CN118139616A - 用于制备脂质纳米颗粒的高通量方法及其用途 - Google Patents

用于制备脂质纳米颗粒的高通量方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本文提供用于优化和制造各种脂质纳米颗粒(LNP)组合物的高通量方法及其用途。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于制造LNP组合物的高通量筛选方法，所述方法包括：获得包含有效载荷和多个能够自组装的分子的至少两种可混合的溶液，以及在一组受控的条件下混合所述至少两种溶液，通过这些条件，注入顺序、速度、体积、相比率和混合持续时间是变化的。在各种实施方案中，本公开使得能够确定最优包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率以及配制物稳定性。本文所公开的方法使得能够有效优化用于制备基于LNP的治疗剂的制造条件。

Description

用于制备脂质纳米颗粒的高通量方法及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年10月26日提交的美国临时专利申请号63/272,136的权益，该美国临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
背景技术
脂质纳米颗粒(LNP)已作为生物相容的和稳定的药物递送平台而广泛开发。用于制备脂质纳米颗粒的脂质通常是低毒性的生理脂质(生物相容的和可生物降解的)。脂质的理化多样性和生物相容性及其增强药物的口服生物利用度的能力使得脂质纳米颗粒成为非常有吸引力的药物递送载体。此外，基于脂质的配制物可通过多种方式积极地影响药物吸收，包括：增加溶解能力、防止药物在肠道稀释时沉淀、增强膜通透性、抑制外排转运蛋白、减少CYP酶、增强乳糜微粒产生和淋巴转运。LNP为用于siRNA递送的主要非病毒载体，并且截至2019年，在70％的纳米医学临床试验中被采用。Anselmo S等人，2019,Bioeng.Transl.Med.4(3):e10143。
基于脂质的纳米载体给药品的质量控制带来了另外的挑战，部分是由于其复杂的理化性质。根据美国FDA最近发布的关于脂质体药品的指南，这些配制物应指定质量属性，包括颗粒结构和尺寸分布、颗粒表面的理化性质、脂质含量、游离API的量和包封效率、以及物理和化学稳定性。不同的制备条件和参数可能影响LNP配制物的质量属性。例如，脂质组合物，特别是并入不同量和/或分子量的经聚乙二醇化的脂质，显著影响脂质体的胶体稳定性、细胞摄取和药代动力学(参见，例如，Allen等人，1991,Biochem Biophys Acta,1066(1):29-36；Garbuzenko等人，2005,Chem Phys Lipids,135(2):117-29；Immordino等人，Int J Nanomedicine 1(3)(2006)297-315)，而siRNA或ASO负载可通过电荷介导的与阳离子脂质的相互作用来控制。Schroeder等人，2010,J Intern Med 267(1):9-21；Cullis等人，2017,Mol Ther 25(7):1467-1475。LNP的下游性能也很大程度上取决于其质量属性。因此，筛选不同水平的这些参数非常需要具有简便程序和多种分析输出的高通量方法。
LNP结构和运载物递送受四种主要组分调节：可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质(PEG-脂质)。阳离子可电离脂质在LNP配制期间促进带负电荷的核酸的包封，并且有助于在内体pH范围5.5至6.5下运载物的胞质内递送。辅助脂质和胆固醇可增加结构稳定性，促进膜融合，并增强LNP的内体逃逸。添加PEG-脂质的影响是多方面的，并且导致了所谓的“PEG-困境”。PEG-脂质对于在自组装期间控制粒度并防止颗粒聚集是必要的。然而，亲水性PEG冠会阻碍颗粒表面与亲脂性细胞膜之间的相互作用，导致细胞内化不良。PEG的存在还可以阻止LNP经由受体介导的内吞作用进行细胞内化所必需的转运蛋白的表面结合。此外，PEG-脂质还通过充当血浆蛋白(包括调理素)吸附的空间屏障来延长体内LNP循环时间。虽然延长半衰期增加治疗性暴露量，但增加LNP循环可能诱导抗PEG抗体生成，导致不良过敏反应。
因此，实现有效的细胞内递送高度依赖于了解多元PEG-脂质的作用以克服PEG困境。先前的研究表明，调整PEG尺寸、架构、含量、碳尾类型、以及长度可调节LNP功效。
发明内容
为了满足基于脂质的纳米药物的筛选和优化的需要，本公开提供用于制备包封各种治疗性有效载荷的此类基于脂质的纳米颗粒的高通量筛选(HTS)工作流程。在各种实施例中，本发明提供一种经优化的溶剂注入方法，用于使用机器人液体处理器进行LNP的简便自组装。在各种实施例中，描述了有效载荷的最优脂质组成、总脂质浓度和负载量。
在各种实施例中，本公开涉及一种用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的经优化的高通量筛选方法，该方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。
如本文所指出的，脂质纳米颗粒(LNP)越来越多地用于改善核酸的递送效率和治疗性功效。已发现各种配制物参数可影响这些纳米颗粒配制物的质量属性。然而，目前缺乏有效的系统筛查方法来应对这些挑战。根据本发明，已经开发了自动化高通量筛选(HTS)工作流程，用于简化负载有例如反义寡核苷酸(ASO)的LNP的制备和分析性表征。根据本发明，可以在短短3小时内在完整的96孔板中进行该表征。
根据本发明，使用机器人液体处理器通过自动溶剂注入方法配制负载ASO的LNP，并且评定具有不同配制物组成和ASO负载的粒度分布、包封效率和稳定性。本文所述的结果表明经聚乙二醇化的脂质含量显著影响粒度分布，而可电离脂质/ASO电荷比率影响ASO的包封效率。此外，我们的HTS方法的结果与使用微流体配制器的最先进的放大方法的结果相关，从而为稳健的配制物开发和实验方法的设计提供一种新颖方法。该方法可以将材料使用量减少至约十分之一，从而将分析输出和信息积累改善约100倍。
已开发了一种新颖HTS工作流程来制备ASO-LNP并分析其PEG-脂质含量与粒度分布之间的关系。使用高通量液体处理器，以不同的PEG-脂质摩尔比(1至5mol％)制备并配制含有跨磷酸甘油酯、甘油二酯和神经酰胺家族的多种PEG-脂质的不同ASO-LNP的文库。本文描述PEG-脂质参数的影响，包括分子量(mw)、碳尾长度、以及摩尔比。另外，本文描述许多另外的PEG-脂质变量，包括PEG架构、脂质尾部饱和度、PEG-脂质电荷和接头化学。
在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，寡核苷酸为shRNA。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的尺寸为约500至3000个核苷酸。在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100Da与1000Da之间。
在各种实施例中，有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，第一溶液为水性缓冲液。在各种实施例中，第一溶液包含pH和渗透压受控的缓冲液。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括甲醇。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括乙醇。
在各种实施例中，自组装分子至少包括由至少一种脂质分子物质组成的脂质组分。在各种实施例中，至少一种脂质分子物质选自阳离子或可电离脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。在各种实施例中，所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。在各种实施例中，脂质的总浓度是变化的。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.4至约4mM之间变化。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组合物的约0.5％至约5％之间变化。在各种实施例中，有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。
在各种实施例中，LNP为聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，LNP为脂质体。在各种实施例中，LNP为脂蛋白纳米颗粒。在各种实施例中，将所述第一溶液注入所述第二溶液中。在各种实施例中，将所述第二溶液注入所述第一溶液中。在各种实施例中，最优参数为产生大于80％的有效载荷包封效率的那些参数。在各种实施例中，最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。在各种实施例中，LNP在4摄氏度的溶液中储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
在各种实施例中，本公开涉及一种用于优化用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的工艺的高通量方法，该方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。
在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，寡核苷酸为shRNA。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100Da与1000Da之间。
在各种实施例中，有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，第一溶液为水性缓冲液。在各种实施例中，第一溶液包含pH和渗透压受控的缓冲液。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括甲醇。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括乙醇。
在各种实施例中，自组装分子至少包括由至少一种脂质分子物质组成的脂质组分。在各种实施例中，至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。在各种实施例中，所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。在各种实施例中，脂质的总浓度是变化的。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.4至约4mM之间变化。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组合物的约0.5％至约5％之间变化。在各种实施例中，有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。
在各种实施例中，LNP为聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，LNP为脂质体。在各种实施例中，LNP为脂蛋白纳米颗粒。在各种实施例中，将所述第一溶液注入所述第二溶液中。在各种实施例中，将所述第二溶液注入所述第一溶液中。在各种实施例中，最优参数为产生大于80％的有效载荷包封效率的那些参数。在各种实施例中，最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。在各种实施例中，LNP在4摄氏度的溶液中储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
在各种实施例中，本公开涉及用于将有效载荷包封在液体纳米颗粒(LNP)制剂中的经优化的高通量方法，该方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。
在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，寡核苷酸为shRNA。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100Da与1000Da之间。
在各种实施例中，有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，第一溶液为水性缓冲液。在各种实施例中，第一溶液包含pH和渗透压受控的缓冲液。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括甲醇。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括乙醇。
在各种实施例中，自组装分子至少包括由至少一种脂质分子物质组成的脂质组分。在各种实施例中，至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。在各种实施例中，所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。在各种实施例中，脂质的总浓度是变化的。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.4至约4mM之间变化。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组合物的约0.5％至约5％之间变化。在各种实施例中，有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。
在各种实施例中，LNP为聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，LNP为脂质体。在各种实施例中，LNP为脂蛋白纳米颗粒。在各种实施例中，将所述第一溶液注入所述第二溶液中。在各种实施例中，将所述第二溶液注入所述第一溶液中。在各种实施例中，最优参数为产生大于80％的有效载荷包封效率的那些参数。在各种实施例中，最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。在各种实施例中，LNP在4摄氏度的溶液中储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
在各种实施例中，本公开涉及一种向有此需要的患者施用LNP制剂的方法，其中所述LNP制剂通过以下制造：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。
在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，寡核苷酸为shRNA。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100Da与1000Da之间。
在各种实施例中，有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，第一溶液为水性缓冲液。在各种实施例中，第一溶液包含pH和渗透压受控的缓冲液。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括甲醇。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括乙醇。
在各种实施例中，自组装分子至少包括由至少一种脂质分子物质组成的脂质组分。在各种实施例中，至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。在各种实施例中，所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。在各种实施例中，脂质的总浓度是变化的。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.4至约4mM之间变化。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组合物的约0.5％至约5％之间变化。在各种实施例中，有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。
在各种实施例中，LNP为聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，LNP为脂质体。在各种实施例中，LNP为脂蛋白纳米颗粒。在各种实施例中，将所述第一溶液注入所述第二溶液中。在各种实施例中，将所述第二溶液注入所述第一溶液中。在各种实施例中，最优参数为产生大于80％的有效载荷包封效率的那些参数。在各种实施例中，最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。在各种实施例中，LNP在4摄氏度的溶液中储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
在各种实施例中，本公开涉及用于将有效载荷包封在液体纳米颗粒(LNP)制剂中的经优化的高通量方法，该方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。
在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，寡核苷酸为shRNA。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100Da与1000Da之间。
在各种实施例中，有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，第一溶液为水性缓冲液。在各种实施例中，第一溶液包含pH和渗透压受控的缓冲液。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括甲醇。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括乙醇。
在各种实施例中，自组装分子至少包括由至少一种脂质分子物质组成的脂质组分。在各种实施例中，至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。在各种实施例中，所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。在各种实施例中，脂质的总浓度是变化的。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.4至约4mM之间变化。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组合物的约0.5％至约5％之间变化。在各种实施例中，有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。
在各种实施例中，LNP为聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，LNP为脂质体。在各种实施例中，LNP为脂蛋白纳米颗粒。在各种实施例中，将所述第一溶液注入所述第二溶液中。在各种实施例中，将所述第二溶液注入所述第一溶液中。在各种实施例中，最优参数为产生大于80％的有效载荷包封效率的那些参数。在各种实施例中，最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。在各种实施例中，LNP在4摄氏度的溶液中储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
在各种实施例中，本公开涉及一种用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的经优化的高通量筛选方法，该方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。
在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，寡核苷酸为shRNA。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100Da与1000Da之间。
在各种实施例中，有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，第一溶液为水性缓冲液。在各种实施例中，第一溶液包含pH和渗透压受控的缓冲液。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括甲醇。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括乙醇。
在各种实施例中，自组装分子至少包括由至少一种脂质分子物质组成的脂质组分。在各种实施例中，至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。在各种实施例中，所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。在各种实施例中，脂质的总浓度是变化的。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.4至约4mM之间变化。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组合物的约0.5％至约5％之间变化。在各种实施例中，有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。
