CN118127149A - 一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物、模型及试剂盒 - Google Patents

一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物、模型及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物、模型及试剂盒。通过血液基因表达用于败血症风险评估和细菌与病毒感染的分类，使用一组血液基因表达生物标志物来计算败血症风险评分，该评分可用于确定败血症的风险以及如果被感染，细菌或病毒的感染型。生物标志物也可以使用具有适当测定系统的试剂盒来测定，从而得出败血症风险评分，该评分可以单独使用或与额外的临床标准组合使用，以裁定感染型和败血症风险。

Description

一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物、 模型及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物、模型及试剂盒。
背景技术
与自行解决的非传染性全身性炎症病例相比，感染引起的败血症的早期准确诊断极具挑战性。临床表现可能看起来非常相似，但误诊这两种情况可能会产生可怕的后果。当患者没有感染时，不正确地使用抗生素治疗会导致抗生素过度使用。相反，如果不能正确识别和治疗真正的败血症，可能会导致严重并发症、长期衰弱，甚至死亡。因此，快速区分感染性败血症和非感染性炎症对于改善患者预后和降低医疗成本至关重要。
目前的诊断方法在很大程度上依赖于通过细菌培养测试和监测身体炎症反应释放的急性期生物标志物来检测病原体。虽然细菌培养被认为是确认感染的金标准，但它有明显的局限性。培养需要很长时间才能得到结果，而且灵敏度很低，只有大约30%的血液培养物和65%的所有来源的血液培养液的细菌生长检测呈阳性，即使在已知感染的情况下也是如此。此外，阴性培养结果并不确定，因为污染可能导致假阳性。因此，细菌培养缺乏最佳败血症诊断所需的速度、敏感性和特异性的组合。
在使用的宿主生物标志物中，降钙素原（PCT）已被广泛研究用于区分系统性炎症的感染性和非感染性原因。然而，单独升高的PCT水平并不一定能证实存在细菌感染。事实上，美国食品药品监督管理局只有在决定开始或停止使用下呼吸道感染和已确诊败血症患者的抗生素时才批准PCT检测。 像PCT这样的单一生物标志物本身不太可能提供足够的敏感性和特异性来可靠地识别可能发展为败血症或对患者进行风险分层的感染。身体对感染反应的复杂性需要更全面的诊断解决方案。
目前在临床实践中还没有基于全血基因表达，生成败血症风险评分及感染型评分，并帮助医生确定潜在的败血症风险和治疗强度。
发明内容
本发明旨在至少解决相关技术中存在的技术问题之一，公开了血液基因表达用于败血症风险评估和细菌与病毒感染的分类的用途。特别地，本发明提供了一种多种生物标志物得出败血症的风险评分及感染型评分的方法，该评分可以单独使用或与额外的临床标准（例如CRP或PCT）组合使用，以裁定感染型和败血症风险。
一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物，所述生物标志物为HK3、CKAP4、BATF、FCER1A、LILRA5、CST7、PPP2R2D、CAMK1D、S100A12、CD96、IFI27、SLC12A9、MX1、OAS2、IRF7、ISG15、RAB31、GBA2、HERC5、OAS1、SAMD9、USP18、VIM、PLAC8、PLA2G7、JUP、SUCLG2、HESX1、SMARCD、ICAM1、EB13、DECR1、ATP5E、HMGB3、IFI44L和PI3中的多种组合。
进一步的，其中评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物的寡核苷酸的全部或其核苷酸序列、RNA或DNA表达水平。
进一步的，其中所述生物标志物的表达水平以阈值Ct表示。
进一步的，其中所述生物标志物包括评估受试者的败血症风险的基因为ATP5E、PLA2G7、FCER1A、CAMK1D、LILR5和HMGB3，以及用于评估受试者的败血症感染型的基因为RAB31和IFI44L。
一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的模型，所述模型包含HK3、CKAP4、BATF、FCER1A、LILRA5、CST7、PPP2R2D、CAMK1D、S100A12、CD96、IFI27、SLC12A9、MX1、OAS2、IRF7、ISG15、RAB31、GBA2、HERC5、OAS1、SAMD9、USP18、VIM、PLAC8、PLA2G7、JUP、SUCLG2、HESX1、SMARCD、ICAM1、EB13、DECR1、ATP5E、HMGB3、IFI44L和PI3中的多种组合的生物标志物，通过生物标志物的表达水平得到败血症风险评分和感染型评分，其中所述风险评分和感染型评分：
从两个不同基因之间的阈值Ct差异中得出；
或通过多对生物标志物差异的倍数得出：
风险评分=（ATP5E-PLA2G7）-（FCER1A-CAMK1D+LILRA5-HMGB3），
感染型评分=RAB31-IFI44L。
进一步的，所述通过多对生物标志物差异的倍数得出的风险评分临界值为-12.341。
进一步的，所述通过多对生物标志物差异的倍数得出的感染型评分临界值为5.314。
进一步的，败血症风险评分确定在初次感染和发烧后患败血症的风险；感染型评分确定超过规定界限的细菌感染的感染型，感染型评分高表示细菌感染，感染型评分低表示病毒感染。
