)。最近，PGE2分解代谢酶15-PGDH，被鉴定为导致肌肉萎缩的衰老因子。值得注意的是，15-PGDH的抑制通过诱导肌肉线粒体生物发生来改善、增强和/或恢复肌肉质量和功能(2)。用小分子抑制剂(SW033291；SW)导致肌肉萎缩的分解代谢调节物如atrogene、泛素连接酶MuRF1(Trim63)和Fbxo32(Atrogene-1)以及TGF-β信号传导的减少。然而，在衰老的肌肉纤维中调节15-PGDH表达或其蛋白质组相互作用的信号通路尚不清楚。

如本文所述，神经依赖性活性在调节肌纤维中的15-PGDH表达中起关键作用。在坐骨神经横切时，15-PGDH在肌纤维中显著上调，这与质谱显示的PGE2代谢增加有关。15-PGDH是在去神经支配的肌纤维中被激活的持续遗传程序的一部分，其具有与先前表征的肌肉萎缩的分解代谢调节因子不同的时间动态。如本文所示，去神经支配的肌肉的单核分析揭示15-PGDH表达与自噬和有丝分裂正相关。有趣的是，这种关系反映在去神经支配的老年肌肉中15-PGDH的亚细胞区室化中，与同样缺乏线粒体的自噬标志物LC3A聚集在一起。在患有神经源性肌病的患者活检组织的靶纤维中观察到类似的15-PGDH聚集体。

如本文所述，在一个方面，15-PGDH的药理学抑制加速运动恢复并促进坐骨神经挤压后新NMJ的形成，所述坐骨神经挤压是外周神经损伤的小鼠模型。在老年小鼠中，1个月的15-PGDH抑制逆转了年龄相关的NMJ损失，并改善、增强和/或恢复了AChR的稳定性，这是由老年NMJ中AChR降解和片段化的减少所证明的。

如本文所述，15-PGDH是负调节NMJ稳定性的去神经支配的分子靶标。在一个方面，15-PGDH的药理学抑制加速了外周神经损伤的小鼠模型中的功能恢复，促进了老年小鼠中新NMJ的形成，并且改善了NMJ处运动神经元突触的异常。在另一个方面，本公开提供了在衰老中15-PGDH抑制的新颖且有益的作用，具有治疗神经源性肌肉萎缩的治疗潜能。

材料和方法

动物饲养

所有动物实验和方案都符合斯坦福大学和实验动物护理行政小组(ALPAC)的制度性指导原则。在该研究中使用雄性C57BL/6小鼠。老年小鼠(24-29月龄)获自美国国家老龄化研究所(NIA)老年群体，年轻小鼠(2-4月龄)购自Jackson Laboratory。

体内药物治疗

老年小鼠

如前所述(2)，用5mg/kg SW033291(SW)或载体(10％乙醇，5％ Cremophor EL和85％ D5W(5％(wt/v)右旋糖的水溶液，表3和表4))一天一次腹膜内治疗小鼠1个月。在七个独立的实验中进行载体和SW治疗，用于衰老研究，包括年轻和老年的载体治疗组和SW治疗组。在注射开始之前，将小鼠基于其体重随机分成载体治疗的对照组和SW治疗的实验组。在实验终点对所有小鼠进行全身尸检，并且从研究中排除发生肿瘤的小鼠。

坐骨神经横断损伤/挤压损伤小鼠药物治疗

如下所述诱导神经损伤。如上所述，用SW或载体作为对照，在损伤后14天内每天一次腹膜内治疗小鼠。

坐骨神经横切术

在手术前30分钟向小鼠皮下注射1mg/kg体重的丁丙诺啡SR^TM LAB以进行手术后疼痛治疗。用3％异氟烷麻醉小鼠。将右腿从膝部刮至髋部并消毒。在股骨前面大约1.5mm处平行于股骨引入0.5cm切口。使用高压灭菌的尖棒定位和分离腘绳肌以允许接近坐骨神经。使用止血钳(Fine Science Tools,13020-12)夹紧坐骨神经，然后使用精细无菌剪将约5mm的神经横切。然后使用7mm高压灭菌反射夹(World Precision Instruments，500344；施放器：500345)。监测小鼠从麻醉中恢复，然后返回其居住笼中。

坐骨神经挤压手术

坐骨神经挤压手术采用了先前Bauder和Ferguson所描述的方案(41)。如上所述进行压碎手术，并进行以下修改。在定位坐骨神经后，用尖棒轻轻地移动神经，以便使用止血钳(Fine Science Tools,13020-12)。接着，将神经轻轻地放置在钳的下颚上，并用钳(锁定手柄的第一位置)按3下压碎15秒。使用7mm高压灭菌反射夹(World PrecisionInstruments，500344；施放器：500345)。监测小鼠从麻醉中恢复，然后返回其居住笼中。

全方位神经肌肉接头染色

解剖趾长伸肌(EDL)和比目鱼肌，并在室温下在4％ PFA的PBS中固定30分钟。将肌肉在PBS中充分洗涤并在4℃下储存在含有0.01％叠氮化钠(Sigma，S2002)的PBS中直至处理。对于全组织染色，使用远端腱将EDL分离成4片，以制备用于染色的较薄的肌肉片。移除比目鱼肌或EDL片的近侧腱和远侧腱，以允许在体视显微镜下使用精细镊对肌纤维的细束进行撕裂。小心操纵组织以避免用镊子尖端接触终板带。接着，将肌纤维束在PBS-T(0.3％Triton X-100的PBS溶液)中孵育1小时，并在补充有1:50稀释的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch，115-007-003)和IgM(Jackson ImmunoResearch，115-007-020)的封闭溶液(5％山羊血清和0.3％ Triton X-100的PBS溶液)中在室温下封闭1小时。然后将组织与抗神经丝和突触囊泡(2H3和SV，DSHB)的一抗混合物以5μg/ml在4℃孵育最少24小时，同时轻轻摇动。然后将组织用PBS-T漂洗，并与稀释在封闭溶液中的二抗混合物(山羊抗小鼠IgG1-Cy^TM 3、Bungarotoxin-AF^TM 647和Hoechst 33342)在4℃下孵育过夜，同时轻轻摇动。将组织用PBS充分洗涤并封固在Fluoromount-G^TM封固剂(Southern Biotech，0100-01)中，并放置过夜以平衡，用于共聚焦显微术。