在各种实施例中，LNP为聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，LNP为脂质体。在各种实施例中，LNP为脂蛋白纳米颗粒。在各种实施例中，将所述第一溶液注入所述第二溶液中。在各种实施例中，将所述第二溶液注入所述第一溶液中。在各种实施例中，最优参数为产生大于80％的有效载荷包封效率的那些参数。在各种实施例中，最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。在各种实施例中，LNP在4摄氏度的溶液中储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
在各种实施例中，本公开涉及用于将有效载荷包封在液体纳米颗粒(LNP)制剂中的经优化的高通量方法，该方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。
在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，寡核苷酸为shRNA。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100Da与1000Da之间。
在各种实施例中，有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，第一溶液为水性缓冲液。在各种实施例中，第一溶液包含pH和渗透压受控的缓冲液。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括甲醇。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括乙醇。
在各种实施例中，自组装分子至少包括由至少一种脂质分子物质组成的脂质组分。在各种实施例中，至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。在各种实施例中，所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。在各种实施例中，脂质的总浓度是变化的。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.4至约4mM之间变化。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组合物的约0.5％至约5％之间变化。在各种实施例中，有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。
在各种实施例中，LNP为聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，LNP为脂质体。在各种实施例中，LNP为脂蛋白纳米颗粒。在各种实施例中，将所述第一溶液注入所述第二溶液中。在各种实施例中，将所述第二溶液注入所述第一溶液中。在各种实施例中，最优参数为产生大于80％的有效载荷包封效率的那些参数。在各种实施例中，最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。在各种实施例中，LNP在4摄氏度的溶液中储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
在各种实施例中，本公开涉及一种通过包括下列步骤的工艺制造的经优化的脂质纳米颗粒(LNP)：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。
在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，寡核苷酸为shRNA。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100Da与1000Da之间。
在各种实施例中，有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，第一溶液为水性缓冲液。在各种实施例中，第一溶液包含pH和渗透压受控的缓冲液。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括甲醇。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括乙醇。
在各种实施例中，自组装分子至少包括由至少一种脂质分子物质组成的脂质组分。在各种实施例中，至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。在各种实施例中，所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。在各种实施例中，脂质的总浓度是变化的。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.4至约4mM之间变化。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组合物的约0.5％至约5％之间变化。在各种实施例中，有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。
在各种实施例中，LNP为聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，LNP为脂质体。在各种实施例中，LNP为脂蛋白纳米颗粒。在各种实施例中，将所述第一溶液注入所述第二溶液中。在各种实施例中，将所述第二溶液注入所述第一溶液中。在各种实施例中，最优参数为产生大于80％的有效载荷包封效率的那些参数。在各种实施例中，最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。在各种实施例中，LNP在4摄氏度的溶液中储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
在各种实施例中，本公开涉及用于将有效载荷包封在液体纳米颗粒(LNP)制剂中的经优化的高通量方法，该方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述LNP制剂。
在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，寡核苷酸为shRNA。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，所述多肽在约1,000Da与约10,000Da之间。在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100Da与1000Da之间。
在各种实施例中，有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，第一溶液为水性缓冲液。在各种实施例中，第一溶液包含pH和渗透压受控的缓冲液。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括甲醇。在各种实施例中，第二溶液的有机相包括乙醇。
在各种实施例中，自组装分子至少包括由至少一种脂质分子物质组成的脂质组分。在各种实施例中，至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。在各种实施例中，所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。在各种实施例中，脂质的总浓度是变化的。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.4至约4mM之间变化。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。在各种实施例中，经聚乙二醇化的脂质的百分比在总脂质组合物的约0.5％至约5％之间变化。在各种实施例中，有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。
在各种实施例中，LNP为聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，LNP为脂质体。在各种实施例中，LNP为脂蛋白纳米颗粒。在各种实施例中，将所述第一溶液注入所述第二溶液中。在各种实施例中，将所述第二溶液注入所述第一溶液中。在各种实施例中，最优参数为产生大于80％的有效载荷包封效率的那些参数。在各种实施例中，最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。在各种实施例中，LNP在4摄氏度的溶液中储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
在各种实施例中，本公开涉及一种用于对用于LNP形成的多个参数进行HTS筛选的工作流程，该工作流程包括：(i)机器人液体处理器；(ii)至少一个能够测量期望的LNP特性的仪器；和(iii)至少一个包含多个微孔的微量板；其中所述机器人液体处理器能够将多种溶液注入所述微孔中的每一者中；其中所述参数在微孔之间系统地变化；并且其中能够针对每个微孔测量所述期望的LNP特性。
在各种实施例中，该多个参数选自总脂质含量、自组装分子的类型；所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度；相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、体积和速度以及混合持续时间。在各种实施例中，期望的LNP特性选自由以下项组成的组：平均粒度、粒度分布、包封效率和颗粒稳定性。在各种实施例中，所述仪器能够进行动态光散射(DLS)、紫外-可见(UV-Vis)或荧光光谱分析。
附图说明
图1A至1F示出来自高速乙醇至缓冲液注入、随后进行多轮混合所产生的具有高ASO负载的均匀LNP的数据。使用不同的混合条件，将由0.4μmol总脂质和1.5mol％DSPE-PEG2000构成的LNP与ASO-1在N/P比率为1的情况下混合。使用机器人研究以0.1、0.5或0.9ml/s的速度反向注入顺序(乙醇到缓冲液或缓冲液到乙醇)、然后重复10次混合(图1A至1C)，或者以0.5或0.9ml/s的速度注入乙醇至缓冲液、然后重复10或20次混合(图1D至1F)。通过动态光散射(DLS)测量粒度(图1A和1D)和多分散性(图1B和1E)。通过OD260测量游离ASO-1并计算包封效率(图1C和1F)。结果为平均值±SD，n＝3；ns，不显著，****P<0.0001，通过(图1A至1C)双因素或单因素(图1D至1F)方差分析进行分析，然后进行Tukey多重比较。
图2示出用于负载ASO的LNP配制物的HTS工作流程。使用液体处理器通过自动溶剂注入方法制备九十六个样品(32种条件，n＝3)，这些样品随着4个水平的脂质组成、2个水平的总脂质浓度和4个水平的ASO负载量而变化，然后通过DLS和ASO包封(通过260nm处的吸光度)表征粒度分布。显示了样品板的代表性LEA(实验室执行和分析)LibraryStudio设计布局。
图3A至3E为负载ASO-1的LNP配制物的HTS分析。图3A为显示筛选设计的图像。在96孔板中筛选配制物参数，包括总脂质浓度(2个水平)、脂质组合物中并入的经聚乙二醇化的脂质含量(4个水平)和ASO的负载比率(4个水平)，其中每种条件重复3次。图3B至3D示出样品在PBS中稀释并通过DLS表征粒度分布。图3B为显示代表性尺寸分布的坐标图，其示出具有增加的量的添加到脂质组合物中的经聚乙二醇化的脂质的小颗粒群体。图3C至3D为热图，示出LNP的平均直径为45至145nm且％PD为10％-50％，但当脂质组合物中未并入DSPE-PEG2000时，具有多峰尺寸分布的大聚集体(直径为500至1500nm)除外，如“超出范围”黑点所指示。还显示了对总脂质浓度为2mM的样品进行的定量分析。图3E为显示样品等分试样(总脂质浓度2mM)的条形图，通过OD260测量等分试样的未包封的ASO的量以计算包封效率。结果为平均值±SD，n＝3；ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，且****P<0.0001，通过双因素方差分析然后进行Tukey多重比较来分析。该数据通过LC确认。
图4为显示在没有经聚乙二醇化的脂质的情况下制备的LNP产生大聚集体的条形图。在没有DSPE-PEG2000的情况下制备的负载ASO-1的LNP的平均颗粒直径(筛选条件在图3C至3D中的A行和E行中示出)显示为平均值±SD，n＝3；ns，不显著，*P<0.05，***P<0.001，通过双因素方差分析然后进行Sidak多重比较来分析。
图5A至5C为负载ASO-1的阳离子LNP配制物的HTS分析。筛选的阳离子LNP表现出60至120nm的平均直径(图5A)、10％-50％的多分散性(图5B)、以及在增加经聚乙二醇化的脂质的量方面与MC3 LNP相似的趋势。不存在DSPE-PEG2000会产生具有多峰尺寸分布的大聚集体，如通过“超出范围”黑点或通过白点所指示的不完整测量(由于大聚集体)。还显示了对总脂质浓度为2mM的样品进行的定量分析。(图5C)通过OD260测量样品中未包封的ASO的量以计算包封效率。结果为平均值±SD，n＝3；ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，且****P<0.0001，通过双因素方差分析然后进行Tukey(图5A至5B)或Sidak(图5C)多重比较来分析。
图6A至6C为在2mM总脂质浓度、不同量的DSPE-PEG2000和不同寡核苷酸负载下用可电离脂质配制的负载ASO-2的LNP的HTS分析。结果显示在粒度(图6A)、多分散性(图6B)和ASO的包封效率(图6C)方面与负载ASO-1的LNP(图3A至3E)相似的趋势。结果为平均值±SD，n＝3；ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，且****P<0.0001，通过双因素方差分析然后进行Tukey多重比较来分析。
图7A至7E为与使用进行微流体制备的那些结果相关的HTS分析结果。图7A为显示减小粒度和增加多分散性与增加经聚乙二醇化的脂质的量的相关性的坐标图。LNP采用不同摩尔比率的DSPE-PEG2000和固定的N/P比率2来制备。图7B为显示颗粒尺寸在高总脂质浓度下稳定的坐标图。在0.4、0.7、1或2mM的总脂质浓度，固定的1.5mol％DSPE-PEG2000，且N/P比率为2下制备LNP。图7C至7D显示粒度(图7C)是稳定的，而ASO的％EE(图7D)在高且过量的ASO负载下减少。LNP是在N/P比率＝5、2、1或0.5以及1.5mol％的DSPE-PEG2000下制备的。图7E。通过/>或采用不同配制物参数的高通量溶剂注入来制备的负载ASO-1的LNP的代表性冷冻TEM图像。放大的图像显示了使用两种方法以相同配制物参数制备的代表性LNP(由蓝色箭头表示)的相似结构模式。组中的HTS结果(图7A、7C和7D)来自图3中所示的相同筛选实验。结果为平均值±SD，n＝3，但对于图7D中的微流体结果，n＝1除外。
图8A至8B示出通过高通量溶剂注入方法或制备的负载ASO-1的MC3 LNP在4℃下2周的稳定性。图8A示出平均粒度，且图8B为显示历经2周的多分散性的图。总脂质浓度为2mM，N/P比率为1(HTS样品)或0.5(/>样品)，且PEG量从1.5到5mol％变化。结果为平均值±SD，n＝3；*P<0.05和**P<0.01与每个组内第0天的结果相比，通过单因素方差分析然后进行Dunnett多重比较来分析。随后的研究(未显示)证明了在4℃储存1个月后的类似结果。
图9为显示图8A至8B所示的HTS LNP在40℃历经2周的稳定性的坐标图。结果为平均值±SD，n＝3；*P<0.05与每组内第0天的结果相比，通过单因素方差分析然后进行Dunnett多重比较来分析。
图10为显示在40℃来自LNP的ASO泄漏的图。通过OD260测量2周内从LNP释放的ASO-1。结果为平均值±SD，n＝3；*P<0.05和ns，与1.5mol％DSPE-PEG2000组相比不显著，通过双因素方差分析然后进行Turkey多重比较来分析。
图11显示，与负载ASO的LNP的微流体制备相比，HTS方法显著节省了原材料并改善了分析性输出。所需的材料是针对总脂质为2mM、含有1.5mol％DSPE-PEG2000且N/P比率(基于MC3和ASO-1)为1的典型样品来计算的。
图12A至12B示出对ASO包封进行定量的替代方法。图12A为工作流程的示意图。通过高通量溶剂注入方法制备负载ASO的LNP，并与荧光探针Sybr-金混合，然后使用荧光读板器(Ex/Em＝495/550nm)进行定量。图12B为显示在不同N/P比率下制备的两种不同LNP配制物的可比较％包封效率的图。结果为平均值±SD，n＝2；ns，不显著。
图13A示出负载HiBiT肽的脂质体配制物的HTS工作流程。比较了两种纯化方法，包括高通量凝胶过滤和在96孔板中透析。通过高通量溶剂注入方法合成LNP，然后通过DLS表征粒度分布，并通过UV-Vis、发光和荧光表征游离运载物量。然后使用高通量凝胶过滤或透析来纯化LNP，然后分别使用UV-Vis、荧光和DLS来分析纯化效率、颗粒回收率和粒度稳定性。
图13B为显示筛选设计的图像。使用屏蔽经聚乙二醇化的脂质和与叠氮化物缀合的经聚乙二醇化的脂质两者在96孔板中筛选配制物参数，该参数包括不含MC3的DPPC LNP、含MC3的DPPC LNP、不含MC3的DSPC LNP和含MC3的DSPC LNP，其中每种条件重复3次。
图13C为热图，其显示LNP的平均直径为50至200nm，但当脂质组合物中未并入DSPE-PEG2000时，具有多峰尺寸分布的大聚集体除外，如“超出范围”黑点所指示。
图13D至13F为显示对纯化之前(图13D)和之后的游离肽浓度进行定量的表格。凝胶过滤和透析分别得到约98％(图13E)和约61％(图13F)的平均纯化效率。使用MWCO为40kD的96小柱板进行凝胶过滤并用PBS洗脱。使用MWCO为10kD的96孔透析板在3L PBS中透析过夜，其中更换介质3次。透析后数据点丢失是由于样品回收率低。
图13G至13H为显示通过凝胶过滤进行纯化后的颗粒回收率和对尺寸进行定量的数据。图13G回收率一般在80％-120％之间，但由于在不使用经聚乙二醇化的脂质的情况下制备的聚集样品所导致的较低数值除外。图13H通过凝胶过滤进行纯化后的粒度分布保持恒定。
图14示出本文描述的一般程序，涉及使用机器人液体处理器(左上)和高通量筛选(左下)通过自动溶剂注入来制备LNP，然后分析质量属性，例如粒度分布(右上)、ASO包封(中下)和LNP稳定性(右下)。
图15A至15E为ASO-LNP配制物文库的示意图。使用液体处理机器人通过将含有ASO的水相与含有具有不同PEG-脂质组成的溶解的脂质混合物的乙醇相快速混合来配制ASO-LNP(图15A)。每种脂质混合物包含选自磷酸甘油酯、甘油二酯或神经酰胺(图15B)家族的不同PEG-脂质，与可电离脂质MC3(图15C)、胆固醇(图15D)和辅助脂质DSPC(图15E)组合以生成具有54种不同配制物的ASO-LNP文库。
图16A至16F示出ASO-LNP的粒度分布。使用液体处理机器人用不同类型和数量的经聚乙二醇化的脂质制备ASO-LNP。相应ASO-LNP配制物中使用的PEG-脂质类似物由X轴标签下的#表示，且可从表1中引用。在96孔板设置中使用动态光散射来表征颗粒文库以鉴定跨阴离子(线性、支链)和中性PEG-脂质的不同子集的粒度(图16A至16C)和多分散性趋势(图16D至16F)，作为通过X轴值指示的PEG尺寸(Da)、通过不同颜色背景指示的C尾类型以及通过相应的条形颜色指示的ASO-LNP中PEG-脂质含量(mol％)的函数。
图17示出ASO-LNP HTS文库的行为趋势。图16A至16C中的平均颗粒直径使用经颜色编码的热图来表示。
图18示出命中ASO-LNP到规模放大的配制物的转化。ASO-LNP配制物是从我们的HTS文库中的1、3和5mol％数据中鉴定出来的，并使用微流体混合器进行了规模放大。通过比较两种配制物规模和技术的尺寸分布，验证了跨两种配制物规模和技术的平滑转换。
具体实施方式
用于药物递送的脂质纳米颗粒(LNP)由于其复杂的物理化学特性受到各种配制物参数的影响而在制造方面具有挑战性。在LNP制造中控制颗粒结构和尺寸分布、颗粒表面的理化性质、脂质含量、游离API的量和包封效率以及物理和化学稳定性是困难且复杂的。通过传统的批量方法筛选LNP配制物参数(包括脂质物质、百分比、浓度和载药量)需要大量时间和原材料。因此，优选具有最小材料输入以及高效制备和分析性输出的高通量筛选方法来确定具有最优质量属性的领先候选配制物。机器人液体处理器主要用于液体添加和转移，并且尚未用作具有微调仪器参数的LNP配制器。此外，缺乏集成有LNP制备和分析两者的简化高通量工作流程。本文提供用于使用机器人液体处理器基于期望的特性来优化LN P制造的高通量方法以用于基于注入的LNP形成。本文进一步提供经优化的LNP颗粒及其制造商的方法。
应当理解，本文的描述仅为示例性和解释性的，而不是对要求保护的本发明的限制。在本申请中，除非另外具体陈述，否则单数的使用包含复数。
此处使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，出于任何目的明确以全文引用的方式并入。如根据本公开所用，除非另外指明，否则以下术语应理解为具有以下含义：
在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”表示“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式、诸如“包括”和“被包括”的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，例如“元件”或“组分”的术语涵盖包含一个单位的元件和组分，以及包含多于一个亚单位的元件和组分。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物、啮齿动物等，其将会是特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中用于人类受试者时可互换使用。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸后者任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，诸如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，诸如2',3'-二脱氧核糖；以及核苷酸间键结修饰，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoro-anilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和磷酰胺酯(phosphoroamidate)。