一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的试剂盒，所述试剂盒包含：HK3、CKAP4、BATF、FCER1A、LILRA5、CST7、PPP2R2D、CAMK1D、S100A12、CD96、IFI27、SLC12A9、MX1、OAS2、IRF7、ISG15、RAB31、GBA2、HERC5、OAS1、SAMD9、USP18、VIM、PLAC8、PLA2G7、JUP、SUCLG2、HESX1、SMARCD、ICAM1、EB13、DECR1、ATP5E、HMGB3、IFI44L和PI3中的多种组合生物标志物。
本发明技术方案一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物、模型及试剂盒，具有以下优点：
本发明公开了血液基因表达用于败血症风险评估和细菌与病毒感染的分类的用途，使用一组血液基因表达生物标志物来计算败血症风险评分，该评分可用于确定败血症的风险以及如果被感染，感染型（细菌或病毒）。生物标志物也可以使用具有适当测定系统的试剂盒来测定，例如qPCR系统，例如ABI QuantStudio 5，以测定mRNA表达，从而得出败血症风险评分，该评分可以单独使用或与额外的临床标准（例如CRP或PCT）组合使用，以裁定感染型和败血症风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.本发明的感染与非感染的计算机分析流程图。使用贪婪正向搜索从计算机荟萃分析中总共鉴定了10个基因。
图2. 本发明的细菌与病毒的计算机分析流程图。使用贪婪正向搜索从计算机荟萃分析中总共鉴定出13个基因。
图3. 本发明的用于qPCR分析的最后36个发现基因组分析流程图。
图4.本发明的基因对delta Ct（ΔCt）的单变量分析图，用于区分败血症/感染和非感染样本。
图5. 本发明的区分败血症的感染与非感染的基因对的ΔCt分布图。
图6.本发明的基因对ΔCt的单变量分析图，用于区分细菌和病毒样本。
图7.本发明的区分败血症的细菌和病毒感染的基因对ΔCt分布图。
图8.本发明的生成败血症风险评分和BV评分的最佳基因对组合和方程示意图。其中A图为败血症风险评分，B图为感染型（BV）评分。
图9.本发明的败血症的感染风险评分组在-12.341的最佳临界值的发现和验证性能图。
图10. 本发明的感染型（BV）评分组在5.314分的最佳临界值的发现和验证性能图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
下面结合图1至图10说明一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物、模型及试剂盒。
本发明提供了败血症风险生物标志物、细菌与病毒生物标志物组以及用于获得样品的败血症风险评估生物标志物表达水平的方法。这些组合物和方法可用于评估败血症风险。此外，提供了可用于实践受试者方法的试剂盒，以运行测定，确定生物标志物水平，并计算败血症风险评分和感染型（细菌与病毒或BV）评分。本发明的这些和其他目的、优点和特征对于本领域技术人员在阅读下面更全面描述的组合物和方法的细节后将变得显而易见。
在描述本发明的方法和组合物之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法或组合物，因为这样当然可以变化。还应理解，此处使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不意图是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
如上所述，本发明的方面包括被发现可用于提供败血症风险评估的方法、组合物、系统（即qPCR系统，如AB QuantStudio 5）和试剂盒。所谓“败血症”，是指由感染和身体对感染的极端反应引起的疾病。通过“风险评估”发热患者或“提供败血症确定作为临床症状之一”，通常意味着提供败血症风险作为额外的临床症状，例如确定受试者在发烧后不久患败血症的风险。感染的分类，无论是细菌感染还是病毒感染，是为了在发热患者感染的情况下提供细菌或病毒感染的诊断。
在描述本发明时，将首先描述用于提供败血症风险和细菌与病毒评估的组合物，然后描述其用途的方法和试剂盒。
在本发明的一些方面中，提供了败血症和细菌与病毒感染的生物标志物以及败血症风险的生物标志物组。“败血症风险生物标志物”是指其在样本中的代表性与败血症风险表型相关的分子实体。例如，与总体发热队列相比，败血症风险/结果生物标志物可以在来自感染可能导致败血症的低风险或高风险个体的样本中有差异地表示，即在不同水平上。在某些情况下，生物标志物（如CAMK1D）水平升高与高风险败血症表型相关。例如，样品中生物标志物的RNA拷贝数在与高风险表型相关的样品中可以是具有低风险表型的样品的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、7.5倍、10倍或更大，这通常代表在qPCR仪器中从较高的阈值Ct移动到较低的阈值Ct。在其他情况下，生物标志物水平的降低与败血症表型相关，例如PLA2G7。例如，与具有低风险表型的样品相比，与高风险表型相关的样品中的生物标志物的PLA2G7的RNA拷贝数可以少10%、20%、30%、40%、50%或多，这通常代表在qPCR仪器中从较低的时间阈值Ct移动到较高的阈值Ct。
败血症风险测定生物标志物可能包括与感染/败血症相关的蛋白质和肽及其相应的遗传序列，即RNA、DNA等。