组织切片的免疫荧光染色和成像

收集腓肠肌(GA)和胫骨前肌(TA)肌肉用于肌肉横切面的免疫组织化学分析。解剖后的肌肉包埋在O.C.T.中，并在液氮冷却的异戊烷中冷冻。将冷冻组织在10μm处横向切片并在-20℃保存。为了进行免疫组织化学分析，将冷冻切片平衡至室温，在PBS中再水化并用4％ PFA在室温下固定10分钟。将固定的组织在补充有1:50稀释的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch，115-007-003)和IgM(Jackson ImmunoResearch，115-007-020)Fab片段的山羊血清为基础的封闭液(试剂和材料)中在室温下封闭1小时，然后与一抗(表1)在4℃下孵育过夜。以2μg/ml至5μg/ml的量将一抗引入封闭液中或以制造商推荐的稀释度引入。用PBS-T(试剂和材料)彻底漂洗切片，并与相容的二抗在室温下孵育1小时(表2)。用PBS彻底冲洗组织，用Hoechst33342对细胞核进行复染。然后按照制造商方案用Lipofuscin处理切片，并用Fluoromount-G^TM封固剂(Southern Biotech，0100-01)覆盖。使用具有20X/0.75NA或油浸63X/1.4NA物镜的KEYENCE BZ-x700一体化荧光显微镜(如前所述(2))获得图像。

共聚焦显微术

在具有智能成像创新软件的Marianas旋转盘共聚焦(SDC)显微镜上使用20X/NA0.75或油浸40X/NA0.9物镜以1μm的步长捕获多个焦平面来获得共聚焦图像。分析使用20X物镜获得的图像以评价AChR的去神经支配、轴突肿胀和片段化。分析使用油浸渍40X物镜获得的图像以定量用α-银环蛇毒素-AF647染色的NMJ相关的内溶酶体囊泡。使用NIHImageJ软件从共聚焦切片产生最大强度投影图像。数据采集和NMJ评分由对治疗条件不知情的两个研究人员进行。

CODEX成像

如Wang et al.,2022Biorxiv所述进行CODEX多路复用成像。通过CODEXPhenoCycler System(Akoya Biosciences)进行流体交换，并在Keyence BX710自动显微镜(Keyence)上成像。使用20x Nikon0.75NA PlanApo透镜以0.8μm的Z分辨率在3D中捕获图像。图像由CRISP-CODEX图像处理器(github.com/wise-yx/CRISP-CODEX-Processor)处理，使用用Gibson-Lanni PSF初始化100次的盲去卷积。

体内肌肉力量测量

如前所述(2，42，43)在小鼠中测量跖屈峰值等长扭矩(N.mm)。简言之，用3％异氟烷与氧气混合麻醉小鼠，并将腿从踝部剃至髋部，以允许可重复地接近胫骨神经。脚被绑在一个附着在伺服电机(Aurora Scientific，300C-LR)的脚踏板上，并将膝关节固定到固定的钢柱上。通过在膝关节后面插入两个Pt-Ir电极针(Aurora Scientific)，经皮电刺激胫骨神经引起收缩。通过以150Hz的频率和0.1ms的方波脉冲向胫骨神经注入0.4mA电流来实现峰值等长扭矩。对每条肌肉进行三次强直测量，在每次测量之间恢复1分钟，并选择最高值。力测量采集是盲目的，并且进行力测量的研究人员不知道治疗条件。使用AuroraScientific动态肌肉分析软件套件分析数据。在损伤后第3天、第7天和第14天，在经历单侧坐骨神经挤压损伤的小鼠中进行纵向力量测量。在所有实验小鼠中在所有时间点测量由对侧未损伤的腿产生的峰值强直力。

LC-MS/MS测定前列腺素

前列腺素PGE2、PGD2和PGF2α以及PGE2代谢物15-酮PGE2和13,14-二氢-15-酮PGE2(PGEM)如前所述(2)测定。简言之，在解剖时将组织在液氮中快速冷冻，并在-80℃冰箱中保存不超过2周，然后使用LC-MS/MS进行前列腺素定量处理。将组织在丙酮为基础的均质化缓冲液(丙酮/水1:1v/v)中用丁基化羟基甲苯(0.005％)均质化以防止氧化。在具有1.4mm陶瓷珠(MP Biomedicals)和FastPrep24匀浆器的Lysing Matrix D管中匀浆组织。校准曲线制备、提取程序、LC-MS/MS和定量数据分析如7中所述进行。

蛋白质印迹分析

在液氮中解剖时将组织快速冷冻并且在均质化之前储存在-80℃冰箱中。为了制备总裂解物，使用裂解基质Lysing Matrix S(MP Biomedicals)金属珠在FastPrep24匀浆器中在RIPA缓冲液(Cell Signaling Technology，9806)中用Halt^TM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(ThermoFisher，78440)匀浆组织。使用BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisher)分析裂解物的总蛋白浓度。在NuPAGE^TM迷你蛋白凝胶上分析20μg总蛋白。将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并在封闭前用Ponceau S(Sigma)染色溶液染色。用牛血清白蛋白(BSA)为基础的封闭溶液封闭膜。使用以下一抗：15-PGDH(Santa Cruz Biotechnology，sc-271418)、GAPDH(Cell Signaling Technology，2118)和β-微管蛋白(Cell Signaling Technology，2146)。我们使用以下辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗：抗小鼠IgGγ链抗体(Sigma，AP503P)和抗兔IgG抗体(Cell Signaling Technology，7074)。使用ECL底物(ThermoFisher)和ChemiDoc(BioRad)成像系统进行化学发光。使用NIH ImageJ软件分析图像。

活性测定

在液氮中解剖时将腓肠肌快速冷冻并储存在-80℃中。根据制造商的手册，使用PicoProbe 15-PGDH活性测定试剂盒(BioVision，K562)分析15-PGDH活性。简言之，在具有1.4mm陶瓷珠(MP Biomedicals)和FastPrep匀浆器的Lysing Matrix D试管中匀浆组织，所述匀浆器提供有试剂盒。组织匀浆在4℃以10,000g旋转5分钟，收集上清液并用于15-PGDH活性测量。还使用BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisher)分析上清液的总蛋白浓度，并将测得的15-PGDH活性归一化为总蛋白量。