术语“寡核苷酸”是指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如用于构建突变型基因。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。
术语“多肽”或“蛋白质”是指具有蛋白质的氨基酸序列的大分子，其包括天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代。术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖抗原结合分子、抗体或序列，其具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白质相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与天然蛋白质相比，此类片段还可以含有经修饰的氨基酸。有用的多肽片段包括抗原结合分子的免疫功能片段。
术语“分离的”是指(i)不含通常发现的至少一些其他蛋白质，(ii)基本上不含来自相同来源的其他蛋白质，例如来自相同物种，(iii)从至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或在自然界中与其缔合的其他材料，(iv)与在自然界中不与其缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)，或(v)在自然界中不存在。
多肽(例如，抗原结合分子)的“变体”包含氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸残基相对于另一多肽序列插入、缺失和/或取代至该氨基酸序列中。变体包括例如融合蛋白。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或者两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过将这些序列进行比对并比较所确定。“同一性百分比”意为所比较的分子中的氨基酸或核苷酸之间相同残基所占的百分比，并且基于所比较的最小分子的大小进行计算。对于这些计算，比对中的空位(如果有的话)优选地通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。
为了计算百分比同一性，所比较的序列通常以给出序列之间最大匹配的方式进行比对。可用于确定同一性百分比的计算机程序的一个实例为GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人，Nucl.Acid Res.,1984,12,387；威斯康星大学遗传学计算机集团，Madison,Wis.)。使用计算机算法GAP来比对待确定序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。将序列进行比对，以实现其相应氨基酸或核苷酸的最优匹配(“匹配跨度”，如通过算法所确定)。在某些实施例中，该算法还使用了标准比较矩阵(参见例如，对于PAM 250比较矩阵，Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure,5:345-352；对于BLO-SUM 62比较矩阵，Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89,10915-10919)。
术语“衍生物”是指包括除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代以外的化学修饰的分子。在某些实施例中，衍生物包含共价修饰，包括但不限于与聚合物、脂质或其他有机或无机部分的化学键合。在某些实施例中，经化学修饰的抗原结合分子可具有比未经化学修饰的抗原结合分子更长的循环半衰期。在一些实施例中，衍生抗原结合分子经共价修饰以包括一种或多种水溶性聚合物附接物，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇。
肽类似物通常作为非肽药物用于制药工业，其性质与模板肽的性质类似。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”或“模拟肽”。Fauchere,J.L.,1986,Adv.Drug Res.,1986,15,29；Veber,D.F.&Freidinger,R.M.,1985,Trends in Neuroscience,8,392-396；以及Evans,B.E.,等人，1987,J.Med.Chem.,30,1229-1239，这些文献通过引用并入本文以用于任何目的。
术语“治疗有效量”是指被确定为在哺乳动物中产生治疗性应答的免疫细胞或其他治疗剂的量。本领域普通技术人员容易确定此类治疗有效量。
术语“患者”和“受试者”可互换使用，且包括人类和非人类动物受试者以及患有经正式诊断的病症的受试者、未正式确认的病症的受试者、正在接受医疗护理的受试者、处于发生病症风险的受试者等。
术语“治疗”和“处理”包括治疗性治疗、预防性治疗和其中降低受试者发生病症或其他风险因素的风险的应用。治疗不需要完全治愈病症并且涵盖其中减轻症状或降低潜在危险因素的实施例。术语“预防”并不要求100％消除事件发生的可能性。相反，它表示在化合物或方法的存在下事件发生的可能性已经降低。
可使用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的方式或如本文所述来执行。上述技术和程序通常可以根据本领域众所周知的常规方法以及如引用的各种一般和更具体的参考文献中所述和整个本说明书中所讨论的来执行。参见例如：Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，其出于任何目的以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“实质上”或“基本上”是指与参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度相比高约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“基本上相同”或“实质上相同”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大约相同的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
如本文所用，术语“实质上不含”和“基本上不含”可互换使用，并且当用于描述组合物诸如细胞群或培养基时，是指不含指定物质的组合物，诸如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含指定物质，或通过常规方法测量不可检测到。在提及不存在组合物的特定物质或组分的情况下，类似的含义可应用于术语“不存在”。
如本文所用，术语“明显的”是指易于通过一种或多种标准方法检测到的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围或事件。术语“不明显”和“不明显的”及其等同形式是指通过标准方法不易检测或检测不到的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围或事件。在一个实施例中，如果事件发生的概率少于5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.001％或更少，则该事件是不明显的。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”应被理解为暗示包括所陈述的步骤或元件或者步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或元件或者步骤或要素组。在特定实施例中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义地使用。
如本文所用，“由...组成”意为包括且限于短语“由...组成”之中的任何内容。因此，短语“由...组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，并且可能不存在其他要素。
“基本上由...组成”是指包括在该短语之中列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于在本公开中针对所列出的要素而指定的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由...组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，但是没有其他要素是任选的并且可以存在也可以不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。
在整个说明书中对“一个实施例”、“实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某个实施例”、“另外的实施例”或“进一步的实施例”的引用或它们的组合意指结合该实施例描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书各处出现的上述短语不一定全部指相同实施例。此外，具体特征、结构或特性可在一个或多个实施例中以任何合适的方式组合。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比变化高达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在特定实施例中，术语“约”或“大约”当在数值之前时表示该值加上或减去15％、10％、5％或1％的范围，或其任何中间范围。
用于优化脂质纳米颗粒的制造的高通量筛选方法
为了满足对基于脂质的纳米药物进行筛选和优化的需要，本文的公开内容提供一种用于制备脂质纳米颗粒以及用于表征其粒度分布和有效载荷包封的高通量筛选(HTS)工作流程。
在各种实施例中，本公开涉及用于优化脂质纳米颗粒(LNP)的制造的高通量筛选方法。在各种实施例中，本文所公开的方法利用高通量筛选(HTS)筛选工作流程，该工作流程包括(i)机器人液体处理器，(ii)至少一种能够测量所期望LNP特性的仪器；和(iii)至少一个微量板，其中所述微量板包括多个微孔。在各种实施例中，LNP是使用溶剂注入方法通过上述HTS筛选工作流程形成的。参见，例如，Gentine等人，2012,J Liposome Res.22,18-30；Schubert和Muller-Goymann,2003,Eur.J.Pharm.Biopharm.55,125-131。
在各种实施例中，HTS工作流程包括能够测量所期望LNP特性的仪器。此类特性包括包封效率、平均粒度和粒度分布。物理稳定性也可以通过在储存后不同时间点测量粒度和有效载荷释放来确定。此类分析技术是本领域已知的，并且包括扫描/透射电子显微镜检查(SEM/TEM)、原子力显微镜检查(AFM)分析性超速离心(AUC)、动态光散射(DLS)、紫外(UV)光谱分析和流场分馏(FFF)。在各种实施例中，HTS工作流程包括能够进行DLS、UV-Vis或荧光光谱分析的仪器。在各种实施例中，本文所公开的方法利用高通量筛选(HTS)筛选工作流程，该工作流程包括(i)机器人液体处理器，(ii)能够执行DLS的仪器；(iii)能够对样品进行UV-Vis或荧光光谱分析的仪器；和(iv)至少一个微量板，其中所述微量板包括多个微孔。
在各种实施例中，HTS工作流程提供一种使用溶剂注入系统来优化LNP制造的方法。如本文所用，“溶剂注入系统”是指将包含含脂质自组装分子的第一溶液快速注入到第二溶液中。在各种实施例中，溶液为可相互混合的或可混溶的。在各种实施例中，第一溶液为水可混溶的溶剂。在各种实施例中，至少一种溶液为有机相溶剂。丙酮、乙醇、异丙醇和甲醇全部为用于LNP制备的合适溶剂。在各种实施例中，第一溶液为醇。在各种实施例中，第一溶液为乙醇。在各种实施例中，第一溶液为甲醇。
在各种实施例中，将由LNP包封的有效载荷溶解于所述第二溶液中。在各种实施例中，将由LNP包封的有效载荷溶解于所述第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷由第三水混溶的溶剂包封。
在各种实施例中，溶液中的至少两者为不同的相。在各种实施例中，将三种溶液注入到彼此中。在各种实施例中，将至少四种溶液注入到彼此中。在各种实施例中，存在至少一种有机相和至少一种水相。
在各种实施例中，溶液中的一者包含水性溶剂。在一些实施例中，水性溶剂为水性缓冲液。
将一种溶液注入到另一种溶液中是由机器人液体处理器控制的。如本文所用，术语“机器人液体处理器”意为能够自动将液体移液、转移并混合至多个并行的孔、微孔或其他液体储存器中的装置。在各种实施例中，机器人液体处理器能够将不同成分或不同量的液体并行递送至不同的孔、微孔或储液器。在各种实施例中，机器人液体处理器能够以不同的速度或持续时间并行地将液体移液、转移并混合至不同的孔、微孔或储液器。
在各种实施例中，在将所述一种溶液注入到所述第二溶液中之后，机器人液体处理器重复地吸取并重新注入所述溶液，从而混合至少两种溶液。在各种实施例中，改变该注入和/或混合的速度和持续时间以确定用于LNP形成的最优参数。在各种实施例中，注入和/或混合的速度从0.1ml/s到0.9ml/s变化。在各种实施例中，初始注入速度(即液体的第一次注入)以0.1ml/s至0.9ml/s的速度进行。参见图1。在各种实施例中，后续注入/混合历经1至10秒进行(以0.1ml/s至0.9ml/s混合10次)。
在各种实施例中，LNP形成在至少一个微量板中完成。在各种实施例中，微量板由多个微孔构成，其中形成条件(例如脂质物质、脂质组成、总脂质浓度、有效载荷、有效载荷的负载比率、相物质)在微孔之间是变化的。微量板可以是任何尺寸并且包括任何数量的微孔。在各种实施例中，微量板包括4、6、8、12、24、48、96、384、1536个微孔。
本文所提供的HTS方法的一个优点为LNP形成可以在少量溶液中快速发生。本文所公开的方法将材料消耗减少至十分之一，并将处理输出改善至100倍(参见图11)。与例如使用基于微流体的制备所形成的LNP相比，在微孔中进行LNP形成所使用的材料比少得多。在各种实施例中，微孔为约10μL、约20μL、约30μL、约40μL、约50μL、约60μL、约70μL、约80μL、约90μL、约100μL、约125μL、约150μL、约175μL、约200μL、约250μL、约350μL、约360μL、约400μL、约500μL、约1000μL、约2000μL、约3000μL、约4000μL的体积。
脂质纳米颗粒(LNP)
本文提供经优化的脂质纳米颗粒，以及用于优化这些脂质纳米颗粒“LNP”的制造的方法。如本文所用，术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指包含以下项的组合物：(i)多个自组装分子，其中所述自组装分子包括脂质组分；和(ii)有效载荷。使用本发明优化制造的LNP可以用于任何目的。在各种实施例中，经优化的LNP可用于递送疫苗。在各种实施例中，经优化的LNP可用于将药物递送至有此需要的患者。LNP可携带任何有效载荷，包括但不限于核酸、肽、蛋白质和小分子。此外，LNP可仅由脂质(例如脂质体)组成，或者可包括其他组分，诸如能够自组装的聚合物或蛋白质。
在各种实施例中，LNP为使用上述技术制造的经优化的LNP。在各种实施例中，经优化的LNP通过包括下列步骤的工艺制造：(i)获得包含水相的第一溶液；(ii)获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；(iii)将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；(iv)使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；(v)在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒，其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；(vi)测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；(vii)确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；和(viii)基于所述最优参数制造所述LNP制剂。
在各种实施例中，本发明涉及使用高通量方法制造LNP的方法，该方法包括以下步骤：(i)获得包含水相的第一溶液，(ii)获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；(iii)将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；(iv)使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；(v)使用所述机器人处理器在适合于LNP形成的条件下混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒。
自组装分子
如本文所用，术语“自组装分子”是指能够在没有来自外部来源的指导或管理的情况下进行限定排列的任何分子。经优化的LNP可由单一自组装分子物质组成，或者可以由多种自组装分子物质组成。在各种实施例中，经优化的LNP包括具有至少一种脂质分子物质的脂质组分。在各种实施例中，LNP可包括聚合物分子和/或蛋白质/肽分子。在各种实施例中，LNP的自组装分子可仅包括脂质分子。
脂质组分可包括单一脂质物质，或其可包含多于一种类型的脂质。在本发明的各种实施例中，LNP制剂中的脂质的相对组成将是不同的。在各种实施例中，当考虑用于制造给定LNP配制物的最优参数时，将评估不同的脂质物质或脂质物质的不同组合。在各种实施例中，至少一种脂质分子为经聚乙二醇化的。在各种实施例中，脂质组分可包括磷脂。
在各种实施例中，LNP配制物可包含一种或多种阳离子或可电离脂质。在一些实施例中，该一种或多种阳离子脂质选自由以下组成的组：cKK-E12、OF-02、C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、ICE(基于咪唑的)、HGT5000、HGT5001、HGT4003、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、3-(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)-6-(4-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)丁基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标23)、3-(5-(双(2-羟基十二烷基)氨基)戊-2-基)-6-(5-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)戊-2-基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标24)、N1GL、N2GL、V1GL和它们的组合。
在一些实施例中，该一种或多种阳离子或可电离脂质为氨基脂质。在各种实施例中，氨基脂质为伯胺、仲胺、叔胺、季胺、吡咯烷或哌啶。适用于本发明的氨基脂质包括WO2017180917中描述的那些，该文献通过引用并入本文。WO2017180917中的示例性氨基脂质包括段落[0744]中描述的那些，诸如DLin-MC3-DMA(MC3)、(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(L608)和化合物18。其他氨基脂质包括化合物2、化合物23、化合物27、化合物10和化合物20。适用于本发明的进一步的氨基脂质包括WO2017112865中描述的那些，该文献通过引用并入本文。WO2017112865中的示例性氨基脂质包括根据式(I)、(Ial)至(Ia6)、(lb)、(II)、(Ila)、(III)、(Ilia)、(IV)、(17-1)、(19-1)、(19-11)和(20-1)中的一者的化合物，以及段落[00185]、[00201]、[0276]的化合物。在一些实施例中，适用于本发明的进一步的氨基脂质包括WO2016118725中描述的那些，该文献通过引用并入本文。WO2016118725中的示例性阳离子脂质包括诸如KL22和KL25的那些。在一些实施例中，适用于本发明的进一步的氨基脂质包括WO2016118724中描述的那些，该文献通过引用并入本文。WO2016118725中的示例性阳离子脂质包括诸如KL10、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)和KL25的那些。
在一些实施例中，LNP配制物将包含一种或多种非阳离子脂质。在一些实施例中，该一种或多种非阳离子脂质选自DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPC(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油))。