5'（氨基）末端的起始密码子决定编码序列的边界，3'（羧基）末端的翻译终止密码子决定。转录终止序列可以位于编码序列的3'处。此外，基因可任选地包括其天然启动子（即基因的外显子和内含子在非重组细胞（天然存在的细胞）中可操作地连接的启动子）和相关的调控序列，并且可具有或不具有AUG起始位点上游的序列，并且可以包括或不包括未翻译的前导序列、信号序列、下游未翻译序列、转录起始和终止序列、多腺苷酸化信号、翻译起始和停止序列、核糖体结合位点等。
如本发明公开的实施例所示，本发明人已经鉴定了与感染/败血症风险和细菌与病毒感染相关的几种分子实体，并发现其在提供败血症风险评估和感染型分类中的组合用途（即作为一个小组）。这些包括但不限于HK3、CKAP4、BATF、FCER1A、LILRA5、CST7、PPP2R2D、CAMK1D、S100A12、CD96、IFI27、SLC12A9、MX1、OAS2、IRF7、ISG15、RAB31、GBA2、HERC5、OAS1、SAMD9、USP18、VIM、PLAC8、PLA2G7、JUP、SUCLG2、HESX1、SMARCD、ICAM1、EB13、DECR1、ATP5E、HMGB3、IFI44L和PI3，它们与发热患者中出现的组合感染有关可以利用定量PCR系统（例如Applied Biosystem QuantStudio、实时PCR 7500或Bio-Rad CFX系统）来准确测量血液生物标志物基因表达（拷贝数）以得出败血症风险评分和感染型分类，将患有败血症的高风险和低风险患者分离的血液。
风险评分和感染型评分通过每对生物标志物差异的倍数得出，例如通过以下公式得出：
风险评分=（ATP5E-PLA2G7）-（FCER1A-CAMK1D+LILRA5-HMGB3），最佳临界值为-12.341。
感染型分数=RAB31-IFI44L，最佳临界值为5.314。
对于败血症风险评估，败血症风险评分在两个范围内评估高风险或低风险患者的风险，以确定在初次感染和发烧后患败血症的风险；对于感染类型分类，BV评分确定了超过规定界限的细菌感染的感染类型，反之亦然。
对于败血症风险，高于所述风险评分临界值指示发热患者在不久的将来具有败血症的高风险。对于感染型评分，感染型评分高表示细菌感染，感染型评分低表示病毒感染。
在本发明方法中用作败血症/感染和细菌与病毒组的败血症风险生物标志物的其他组合可以由普通技术人员使用任何方便的统计方法容易地识别，例如本领域已知的或本发明的工作实例中描述的。例如，可以通过组合用于败血症风险分类分析和感染分型的遗传算法（GA）和全配对（AP）支持向量机（SVM）方法来选择分析物组。预测特征是自动确定的，例如通过迭代GA/SVM，从而产生具有最佳分类性能的非常紧凑的非冗余败血症/感染相关分析物集。虽然不同的分类器集通常只包含适度的重叠基因特征，但它们在提供败血症风险评估和感染分型方面将具有与上文和本发明工作实例中描述的那些相似的准确度。
在本发明的一些方面中，提供了用于获得受试者的败血症风险生物标志物表达水平的方法。败血症风险生物标志物表达水平是指生物样品（例如来自受试者的全血或血浆）中一种或多种受试者败血症生物标志物（例如一组败血症标志物）的表达水平。术语“生物样品”包括从生物体中获得的各种样品类型，并可用于其他手段，如诊断、预后或监测测定。该术语包括生物来源的血液和其他液体样品或衍生自其的细胞及其后代。该术语包括在采购后以任何方式操纵的样品，例如通过试剂处理、溶解或富集某些成分。该术语包括临床样品，包括细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织/FFPE组织样品。用于本发明方法的临床样品可以从各种来源获得，特别是血液样品。
样本来源包括血浆或全血样本或制剂。在许多实施方案中，血浆是人类样品的合适的初始来源。在受试者测定中使用的样品通常是新鲜血浆。
受试者样本通常是在患者发烧并怀疑感染可能导致败血症的临床访视期间从患者身上获得的。
一旦获得样品，就可以直接使用、冷冻或在适当的培养基中短期保存。通常，样本将来自人类患者。通常，合适的样本来源将来源于发烧患者的全血，感兴趣的分子实体（即mRNA、DNA和蛋白质）可以被分析到全血中。
受试者样品可以以多种方式进行处理，以增强对一种或多种败血症生物标志物的检测。例如，在样品是全血的情况下，可以在分析之前从样品中去除红细胞（例如，通过溶解红细胞）。这种治疗可以用于降低使用亲和试剂检测败血症生物标志物水平的非特异性背景水平。败血症生物标志物的检测也可以通过使用本领域已知的程序（例如，酸沉淀、醇沉淀、盐沉淀、疏水沉淀、过滤）浓缩样品来增强。在一些实施方案中，测试和对照样品的pH值将被调节至并保持在接近中性的pH值。这种pH值调节将防止复杂的形成，从而对样品中的生物标志物水平提供更准确的定量。
在实践受试者方法时，评估个体生物样本中败血症风险生物标志物的水平。受试者样本中一种或多种败血症风险生物标志物的水平可以通过任何方便的方法进行评估。例如，可以通过测量一种或多种寡核苷酸的水平/量来检测RNA生物标志物。败血症风险基因表达水平可以通过测量一个或多个败血症风险基因的一种或多种核酸转录物（例如mRNAs）的水平/量来检测。术语“评估”、“分析”、“测量”、“评估”和“确定”可互换地用于指代任何形式的测量，包括确定元素是否存在，以及包括定量和定性确定。评估可以是相对的，也可以是绝对的。
例如，可以通过在样品中检测一种或多种RNA/DNA或其片段的量或水平来评估至少一种败血症风险生物标志物水平，以获得拷贝数表示。本申请中使用的术语“RNA”和“核酸”是可互换的。“寡核苷酸”是指核酸（RNA或DNA序列）的聚合物，而不是指分子的特定长度。因此，RNA、DNA及其片段被包括在寡核苷酸的定义中。该术语还包括修饰的寡核苷酸，例如甲基化的DNA、荧光团/猝灭剂连接的DNA、修饰的碱基RNA/DNA、DNA引物等。定义中包括例如含有一种或多种碱基类似物的寡核苷酸、具有取代键的寡核苷酸以及本领域已知的其他修饰，包括天然存在的和非天然存在的。