单核RNA-seq

使用改良版本的10x Genomics“从复杂组织中分离细胞核用于单细胞多组学ATAC+基因表达测序”方案分离肌肉细胞核。简言之，将约50mg速冻肌肉在200μL冰冷的NP-40裂解缓冲液中切碎直至均质。加入另外300uL NP-40裂解缓冲液，在1.5mL Eppendorf中杜恩斯匀浆10次，并在冰上裂解5分钟。将悬浮液通过40μm过滤器盖FACS管过滤，用250μL核FACS缓冲液(1％ BSA+0.2U/μL RNA酶抑制剂，在PBS中)洗涤，然后用7AAD(Miltenyi)标记2分钟。使用摇桶离心机在4℃下以300g沉淀核10分钟，然后重悬于250μL核FACS缓冲液中。通过FACS(配备有4个激光器的Sony SH800)前瞻性地分离7AAD+核。将细胞核在0.1x裂解缓冲液中透化，用1mL洗涤缓冲液洗涤、沉淀，并在使用10x Chromium系统(10x Genomics)产生液滴之前重悬于细胞核缓冲液中至每μL 6000个细胞核。按照制造商的说明进行文库生成，并在Illumina NovaSeq 6000上测序。

去神经支配肌肉RNA-seq数据再分析

对Ehmsen等人(2019，Scientific Data，SRP196460)储存的数据进行SNT后骨骼肌去神经支配的纵向RNA-seq分析。使用HiSat2进行与mm10的序列比对，并通过StringTie产生mRNA计数。DESeq2用于计算每百万的转录本和差异表达的基因(DEG)。在PCA分析后，56个样品中有55个通过质量控制。通过跨时间点的层次聚类归一化时间点间的时间表达对所有DEG进行时间序列基因集富集分析。

脊髓免疫染色

如前所述，使用整个完整脊髓的液压挤压来收获脊髓。简而言之，用二氧化碳对小鼠进行安乐死，并使用剪刀从脑干尾部切断头部。脊柱正好在骶髓的尾部切断。将含有冰冷的PBS的钝的25号注射器插入脊髓的尾端，以在含有冰冷的PBS的陪替氏培养皿中液压地挤出整个脊髓。在体视显微镜下识别腰部区域，用锋利的刀片解剖，并在4℃下在4％的PFA的磷酸缓冲液中固定过夜。将固定的腰髓包埋在O.C.T.中，并在液氮冷却的异戊烷中冷冻。将冷冻的组织在35μm处横向切片并保持在-20℃。为了进行免疫组织化学分析，将冷冻的切片平衡至室温，在PBS中再水化，并用胆碱乙酰转移酶(Novus Biologicals，山羊IgG)和裂解的caspase 3(Cell Signaling Technology，兔，IgG)的抗体染色，如方法部分“组织切片的免疫荧光染色和成像”所述。

透射电子显微术

切开趾长伸肌(EDL)肌肉，用近端腱和远端腱固定在涂有硅橡胶的陪替氏培养皿的底部。将组织在2％戊二醛(Electron Microscopy Sciences，16000)和4％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences，15700)的0.1M甲酸钠(Electron MicroscopySciences,12300)pH 7.4中固定24小时。然后将组织从陪替氏培养皿转移到含有1％四氧化锇(Electron Microscopy Sciences,19100)的微量离心管中，并在室温下保持1小时，轻微旋转。将组织用超滤水洗涤三次并用1％乙酸铀酰染色，在乙醇中脱水并包埋在树脂(Electron Microscopy Sciences,14120)中，并置于65℃烘箱中过夜。使用Leica EMUC7超显微切片机在80nm下产生横切面，置于网格内，并在3.5％乙酸铀酰酯中染色40秒在50％丙酮溶液中45秒，然后在Sato柠檬酸铅中染色2分钟。使用Gatan Microscopy Suite软件，用JOEL JEM 1400透射电子显微镜对网格成像。通过在ImageJ中对实验条件不知情的个体对图像进行定量。

统计分析

使用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。使用非配对t检验确定实验组之间的统计差异。这种情况的例外包括在图5H和图6E中进行的统计分析，其中使用配对t检验来识别对照和进行单侧神经横切的小鼠的去神经支配肌肉之间的差异，图2B、图2D、图3C、图15F、图16D，使用单向ANOVA检验，并且图10B，以及图11B是使用双向ANOVA测试来识别实验组之间的统计差异。对于所有统计测试，P<0.05被认为是显著的。

抗体列表

表1.用于本研究的一抗列表

表2.用于本研究的二抗和缀合蛋白的列表

试剂和溶液

表3.用于本研究的试剂列表

表4.用于本研究的溶液列表

#	名称	细节
			1	封闭溶液(IHC)	5％山羊血清，0.3％Triton-X 100的PBS溶液
2	封闭溶液(WB)	2％牛血清白蛋白的TBST溶液
			3	D5W	5％(wt/v)右旋糖的H2O溶液(过滤灭菌)
4	PBS-T	磷酸盐缓冲盐水(PBS，1X)，0.3％Triton-X 100
			5	TBS-T	50mM Tris，150mM NaCl，0.1％(v/v)Tween-20
6	载体(用于体内药物治疗)	85％D5W，10％乙醇，5％Cremophor EL

结果

15-PGDH在去神经支配的肌肉纤维中上调

15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)在老年小鼠肌肉中增加(2)。由于运动神经元变性和肌纤维部分去神经支配是骨骼肌衰老的标志(3)，研究了NMJ功能障碍与15-PGDH上调在老年肌肉中的关系。

为了直接确定肌纤维去神经支配是否导致15-PGDH上调，在年轻健康小鼠中进行单侧坐骨神经横切(SNT)，并如方法部分所述分析肌纤维对去神经支配的反应。图5A描述了实验方案。CTL表示对照，DN表示去神经支配状态。在大腿水平处切除5毫米的右坐骨神经以确保下肢肌肉完全去神经支配。将未受影响的对侧腿用作对照。手术后14天通过免疫荧光NMJ分析整个趾长伸肌(EDL)肌肉证实去神经支配的程度。如图5B左图所示，通过在突触后肌纤维肌膜上染色乙酰胆碱受体(AChR)的银环蛇毒素标记的NMJ处神经丝的共定位，证实了对侧EDL肌肉中NMJ的神经支配。图5B右图显示，尽管在突触后肌膜上存在AChR，但在去神经支配的EDL肌肉中未检测到神经丝染色，证实了坐骨神经切除后肌肉纤维的完全去神经支配。

使用多重组织成像(CODEX，通过索引共检测)来研究去神经支配的肌肉中的15-PGDH水平，并将其表达定位于骨骼肌中发现的一系列细胞类型。如图5C和图6B所示，CODEX分析显示在年轻C57BL/6小鼠中SNT后14天，去神经支配的胫骨前肌(TA)肌纤维中15-PGDH显著上调。如图5C所示，与对侧腿中的运动神经元的轴突中的强染色相比，CODEX通过在去神经支配的TA中的TA横截面的神经束中缺乏神经丝染色进一步证实了SNT的有效性。如图6A所示，CODEX分析进一步揭示了去神经支配的TA中免疫细胞在该时间点的广泛浸润，而脉管系统不受SNT的影响。如图5D所示，通过蛋白质印迹分析定量15-PGDH的上调。图5E和图6C描绘了与对侧对照相比，SNT后去神经支配的腿的GA中15-PGDH增加约4.5倍，进一步支持CODEX结果。