在一些实施例中，LNP配制物包含一种或多种经PEG修饰的脂质。在一些实施例中，该一种或多种经PEG修饰的脂质包含共价连接至具有C6-C20长度的烷基链的脂质的长度高达5kDa的聚(乙二醇)链。PEG脂质可选自由以下组成的非限制性组：经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、将PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油和经PEG修饰的二烷基甘油。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在各种实施例中，LNP内的PEG化的脂质的百分比(即PEG密度)是变化的。研究发现LNP中的聚乙二醇(PEG)密度影响粒度、表面电荷和稳定性。在各种实施例中，PEG密度在约0.1％与约10％之间变化。在各种实施例中，PEG密度在约0.2％与约9％之间变化。在各种实施例中，PEG密度在约0.3％与约8％之间变化。在各种实施例中，PEG密度在约0.4％与约7％之间变化。在各种实施例中，PEG密度在约0.5％与约6％之间变化。在各种实施例中，PEG密度在约0.5％与约5％之间变化。
在各种实施例中，存在于用于LNP制备的溶液中的脂质组分的总浓度是变化的，以便实现任何给定LNP的最优特性。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.1mM与约8mM之间变化。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.2mM与约7mM之间变化。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.3mM与约6mM之间变化。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.4mM与约4mM之间变化。在各种实施例中，脂质的总浓度在约0.5mM与约3mM之间变化。
在各种实施例中，LNP将包含多于一种类型或种类的脂质。在各种实施例中，LNP将包含至少2种类型的脂质。在各种实施例中，LNP将包含至少3种类型的脂质。在各种实施例中，LNP将包含至少4种类型的脂质。在各种实施例中，LNP将包含至少5种类型的脂质。在各种实施例中，LNP将包含至少6种类型的脂质。在各种实施例中，LNP将包含至少7种类型的脂质。
纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种结构脂质。本发明的纳米颗粒组合物可包括结构脂质(例如，胆固醇粪生甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、麦角固醇、水解番茄碱、番茄碱、熊果酸或α-生育酚)。
纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种磷脂，诸如一种或多种(多)不饱和脂质。一般而言，此类脂质可包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可以选自由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。脂肪酸部分可以选自由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。还涵盖非天然物质，包括具有修饰和取代(包括分支、氧化、环化和炔烃)的天然物质。
在一些实施例中，纳米颗粒组合物可包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、或DSPC和DOPE两者。可用于本发明的组合物和方法的磷脂可选自由以下组成的非限制性组：DSPC、DOPE、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二-十一酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。
LNP组合物可包括除前述部分中描述的那些组分之外的一种或多种组分。例如，纳米颗粒组合物可包括一种或多种疏水性小分子，诸如维生素(例如，维生素A或维生素E)或甾醇。
LNP组合物还可包括一种或多种通透性增强剂分子、碳水化合物、聚合物、治疗剂、表面改变剂或其他组分。通透性增强剂分子可以是例如美国专利申请公开号2005/0222064中描述的分子。碳水化合物可包括单糖(例如，葡萄糖)和多糖(例如，糖原及其衍生物和类似物)。
聚合物可包括在LNP组合物中和/或用于包封或部分地包封LNP组合物。聚合物可以是可生物降解的和/或生物相容的。聚合物可选自但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳基化合物。例如，聚合物可包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟基丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚亚烷基诸如聚乙烯和聚丙烯、聚亚烷基二醇诸如聚(乙二醇)(PEG)、聚环氧烷(PEO)、聚对苯二甲酸烷二醇酯诸如聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯基酯诸如聚(乙酸乙烯酯)、聚卤乙烯诸如聚(氯乙烯)(PVC)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、经衍生的纤维素(诸如烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟基丙基纤维素、羧甲基纤维素)、丙烯酸聚合物(诸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)及其共聚物和混合物)、聚二噁烷酮及其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚富马酸丙二醇酯、聚甲醛、泊洛沙姆、聚氧胺、聚(原)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)和三亚甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮。
治疗剂可包括但不限于细胞毒性剂、化疗剂和其他治疗剂。细胞毒性剂可包括例如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、美登素类、拉奇霉素(rachelmycin)及其类似物。放射性离子也可以用作治疗剂并且可包括例如放射性碘、锶、磷、钯、铯、铱、钴、钇、钐和镨。其他治疗剂可包括，例如，抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、和5-氟尿嘧啶、以及丁卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、拉奇霉素、美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)以及顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素、博莱霉素、光神霉素和安曲霉素(anthramycin))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春碱、紫杉醇和美登素类)。
表面改变剂可包括但不限于阴离子蛋白质(例如，牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如，阳离子表面活性剂诸如二甲基二-十八烷基溴化铵)、糖或糖衍生物(例如，环糊精)、核酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如，乙酰半胱氨酸、艾蒿(mugwort)、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、臭根(clerodendrum)、溴己新、卡西司坦、依拉嗪酮、美司钠、氨溴索、索布雷罗、多碘醇、来托斯坦、斯普罗宁、硫普罗宁、凝溶胶蛋白、胸腺肽134、阿法链道酶(dornase alfa)、奈替克新(neltenexine)和厄多司坦)和DNA酶(例如，rhDNA酶)。表面改变剂可设置在LNP内和/或LNP组合物的表面上(例如，通过涂覆、吸附、共价键结或其他方法)。
除了这些组分之外，本发明的LNP组合物可包括可用于药物组合物的任何物质。例如，LNP组合物可包括一种或多种药用赋形剂或辅助成分，诸如但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、造粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体媒介物、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油类、防腐剂和其他物质。还可以包括赋形剂，诸如蜡、黄油、着色剂、包衣剂、调味剂和芳香剂。药用赋形剂为本领域公知的(参见，例如，Remington的The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006)。
稀释剂的实例可包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉和/或它们的组合。造粒剂和分散剂可选自由以下组成的非限制性清单：马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘果肉、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯基吡咯烷酮)(交联聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲基纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝十二烷基硫酸钠、季铵化合物和/或它们的组合。
表面活性剂和/或乳化剂可包括但不限于天然乳化剂(例如，阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄芪胶、软骨藻、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶体粘土(例如，膨润土[硅酸铝]和[硅酸铝镁])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、单硬脂酸三醋精、乙二醇二硬脂酸酯、甘油单硬脂酸酯和丙二醇单硬脂酸酯，聚乙烯醇)卡波姆(例如羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、粉末纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、[/>20]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇、[/>60]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[/>80]、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯[/>40]、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯[/>60]、脱水山梨醇三硬脂酸酯[65]、单油酸甘油酯、脱水山梨醇单油酸酯[/>80])、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯[/>45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚氧亚甲基硬脂酸酯和/>)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如/>)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚[/>30])、聚(乙烯基吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、十二烷基硫酸钠、F 68、/>188、西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶鎓、苯扎氯铵、多库酯钠和/或它们的组合。
粘合剂可以是淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；天然和合成胶(例如，阿拉伯树胶、海藻酸钠、爱尔兰苔藓提取物、潘瓦胶(panwar gum)、印度树胶、车前籽胶(mucilage of isapol husks)、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、硅酸镁铝和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；海藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；和它们的组合，或任何其他合适的粘合剂。
防腐剂包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、一硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和/或亚硫酸钠。螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。抗微生物防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、布罗波尔、西曲溴铵、氯化西吡啶、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、己替丁、咪脲、苯酚、苯氧基乙醇、苯乙醇、硝酸苯基汞、丙二醇和/或硫柳汞。抗真菌防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。醇防腐剂的实例包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苯酚、苯甲醇、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙醇。酸性防腐剂的实例包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢抗坏血酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包括但不限于生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸地特肟、西曲溴铵、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、十二烷基硫酸钠(SLS)、十二烷基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、GLYDANT对羟基苯甲酸甲酯、115、/>II、NEOLONETM、KATHONTM和/或/>
缓冲剂的实例包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、d-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、乳糖醛酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢二钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸钙(calcium hydroxide phosphate)、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、钾磷酸盐混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、钠磷酸盐混合物、氨丁三醇、氨基磺酸盐缓冲液(例如HEPES)、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇和/或它们的组合。润滑剂可选自由以下组成的非限制性组：硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石粉、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、十二烷基硫酸基镁、十二烷基硫酸钠和它们的组合。
油的实例包括但不限于扁桃仁、杏仁、鳄梨、巴巴苏、佛手柑、黑加仑籽、琉璃苣、杜松子、甘菊、芥花籽、香菜、巴西棕榈、蓖麻、肉桂、可可脂、椰子、鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻籽、香叶醇、葫芦、葡萄籽、榛子、牛膝草、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴、夏威夷核果、醒目薰衣草(lavandin)、薰衣草、柠檬、山苍子、夏威夷果、锦葵、芒果籽、白芒花籽、水貂、肉豆蔻、橄榄、橙子、橘刺鲷、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、檀香、sasquana、香薄荷(savoury)、沙棘、芝麻、乳木果油、硅油、大豆、向日葵、茶树、蓟、山茶、香根草、核桃和小麦胚芽油，以及硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、聚二甲基硅氧烷360、二甲基硅油、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二醇、油醇、硅油和/或它们的组合。
在各种实施例中，LNP可以是脂质体。在各种实施例中，LNP可以是聚合物脂质纳米颗粒。在各种实施例中，LNP可包括另外的蛋白质或肽分子。
有效载荷
本发明的LNP被制造为包封有效载荷。术语“有效载荷”是指任何化学实体、药物、药(此类药可以是但不限于小分子、无机固体、聚合物或生物聚合物)、小分子、核酸(例如，DNA、RNA、siRNA等)、蛋白质、肽等，其与本公开中描述的脂质纳米颗粒配制物复合。有效载荷还涵盖用于治疗或预防疾病、病痛、不适或身体功能紊乱的候选物(例如，具有未知的结构和/或功能)，并且包括但不限于测试化合物，这些测试化合物是已知的和潜在的治疗化合物两者。通过使用本公开的筛选方法进行筛选，可以确定测试化合物具有治疗作用。
在各种实施例中，有效载荷由一种或多种核苷酸构成。例如，在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，此类有效载荷包封的LNP可以通过N:P比率来表征。如本文所用，“N/P比率”是指带正电的聚合物胺(N＝氮)基团与带负电的核酸磷酸酯(P)基团的比率。N/P比率在细胞内有效载荷递送中起着重要作用。在各种实施例中，有效载荷的N:P比率是变化的。在各种实施例中，N:P比率在约0.5至约5之间变化。在各种实施例中，N:P比率在约.25与约10之间变化。在各种实施例中，N:P比率为约.1、约.2、约.25、约.5、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约6、约7、约8、约9或约10。
在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为siRNA。在各种实施例中，寡核苷酸为shRNA。寡核苷酸可以具有变化的长度。在各种实施例中，寡核苷酸的长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40个核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约2个与约40个核苷酸之间。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约4个与约35个核苷酸之间。在各种实施例中，寡核苷酸的长度为约10个和约30个核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约12个与约17个核苷酸之间。
在各种实施例中，有效载荷为mRNA。在各种实施例中，mRNA的长度为约500至3000个核苷酸。在各种实施例中，mRNA的长度为500个核苷酸、1000个核苷酸、1500个核苷酸、2000个核苷酸、2500个核苷酸、3000个核苷酸。在各种实施例中，mRNA编码抗原肽。在各种实施例中，mRNA为疫苗的一部分。
在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，多肽在约1,000至10,000Da之间。在各种实施例中，多肽为约500Da、约600Da、约700Da、约800Da、约900Da、约1,000Da、约1,500Da、约2,000Da、约2,500Da、约3,000Da、约3,500Da、约4,000Da、约4,500Da、约5,000Da、约5,500Da、约6,000Da、约6,500Da、约7,000Da、约7,500Da、约8,000Da、约8,500Da、约9,000Da、约9,500Da、约10,000Da、约15,000Da或约20,000Da。
在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100Da与1000Da之间。在各种实施例中，小分子为约50Da、约60Da、约70Da、约80Da、约90Da、约100Da、约150Da、约200Da、约250Da、约300Da、约350Da、约400Da、约450Da、约500Da、约550Da、约600Da、约650Da、约700Da、约750Da、约800Da、约850Da、约900Da、约950Da、约1,000Da、约1,500Da或约2,000Da。
药物制剂