作为另一个例子，至少一种败血症风险生物标志物水平可以通过在患者样本中检测一种或多种RNA转录物或由感兴趣基因编码的片段的量或水平来评估，以获得核酸生物标志物表示。可以使用任何方便的方案来检测样品中核酸的水平。虽然检测核酸的各种方式是已知的，例如在差异基因表达分析中使用的方式，但用于生成生物标志物表示的一种代表性且方便的方案是基于阵列的基因表达谱分析方案。这样的应用是杂交测定，其中使用在待产生的生物标志物表示中显示待测定/分析的每个基因的“探针”核酸的核酸。在这些测定中，首先从被测定的初始核酸样品制备目标核酸样品，其中制备可以包括用标记物（例如，信号产生系统的成员）标记目标核酸。在靶核酸样品制备之后，样品在杂交条件下与阵列接触，从而在与附着于阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。然后定性或定量地检测杂交复合物的存在。
杂交核酸的结果提供了关于已被探测的每个基因的表达的信息，其中表达信息是关于基因是否表达，以及通常在什么水平上表达，其中表达数据，即生物标志物表达（例如，以转录组的形式），可以是定性和定量的。
或者，可以采用基于非阵列的方法来定量样品中一种或多种核酸的水平，包括基于扩增方案的方法，例如基于聚合酶链式反应（PCR）的测定，包括定量PCR、逆转录PCR（RT-PCR）、实时PCR等。
当要检测蛋白质水平时，可以采用任何方便地评估蛋白质水平的方案，其中测定样品中一种或多种蛋白质的水平。例如，用于测定蛋白质水平的一种代表性且方便的方案是酶联免疫吸附测定（ELISA）。在ELISA和基于ELISA的测定中，一种或多种对感兴趣的蛋白质特异的抗体可以固定在选定的固体表面上，优选表现出蛋白质亲和力的表面，例如聚苯乙烯微量滴定板的孔上。在洗涤以去除不完全吸附的物质后，用非特异性“阻断”蛋白涂覆测定板孔，该蛋白已知对测试样品是抗原中性的，例如牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白或奶粉溶液。这允许阻断固定表面上的非特异性吸附位点，从而减少由抗原非特异性结合到表面上引起的背景。在洗涤以去除未结合的阻断蛋白后，在有利于免疫复合物（抗原/抗体）形成的条件下，将固定表面与待测试的样品接触。这些条件包括用磷酸盐缓冲盐水（PBS）/Tweenor PBSATriton-X 100中的稀释剂如BSA或牛丙种球蛋白（BGG）稀释样品，这也有助于减少非特异性背景，并允许样品在约25°-27°C的温度下孵育约2-4小时（尽管也可以使用其他温度）。孵育后，洗涤与抗血清接触的表面，以去除非免疫复合物材料。示例性的洗涤程序包括用诸如PBS/Tween、PBS/Triton-X 100或硼酸盐缓冲液的溶液洗涤。免疫复合物形成的发生和量然后可以通过使结合的免疫复合物经受对靶标具有不同于第一抗体的特异性的第二抗体并检测第二抗体的结合来确定。在某些实施方案中，第二抗体将具有相关的酶，例如尿素酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶，其将在与适当的发色底物孵育时产生彩色沉淀。例如，脲酶或过氧化物酶缀合的抗人IgG可以在有利于形成免疫复合物的条件下使用一段时间（例如，在室温下在含PBS的溶液如PBS/Tween中孵育2小时）。在与第二抗体孵育并洗涤以除去未结合的物质之后，标记物的量被定量，例如，在脲酶标记物的情况下，通过与发色底物如尿素和溴甲酚紫孵育，或者在过氧化物酶标记物的情况下，通过2，2'-叠氮基二－（3-乙基-苯并噻唑啉）-6-磺酸（ABTS）和H2O2孵育。然后通过测量颜色产生的程度来实现量化，例如使用可见光谱分光光度计。
可以通过将样品结合到测定板上来改变上述格式。然后，将第一抗体与测定板一起孵育，然后使用对第一抗体具有特异性的标记的第二抗体检测结合的第一抗体。
固定一种或多种抗体的固体基质可由多种材料制成，形状多种多样，例如微量滴定板、微珠、量油尺、树脂颗粒等。可选择基质以最大限度地提高信噪比，最大限度地减少背景结合，并易于分离和成本。冲洗可能以最适合所用基质的方式受到影响，例如，从储液器中取出珠或量油尺，排空或稀释储液器，如微量滴定板孔，或用冲洗溶液或溶剂冲洗珠、颗粒、色谱柱或过滤器。
或者，可以使用非ELISA方法来测量样品中一种或多种蛋白质的水平。代表性实例包括但不限于质谱法、蛋白质组阵列、xMAP™微球技术、流式细胞术、蛋白质印迹和免疫组织化学。
所得数据提供了关于已被探测的每个生物标志物在样品中的水平的信息，其中所述信息是关于生物标志物是否存在以及通常在什么水平，并且其中所述数据可以是定性的和定量的。因此，在检测是定性的情况下，所述方法提供对目标生物标志物（例如核酸或蛋白质）是否存在于被测定的样品中的读取或评估，例如评估。在另一些实施方案中，所述方法提供对目标生物标志物是否存在于被测定的样品中的定量检测，即对目标分析物（例如，被测定样品中的核酸或蛋白质）的实际量或相对丰度的评估或评估。在这样的实施方案中，定量检测可以是绝对的，或者如果该方法是检测样品中的两种或多种不同分析物，例如靶核酸或蛋白质的方法，则可以是相对的。因此，当用于量化样品中的目标分析物，例如核酸或蛋白质时，术语“量化”可以指绝对或相对量化。可以通过包括一种或多种对照分析物的已知浓度并参考目标分析物的检测水平与已知对照分析物（例如，通过生成标准曲线）来实现绝对定量。可替换地，可以通过比较两种或多种不同的目标分析物之间的检测水平或量来实现相对定量，以提供两种或更多种不同分析物中的每一种的相对定量，例如相对于彼此。