15-PGDH是PGE2分解成13,14-二氢-15-酮-PGE2(PGEM)的限速酶。如图5G所示，去神经支配和对侧GA肌肉的蛋白质裂解物中15-PGDH比活性的功能测定证实15-PGDH在去神经支配时变得显著更具活性。为了评价去神经支配时15-PGDH的上调如何影响肌肉中的前列腺素代谢，对对侧和去神经支配的肌肉进行LC-MS/MS。这种方法克服了抗体测定(如ELISA)与密切相关的前列腺素及其代谢产物交叉反应的局限性，这些前列腺素及其代谢产物通常具有高度的结构相似性。值得注意的是，LC-MS/MS区分前列腺素(PGE2和PGD2)和PGE2代谢物，例如PGEM。如图5H所示，LC/MS-MS结果显示PGEM(PGE2分解的稳定代谢物)与来自对侧腿的GA相比在去神经支配的GA肌肉中显著增加。图6D和图6E描绘了LC/MS-MS结果，显示PGE2和PGD2水平未改变(n.s)。

这些发现一起强调了神经依赖性活性在调节肌纤维中的15-PGDH表达中的作用，并证明神经支配的丧失也与通过15-PGDH上调增加的PGE2分解有关。

15-PGDH是去神经支配后持续的基因程序反应的一部分

肌纤维去神经支配作用启动了一系列分解代谢的分子程序，其导致萎缩和降解。在老年小鼠中15-PGDH的抑制在抑制萎缩基因的肌肉表达和增强代谢基因方面具有深远的效果。为了了解15-PGDH上调在去神经支配时的调节和生物学作用，通过RNA测序在SNT上检测基因表达的纵向变化(5)。

与蛋白质水平上所示的结果一致，如图7A所示，箭头所示的线，15-PGDH(HPGD)mRNA早在第3天被上调，并继续增加表达，在SNT后第21天左右达到稳定。图7A还显示，在SNT后90天，与对侧腿相比，15-PGDH在去神经支配的腿中上调约50倍。这种时间调节的表达模式不同于众所周知的去神经支配的分解代谢调节因子，包括炎性骨髓细胞表面标记物CD11b(ITGAM)；肌肉无名指蛋白-1,MuRF1(Trim63)；叉头框蛋白O3；FOXO3；和神经细胞粘附分子1，NCAM1，如图7A所示。实际上，进行与基因本体(GO)分析配对的时程基因集富集分析(GSEA)。如图8所示，这些去神经支配基因聚集成具有代表不同生物学过程的独特时间动力学的基因集。图7A还显示了CD11b与其它炎症基因共享其在前3天上调的立即应答和瞬时应答，富集GO术语用于嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润，如图7B所示。如图7A至图7B所示，MuRF1和其它蛋白体相关的萎缩基因在SNT后早期上调2周，对应于快速肌肉萎缩的阶段(5)。如图7B所示，NCAM1与纤维化基因和ECM蛋白一起被分组，所述基因和ECM蛋白的表达在时间过程的晚期阶段逐渐增加，这与在具有神经源性肌病(如SMA)的肌肉中纤维变性积聚的观察一致。

15-PGDH在SNT后一周以持续表达模式分组为上调的不同基因簇。对这一簇的GO分析揭示15-PGDH与与肽基-赖氨酸脱乙酰化、失巢凋亡(一种细胞死亡形式)和NMJ发育相关的基因共表达。与术语肽基-赖氨酸脱乙酰化相匹配的基因含有组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)，一种IIa类HDAC，其作为肥大的抑制因子并调节神经源性肌肉萎缩(7，8)。值得注意的是，15-PGDH抑制降低了老年小鼠骨骼肌中HDAC4的表达(2)，表明15-PGDH活性可以调节该簇中其它基因的表达。

15-PGDH与去神经支配纤维中的自噬和有丝分裂有关

肌肉由多种细胞类型组成，每种细胞类型对去神经支配具有不同的分子反应。15-PGDH在老年肌肉中由巨噬细胞以及肌纤维表达(2)。此外，由于肌纤维是在肌细胞核细胞群中具有已知转录异质性的合胞体细胞(2)，因此利用单核RNA测序(snRNA-seq)进一步解决15-PGDH的分子调控。收集来自经历单侧坐骨神经横切的4只小鼠的GA肌肉并加工以获得完整的核。图7C描绘了单核RNA测序实验的实验方案。使用荧光激活的单细胞分选(FACS)纯化细胞核，并使用10XChromium系统构建用于测序的文库。图7D和图9A至图9D显示了单核转录组结果的细胞类型注释。对来自对照和去神经支配的肌肉的13888个单核转录组进行了分析，无偏聚类揭示了骨骼肌中预期的所有主要细胞类型，包括肌细胞核亚型(如突触核和肌腱连接肌细胞核)、肌肉干细胞(MuSC)、成纤维脂肪祖细胞(FAP)、内皮细胞、免疫细胞、平滑肌(SM)、脂肪细胞、腱细胞(Tn)和周细胞。如图7E和图9C所示，与对侧腿相比，去神经支配的肌肉中最显著的细胞类型组成变化是IIb型肌纤维的缺失和来自去神经支配的肌纤维聚集成不同群体的肌细胞核的出现。图7E还显示了去神经支配后免疫细胞丰度的细微增加，与图6A所示的CODEX结果一致。

在对侧GA肌肉中，如图7F所示，15-PGDH由免疫细胞和腱细胞表达，但不在肌细胞核中表达。相反，15-PGDH在去神经支配的腿中的去神经支配的肌细胞核簇中高度表达，如图7F和图9E所示。为了进一步解决15-PGDH在去神经支配肌纤维中的功能，对与15-PGDH表达模式相匹配的共调节基因进行了单细胞基因相关分析。图9F显示了单细胞基因与15-PGDH相关的结果。如图7G所示，对于p53信号传导、细胞衰老、FoxO信号传导、TGFβ信号传导和自噬，富集了与15-PGDH正相关的基因；而负相关基因是代谢的并编码线粒体酶。有趣的是，与15-PGDH相关的自噬基因包括LC3A(Map1lc3a)和线粒体自噬调节因子Parkin(Prkn)，它们分别在图7H至图7I中显示。两者在去神经支配的肌细胞核簇中都被高度上调，并且对应于表达线粒体膜标记物电压依赖性阴离子通道(VDAC1)和线粒体糖酵解酶丙酮酸脱氢酶(PDHA1)的减少相对应，如图7J所示。