在各种实施例中，经优化的脂质纳米颗粒可以全部或部分配制为药物制剂。本发明的药物制剂可包括一种或多种纳米颗粒组合物。例如，药物组合物可包括一种或多种纳米颗粒组合物，该纳米颗粒组合物包括一种或多种不同的有效载荷。本发明的药物组合物可进一步包括一种或多种药用赋形剂或辅助成分，诸如本文所述的那些。关于药物组合物和药剂的配制和制造的一般指南可在例如Remington的The Science and Practice ofPharmacy，第21版，A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006中获得。常规赋形剂和辅助成分可用于本发明的任何药物组合物中，除非任何常规赋形剂或辅助成分可能与本发明纳米颗粒组合物的一种或多种组分不相容。如果赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的组分的组合可能导致任何不期望的生物效应或其他有害效应，则该赋形剂或辅助成分可能与该组分不相容。
在一些实施例中，一种或多种赋形剂或辅助成分可占包括本发明的纳米颗粒组合物的药物组合物的总质量或体积的大于50％。例如，一种或多种赋形剂或辅助成分可构成药物常规的50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施例中，药用赋形剂为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施例中，赋形剂被批准用于人类和兽医用途。在一些实施例中，赋形剂被美国食品和药物管理局批准。在一些实施例中，赋形剂为药物级。在一些实施例中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
根据本公开的药物组合物中的一种或多种纳米颗粒组合物、一种或多种药用赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将依据接受治疗的受试者的特性、尺寸和/或条件并进一步依据该组合物的施用途径而变化。举例来说，药物组合物可包含0.1％至100％(wt/wt)的一种或多种纳米颗粒组合物。
纳米颗粒组合物和/或包括一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物可向任何患者或受试者施用，包括那些可受益于通过将mRNA递送至一种或多种特定细胞、组织、器官、或其系统或组(诸如肾系统)所提供的治疗效应的患者或受试者。尽管本文所提供的纳米颗粒组合物和包括纳米颗粒组合物的药物组合物的描述主要涉及适用于向人类施用的组合物，但本领域技术人员应当理解，此类组合物一般适用于向任何其他哺乳动物施用。为了使组合物适用于向各种动物施用而对适用于向人类施用的组合物进行修改是众所周知的，并且掌握普通技术的兽医药理学家可仅通过普通的(如果有的话)实验来设计和/或进行此类修改。考虑向其施用组合物的受试者包括但不限于人类、其他灵长动物和其他哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠。
包括一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物可通过药理学领域已知的或以后开发的任何方法来制备。一般而言，此类制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分带至关联，然后，如果需要或必要的话，将产品分割、成型和/或包装成所期望的单剂量单位或多多剂量单位。
根据本公开的药物组合物可作为单一单位剂量和/或作为多个的单一单位剂量批量制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”为包含预定量的活性成分(例如，纳米颗粒组合物)的药物组合物的离散量。活性成分的量一般等于将向受试者施用的活性成分的剂量和/或此类剂量的合适分数，诸如例如此类剂量的二分之一或三分之一。
本发明的药物组合物可制备成适用于多种施用途径和方法的多种形式。例如，本发明的药物组合物可制备成液体剂型(例如，乳剂、微乳剂、纳米乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂)、可注射剂型、固体剂型(例如，胶囊剂、片剂、丸剂、粉末剂和颗粒剂)、用于外用和/或透皮施用的剂型(例如，软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、粉末剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂和贴剂)、混悬剂、粉末剂和其他形式。
用于口服和肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药用乳剂、微乳剂、纳米乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型还可包含本领域中常用的惰性稀释剂，诸如例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇脂肪酸酯和它们的混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物还可包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在用于肠胃外施用的某些实施例中，将组合物与增溶剂诸如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或它们的组合混合。
可注射制剂，例如，无菌可注入水性或油性混悬剂可根据已知技术使用合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂配制。无菌可注射制剂可以是无菌可注射溶液剂、混悬剂及/或乳剂，其处于非毒性的肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中，例如，作为1,3-丁二醇的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂为水、林格溶液、USP和等渗氯化钠溶液。无菌的固定油传统上用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸诸如油酸可用于可注射剂的制备中。
可注射配制物可例如通过以下方式无菌化：通过除菌过滤器过滤，和/或通过以无菌固体组合物形式并入无菌化剂，该固体组合物可在使用前溶解或分散于无菌水中或其它无菌可注入介质中。
为了延长活性成分的效应，经常希望减缓对来自皮下或肌肉内注射的该活性成分的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，并继而可能取决于晶体尺寸和晶形。替代性地，通过将药物溶解或悬浮在油媒介物中实现对肠胃外施用的药物的延迟吸收。通过形成该药物在可生物降解聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯中的微胶囊化基质来制备可注射长效剂型。依据药物与聚合物的比率和所采用的具体聚合物的属性，可控制药物的释放速率。其它可生物降解聚合物的示例包括聚原酸酯和聚酐。也通过将药物入陷到与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备长效可注射配制物。
用于直肠和阴道施用的组合物通常为栓剂，其可通过将组合物与合适的非刺激性赋形剂诸如可可脂、聚乙二醇或栓蜡混合来制备，该赋形剂或载体在环境温度下为固体但在身体温度下为液体并因此在直肠或阴道腔体内融化并释放活性成分。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、膜剂、粉末剂和颗粒剂。在此类剂型中，将活性成分与下列物质混合：至少一种惰性的、药用赋形剂诸如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或填充物或增量剂(例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸)、粘合剂(例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶)、湿润剂(例如甘油)、崩解剂(例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)、溶液阻滞剂(例如石蜡)、吸收加速剂(例如季铵化合物)、润湿剂(例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯)、吸收剂(例如高岭土和膨润土、硅酸盐)和润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠)，以及它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型可包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物可用作软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充物，该填充物使用赋形剂诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。固体剂型片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可制备有包衣和外壳，诸如肠溶衣和药物配制领域中众所周知的其他包衣。它们可以任选地包含遮光剂，并且可以是仅或优先地在消化道的某些部分内任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。相似类型的固体组合物可用作软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充物，该填充物使用赋形剂诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。
用于组合物的外用或透皮施用的剂型可包括软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗液、凝胶剂、粉末剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂和/或贴剂。一般而言，活性成分在无菌条件下与药用赋形剂和/或如可能需要的任何需要的防腐剂和/或缓冲剂混合。另外，本公开考虑使用透皮贴剂，其通常具有提供化合物至身体的受控递送的另外的优点。此类剂型可例如通过将化合物溶解和/或分散于适当的介质中来制备。替代性地或另外，可通过提供速率控制膜和/或通过将化合物分散于聚合物基质和/或凝胶中来控制速率。
用于递送本文所述的皮内药物组合物的合适装置包括短针装置，诸如美国专利号4,886,499；5,190,521；5,328,483；5,527,288；4,270,537；5,015,235；5,141,496；和5,417,662中描述的那些装置。皮内组合物可通过限制针进入皮肤的有效刺入长度的装置来施用，诸如PCT公开WO 99/34850中描述的那些装置及其功能等同物。经由液体射流注射器和/或经由刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针将液体组合物递送至真皮的射流注射装置是合适的。射流注射装置在例如美国专利号5,480,381；5,599,302；5,334,144；5,993,412；5,649,912；5,569,189；5,704,911；5,383,851；5,893,397；5,466,220；5,339,163；5,312,335；5,503,627；5,064,413；5,520,639；4,596,556；4,790,824；4,941,880；4,940,460以及PCT申请WO 97/37705和WO 97/13537中描述。使用压缩气体来加速粉末形式的疫苗穿过皮肤外层到达真皮的弹道粉末/颗粒递送装置是合适的。替代性地或另外，常规注射器可用于皮内施用的经典mantoux氏方法。
适合于外用施用的配制物包括但不限于液体和/或半液体制剂，诸如搽剂、洗剂、水包油和/或油包水乳剂(诸如霜剂、软膏剂和/或糊剂)和/或溶液剂和/或混悬剂。可外用施用的配制物可例如包含约1％至约10％(wt/wt)的活性成分，但活性成分的浓度可高达活性成分在溶剂中的溶解度极限。用于外用施用的配制物可进一步包含本文所述的一种或多种另外的成分。
药物组合物可以以适合于经由颊腔进行肺部施用的配制物来制备、包装和/或销售。此类配制物可包含干颗粒，该干颗粒包含活性成分并且其直径在约0.5nm至约7nm或约1nm至约6nm范围内。此类组合物方便地为干粉形式，用于使用包括干粉储存器的装置(推进剂流可被引导至该干粉储存器以分散粉末)的装置和/或使用自推进溶剂/粉末分配容器(诸如包括溶解和/或悬浮于密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的装置)施用。此类粉末包含颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有大于0.5nm的直径，并且按数量计至少95％的颗粒具有小于7nm的直径。替代性地，按重量计至少95％的颗粒具有大于1nm的直径，并且按数量计至少90％的颗粒具有小于6nm的直径。干粉组合物可包括固体细粉稀释剂诸如糖并且方便地以单位剂量形式提供。
低沸点推进剂一般包括在大气压下沸点低于65°F的液体推进剂。一般而言，推进剂可构成组合物的50％至99.9％(wt/wt)，并且活性成分可构成组合物的0.1％至20％(wt/wt)。推进剂可进一步包含另外的成分，诸如液体非离子和/或固体阴离子表面活性剂和/或固体稀释剂(其可具有与包含活性成分的颗粒相同数量级的粒度)。
经配制用于肺部递送的药物组合物可提供溶液剂和/或混悬剂的液滴形式的活性成分。此类配制物可作为包含活性成分的水性溶液剂和/或稀醇溶液剂和/或混悬剂(任选无菌的)来制备、包装和/或销售，并且可使用任何气化和/或雾化装置方便地施用。此类配制物可进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于调味剂诸如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂诸如羟基苯甲酸甲酯。通过这种施用途径提供的液滴可具有在约1nm至约200nm范围内的平均直径。
本文描述为可用于肺部递送的配制物可用于药物组合物的鼻内递送。适合于鼻内施用的另一种配制物为包含活性成分且具有约0.2μm至500μm的平均颗粒的粗粉。此类配制物以鼻吸的方式施用，即通过鼻道从保持靠近鼻的粉末容器快速吸入。
适合于经鼻施用的配制物可例如包含约少至0.1％(wt/wt)至多至100％(wt/wt)的活性成分，并且可包含一种或多种本文所述的另外的成分。药物组合物可以以适合于颊腔施用的配制物来制备、包装和/或销售。此类配制物可以是例如使用常规方法制备的片剂和/或锭剂的形式，并且可以是例如0.1％至20％(wt/wt)的活性成分，余量包含口腔可溶解的和/或可降解的组合物以及任选使用的一种或多种本文所述的另外的成分。替代性地，适合于颊腔施用的配制物可包括包含活性成分的粉末剂和/或气雾化和/或雾化的溶液剂和/或混悬剂。此类粉末状、气雾化的和/或气雾化的配制物在分散时可具有在约0.1nm至约200nm范围内的平均颗粒和/或液滴尺寸，并且可进一步包含一种或多种本文所述的任何另外的成分。
药物组合物可以以适合于眼科施用的配制物来制备、包装和/或销售。此类配制物可以是例如滴眼剂的形式，包括例如活性成分在水性或油性液体赋形剂中的0.1/1.0％(wt/wt)溶液剂和/或混悬剂。此类滴剂可进一步包含缓冲剂、盐和/或本文所述的一种或多种其他任何另外的成分。其他可用的可眼科施用的配制物包括包含微晶形式和/或脂质体制剂中的活性成分的那些。滴耳剂和/或滴眼剂被认为在本公开的范围内。
包含一种或多种有效载荷的纳米颗粒组合物可通过任何途径施用。在一些实施例中，本发明的组合物，包括含有一种或多种本发明的纳米颗粒组合物的预防性、诊断性或成像组合物，通过多种途径中的一种或多种施用，这些途径包括口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、经皮或真皮内、皮间、直肠、阴道内、腹膜内、外用(例如通过粉末剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻腔、颊腔、肠内、玻璃体、瘤内、舌下、鼻内；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；作为口腔喷雾剂和/或粉末剂、鼻喷雾剂和/或气雾剂，和/或通过门静脉导管。在一些实施例中，组合物可以静脉内、肌肉内、皮内或皮下施用。然而，考虑到药物递送科学中可能的进展，本公开涵盖通过任何适当的途径递送本发明的组合物。一般而言，最适当的施用途径将取决于多种因素，包括包含一种或多种mRNA的纳米颗粒组合物的性质(例如，其在各种身体环境诸如血流和胃肠道中的稳定性)、患者的状况(例如，患者是否能够耐受特定的施用途径)等。
在某些实施例中，根据本公开的组合物可以以足以在给定剂量中递送与0.0001mg/kg至约10mg/kg、约0.001mg/kg至约10mg/kg、约0.005mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约0.0001mg/kg至约5mg/kg、约0.001mg/kg至约5mg/kg、约0.005mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约2mg/kg至约5mg/kg、约0.0001mg/kg至约1mg/kg、约0.001mg/kg至约1mg/kg、约0.005mg/kg至约1mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg、或约0.1mg/kg至约1mg/kg的剂量水平递送，其中1mg/kg的剂量提供每1kg受试者体重1mg组合物。在特定实施例中，可施用约0.005mg/kg至约5mg/kg的本发明纳米颗粒组合物的剂量。剂量可每天以相同或不同的量施用一次或多次，以获得所期望水平的mRNA表达和/或治疗、诊断、预防或成像效应。所期望的剂量可例如每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周递送。在某些实施例中，可使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送所期望的剂量。在一些实施例中，可例如在外科手术之前或之后或者在急性疾病、病症或病状的情况下施用单一剂量。
包含一种或多种有效载荷的纳米颗粒组合物可以与一种或多种其他治疗剂、预防剂、诊断剂或成像剂组合使用。“与...组合”并不旨在暗示药剂必须在相同时间施用和/或配制以用于一起递送，尽管这些递送方法在本公开的范围内。例如，可以组合施用包含一种或多种不同mRNA的一种或多种纳米颗粒组合物。组合物可以在一种或多种其他期望的治疗或医学程序同时、之前或之后施用。一般而言，每种药剂将以针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。在一些实施例中，本公开涵盖递送本发明的组合物或与改善其生物利用度、降低和/或改变其代谢、抑制其排泄和/或改变其在体内的分布的药剂组合的其成像、诊断或预防组合物。
将进一步认识到，组合使用的治疗性、预防性、诊断性或成像活性剂可在单一组合物中一起施用或在不同组合物中单独施用。一般而言，预期组合使用的药剂将以不超过它们单独使用的水平的水平使用。在一些实施例中，组合使用的水平可以低于单独使用的水平。
在组合方案中采用的疗法(治疗剂或程序)的特定组合将考虑期望的治疗剂和/或程序与待实现的期望的治疗效果的相容性。还将认识到，所采用的疗法可实现针对相同病症的期望的效应(例如，可用于治疗癌症的组合物可与化疗剂同时施用)，或者它们可实现不同的效应(例如，控制任何不良效应)。
实例
下列实例并不意味着限制，而是旨在为本发明提供进一步的信息和支持。下面的实例表明，针对最优有效载荷负载和粒度分布来优化LNP形成的HTS方法可直接转化为规模放大的制造工艺，诸如基于微流体的方法。这种HTS方法将材料消耗减少至约十分之一，并将加工输出提高至约100倍。这些结果指示HTS方法在优化LNP制造方面的稳健性和实用性，因此促进其临床转化。
材料和方法
材料
包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)、阳离子1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)在内的脂质购自Avanti Polar Lipids(AL,USA)。可电离脂质二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA，MC3)来自MCE(NJ,USA)，并且胆固醇来自Sigma(MO,USA)。内部合成了两种模型ASO：ASO-1(13聚体，钠盐形式)和ASO-2(16聚体，钠盐形式)。所有其他试剂至少为试剂级且不含DNase/RNAse。负载ASO的LNP的高通量制备
使用LEA Library Studio软件(Unchained Labs,CA,USA)在96孔板矩阵中设计，筛选LNP配制物的不同脂质组成、总脂质浓度和ASO负载量。在负载ASO-1的MC3 LNP的典型筛选中，将ASO以对应于5、2、1和0.5的N/P比的浓度溶解于柠檬酸盐缓冲液(25mM,pH 4)中，并使用机器人液体处理器(Freedom EVO,NC,USA)以150μl/孔分配到96孔板(Greiner Bio One 655101,NC,USA)中。通过使用/>机器人混合单个脂质储备液(20mg/ml，在乙醇中)并用乙醇稀释来制备具有不同总脂质量(0.2或0.4μmol/孔)和DSPE-PEG2000含量(占总脂质的0、1.5、3或5mol％)的脂质混合物。然后，以0.5ml/s的速度将50μl脂质快速分配到ASO板中，然后使用/>机器人通过10轮移液(每次100μl)进行相混合，以促进负载ASO的LNP的自组装。所得板含有96个LNP样品(200μl/孔)，在32个平行条件下变化(4个水平的ASO负载、2个水平的总脂质浓度和4个水平的脂质组成，n＝3)。在其他实验中，可电离脂质MC3被永久阳离子脂质DOTAP替换，或者13聚体ASO-1被16聚体ASO-2替换，并针对相似的配制物参数进行筛选。还探索了反向分配顺序(将ASO溶液注入到脂质混合物中)以及不同的混合速度和轮次，以优化相混合工艺。/>