一旦确定了一种或多种败血症生物标志物的水平，就可以通过几种方式分析测量结果，以获得败血症风险生物标志物水平的表示。
例如，可以单独分析一种或多种败血症生物标志物的测量结果，以制定败血症风险评分。如本发明所用，“风险评分”是患者样本中一种或多种败血症风险生物标志物的标准化水平，例如，患者样本中血清学mRNA浓度的标准化程度。可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种生成图谱。例如，每个生物标志物的水平可以相对于所选管家基因的表达、相对于整个面板的信号等进行log2转换和归一化。计算败血症风险评分的其他方法对普通技术人员来说是公知的。
作为另一个例子，可以对一组败血症和感染型生物标志物的测量结果进行集体分析，以得出单一的败血症风险和感染型评分。“风险评分”是指代表整个败血症小组中每个败血症风险生物标志物的加权水平的单一度量值。因此，在一些实施方案中，受试者方法包括检测样本中败血症风险组的生物标志物水平，并基于败血症生物标志物的加权水平计算败血症风险评分。可以使用本领域已知的用于计算生物标志物得分的任何方法和算法来计算患者样本的败血症得分。例如，加权的生物标志物水平，例如已经通过例如将每个归一化的生物标志物水平乘以加权因子来加权的log2转换和归一化的生物标记物水平，可以被相加，并且在一些情况下被平均，以得到代表所分析的败血症风险生物标志物组的单个值。感染型评分也可以使用上述方法来确定。
在某些情况下，加权因子，或简称为面板中每个生物标志物的“权重”，可能反映了样品中分析物水平的变化。例如，每个败血症生物标志物的分析物水平可以被对数转换并加权为1（对于在败血症中水平增加的那些生物标志物）或-1（对于在败血症中水平降低的那些生物标记物），以及增加的生物标志物之和与确定为达到败血症特征的减少的生物标记物之和之间的比率。在其他情况下，权重可以反映每个生物标志物对败血症风险和BV评估中生物标志物组的特异性、敏感性和/或准确性的重要性。这样的权重可以通过任何方便的统计机器学习方法来确定，例如，可以使用从中获得样本的数据集的主成分分析（PCA）、线性回归、支持向量机（SVM）和/或随机森林。在某些情况下，每个生物标志物的权重由获得患者样本的数据集定义。在其他情况下，每个生物标志物的权重可以基于参考数据集或“训练数据集”来定义。
本领域普通技术人员可以通过使用基于计算机的系统，例如使用本领域已知的任何硬件、软件和数据存储介质，并使用便于此类分析的任何算法，容易地执行这些分析方法。例如，数据挖掘算法可以通过“云计算”、基于智能手机或基于客户端-服务器的平台等应用。
在某些实施方案中，仅评估一种生物标志物的表达，例如寡核苷酸水平，以产生生物标志物水平的表示。在另一些实施方案中，评估两种或多种，即一组生物标志物的水平。因此，在本主题方法中，评估样品中至少一种生物标志物的表达。在某些实施方案中，所进行的评估可以被视为蛋白质组的评估，因为该术语在本领域中被使用。
在一些情况下，确定或获得受试者的败血症生物标志物表示（例如败血症风险评分或细菌或病毒感染谱）的受试者方法还包括提供败血症生物标志器表示作为报告。因此，在一些情况下，受试者方法可以进一步包括生成或输出提供样本中败血症生物标志物评估结果的报告的步骤，该报告可以以电子介质（例如，计算机监视器上的电子显示器）的形式或以有形介质（例如打印在纸上或其他有形介质上的报告）的形式提供。可以提供任何形式的报告，例如本领域已知的或如下面更详细描述的。
当患者为高风险或低风险和感染型时，败血症风险生物标志物和感染分型表达水平可用于评估败血症风险；即提供败血症临床指征作为风险指标。例如，败血症生物标志物水平的表示可用于作为受试者的风险决定因素，并具有额外的败血症临床标准。通过“如果个体患有败血症的高风险或低风险，则添加生物标志物体征”，这意味着确定个体患败血症并发烧的可能性。败血症和感染型的生物标志物水平代表性、败血症风险评分和感染分型可以与其他临床标准一起预测近期发生败血症的可能性。
例如，败血症风险表型测定元件可以是来自败血症高风险或低风险个体的样本，其可以用作给定受试者的生物标志物表达水平的实验测定中的参考/对照。作为另一个例子，败血症风险表型确定元件可以是代表低风险败血症状态的生物标志物表达水平，例如生物标志物概况或评分，并且可以用作解释给定受试者的生物标志物表达水平的参考/对照。表型测定元件可以是阳性参考/对照，例如来自败血症患者的样品或其生物标志物水平的表示。或者，风险表型确定元件可以是阴性参考/对照，例如来自没有败血症风险的非感染患者的样品或生物标志物表达水平。风险表型确定元件优选的是相同类型的样品，或者如果生物标志物表达水平是从与用于生成被监测个体的生物标志物级别表示的样品相同类型的样本获得的。例如，如果正在评估个体的血浆，则表型确定元件优选为血浆。
在某些实施方案中，将获得的生物标志物表达水平与单个表型确定元件进行比较，以获得关于正在进行败血症风险测试的个体的信息。在其他实施方案中，将所获得的生物标志物表达水平与两个或多个表型决定元件进行比较。例如，可以将所获得的生物标志物表达水平与低风险参考和高风险参考进行比较，以获得关于败血症个体风险的确认信息。
在其他实施方案中，直接使用生物标志物水平的表示，即不与表型确定元件进行比较，以基于生成的风险评分进行败血症风险评估，并基于生成的细菌与病毒评分进行感染分型。
还提供了用于一种或多种试剂及其试剂盒。试剂包括专门设计用于从样品中产生败血症风险和BV生物标志物的上述生物标志物表达水平的试剂，例如一个或多个检测元件，例如用于检测核酸的寡核苷酸、用于检测体液中mRNA的抗体或肽等。在一些情况下，检测元件包括用于检测单个败血症生物标志物丰度的试剂；例如，检测元件可以是包括一个或多个检测元件的量尺、板、阵列或混合物，例如一个或更多个寡核苷酸、一组或更多组PCR引物、一种或更多种抗体等，其可以用于同时检测一种或多种败血症生物标志物的丰度，