这些发现一起表明了肌纤维是去神经支配的肌肉中15-PGDH的主要来源，并证实去神经支配作为肌细胞核中的15-PGDH上调的驱动。另外，这些数据提供了15-PGDH与萎缩相关基因相关并与去神经支配纤维中的代谢活性基因反相关的证据。

去神经支配的老年肌纤维和人肌病中15-PGDH聚集体

考虑到SNT后去神经支配的肌肉的结果，研究了15-PGDH上调与老年肌肉的神经病理学改变之间的联系。运动神经元表现出对年龄的选择性易损性，其中快速疲劳的神经元是最易受影响的，而慢速运动单元倾向于与疾病进展有关(10，11)。这在肌肉中反映为快速糖酵解IIb型肌纤维，以及主要含有IIb型肌纤维的肌肉群，经历比氧化性I型和IIa型肌纤维更高的去神经支配速率。因此，15-PGDH的表达将根据肌肉的纤维类型组成和去神经支配状态而变化。

首先，使用CODEX来研究15-PGDH累积在老年GA肌肉(经历异质性去神经支配的肌肉)中的空间定位。图10A上图显示了GA的去神经支配沿皮肤-骨轴发生(10)，与靠近皮肤的浅表区域中的糖酵解IIb型肌纤维和靠近骨的较深区域中的氧化性I型和IIa型肌纤维的不同纤维型组合物对齐。此外，如图10A所示，尽管在年轻的GA中不存在15-PGDH(2)，但是15-PGDH表达仅限于老年GA浅表区域的IIb型肌纤维，并且在深层区域中被排除在氧化性肌纤维型之外，这证实了与快速运动单元中衰老诱导的去神经支配的关系。

为了进一步证实老年肌肉中去神经支配和15-PGDH表达之间的关系，比较了经历不同去神经支配速率的肌肉群。测量最快速收缩的趾长伸肌(EDL)肌肉中的去神经支配和15-PGDH水平，并与年轻和老年小鼠的最缓慢收缩的比目鱼肌进行比较，结果如图11A所示。如图11B所示，与年轻样品中的3％的肌纤维缺乏神经支配相比，EDL肌肉中20％的肌纤维缺乏神经支配(突触后AChR处没有神经丝染色)，相比之下，老年的比目鱼肌纤维不经历显著的去神经支配。图10B和图11C显示了通过蛋白质印迹定量这些肌肉中的15-PGDH，这揭示了去神经支配速率与衰老和15-PGDH上调之间的正相关性。如图10B所示，在老年EDL肌肉中，即最严重去神经支配的肌肉群中，15-PGDH与年轻相比上调超过5倍。这些结果证实了SNT时15-PGDH的增加，并提示神经性改变驱动老年肌肉中的15-PGDH上调。

15-PGDH在老年肌肉中上调的显著特征是其在肌纤维内的集中聚集体中的亚细胞定位(2)。考虑到通过单核分析将LC3A和Parkin识别为15-PGDH相关基因，测定这些去神经支配标记物与老年肌肉中15-PGDH聚集体的相关性。如图11D至图11F所示，具有中央聚集体的肌纤维也表达去神经支配标记物NCAM1，并且在聚集体内具有自噬体标记物p62和泛素的积累，这与经历自噬介导的降解的去神经支配的肌纤维一致。此外，如图10C至图10D所示，观察到LC3A和15-PGDH在肌纤维中的强共定位和线粒体膜标记物VDAC1与15-PGDH的反相关，表明在该15-PGDH+区室内自噬体的积累和线粒体的破坏。

通过靶或靶样纤维的发育，在人神经源性肌病中也发生LC3A的局部、中枢积累和线粒体的损失。靶纤维的存在是经历具有神经再支配迹象的去神经支配的肌肉的临床适应症。获得具有靶纤维临床诊断的患者活检组织并进行免疫荧光检测15-PGDH、LC3A和线粒体蛋白VDAC1和丙酮酸脱氢酶(PDHA)。与老年小鼠肌肉相似，图10E显示了发现15-PGDH和LC3A共定位于受影响的靶纤维的“靶心”区域。另外，如图10E所示，如所见缺乏VDAC1和PDHa染色，线粒体被排除在15-PGDH+区之外。

总的来说，这些发现证实了15-PGDH在老年小鼠肌肉中经历去神经支配的快速糖酵解肌纤维子集中上调。其亚细胞聚集与自噬体在缺乏线粒体的区域共定位。重要的是，这种机制在人类中是保守的，因为在来自神经源性肌病的活组织检查中观察到15-PGDH聚集体。

15-PGDH抑制加速神经挤压损伤的恢复

神经源性肌肉萎缩构成了大部分的肌肉萎缩疾病，并且由于外周神经系统的损伤或疾病而导致肌肉质量和功能的损失。运动神经元在外周神经损伤后表现出显著的再生能力。然而，肌肉质量和功能的改善、增强和/或恢复依赖于在损伤后形成功能性NMJ以支持重建肌肉质量、功能和活动性。在这点上，肌肉代谢适应和健康可以在发育和再生期间以逆行方式调节功能性突触的形成。实际上，肌肉线粒体生物发生可重塑突触前神经元。

为了确定15-PGDH是否在外周神经损伤后调节NMJ突触形成，在年轻健康小鼠中进行单侧坐骨神经挤压，并且在损伤后14天(dpi)探测NMJ形成。在该时间点预期部分恢复和再神经支配。图12A描绘了实验方案，显示损伤的小鼠每天用SW或载体腹膜内治疗14dpi。使用EDL肌肉的免疫荧光分析来可视化NMJ，图12B至图12C显示了与载体治疗的对照14dpi相比，15-PGDH的药理学抑制显著降低与神经挤压同侧的EDL中的去神经支配速率。为了确定加速的NMJ形成是否导致功能恢复，测量损伤后不同时间点的足底屈肌强直力。为了确保测量的力响应于神经兴奋而不是肌纤维的直接电激活，将电极定位在胫骨神经的水平，并将电流调节到足以激活神经而不是肌纤维去极化的阈值。如图12D和图14D所示，与对侧(未受伤的)腿相比，坐骨神经挤压导致受伤腿中的强直性足底屈肌力早在3dpi就显著降低，这种情况持续到7dpi，而实验组(载体和SW)之间没有差异。图12D显示了SW治疗(15-PGDH抑制)导致在受伤腿中足底屈曲力的产生显著增加(69±8％平均值±标准差)，如图14C至图14E所示，而在对侧腿中没有观察到显著的差异。为了区分肌肉质量对增加的足底屈曲力中的神经肌肉功能的作用，测量了引起足底屈曲的主要肌肉比目鱼肌和腓肠肌的质量。如图14A至图14B所示，尽管在治疗组之间使小鼠体重和未受伤腿中的肌肉质量归一化，但是图12E显示了15-PGDH的药理学抑制促进受伤腿14dpi中的肌肉质量的显著增加。为了区分神经肌肉功能对肌肉功能性能(足底屈肌)的贡献，将测得的力量归一化为腓肠肌和比目鱼肌重量以确定肌肉比力(每单位质量的力量)。如图12F所示，用SW治疗的小鼠显示出比力的显著增加(52±10％平均值±标准差)。与载体治疗的对照小鼠相比，表明增加的功能主要是增加的功能性NMJ形成的结果，与来自NMJ的免疫荧光分析的结果相一致。