负载ASO的LNP的表征
负载ASO的LNP的结构通过低温透射电子显微镜(cyro-TEM)测定。DLS用于测量粒度分布。简而言之，使用机器人将负载ASO的LNP在96孔玻璃底微量板(GreinerBio One 655892,NC,USA)中在磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)中稀释40倍，并通过使用读板器III(Wyatt Technology,CA,USA)来针对平均颗粒直径和粒度分布(以多分散性百分比％PD表示)进行分析。通过添加15μl 0.5M磷酸盐缓冲液(pH7.4)将六十μl等分试样调节至中性pH，然后转移至滤板(MWCO 100kD；AcroPrep,PALL,NY,USA)并对滤液进行离心(2,000xg，10分钟)。然后使用UV读板器(/>Spark,NC,USA)通过OD260对50μl滤液中未包封的ASO进行定量，并计算ASO的包封效率百分比(％EE)：
ASO标准品在相同的缓冲液中制备，并经历与LNP样品相同的过滤过程。对于稳定性实验，将在N/P比为1下制备的60μl LNP在PBS中直接稀释10倍并在4℃或40℃储存，并且分析粒度和历经2的ASO释放。负载ASO的LNP的微流体制备
微流体方法用于通过上述高通量方法筛选的负载ASO的LNP的放大规模的制备。简而言之，通过微流体装置(Precision NanoSystems,BC,Canada)将随总脂质浓度和DSPE-PEG2000含量而变化的不同浓度的ASO-1(溶解于柠檬酸盐缓冲液中)和脂质(溶解于乙醇中)在3/1的水缓冲液/乙醇相比率和12ml/min的恒定总流速下混合。收集的LNP通过基于离心(2,000xg，30分钟)的超滤(MWCO 10kD；Amicon,MilliporeSigma,MA,USA)进行纯化，以移除游离ASO和脂质，然后将缓冲液更换为PBS。通过DLS分析LNP的粒度分布，并且通过亲水相互作用液相色谱(HILIC)分析LNP的ASO包封。简而言之，通过溶解于0.75％Triton溶液中，从纯化的LNP中提取所包封的ASO。使用HILIC色谱柱(Waters ACQUITY UPLCBEH Amide，/>1.7μm，3mm x 50mm)、流动相A(在乙腈中的25mM乙酸铵/水，80/20，v/v)和流动相B(在乙腈中的25mM乙酸铵/水，40/60，v/v)进行在10分钟内0％-100％相B的梯度洗脱，流速为0.8ml/min，柱温为40℃，且检测波长为260nm。
统计分析
所有结果均以平均值±SD表示，n＝3。使用Prism 8.0(GraphPad软件)，通过单因素或双因素方差分析(ANOVA)然后进行Turkey、Sidak或Dunnett后检验来分析数据，以对多个组进行比较。P值小于0.05视为统计学显著的。
实例1
通过机器人液体处理器进行相混合工艺的优化
为了开发一种用于LNP制备的高通量溶剂注入方法，首先研究了相混合对于粒度和ASO包封的效应。在N/P比率为1的情况下，通过电荷介导的络合将ASO-1负载到由0.4μmol总脂质和1.5mol％DSPE-PEG2000构成的LNP中。根据仪器设置，使用液体处理器以从最小0.1ml/s到最大0.9ml/s的不同移液速度分配含有脂质的乙醇相并与水性ASO相混合，反之亦然。在低、中或高注入速度下进行乙醇到缓冲液注入然后混合10轮，产生了类似的LNP，其平均直径为约145nm(图1A)、％PD为约18％(图1B)且ASO的％EE为约83％(图1C)。相比之下，以低速(0.1ml/s)进行缓冲液到乙醇注入产生了更大(平均直径为约220nm)及更高多分散性(％PD为约41％)和更低％EE(约43％)的颗粒(图.1A至1C)。然而，增加注入速度产生与来自乙醇到缓冲液注入的那些相似的LNP，表明浓缩脂质在水性缓冲液中的快速消散是形成负载ASO的LNP所必需的。接下来，在乙醇到缓冲液注入的情况下制备LNP，然后在不同的移液次数和速度下进行相混合。中速(0.5ml/s)和10轮混合足以产生具有高ASO负载的均质LNP，而混合速度或轮次的进一步增加不影响粒度和％EE(图1D至1F)。因此，选择乙醇注入缓冲液并以0.5ml/s的速度混合10轮的条件用于后续研究。
实例2
负载ASO的LNP配制物的HTS
为了研究配制物参数对LNP主要质量属性的影响，设计了一种HTS工作流程，该工作流程允许简化这些配制物的制备和表征(图2)。ASO最初溶解于pH 4.0的柠檬酸盐缓冲液中，该值低于MC3的pKa(6.4)，使得脂质将会带有正电荷以促进电荷介导的络合。然后在进行后续分析之前，用磷酸盐缓冲液将溶液pH值调节至中性。
对于典型的筛选，将32个不同的样品(每个样品3个重复)在96孔板中进行平行筛选，这些样品随着2个水平的总脂质浓度、4个水平的由N/P比率控制的ASO负载和4个水平的经聚乙二醇化的脂质含量而变化(图3A)。在所研究的三个配制物参数中，经聚乙二醇化的脂质对于LNP形成是不可或缺的，因为当脂质组合物中没有并入PEG时，会产生多峰大聚集体(图3C至3D和图4)。增加经聚乙二醇化的脂质含量显著(P<0.0001)降低了平均烈度，即含有1.5、3和5mol％DSPE-PEG2000的脂质导致LNP直径分别为约120、约80和约60nm(图3C至3D)。然而，多分散性也增加，并且5mol的DSPE-PEG2000甚至产生亚群，这可能是由于小DSPE-PEG2000胶束的形成(图3C)。参见，例如，Johnsson等人，2003,Biophys J 85(6):3839-47；Gill等人，2015,J Drug Target23(3):222-31。
另一方面，ASO的％EE主要由N/P比率决定。N/P比率高于1且MC3中络合位点过多，导致％EE>80％；而相较于电荷平衡点两倍过量的ASO-1显著地将％EE降低至约50％(图3E)。当MC3被另一种阳离子脂质DOTAP替换(图5A至5C)或ASO-1被ASO-2替换(图6A至6C)时，也发现了类似的结果，证明了HTS结果的稳健性。
实例3
通过规模放大的LNP制备进行HTS结果的验证
然后通过将来自HTS方法的结果与来自微流体配制器的那些结果进行比较来验证所筛选的配制物参数对LNP质量属性的影响。这两种方法显示出相似的结果：(1)随着PEG含量的增加，LNP尺寸减小但多分散性增加(图7A)；(2)随着总脂质浓度增加至2mM，LNP尺寸是稳定的(图7B)；(3)当N/P比率<2时，LNP尺寸保持稳定(图7C)；(4)过量的ASO负载(N/P比率<1)引起％EE的显著减少(图7D)；并且(5)用相同的N/P比率和经聚乙二醇化的脂质含量制备的LNP显示出相似的结构(图7E)。此外，HTS方法成功地预测了粒度和多分散性对经聚乙二醇化的脂质含量的依赖性，这通过与线性回归R2>0.9的强相关性来显示(图7A)。
实例4
负载ASO的LNP的稳定性筛选
为了进一步研究不同粒度对配制物稳定性的影响，将使用不同PEG含量制备的负载ASO-1的LNP在PBS中稀释10倍，在4℃或40℃孵育，并监测历经2周的粒度分布。N/P比率保持为≥1且ASO的％EE为约90％，使得可以对在稳定性研究期间来自LNP的ASO泄漏进行定量。如图8A至8B中所示，通过高通量溶剂注入或制备的具有1.5或3mol％DSPE-PEG2000的LNP在4℃孵育期间类似地保持其初始平均粒度(图8A)和多分散性(图8B)。在40℃，含有1.5mol％DSPE-PEG2000的LNP在1周后显示粒度增加，同时保持恒定的多分散性(图9)。具有1.5mol％DSPE-PEG2000的LNP也在前3天内表现出最低限度的ASO泄漏，但在2周后与具有3mol％和5mol％DSPE-PEG2000的LNP相似的ASO泄漏水平(图10)。在4℃历经1个月未检测到ASO泄漏。
选择溶剂注入方法来进行LNP配制物的高通量制备，因为相混合工艺可由机器人液体处理器执行。与手动移液相比，多通道液体处理器允许进行96个样品的高通量、并行处理，并且实现跨孔的均匀液体分配和混合。关键工艺涉及快速、彻底地混合互溶相，例如溶解脂质的乙醇和溶解核酸的水性缓冲液，以便促进脂质自组装成球形脂质层和纳米颗粒结构。该方法已广泛用于制备脂质体，当乙醇相控制在50vol％以下时，生成均质的纳米颗粒。增加乙醇相比率和/或脂质浓度产生了大颗粒或聚集体，可能是由于低效的相混合，也如通过低速缓冲液至乙醇注入的结果所示(图1A至1B)。来自通过液体处理器进行的自动混合过程的结果与通过微流体方法制备的LNP的结果高度相关。流速比率(FRR，水性物至有机物流速)是微流体制备期间的关键配制物参数之一，且低FRR产生了较大的颗粒。低速缓冲液至乙醇注入代表低FRR的条件。因此，优化了自动混合条件，并将乙醇至缓冲液注入设定为0.5ml/s，在乙醇/水性物体积比为1/3(25vol％乙醇)下，然后进行10轮移液实现有效的相混合并生成具有高包封效率的均质颗粒。
接下来，开发了一个简化工作流程来筛选配制物变量，包括总脂质浓度、脂质组成和ASO负载量，以获得负载ASO的LNP的最优质量属性。为此，分别通过高通量DLS和OD260来测量ASO的粒度分布和％EE，以确定可以产生具有高ASO负载的均质纳米颗粒的条件。筛选结果指示，经聚乙二醇化的脂质含量显著影响粒度分布(图3B至3D、5A至5B和6A至6B)。以总脂质的1.5mol％并入的DSPE-PEG2000产生平均直径为约120nm的单峰纳米颗粒，而更多的PEG增加多分散性。由叔胺结构组成的可电离脂质已越来越多地用于基于脂质的核苷酸递送系统，与永久带电的阳离子脂质相比，表现出更好的细胞内递送效率和更低的细胞毒性。参见，例如，Cullis&Hope,2017,Mol.Ther.25(7):1467-1475；Sabnis等人，2018,Mol Ther.26(6):1509-1519；Semple等人，2010,Nature Biotechnology,28(2):172-176。与电荷介导的络合的负载机制一致，筛选结果指示N/P比率决定了ASO包封，在N/P比率＝1时显示％EE为约90％(图3E、5C和6C)，对应的负载能力为0.29mg RTR3833/mg脂质(2mM总脂质，含1.5mol％DSPE-PEG2000)。
重要的是，来自HTS方法的结果成功地预测了来自微流体配制器的那些结果，微流体配制器已越来越多地用于制备具有可规模化生产的纳米颗粒配制物。参见，例如，Belliveau等人，2012,Mol.Ther.Nucleic Acids,1,e37；van Swaay&deMellow,2013,LabChip 13(5):752-67。两种方法都显示了LNP尺寸对于经聚乙二醇化的脂质含量(图7A)、总脂质浓度(图7B)和N/P比率(图7C)的相似依赖性，并且ASO的％EE类似地由N/P比率控制(图7D)。这两种方法还在相同的配制物参数下产生了具有相似结构的LNP(图7E)。此外，这些负载ASO的LNP在40℃历经2周储存，表现出稳定的粒度分布(图8A至8B)以及约20％的所包封的ASO的泄漏(图10)。然而，与微流体制备相比，HTS方法表现出显著的优势，其将原材料节省至约十分之一，同时将制备和分析性输出提高至约100倍(与单次微流体运行相比，在微量板中并行处理96个样品)，指示其用于早期配制物筛选的巨大潜力(图11)。基于筛选结果，确定1.5mol％的DSPE-PEG2000和≥1的N/P比率将会产生具有均质的和稳定的粒度以及高ASO负载的最优LNP配制物。在将不同的脂质和其他ASO引入HTS系统后，同样的说法仍然有效，这表明该筛选平台可以将其应用扩展到各种类型的载体和运载物，诸如siRNA和单引导RNA。
HTS筛选方法展示了制备LNP的可重复配制物平台。从自动注入平台到微流体制剂的可转化结果创建了一种无缝工作流程来支持筛选和规模放大的配制物，并避免了因配制物不一致而引起的桥接研究。下一步是将当前的工作流程与下游体外筛选相结合，将负载ASO的LNP的理化属性与其治疗功效相关联。此外，可进一步改善工作流程，以解决更多配制物属性，诸如ζ电位以及通过液相色谱策略对API和赋形剂两者进行同步定量。Yamamoto等人，2011J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci879(20),3620-5；Li等人，2019,J Chromator A 1601:145-154。
在此实例中，开发了一种高通量方法来筛选配制物参数并解决负载ASO的LNP的质量属性。简化工作流程从自动液体分配和混合开始，然后进行高通量粒度和ASO包封分析，鉴定经聚乙二醇化的脂质含量和N/P比率分别为粒度分布和包封效率的主要决定因素。此外，HTS结果成功地预测了使用微流体进行规模放大制备的结果。稳健的筛选结果以及显著的材料节省和分析性输出的改善表明该方法在促进基于脂质的纳米颗粒配制物的开发方面具有巨大的前景。
实例5
对ASO包封进行定量的替代方法
使用荧光读板器来确定对ASO包封的定量。简而言之，通过高通量溶剂注入方法制备负载ASO的LNP，然后在TE缓冲液中稀释50倍，与等体积的经5000倍稀释的荧光探针Sybr-金混合，并且使用荧光读板器(Ex/Em＝495/550nm)对未包封的ASO进行定量。然后通过直接添加等体积的在1vol％Triton TE中经10000倍稀释的Sybr-金来破坏LNP(即，最终探针稀释度保持在10000倍并且Triton浓度为0.5vol％)(图12A)。然后进行荧光测量以对总ASO进行定量。百分比包封效率(％EE)计算如下：
计算显示在不同N/P比率下制备的两种不同LNP配制物的使用荧光和UV-Vis方法的可比较的％EE结果(图12B)。结果以平均值±SD表示，n＝2；ns，不显著，通过双因素方差分析和Sidak多重比较来进行分析。
实例6
负载HiBiT肽的LNP配制物的HTS
为了研究配制物参数对脂质体主要质量属性的影响，设计了一种HTS工作流程，该工作流程允许简化这些配制物的制备和表征进行。HiBiT最初溶解于补充有150mM NaCl(pH5.5)的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液中，并使用机器人液体处理器分配到微孔板中。与实例2类似地制备脂质混合物(图13A)。
对于典型的筛选，在96孔板中平行筛选32个不同的样品(每个样品3个重复)，这些样品随着4种类型的LNP配制物和经聚乙二醇化的脂质的8种组合而变化，屏蔽经聚乙二醇化的脂质和与叠氮化物缀合的经聚乙二醇化的脂质(图.13B)。在所研究的8个配制物参数中，经聚乙二醇化的脂质对于LNP形成是必需的，因为当脂质组合物中没有并入PEG时，会产生多峰大聚集体(图13C)。纯化之前和之后的游离肽浓度定量对于凝胶过滤和透析分别产生约98％和约61％的平均纯化效率(图13D至13F)。颗粒回收率一般在80％-120％之间，但由于在不使用经聚乙二醇化的脂质的情况下制备的聚集样品所导致的较低数值除外(图13G)。另外，在通过凝胶过滤进行纯化后，粒度分布保持恒定(图13H)。
实例7
HTS鉴定了不同PEG-脂质属性对ASO-LNP尺寸分布的影响。
负载ASO的LNP的HTS制备和表征
LNP配制物中的胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和所有线性经聚乙二醇化的脂质均购自Avanti Polar Lipids(AL,USA)。支链经聚乙二醇化的脂质N-[2',3'-双(甲基聚氧乙烯氧基)丙烷-1'-氧羰基]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-2arm-PEG-2k)商业来源自NOF美国公司(NY,USA)。经聚乙二醇化的脂质的完整列表列于
下表1中。
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用于LNP配制物的可电离脂质二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA；MC3)购自MedChemExpress(NJ,USA)。具有硫代磷酸酯主链的17聚体ASO(分子量5635Da，Na盐形式)由BioSpring GmbH(Frankfurt,Germany)采用固相合成法定制合成。所有其他试剂均不含DNA酶/RNA酶，并从其商业来源不经进一步纯化而使用。
使用先前报导的高通量方法制备具有各种经聚乙二醇化的脂质的LNP。简而言之，将ASO以93.9μg/mL溶解于柠檬酸盐缓冲液(25mM,pH 4.0)中，并使用TECAN Freedom机器人液体处理器(Tecan Life Sciences,NC,USA)以150μL/孔分配到96孔板(Greiner Bio One 655101,NC,USA)中。使用自动化设置，在乙醇中以40:10:(50-X):X的摩尔比制备由MC3、DSPC、胆固醇和相应的PEG-脂质类似物构成的不同脂质混合物，其中X＝1、3或5；且总脂质浓度为4mM，以维持所得ASO-LNP的N:P＝2。N:P定义为可电离脂质中带正电荷的胺(N)基团与核酸主链上带负电荷的磷酸根(P)基团的摩尔比。将脂质混合物转移至12通道储液板(Axygen RES-MW12-LP或-HP，NC,USA)，并使用机器人将50μL脂质相注入96孔板中的ASO溶液中(速度＝0.5mL/s，然后以0.1mL/循环混合10个循环)，在1:3的乙醇：水相体积比率下产生1mM总脂质/孔。每种LNP配制物均以一式三份制备。将负载ASO的LNP在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中稀释，以实现每孔1mM总ASO的最终浓度。将每个样品的小等分试样转移到玻璃底96孔板(Greiner Bio One 655892,NC,USA)中，并在PBS中进一步稀释50倍，以使用/>读板器III(Wyatt Technology,CA,USA)通过动态光散射(DLS)来表征其粒度分布。负载ASO的LNP的微流体制备和表征
使用微流体混合方法对通过HTS方法鉴定的选定阳性和阴性命中ASO-LNP配制物进行规模放大制备。将由MC3、DSPC、胆固醇和选择性PEG-脂质类似物构成的不同脂质混合物以40:10:(50-X):X的摩尔比溶解于乙醇中，其中X＝1、3或5，且总脂质浓度为4mM。使用微流体层流混合装置(NanoAssemblrTM Benchtop，Precision NanoSystems,BC,Canada)以1:3的体积比率和12mL/min的总流速将乙醇流与溶解于柠檬酸盐缓冲液(25mM,pH 4.0)中的含有93.9μg/mL ASO的水性流快速混合。经配制的LNP通过以2,000g离心超滤(MWCO 10kDa；Amicon,MilliporeSigma,MA,USA)纯化30分钟，以移除游离ASO和脂质，然后将缓冲液更换为不含RNA酶的PBS。使用DLS来分析经纯化的配制物的粒度分布。
统计分析
使用Prism 9.2.0(GraphPad Software,San Diego,CA)进行数据绘制和统计分析。所有结果均以平均值±SEM表示，n＝3，含有3个经平均的内部重复。
用于ASO-LNP配制物文库的多种PEG-脂质
在目前的HTS脂质文库设计中，我们选择DLin-MC3-DMA(MC3)、DSPC和胆固醇作为所有ASO-LNP配制物的脂质成分，而PEG-脂质含量是变化的(图15A和15B)。MC3、DSPC和胆固醇的组合用于(首个FDA批准的siRNA-LNP配制物)中，并且在许多临床前LNP模型系统中用作寡核苷酸递送基准。为了系统地了解PEG-脂质特性对LNP运载物递送的影响，在ASO-LNP形成过程中将若干PEG-脂质类似物与MC3、DSPC和胆固醇组合使用(表1)。药物递送应用中常用的PEG-脂质选自生物学相关的脂质家族，包括阴离子磷酸甘油酯以及带中性电荷的甘油二酯和神经酰胺。我们包括了每种PEG-脂质类型的多种类似物，具有不同的C尾长度或PEG链尺寸(图15B)。本研究还评定了架构(线性或支链)和PEG-脂质C尾饱和度的影响。
除了测试单个PEG-脂质特征外，我们还改变PEG-脂质浓度以评定其对于配制物特性和运载物递送的影响。通过调节脂质混合物中胆固醇的摩尔比，将LNP中PEG-脂质的摩尔比调整为1、3和5mol％。使用这些PEG-脂质参数，在基于96孔板的HTS工作流程中制备了包括54种不同ASO-LNP配制物的文库，用于进行理化表征以及对ASO递送的体外评估。
PEG含量控制ASO-LNP的粒度分布
如通过DLS所测量，54种不同ASO-LNP配制物的平均流体动力学直径范围在52与212nm之间，并且表现出粒度随着经聚乙二醇化的脂质的摩尔比从1％增加至5％而减小的一般趋势(图16A至16C)。以1mol％配制的具有短PEG-脂质(M.W.<1000Da)的LNP(例如#6和#10)的最大粒度为212nm。相比之下，5mol％的长PEG脂质(#9)产生最小的颗粒(52nm)，这可能是由于PEG链增加了空间位阻以防止颗粒生长。具体地，随着LNP组合物中PEG尺寸以及PEG摩尔比的增加，阴离子PEG脂质表现出粒度的明显减小(图16A)。相比之下，用中性甘油二酯和神经酰胺PEG-脂质制备的LNP没有表现出粒度与PEG含量之间的相关性，特别是在配制物#13和#16中看出了不相关性(图16B)。这些发现表明，带电的头部基团之间的排斥力在确定阴离子经聚乙二醇化的LNP的粒度以及PEG链的空间屏障方面发挥重要作用。另外，线性与支链DSPE-PEG2k变体(#8和#9)的比较表明PEG结构对流体动力学直径没有显著影响(图16C)。平均颗粒直径也显示在经颜色编码的热图中以指示尺寸趋势(参见图17)。
虽然增加PEG-脂质摩尔比对于颗粒直径具有电荷依赖性影响，但PEG-脂质含量与LNP多分散性(％PD)具有总体正相关性(图16D至16F)。这一趋势的显著例外为#6、#15和#16。PEG-脂质#15和#16来自带中性电荷的神经酰胺-C8 PEG-脂质家族，它们也显示PEG-脂质含量与粒度之间没有相关性。与我们之前的数据一致，以5mol％配制的具有长PEG臂(2000Da)的PEG-脂质具有高度多分散的尺寸分布，可能是由于胶束PEG-脂质亚群的存在。