另一种类型的此类试剂是探针核酸阵列，其中表示感兴趣的基因（生物标志物）。本领域已知各种不同的阵列形式，具有各种不同的探针结构、衬底组成和附着技术（例如，点印迹阵列、微阵列等）。
一种专门用于产生生物标志物水平表征（如败血症风险评估生物标志物级别表征）的试剂是特异性结合生物标志物的抗体的集合，例如ELISA形式、xMAP™微球形式、蛋白质组阵列上、悬浮液中的抗体，用于通过流式细胞术、蛋白质印迹、点印迹或免疫组织化学进行分析。使用这些抗体的方法在本领域中是众所周知的。这些抗体可以在溶液中提供。或者，它们可以预先结合到固体基质上，例如多孔培养皿的孔或xMAP微球的表面上。
特别地，探针阵列、引物集合或抗体集合，其包括对选自HK3、CKAP4、BATF、FCER1A、LILRA5、CST7、PPP2R2D、CAMK1D、S100A12、CD96、IFI27、SLC12A9、MX1、OAS2、IRF7、ISG15、RAB31、GBA2、HERC5、OAS1、SAMD9、USP18、VIM、PLAC8、PLA2G7、JUP、SUCLG2、HESX1、SMARCD、ICAM1、EB13、DECR1、ATP5E、HMGB3、IFI44L和PI3，或与它们相关的特异性生物化学底物。受试者探针、引物或抗体集合或试剂可包括仅对以上列出的基因/蛋白质/脂质/辅因子特异性的试剂，或者它们可包括对以上未列出的额外基因/蛋白质、脂质/辅因素特异性的探针、引物或对本领域已知表达模式与败血症相关的基因/蛋白/脂质/辅助因子特异性的抗体，例如CAMK1D、PLA3G7、FCER1A、LILRA5或细菌对病毒的RAB31和IFI44L。
在某些情况下，可以提供系统，例如qPCR仪器，例如AB QuantStudio 5。如本发明所用，术语“系统”是指试剂的集合，然而，通过例如从相同或不同的来源购买试剂的集合来编译。在某些情况下，可以提供套件。如本发明所用，术语“试剂盒”是指提供的试剂集合，例如一起出售。例如，样品核酸或蛋白质的基于核酸或抗体的检测可以分别与电化学生物传感器平台相结合，该平台将允许对这些生物标志物进行多重测定，用于个性化败血症护理。
本发明的系统和试剂盒可包括上述阵列、基因特异性引物集合或蛋白质特异性抗体集合。所述系统和试剂盒可以进一步包括在各种方法中使用的一种或多种附加试剂，例如用于产生靶核酸、dNTP和/或rNTP的引物，所述引物可以是预混的或分离的，一种或更多种唯一标记的dNTP和/或rNTP，例如生物素化的或Cy3或Cy5标记的dNTP，具有不同散射光谱的金或银颗粒，或其他合成后标记试剂，例如荧光染料的化学活性衍生物，酶，例如逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，各种缓冲介质，例如杂交和洗涤缓冲液，预制探针阵列，标记的探针纯化试剂和组分，例如旋转柱等。信号产生和检测试剂，例如标记的第二抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物、化学荧光或化学发光底物等。
受试者系统和试剂盒还可以包括一个或多个败血症风险和BV表型确定元件，在许多实施方案中，该元件是参考或对照样品或生物标志物表示，其可以例如通过合适的实验或计算手段用于基于“输入”生物标志物水平概况（例如，已经用上述生物标志物确定元件确定的）进行败血症诊断。代表性的败血症风险表型确定元件包括来自已知具有结果信息、败血症风险评分和生物标志物表达水平的数据库的个体的样本，例如参考或对照概况或评分等，如上所述。
以下实例是通过举例说明而非限制的方式提供的。
实施例
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的描述，而不是为了限制本发明者视为其发明的范围，也不是为了表示以下实验是所有或仅进行的实验。已努力确保所用数字（如数量、温度等）的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。
基因表达数据集：在我们的研究中，利用各种公开的数据集来收集全面的基因表达信息。检索美国国立卫生研究院基因表达综合数据库（GEO）数据集以访问人类微阵列全基因组表达研究，而基因组型组织表达（GTEx）项目数据集专门用于与败血症和感染分型相关的RNA测序研究。我们排除了非临床数据集，以确保数据具有相关性。为了对每项研究中的不同阵列进行归一化，我们采用了GC鲁棒多阵列平均（gcRMA）、RMA或正态指数背景校正等技术，然后进行分位数归一化。值得注意的是，在每项研究中，使用不同微阵列类型分析的队列被视为独立的数据集。对于败血症（感染）与非感染数据集，使用了25个数据集，包含1705个样本、728个非感染样本、563个细菌样本、363个病毒样本和51个未指明感染样本（图1）。对于细菌与病毒数据集，使用了19个数据集，包含1136个样本、265个未感染样本、559个细菌样本和312个病毒样本（图2）。
公共数据集协同归一化。我们使用conTrols的作战CO规范化（COCONUT）进行公共数据集规范化。ComBat只假设数据已经标准化，并且所有基因和样本的表达值都已经估计出来。在运行COCONUT之前，我们确保所有数据集都如上文基因表达数据集部分所述进行了规范化。COCONUT允许表达数据的共同标准化，而不会改变研究之间的基因分布，也不会对样本诊断产生任何偏见。它应用了ComBat经验贝叶斯归一化方法的修改版本，该方法假设仅在控制样本之间具有相等的分布。简言之，来自每个队列的对照在没有协变量的情况下进行ComBat共同归一化，并且为每个数据集的对照样本获取ComBat估计参数。然后将这些参数应用于每个数据集中的疾病样本，这使得所有样本假设相同的背景分布，同时在数据集中保留每个数据集中控制样本和疾病样本之间的差异。在验证已发布的签名时，我们对所有19个数据集进行了联合归一化，并对所有数据集进行分析。然而，对于签名发现，将数据随机分配到两组中的一组（训练和保持验证），并使用COCONUT联合归一化对每组进行独立的批量校正。