总之，这些数据表明15-PGDH抑制加速了外周神经损伤后运动功能的恢复和改善、增强和/或恢复。功能性NMJ的形成在神经损伤后的运动恢复中起关键作用，并且这些数据表明15-PGDH在功能性神经肌肉突触的形成中起关键作用，因为其药理学抑制促进外周神经挤压的小鼠模型中NMJ的形成。

外周神经损伤增加脊髓15-PGDH活性

考虑到SW治疗的小鼠中运动恢复的加速，评估了坐骨神经挤压对脊髓15-PGDH水平的影响。年轻小鼠经历单侧坐骨神经挤压损伤并且用载体或SW腹膜内治疗。14dpi收集脊髓。

在转录物水平，小胶质细胞(驻留在神经系统中的巨噬细胞)在构成脊髓的细胞中表达最高水平的15-PGDH。通过用小胶质细胞标记物Iba-1和15-PGDH共免疫染色坐骨神经横切面，在蛋白质水平证实这些数据。如图13B所示，在与Iba-1共染色的细胞中检测到15-PGDH。这证实了肌肉中的数据，显示组织驻留巨噬细胞作为表达15-PGDH的主要细胞类型。接着，为了解决外周神经损伤后脊髓中小胶质细胞的空间定位，用Iba-1染色损伤小鼠14dpi的腰髓横截面。如图13A所示，外周神经损伤引起小胶质细胞的累积增加，所述小胶质细胞具有在损伤侧同侧的脊髓中运动神经元周围的活化形态。根据免疫荧光结果，图13C至图13D显示了与未损伤的对照相比，损伤的脊髓中15-PGDH蛋白水平和比活性显著增加。图13E显示了对照和损伤小鼠(每个n＝4)的腰髓中15-PGDH比活性的动力学测量。早在对侧对照腿中在实验组(载体和SW治疗)之间，在动物体重(图14A)、肌肉重量(图14B)和力量(图14C至图14E)方面没有观察到差异。

15-PGDH抑制在老年小鼠中改善、增强和/或恢复NMJ

15-PGDH抑制可增加老年小鼠肌肉中的线粒体功能和生物发生(2)。神经肌肉接头(NMJ)在衰老和疾病中表现出高度形态可塑性(13，14)。增加的肌线粒体生物发生重塑肌肉营养不良中的NMJ(12，15)。另外，肌肉纤维中自噬和自噬体形成的失调导致年轻小鼠中突触后AChR的过早去神经支配和退化，这些表型在老年肌肉中观察到。然而，增加的肌肉线粒体生物发生和15-PGDH抑制对老年NMJ的作用尚不清楚。另外，由于基因集富集和GO分析将15-PGDH与NMJ发育相关的基因和已知的神经源性肌肉萎缩标记物(HDAC4)分组在去神经支配的肌肉中，15-PGDH抑制可以改善、增强和/或恢复在NMJ累积的年龄相关的异常并导致新的功能性NMJ的形成。如坐骨神经挤压模型所示。因此，检查了15-PGDH的药理学抑制对老年小鼠(>26个月)中NMJ的形态学状态的影响。图15A显示了小鼠每天腹膜内治疗一次(i.p.)使用载体或SW033291。腹膜内注射一个月后收集EDL肌肉，图15B显示了免疫染色以观察突触前运动神经元和突触后AChR。老年肌肉表现出高比率的NMJ相关改变，例如去神经支配(21.6±2.3)；平均±均值标准误差。在载体治疗的小鼠中，轴突肿胀(19.6±1.4)和突触后AChR片段化(28.9±2.8)，其显示在图15B至图15E和图18中。图15C至图15E显示了15-PGDH抑制显著降低老年肌肉中NMJ异常的发生率，包括去神经支配(图15C)、AChR片段化(图15D)和运动神经元轴突肿胀(图15E)。考虑到NMJ的形态学改善、增强和/或恢复，如图15B下图所示，并且在系统15-PGDH抑制一个月后，在老年EDL中去神经支配速率较低(12.4±2.9；平均±均值标准误差)，使用油浸共聚焦显微镜更接近地评估突触后AChR。去神经支配与突触后AChR在涉及自噬标记物LC3A和泛素结合蛋白p62(16-18)的过程中以Trim63依赖性方式的过度降解相关。15-PGDH抑制显著降低老年小鼠肌肉中的泛素连接酶Trim63。考虑到15-PGDH在老年肌肉纤维中与p62和LC3A空间定位的发现，确定了15-PGDH抑制影响AChR结构和在老年NMJ中的稳定性。如图15F和图15G中图所示，与年轻小鼠相比，观察到老年NMJ中富含AChR的内/溶酶体囊泡的发生率增加。图15F至图15G的结果表明，15-PGDH抑制导致老年NMJ中富含AChR的内/溶酶体囊泡的数目显著减少，表明老年肌肉中AChR稳定性的改善、增强和/或恢复。类似地，老年NMJ形态被改善、增强和/或恢复为在年轻EDL中发现的分支和蝴蝶脆饼样结构，其在图15B和图15G右图中示出。

综上所述，这些数据表明15-PGDH抑制改善了NMJ的形态学变化，并改善、增强和/或恢复了老年小鼠肌肉中突触后肌纤维中的AChR稳定性。这些作用部分是由于15-PGDH抑制对促进肌纤维线粒体再生和减少肌肉萎缩标记物(如Trim63和HDAC4)的影响，以改善、增强和/或恢复AChR稳定性并以逆行方式刺激功能性NMJ的形成。