我们还比较了具有不同C尾长度(DMPE/DPPE/DSPE、DSG/DMG和Cer-C8/Cer-C16)、饱和水平(DSPE/DOPE)和PEG连接子化学性质(DMPE/DMG和DSPE/DSG)的脂质锚定基团的效应。PEG-脂质疏水性尾部对于LNP尺寸或多分散指数没有显著效应，这与PEG-脂质的亲水性PEG组分的重要性形成对比。之前曾报道过用含有14、16或18碳链的PEG-脂质制备的siRNA-LNP也有类似的观察结果。
对于LNP粒度的回归分析
线性回归模型证实了PEG-脂质电荷、摩尔比和PEG尺寸对于LNP粒度分布的显著性(p<0.05)，而相比之下，不同C尾属性的影响并不显著(表2和表3)。
阴离子PEG-脂质的线性回归模型：
ASO-LNP流体动力学直径(nm)＝225.71-0.44*碳尾长度(#C)-0.05*PEG大小(Da)-14.12*PEG-脂质mol％
表2
系数 标准误差 t Stat P值
截距 225.7093718 26.01575913 8.67587106 6.4911E-10
C尾长度(#C) -0.445909286 1.509467593 -0.2954083 0.76959034
PEG尺寸(Da) -0.047938375 0.004190871 -11.438761 7.6631E-13
PEG-脂质mol％ -14.12145396 1.568862698 -9.001077 2.788E-10
型号总结：
R平方＝0.869，调整后的R平方＝0.857，标准误差＝15.37，观测值＝36。方差分析：显著性F＝3.16x 10-14
中性PEG-脂质的线性回归模型：
ASO-LNP流体动力学直径(nm)＝172.68+1.29*碳尾长度(#C)-0.03*PEG大小(Da)-6.21*PEG-脂质mol％
表3
系数 标准误差 t Stat P值
截距 172.6862673 17.81521134 9.693192182 1.3723E-07
C尾长度(#C) 1.294659428 1.101953097 1.174877072 0.25964028
PEG尺寸(Da) -0.031757849 0.006357037 -4.99569956 0.00019607
PEG-脂质mol％ -6.209444167 2.271734507 -2.733349407 0.0161647
型号总结：
R平方＝0.700，调整后的R平方＝0.636，标准误差＝15.74，观测值＝18。方差分析：显著性F＝5.9x 10-4
综上所述，这些数据表明LNP尺寸分布主要取决于表面稳定PEG含量，而不是脂质尾属性，并且这种PEG依赖性在阴离子PEG-脂质支架中尤其占主导地位。
实例8
用于鉴定ASO-LNP行为趋势的HTS
本发明的HTS方法允许以96孔板格式快速制备和表征不同的ASO-LNP配制物。该高通量工作流程可以无缝扩展，以评估靶标细胞系中的LNP递送。该HTS方法导致显著的材料和时间节约。此外，它通过直接比较相同环境中的ASO-LNP配制物来生成可靠的数据集，从而最大限度地减少处理变化。
HTS方法还具备数据分析和解释的优势。首先，可以在短时间内生成涉及大量配制物的表征(图16A至16F)。其次，全面筛选允许鉴定在狭窄样本量中被掩盖的相关性。例如，我们的HTS数据集指示，PEG-脂质的亲水性PEG组分控制LNP粒度分布(图16A至16F)。此类行为趋势可通过使用回归分析的预测相关性来定量地定义。线性回归模型证实了与C尾属性相比，PEG脂质浓度和PEG尺寸(p<0.05)对于LNP尺寸分布的显著电荷依赖性影响。通过迭代筛选更广泛的样品集并结合先进的机器学习算法，可以进一步改善这些相关性的准确性。
HTS预测规模放大配制物的ASO-LNP性能
与所有筛选测定一样，HTS方法的价值在于其预测规模放大系统中行为的能力。因此，我们验证了LNP属性从HTS方法到可扩展的微流体方法的可转化性，以生产自组装纳米颗粒配制物。从HTS文库中选择用特定PEG物质和摩尔比配制的六种命中ASO-LNP(#13-1％、#16-3％、#1-5％、#10-1％、#8-3％、#9-5％)。根据一定的逻辑依据来选择代表性配制物以包括多种PEG-脂质阵列，该阵列包括甘油二酯(#13)、神经酰胺(#16)和磷酸甘油酯(#1)PEG-脂质，这些PEG-脂质具有不同的脂质尾饱和水平(#10、#8)、PEG架构(#9)以及PEG脂质含量(1、3、5mol％)，以确保跨宽范围的LNP中PEG含量来对HTS可预测性进行可靠验证。使用微流体混合器(NanoAssemblrTM Benchtop)在与HTS对应物相似的配制条件下将选定的ASO-LNP规模放大10倍。
用微流体制备的6种不同LNP的DLS表征表明，它们的流体动力学直径与使用HTS方法配制的相应LNP相似。(图18)。HTS方法可靠地预测了物理化学特性，并且在基于微流体的配制物中提供了这些属性的平滑转换。目前，微流体技术因其可扩展性(从<mL到L)适合于基于LNP的药物递送媒介物的临床前和临床转化而得到了广泛的应用。因此，预测性HTS方法可用于规模放大的配制物，同时节省在可扩展的微流体平台上优化配制物通常所需的大量资源。
根据本发明，描述了高通量筛选方法以将LNP尺寸分布趋势作为各种PEG-脂质参数(如PEG尺寸、LNP中的PEG-脂质含量、碳尾长度等)的函数进行表征。本文所述的发明可进一步与机器学习算法相结合，以鉴定和定义用HTS获得的巨大数据集之间的定量相关性。
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Claims (238)

1.一种用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的经优化的高通量筛选方法，所述方法包括：
a.获得包含水相的第一溶液；
b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；
c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；
d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；
e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器来混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；
f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；
g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及
h.基于所述最优参数来制造所述LNP制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。
6.根据权利要求2至5所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其中mRNA的尺寸为约500至约3000个核苷酸的长度。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da至约10,000Da之间。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述小分子在约100Da至1000Da之间。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一溶液包含pH受控和渗透压受控的缓冲液。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一种脂质分子物质的脂质组分。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种脂质分子物质选自由以下项组成的组：阳离子脂质物质、可电离脂质物质、非阳离子脂质物质、磷脂物质和非磷脂物质。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
22.根据权利要求1所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。
23.根据权利要求22所述的方法，其中脂质的所述总浓度在约0.4至约4mM之间变化。
24.根据权利要求1所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。
25.根据权利要求24所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的所述百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。
26.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的N:P比率是变化的。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述N:P比率在约0.5至约5之间变化。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述LNP为聚合物脂质纳米颗粒。
29.根据权利要求1至27所述的方法，其中所述LNP为脂质体。
30.根据权利要求1至27所述的方法，其中所述LNP为脂蛋白纳米颗粒。
31.根据权利要求1所述的方法，其中将所述第一溶液注入所述第二溶液中。
32.根据权利要求1所述的方法，其中将所述第二溶液注入所述第一溶液中。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的包封效率的那些参数。
34.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。
35.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述LNP在4摄氏度溶液中的储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
36.一种用于优化用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的工艺的高通量方法，所述方法包括：
a.获得包含水相的第一溶液；
b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；
c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；
d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；
e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器来混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；
f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；
g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及
h.基于所述最优参数来制造所述LNP制剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。
41.根据权利要求37至42所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。
43.根据权利要求42所述的方法，其中mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。
44.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
45.根据权利要求45所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da至约10,000Da之间。
46.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述小分子在约100Da至1000Da之间。
48.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
49.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
50.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
51.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一溶液包含pH受控和渗透压受控的缓冲液。
52.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
53.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
54.根据权利要求36所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一种脂质分子物质的脂质组分。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
57.根据权利要求36所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。
58.根据权利要求57所述的方法，其中脂质的所述总浓度在约0.4至约4mM之间变化。
59.根据权利要求54或55所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。
60.根据权利要求59所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的所述百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。
61.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的N:P比率是变化的。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述N:P比率在约0.5至约5之间变化。
63.根据权利要求36至62中任一项所述的方法，其中所述LNP为聚合物脂质纳米颗粒。
64.根据权利要求36至62所述的方法，其中所述LNP为脂质体。
65.根据权利要求36至62所述的方法，其中所述LNP为脂蛋白纳米颗粒。
66.根据权利要求36所述的方法，其中将所述第一溶液注入所述第二溶液中。
67.根据权利要求36所述的方法，其中将所述第二溶液注入所述第一溶液中。
68.根据权利要求36至67中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的包封效率的那些参数。
69.根据权利要求36至67中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。
70.根据权利要求36至67中任一项所述的方法，其中所述LNP在4摄氏度溶液中的储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
71.一种用于将有效载荷包封在液体纳米颗粒(LNP)制剂中的经优化的高通量方法，所述方法包括：
a.获得包含水相的第一溶液；
b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；
c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；
d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；
e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器来混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；
f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；
g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及
h.基于所述最优参数来制造所述LNP制剂。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。
76.根据权利要求72至75所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
77.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。
78.根据权利要求77所述的方法，其中mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。
79.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da至约10,000Da之间。
81.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述小分子在约100Da至1000Da之间。
83.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
84.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
85.根据权利要求71所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
86.根据权利要求71所述的方法，其中所述第一溶液包含pH受控和渗透压受控的缓冲液。
87.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
88.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
89.根据权利要求71所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一种脂质分子物质的脂质组分。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。
91.根据权利要求89或90所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
92.根据权利要求89或90所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。
93.根据权利要求92所述的方法，其中脂质的所述总浓度在约0.4至约4mM之间变化。
94.根据权利要求89或90所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。
95.根据权利要求94所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的所述百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。
96.根据权利要求72至78中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的N:P比率是变化的。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述N:P比率在约0.5至约5之间变化。
98.根据权利要求71至97中任一项所述的方法，其中所述LNP为聚合物脂质纳米颗粒。
99.根据权利要求71至97所述的方法，其中所述LNP为脂质体。
100.根据权利要求71至97所述的方法，其中所述LNP为脂蛋白纳米颗粒。
101.根据权利要求71所述的方法，其中将所述第一溶液注入所述第二溶液中。
102.根据权利要求71所述的方法，其中将所述第二溶液注入所述第一溶液中。
103.根据权利要求71至102中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的包封效率的那些参数。
104.根据权利要求71至102中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。
105.根据权利要求71至102中任一项所述的方法，其中所述LNP在4摄氏度溶液中的储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
106.一种向有需要的患者施用LNP制剂的方法，其中所述LNP制剂通过以下来制造：
a.获得包含水相的第一溶液；
b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；
c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；
d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；
e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器来混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；
f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；
g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及
h.基于所述最优参数来制造所述LNP制剂。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。
110.根据权利要求108所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。
111.根据权利要求107至110所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