样品制备、RNA分离和定量实时PCR。在每个参与者的组织活检进行诊断确认或手术之前，使用乙二胺四乙酸（EDTA）管从他们身上采集外周血样本。立即对采集的血样进行处理以分离总RNA。
使用Trizol LS试剂（Invitrogen，CA，USA）从500µl的败血症/感染患者和非感染患者获得的人类全血中进行总RNA分离。通过使用生物分析仪2100（Agilent，Santa Clara，CA，USA）测量RNA完整性数（RIN）来评估分离的RNA的质量。然后将分离的RNA储存在-80°C下以备进一步使用。对于cDNA的逆转录，遵循来自TaKaRa（Shiga，Japan）的制造商的方案。
使用Applied Biosystem设备进行定量聚合酶链式反应（qPCR），总反应体积为10μl。定量实时PCR反应包括在95°C下进行10分钟的初始步骤，然后使用MastercyclerRealplex（Eppendorf）在95°C.下进行40次变性循环15秒，在60°C.下退火/延伸60秒。使用ΔCt方法评估mRNAs的表达，该方法涉及计算两个基因对之间的Ct值的差异：ΔCt=平均值Ct（基因1）-平均值Ct（基因2）。表1为区分败血症的感染与非感染的基因对的Ct值的差异，其中一栏为最下方败血症细胞基因组对（PLAC8及PLA2G7）的ΔCt；表2为区分败血症的细菌和病毒感染的基因对的Ct值的差异ΔCt。
表1：
表2：
微阵列/RNAseq计算机分析使用Genome Studio软件得出微阵列/RNAseq原始表达数据进行分析。对原始数据进行了分位数归一化和log2缩放。平均表达值≥2倍背景水平的基因用于开发败血症风险和感染分类面板，并通过“留一”交叉验证进行递归特征消除。选择最准确区分败血症与非感染样本以及细菌感染与病毒感染的顶级探针作为血浆中实时qPCR验证的候选探针。
数据分析使用来自定义的回顾性队列的全血总RNA样本，通过实时qPCR验证基因特征。通过接收操作特征（ROC）曲线、ROC曲线下面积（AUC）和95%特异性下的灵敏度来评估每个单独的基因特征。使用直接比率和八个机器学习模型来评估败血症与非感染以及细菌与病毒的区分性能。这些模型包括：套索、逻辑回归、弹性网（EN）、支持向量机（SVM）、随机森林（RF）、K近邻（KNN）、XGBoost（XGB）、多层感知器（MLP）。使用“留一”（LOO）交叉验证（CV）来评估分类准确性，并选择一个临界值来最大限度地减少总分类误差。
如果评分高于或等于临界值，则样本被归类为败血症的高风险，反之亦然。
用于败血症风险评估和感染分型的基因组开发的研究设计。首先，从公开的基因表达数据库（包括微阵列和RNA测序数据集）中收集了一个包括非感染、感染/败血症和细菌/病毒感染的大型队列。采用机器学习技术和荟萃分析来分析这些数据集，确定败血症、非感染和细菌/病毒感染之间表现出显著差异表达的基因。在第二步中，使用实时qPCR在全血队列中进一步研究从第一步中选择的候选基因，并对每个适应症进行明确的诊断。测量了这些基因的表达水平，并根据它们在使用ROC AUC分析和遗漏交叉验证将两组（败血症与非感染和细菌与病毒）分离时的表现，确定了区分非感染、感染和细菌感染与病毒感染的最重要基因特征的子集。这一过程旨在完善和最终确定一个具有最佳性能的最小化面板，其中包括三对在败血症与非感染之间表现出强大辨别能力的基因，以及一对在细菌与病毒感染之间表现出强大辨别力的基因。
推导用于区分败血症/感染与非感染以及细菌与病毒分类器的36个基因特征。为了发现在全球范围内适用于区分败血症/感染与非感染以及细菌与病毒患者的差异基因表达特征，我们实施了一个机器学习框架。该框架促进了从公共领域获得的综合多队列基因表达数据集的聚合和分析，如图1和图2所示。
分析后，我们在训练集中采用了严格的选择标准，考虑到错误发现率（FDR）≤1%和受试者工作特征曲线下面积（ROC AUC）≥0.8。随后，我们采用了各种策略来识别一组简明的基因，这些基因可以有效区分败血症/感染和非感染。通过这一严格的荟萃分析过程，我们确定了10个基因特征，用于区分败血症/感染与非感染，13个基因特征用于区分细菌感染与病毒感染。我们进一步整合了来自败血症小组的两个基因、六个细胞内细菌基因、三个管家基因和两个群体测试的细菌与病毒分化基因。考虑到组合的36个基因组可能具有良好的性能和简约性（图3），我们选择它们进行进一步研究，使用具有明确的非感染、细菌和病毒感染样本的队列。
血浆队列的基因特征验证。验证从公共领域多队列荟萃分析和文献中选择的这36个候选基因的表达。为了开发一个分类小组，我们组建了一个独立的全血队列，由18个非感染样本、40个细菌感染样本和56个病毒感染样本组成。
使用实时qPCR对从血浆样品中分离的RNA定量36个特征基因的表达水平。为了确保qPCR结果的准确标准化，我们使用了2个基因的表达比率（测量为ΔCt），而不是使用参考基因。此外，在分类器的开发中，利用特征基因对的比例来区分败血症/感染和非感染受试者以及感染型（BV）。
为了确定将败血症/感染与非感染患者分离的最有效基因对，我们比较了所有可能的基因比率组合。其中，我们发现三对基因表现出最显著的分化。图4和图5显示了败血症和非感染患者中基因对的ΔCt值的分布，用小提琴图表示。