15-PGDH抑制预防老年小鼠运动神经元凋亡

15-PGDH抑制降低衰老小鼠中的肌纤维去神经支配的速率。其次，在用载体和SW治疗的老年小鼠中，突触前运动神经元的健康。神经元PGE2受体与cAMP正偶联，并显示出在脑缺血的小鼠模型中在体内引起神经元保护作用。在肌萎缩性侧索硬化症的小鼠模型中，PGE2以cAMP和蛋白激酶A(PKA)依赖性方式在生理浓度下保护运动神经元。图16C至图16D显示了通过染色活性形式的caspase 3的运动神经元(通过胆碱乙酰转移酶，ChAT的染色来标记)的健康状况，所述caspase 3在细胞凋亡中起主要作用。15-PGDH抑制显著拯救运动神经元死亡(细胞凋亡)，如在老年腰椎运动神经元中较低水平的激活caspase-3所示。

考虑到老年小鼠的SW治疗改善的运动神经元健康，通过透射电子显微镜(TEM)检查EDL肌肉横截面中的严重有髓轴突的线粒体形态。图16A中图显示了TEM显微照片的分析，显示随着年龄增长，严重有髓轴突具有大的线粒体，形态紊乱。在SW治疗一个月后，衰老的线粒体形态被改善、增强和/或恢复，以使环状线粒体形态紧凑，类似于年轻时所见的形态，如图16A至图16B所示。总的来说，这些数据表明系统性15-PGDH抑制在老年小鼠体内对脊髓运动神经元发挥神经保护作用。

衰老伴随着脊髓中15-PGDH活性的增加

考虑到在15-PGDH抑制一个月后老年肌肉中NMJ去神经支配的速率较低，评估了老年小鼠的腰髓中的15-PGDH活性。图17D显示了随着衰老，腰髓中的15-PGDH活性显著增加。由于小胶质细胞表达15-PGDH，为了解15-PGDH活性增加的来源，用运动神经元标记物(ChAT)和IBA1(小胶质细胞)染色老化的腰髓。图17A至图17C显示了由IBA1+细胞覆盖的面积的显著增加，以及老年脊髓中的IBA1免疫反应性。值得注意的是，尽管小胶质细胞在年轻脊髓中表现出分枝的形态，但老年小胶质细胞在ChAT+运动神经元附近表现出对活化形态的剧烈变化。总之，这些数据显示衰老伴随着脊柱15-PGDH活性的增加。

衰老伴随着肌肉质量的剧烈损失，其影响老年人的运动功能、活动能力和生活质量(19)。有几个因素导致肌肉功能随年龄而丧失，包括肌肉干细胞(MuSC)维持肌肉内环境平衡能力的功能性降低(20，21)、组织细胞外基质生化(22)和生物物理学(23，24)组成的变化、肌肉炎症微环境的老化诱导的变化(25-27)、NMJ的病理学重塑(13，28)、自噬受损(29-31)和有丝分裂(32)，和部分去神经支配(33，34)。然而，关于已知的老化肌肉纤维相对较少，并且缺乏标记物来识别肌肉纤维健康与年龄的关系。目前没有用于与年龄相关的肌肉质量损失(肌肉减少症)的疗法，并且获得对老年肌肉中的肌纤维健康的更好理解可以帮助识别对抗肌肉减少症和其它神经源性肌病的新疗法。

前列腺素降解酶15-PGDH在老年肌肉纤维中积累，并与降低的肌肉PGE2水平有关(2)。15-PGDH在年轻和老年小鼠中负调节肌肉质量和功能，并且其系统性抑制通过在老年中诱导肌线粒体生物发生来改善、增强和/或恢复肌肉功能。然而，在老年肌肉纤维中调节15-PGDH或其蛋白质组相互作用的潜在机制尚不清楚。

如该实施例所示，神经依赖性活性在调节肌肉纤维中15-PGDH的表达中起决定性作用。神经依赖性活性的丧失诱导肌肉15-PGDH水平的早期和持续增加。单核RNA测序和CODEX成像显示肌细胞核/肌肉纤维在去神经支配的肌肉中表现出15-PGDH表达的显著增加。RNA-seq数据显示，与15-PGDH表达增加一致，肌细胞核下调与线粒体活性和氧化磷酸化相关的基因，为了响应于去神经支配，它们上调与泛素-蛋白降解、自噬和有丝分裂相关的基因。

此外，如本文所示，对慢性去神经支配的肌肉的分析，以前未知的对肌肉神经源性损伤的细胞反应的动力学。去神经支配肌肉的基因组富集和GO分析表明损伤后免疫细胞立即浸润。这之后是蛋白质降解的早期分解代谢过程，其降低了14dpi。脂肪酸代谢和FOXO3信号传导的变化(其通过萎缩基因(35，36)的活化来调节肌肉萎缩)表现出瞬时模式。如本文所示，15-PGDH在去神经支配肌肉中显示出显著和持续的上调，其与已知调节神经源性肌肉萎缩的NMJ发育(乙酰胆碱受体)、自噬和组蛋白脱乙酰酶4的调节物一致。相反，调节线粒体活性和氧化磷酸化的基因与去神经支配肌肉中的15-PGDH基因表达模式呈负相关。这些数据显示15-PGDH作为响应于慢性肌肉去神经支配的持续遗传程序的一部分，所述慢性肌肉去神经支配与神经源性肌肉萎缩的标记物相关，所述神经源性肌肉萎缩例如自噬、IIa类组蛋白脱乙酰酶和线粒体功能。

考虑到部分去神经支配在衰老肌肉中的重要作用，使用CODEX成像检测15-PGDH在老年肌肉中的空间定位。选择腓肠肌以确定15-PGDH在老年肌肉中的累积是否表现出肌纤维亚型特异性。腓肠肌由深氧化(慢)区和浅糖酵解(快)区组成。本文所述的结果显示15-PGDH在老年小鼠肌肉中聚集在快速糖酵解的肌肉纤维中但不是缓慢和氧化的肌肉纤维中。这些结果与先前的研究相一致，这些研究显示在人类的老年下肢肌肉中快速运动单位的丧失(37)和在老年小鼠中快速疲劳神经肌肉突触的选择性易损性(11)。因此，这些数据表明15-PGDH是一种新的老年肌纤维标记物，其在衰老过程中经历去神经支配/神经再支配和部分去神经支配的情况。随着年龄的延长，缺乏一部分快速糖酵解肌纤维去神经支配的运动神经元的低萌动能力可导致15-PGDH在亚细胞区室中的积累，而在线粒体活性方面则不存在。相反，缓慢激发的运动神经元表现出对年龄诱导的衰退的抗性，并因此保护它们的靶肌肉纤维免于去神经支配-神经再支配重塑和随后的15-PGDH随年龄的累积。这些结果通过定量快速趾长伸肌(EDL)和缓慢比目鱼肌中的去神经支配速率和15-PGDH水平来证实。这些数据识别了老年小鼠肌肉中去神经支配速率和15-PGDH水平之间的平行相关性。尽管15-PGDH显示经历超过20％的去神经支配速率随衰老的快速EDL的显著增加，但缓慢收缩的比目鱼肌在去神经支配速率或15-PGDH水平都不表现出显著的变化。