112.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。
113.根据权利要求112所述的方法，其中mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。
114.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da至约10,000Da之间。
116.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述小分子在约100Da至1000Da之间。
118.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
119.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
120.根据权利要求106所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
121.根据权利要求106所述的方法，其中所述第一溶液包含pH受控和渗透压受控的缓冲液。
122.根据权利要求106所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
123.根据权利要求106所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
124.根据权利要求106所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一种脂质分子物质的脂质组分。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。
126.根据权利要求124或125所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
127.根据权利要求124或125所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。
128.根据权利要求127所述的方法，其中脂质的所述总浓度在约0.4与约4mM之间变化。
129.根据权利要求124或125所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。
130.根据权利要求129所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的所述百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。
131.根据权利要求107至113中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的N:P比率是变化的。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述N:P比率在约0.5至约5之间变化。
133.根据权利要求106至132中任一项所述的方法，其中所述LNP为聚合物脂质纳米颗粒。
134.根据权利要求106至132所述的方法，其中所述LNP为脂质体。
135.根据权利要求106至132所述的方法，其中所述LNP为脂蛋白纳米颗粒。
136.根据权利要求106所述的方法，其中将所述第一溶液注入所述第二溶液中。
137.根据权利要求106所述的方法，其中将所述第二溶液注入所述第一溶液中。
138.根据权利要求106至137中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的包封效率的那些参数。
139.根据权利要求106至137中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。
140.根据权利要求106至137中任一项所述的方法，其中所述LNP在4摄氏度溶液中的储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
141.一种用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的经优化的高通量筛选方法，所述方法包括：
a.获得包含水相的第一溶液；
b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；
c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；
d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；
e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器来混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；
f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；
g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及
h.基于所述最优参数来制造所述LNP制剂。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
144.根据权利要求142所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。
145.根据权利要求142所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。
146.根据权利要求142至145所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
147.根据权利要求141所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。
148.根据权利要求147所述的方法，其中mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。
149.根据权利要求141所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da至约10,000Da之间。
151.根据权利要求141所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述小分子在约100Da至1000Da之间。
153.根据权利要求141所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
154.根据权利要求141所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
155.根据权利要求141所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
156.根据权利要求141所述的方法，其中所述第一溶液包含pH和渗透压受控的缓冲液。
157.根据权利要求141所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
158.根据权利要求141所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
159.根据权利要求141所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一种脂质分子物质的脂质组分。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。
161.根据权利要求159或160所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
162.根据权利要求159或160所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。
163.根据权利要求162所述的方法，其中脂质的所述总浓度在约0.4与约4mM之间变化。
164.根据权利要求159或160所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。
165.根据权利要求164所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的所述百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。
166.根据权利要求142至150中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的N:P比率是变化的。
167.根据权利要求166所述的方法，其中所述N:P比率在约0.5至约5之间变化。
168.根据权利要求141至167中任一项所述的方法，其中所述LNP为聚合物脂质纳米颗粒。
169.根据权利要求141至167所述的方法，其中所述LNP为脂质体。
170.根据权利要求141至167所述的方法，其中所述LNP为脂蛋白纳米颗粒。
171.根据权利要求141所述的方法，其中将所述第一溶液注入所述第二溶液中。
172.根据权利要求141所述的方法，其中将所述第二溶液注入所述第一溶液中。
173.根据权利要求141至172中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的包封效率的那些参数。
174.根据权利要求141至172中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。
175.根据权利要求141至172中任一项所述的方法，其中所述LNP在4摄氏度溶液中的储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
176.一种经优化的脂质纳米颗粒(LNP)，其通过包括下列步骤的工艺来制造：
a.获得包含水相的第一溶液；
b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；
c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；
d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；
e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器来混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；
f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；
g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及
h.基于所述最优参数来制造所述LNP制剂。
177.根据权利要求176所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
178.根据权利要求177所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
179.根据权利要求178所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。
180.根据权利要求178所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。
181.根据权利要求177至180所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
182.根据权利要求176所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。
183.根据权利要求182所述的方法，其中mRNA的尺寸为约1kb至约2kb。
184.根据权利要求176所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
185.根据权利要求184所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da至约10,000Da之间。
186.根据权利要求176所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
187.根据权利要求186所述的方法，其中所述小分子在约100Da至1000Da之间。
188.根据权利要求176所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
189.根据权利要求176所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
190.根据权利要求176所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
191.根据权利要求176所述的方法，其中所述第一溶液包含pH受控和渗透压受控的缓冲液。
192.根据权利要求176所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
193.根据权利要求176所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
194.根据权利要求176所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一种脂质分子物质的脂质组分。
195.根据权利要求194所述的方法，其中所述至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。
196.根据权利要求194或195所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
197.根据权利要求194或195所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。
198.根据权利要求197所述的方法，其中脂质的所述总浓度在约0.4与约4mM之间变化。
199.根据权利要求194或195所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。
200.根据权利要求199所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的所述百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。
201.根据权利要求177至183中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的N:P比率是变化的。
202.根据权利要求201所述的方法，其中所述N:P比率在约0.5至约5之间变化。
203.根据权利要求176至202中任一项所述的方法，其中所述LNP为聚合物脂质纳米颗粒。
204.根据权利要求176至202所述的方法，其中所述LNP为脂质体。
205.根据权利要求176至202所述的方法，其中所述LNP为脂蛋白纳米颗粒。
206.根据权利要求176所述的方法，其中将所述第一溶液注入所述第二溶液中。
207.根据权利要求176所述的方法，其中将所述第二溶液注入所述第一溶液中。
208.根据权利要求176至207中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的包封效率的那些参数。
209.根据权利要求176至207中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的LNP的那些参数。
210.根据权利要求176至207中任一项所述的方法，其中所述LNP在4摄氏度的溶液中储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
211.一种用于对用于LNP形成的多个参数进行HTS筛选的工作流程，所述工作流程包括：
(i)机器人液体处理器；
(ii)至少一个能够测量期望的LNP特性的仪器；和
(iii)至少一个包括多个微孔的微量板；
其中所述机器人液体处理器能够将多种溶液注入所述微孔中的每一者中；
其中所述参数在微孔之间系统地变化；并且
其中能够针对每个微孔测量所述期望的LNP特性。
212.根据权利要求211所述的方法，其中所述多个参数选自总脂质含量、自组装分子的类型；所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度；相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、体积和速度以及混合持续时间。
213.根据权利要求211所述的方法，其中所述期望的LNP特性选自由以下项组成的组：平均粒度、粒度分布、包封效率和颗粒稳定性。
214.根据权利要求211所述的工作流程，其中所述仪器能够进行动态光散射(DLS)、紫外-可见(UV-Vis)或荧光光谱分析。
215.一种用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的经优化的高通量筛选方法，所述方法包括：
a.获得包含水相的第一溶液；
b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；
c.将至少一种有效载荷分子溶解于所述第一溶液或所述第二溶液中；
d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；
e.在适合于LNP形成的条件下使用所述机器人液体处理器来混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和pH、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；
f.测量下列中的至少一者：所述LNP的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；
g.确定用于制造所述LNP制剂的最优参数；以及
h.基于所述最优参数来制造所述LNP制剂；
并且其中通过测量可电离脂质/寡核苷酸的电荷比率来优化所述包封效率。
216.根据权利要求215所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
217.根据权利要求216所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
218.根据权利要求215所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
219.根据权利要求218所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。
220.根据权利要求219所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。
221.根据权利要求215所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
222.根据权利要求215所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。
223.根据权利要求222所述的方法，其中mRNA的尺寸为约500至约3000个核苷酸的长度。
224.根据权利要求215所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
225.根据权利要求224所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da至约10,000Da之间。
226.根据权利要求215所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
227.根据权利要求226所述的方法，其中所述小分子在约100Da至1000Da之间。
228.根据权利要求226所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
229.根据权利要求215所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
230.根据权利要求215所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
231.根据权利要求215所述的方法，其中所述第一溶液包含pH受控和渗透压受控的缓冲液。
232.根据权利要求215所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
233.根据权利要求215所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
234.根据权利要求215所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一种脂质分子物质的脂质组分。
235.根据权利要求234所述的方法，其中所述至少一种脂质分子物质选自由以下项组成的组：阳离子脂质物质、可电离脂质物质、非阳离子脂质物质、磷脂物质和非磷脂物质。
236.根据权利要求235所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
237.根据权利要求215所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。
238.根据权利要求237所述的方法，其中脂质的所述总浓度在约0.4至约4mM之间变化。
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