为了确定分离细菌和病毒感染患者的最有效基因对，我们比较了所有可能的基因比例组合。其中，我们发现三对基因表现出最显著的分化。图6和图7显示了细菌与病毒患者中每个基因对的ΔCt值的分布。
基因特征衍生分类器的推导以及在定义的非感染、细菌和病毒感染的确定队列中的表现。我们随后的目标是评估从基因特征组合中获得的ΔCt值是否可以用于开发能够区分败血症/感染和非感染以及细菌与病毒感染的基因表达分类器。
没有重复基因特征的组合分析代表了基因对ATP5E和PLA2G7、FCER1A和CAMK1D以及LILR5和HMGB3之间Ct值的最大差异，从而给出了使用发现队列区分败血症/感染与非感染的最高AUC。对于细菌与病毒的分类，RAB31和IFI44L之间的差异最能区分细菌与病毒，使用发现队列具有最大ΔCt差异和最高AUC（图8）。
然后使用发现队列建立感染与非感染以及细菌与病毒的最佳性能临界值（图9和图10）。在发现队列中，败血症与非感染的得分临界值为-12.341时，败血症/感染与非感染之间的AUC为0.920，特异性为60.00%，敏感性为92.19%，PPV为93.65%，NPV为54.55（图9）。在相同的临界值下，验证队列的AUC为0.906，特异性为50.00%，敏感性为87.50，PPV为87.50%，NPV为50.00%。这表明生物标志物小组能够区分败血症/感染和非感染患者。
类似地，使用发现队列，细菌与病毒的最佳表现临界得分为5.314。该面板的AUC为0.978，特异性为100%，灵敏度为91.89%，PPV为100%，NPV为90.00%（图10）。在保持相同的临界分数的情况下，验证队列的AUC为1.00，特异性为100%，灵敏度为94.74%，特异性100%，PPV为100%，NPV为92.86%，这表明BV生物标志物小组也能够识别细菌或病毒感染。
本发明的上述调节参数仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为HK3、CKAP4、BATF、FCER1A、LILRA5、CST7、PPP2R2D、CAMK1D、S100A12、CD96、IFI27、SLC12A9、MX1、OAS2、IRF7、ISG15、RAB31、GBA2、HERC5、OAS1、SAMD9、USP18、VIM、PLAC8、PLA2G7、JUP、SUCLG2、HESX1、SMARCD、ICAM1、EB13、DECR1、ATP5E、HMGB3、IFI44L和PI3中的多种组合。
2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，其中评估受试者的败血症风险和感染型的生物标志物的寡核苷酸的全部或其核苷酸序列、RNA或DNA表达水平。
3.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，其中所述生物标志物的表达水平以阈值Ct表示。
4.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，其中所述生物标志物包括评估受试者的败血症风险的基因为ATP5E、PLA2G7、FCER1A、CAMK1D、LILR5和HMGB3，以及用于评估受试者的败血症感染型的基因为RAB31和IFI44L。
5.一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的模型，其特征在于，所述模型包含HK3、CKAP4、BATF、FCER1A、LILRA5、CST7、PPP2R2D、CAMK1D、S100A12、CD96、IFI27、SLC12A9、MX1、OAS2、IRF7、ISG15、RAB31、GBA2、HERC5、OAS1、SAMD9、USP18、VIM、PLAC8、PLA2G7、JUP、SUCLG2、HESX1、SMARCD、ICAM1、EB13、DECR1、ATP5E、HMGB3、IFI44L和PI3中的多种组合的生物标志物，通过生物标志物的表达水平得到败血症风险评分和感染型评分，其中所述风险评分和感染型评分：
从两个不同基因之间的阈值Ct差异中得出；
或通过多对生物标志物差异的倍数得出：
风险评分=（ATP5E-PLA2G7）-（FCER1A-CAMK1D+LILRA5-HMGB3），
感染型评分=RAB31-IFI44L。
6.根据权利要求5所述的模型，其特征在于，所述通过多对生物标志物差异的倍数得出的风险评分临界值为-12.341。
7.根据权利要求5所述的模型，其特征在于，所述通过多对生物标志物差异的倍数得出的感染型评分临界值为5.314。
8.根据权利要求5所述的模型，其特征在于，败血症风险评分确定在初次感染和发烧后患败血症的风险；感染型评分确定超过规定界限的细菌感染的感染型，感染型评分高表示细菌感染，感染型评分低表示病毒感染。
9.一种用于评估受试者的败血症风险和感染型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：HK3、CKAP4、BATF、FCER1A、LILRA5、CST7、PPP2R2D、CAMK1D、S100A12、CD96、IFI27、SLC12A9、MX1、OAS2、IRF7、ISG15、RAB31、GBA2、HERC5、OAS1、SAMD9、USP18、VIM、PLAC8、PLA2G7、JUP、SUCLG2、HESX1、SMARCD、ICAM1、EB13、DECR1、ATP5E、HMGB3、IFI44L和PI3中的多种组合生物标志物。
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