利用转录组学分析的这些结果，评价15-PGDH在神经源性肌病患者的老年去神经支配的肌肉纤维和肌肉中的空间共定位。如本文所示，15-PGDH位于亚细胞区室中，所述亚细胞区室线粒体标记物含量较低并且富含去神经支配标记物，例如NCAM(神经细胞粘附分子)和自噬标记物，例如LC3A和泛素结合蛋白p62。这些结果显示了15-PGDH在人神经源性肌病中的空间定位的特征。

此外，测定了15-PGDH在去神经支配的肌肉中的功能作用。在坐骨神经挤压的小鼠模型中，15-PGDH在阻止神经源性损伤后的修复中起关键作用。对于14dpi的15-PGDH的药理学抑制引起运动功能恢复的显著增加，在这个时间点形成了更多的功能性NMJ。在老年小鼠中的结果显示了类似的证据。老年小鼠中15-PGDH的药理学抑制促进新NMJ的形成并改善在神经肌肉接头累积的与年龄相关的异常。考虑到15-PGDH在老年肌线粒体的再生中的显著效果，以及肌肉逆行信号传导在保持NMJ健康中的作用，15-PGDH通过改善、增强和/或恢复肌纤维代谢健康来重塑老年NMJ。这些结果表明，短期小分子治疗可以加速运动神经损伤后的运动恢复，并在老年小鼠中引起功能性NMJ的形成。

总的来说，这些结果显示15-PGDH在合胞体肌纤维中是如何调节的，并且揭示了神经依赖性活性在调节肌纤维中的15-PGDH表达中的作用。使用CODEX成像，本文显示了15-PGDH在老年小鼠腓肠肌中的表达模式，其与衰老中的肌纤维去神经支配模式紧密相关。这些数据还显示短期药物干预部分地改善、增强和/或恢复老年NMJ形态和AChR稳定性。此外，这些结果显示15-PGDH抑制在加速神经挤压损伤后的运动恢复中的作用。这些结果提供了15-PGDH抑制剂作为改善、增强和/或恢复神经源性肌病和衰老中的运动功能的潜在治疗分子的强的临床前数据。

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尽管为了清楚理解的目的，已经通过图表和实施例的方式详细描述了上述公开内容，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。此外，本文提供的每个参考文献以其整体通过引用并入本文，其程度如同每个参考文献单独通过引用并入本文。

Claims (34)

1.用于在有神经肌肉接头(NMJ)退化的受试者体内改善、增强和/或恢复NMJ形态和/或功能，和/或诱导和/或促进NMJ的形成的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效抑制所述受试者中的15-PGDH活性和/或降低所述受试者中的15-PGDH水平的量的15-PGDH抑制剂，从而改善、增强和/或恢复受试者中的NMJ形态和/或功能，和/或诱导和/或促进受试者中的NMJ的形成。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法导致突触前运动神经元和突触后AChR并置和/或连通性增加。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法导致在NMJ处的片段化乙酰胆碱受体(AChR)簇的数目减少。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致缺少运动神经元的NMJ数目减少。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致运动神经元轴突的起泡减少。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致运动神经元的凋亡减少。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致NMJ形态增强，和/或神经信号向肌肉的传导增强。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致在所述NMJ处富含AChR的囊泡的数目减少。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致在所述NMJ处AChR的表达和/或定位增加。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致AChR降解减少。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致AChR稳定性增加。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致运动神经元中线粒体形态和/或功能的改善、增强和/或恢复。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致所述NMJ处运动神经元突触终端的改善、增强和/或恢复。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法导致所述受试者的骨骼肌质量和/或神经肌肉功能的改善、增强和/或恢复。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肌肉去神经支配和/或部分肌肉去神经支配。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有神经源性肌病、老年诱导的肌肉质量损失、遗传性神经肌肉萎缩病症、神经创伤或损伤、肌肉创伤或肌肉损伤，或其任何组合。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述遗传性神经肌肉萎缩病症是脊髓性肌萎缩(SMA)、迪谢内肌营养不良(DMD)或肌萎缩性侧索硬化(ALS)。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或已经经历选自以下的一种或多种：急性外周神经损伤、肌肉废用、具有神经源性和自身免疫性的涉及靶纤维或管状聚集体形成的肌病，和血管性肌病。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述急性外周神经损伤选自：挫伤性损伤、压迫性减压损伤、神经切断、肉毒杆菌毒性、由于腱切断术引起的损伤，以及运动损伤。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述压迫性减压损伤选自：水肿、腕管综合征、贝克囊肿，以及重复任务损伤。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述肌肉废用选自：骨折后的固定、长期卧床休息、手术后的恢复、呼吸机的恢复、太空飞行，以及久坐的生活方式。

22.根据权利要求18所述的方法，其中所述具有神经源性和自身免疫性的涉及靶纤维或管状聚集体形成的肌病选自：迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、中央轴空病、远端运动轴索神经病变、多灶性运动神经病、肌萎缩侧索硬化症、进行性脊肌萎缩症、多发性硬化、共济失调、强直性肌营养不良、神经源性淀粉样变性、近端管状聚集性肌病、类风湿性关节炎、干燥综合征，以及重症肌无力。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述重症肌无力选自：先天性重症肌无力、偶发性重症肌无力，以及Lambert-Eaton肌无力综合征。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述15-PGDH抑制剂选自：小分子化合物、阻断抗体、纳米抗体和肽。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述15-PGDH抑制剂选自：SW033291和(+)-SW209415。

26.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述15-PGDH抑制剂是具有15-PGDH抑制活性的噻唑烷二酮类似物。

27.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述15-PGDH抑制剂选自：反义寡核苷酸、microRNA、siRNA和shRNA。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者年龄小于30岁。

30.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述受试者年龄至少30岁。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述15-PGDH抑制剂降低或阻断15-PGDH表达。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述15-PGDH抑制剂降低或阻断15-PGDH的酶活性。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法独立于肌细胞增殖。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用包括系统性施用或局部施用。