CN118127113A - 一种提高雨生红球藻全反式虾青素的养殖方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高雨生红球藻全反式虾青素的养殖方法及其应用，属于微藻生物技术领域。该养殖方法采用SPD+NLS串联养殖模式，雨生红球藻用PE板式光反应器绿培，绿色低密度阶段利用红光和白光的适当组合，促进雨生红球藻的生长，在对数生长后期，通过将光照培养模式从白光切换到红光，改善雨生红球藻的自养生长，可以为微藻培养过程中更有效地利用光照实现光合自养。积累虾青素阶段，采用开放式NLS全光谱自然光源，最大程度还原左旋反式天然虾青素的自然生成条件。该方法适用于水资源丰富的长江中下游地区进行大规模养殖雨生红球藻，此方法具有周期短，全反式虾青素含量高等方面的优势，具有广阔的产业化应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，尤其涉及一种提高雨生红球藻全反式虾青素的养殖方法及其应用。
背景技术
天然虾青素是一种高效的生物活性物质，其具有极强的抗氧化性，具有广泛的应用前景。相比其他生物，雨生红球藻被公认为天然虾青素的最佳生物来源。
最新的研究结果表明，在极佳的培养条件下，雨生红球藻(HaematococcusPluvialis)中虾青素的含量最高达到4-6％。目前，规模化养殖雨生红球藻的方法，主要有“两步法”和“一步法”，“两步法”即：第一步为营养生长阶段，即在适宜的条件下培养雨生红球藻以获得高密度生长的“绿色”细胞，此阶段雨生红球藻生长旺盛，但体内虾青素含量少，这一阶段通常在室内进行；第二步为诱导虾青素的积累阶段，即在多种胁迫的条件下促使绿色游动细胞转变为“红色”的不动孢子，诱导积累虾青素，这一阶段主要在户外开放池或封闭式光生物反应器中进行；“一步法”是将“两步法”中的两个阶段在同一个光生物反应器中进行，通过对营养成分和外部环境的调节和控制，既完成“绿色”细胞生物量的大量增加，又实现这些细胞度虾青素的积累。
尽管“一步法”具有操作和防止污染上的优势，但是，目前商业的实际生产中存在雨生红球藻中虾青素的单位产量较低的问题，有研究表明其虾青素产量仅为“两步法”的一半，因此，目前本领域仍然以“两步法”作为主要的养殖方法。近年来，关于提高雨生红球藻的全反式虾青素的方法也备受关注，成为热点。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种提高雨生红球藻全反式虾青素的养殖方法，所述养殖方法包括以下步骤：
(1)雨生红球藻生长阶段
①将藻种接种后，光照强度设为2000-4000Lx，采用红光、白光组合形成的混合光源照射，白光、红光的强度比例为7：3-4，24小时不间断补光，环境温度为20-23℃，通入二氧化碳，二氧化碳的通入量为0.4-0.6L/min，pH控制在7.0-8.5之间；
②待雨生红球藻密度到55-65万个/ml时，以体积比1：9-11的接种比例接种到培养基中，24小时不间断补光，采用红光、白光组合形成的混合光源照射，白光、红光的强度比例为7：3-4，光照强度为3000-8000Lx，环境温度为20-23℃，通入二氧化碳混合气体，二氧化碳的通入量为每升培养基中通入0.5-0.7L/min，pH控制在7.0-8.5之间，培养7-10天；
所述培养基包括以下组份：
| 成分 | 用量 |
| 硝酸钠 | 250mg |
| 三水合磷酸氢二钾 | 40mg |
| 七水合硫酸镁 | 75mg |
| 二水合氯化钙 | 36mg |
| 柠檬酸铁铵 | 6mg |
| EDTA | 1mg |
| 碳酸钠 | 20mg |
| 硼酸 | 2.86mg |
| 四水合氯化锰 | 1.81mg |
| 七水合硫酸锌 | 0.222mg |
| 五水合硫酸铜 | 0.079mg |
| 二水合钼酸钠 | 0.39mg |
| 六水合硝酸钴 | 0.0494mg |
；
(2)虾青素累积阶段
当显微镜观察到藻细胞为不动的厚壁孢子、密度为110-120万个/ml，加入2.5-3.5g/L氯化钠、0.8-1.2g/L碳酸氢钠，然后放入室外开放式跑道池积累虾青素，采用开放式NLS全光谱自然光源。
优选地，所述步骤①中光照强度为3000Lx。
更优选地，所述步骤①中环境温度为21℃。
更优选地，所述步骤①中二氧化碳的通入量为0.5L/min。
更优选地，所述步骤②中雨生红球藻密度到60万个/ml。
更优选地，所述步骤②中雨生红球藻的接种比例为1:10。
更优选地，所述步骤②中光照强度为5000Lx。
更优选地，所述步骤②中环境温度为22℃。
更优选地，所述步骤②中二氧化碳的通入量为0.6L/min。
本发明的目的之二在于提供上述养殖方法在提高雨生红球藻全反式虾青素中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明在培养红球藻的绿色繁殖阶段，采用红光与白光的组合，室内控制温度、光照、pH等，虾青素积累阶段采用室外开放式跑道池积累虾青素，开放式NLS全光谱自然光源(Natural Light Source)，最大程度还原左旋反式天然虾青素的自然生成条件。
(2)在培养基中添加十二烷基苯磺酸钠起到防止生物污染的作用；
(3)在藻类养殖的不同阶段，还进行混合光源的组合，高效促进雨生红球藻的繁殖。
(4)本发明方法在传统“两步法”的基础上合理调节其培养条件，不仅能有效提高雨生红球藻的繁殖能力，并且其全反式虾青素累积量显著提高。该养殖方法采用SPD+NLS串联养殖模式，雨生红球藻用PE板式光反应器绿培，绿色低密度阶段利用红光和白光的适当组合，促进雨生红球藻的生长，在对数生长后期，通过将光照培养模式从白光切换到红光，改善雨生红球藻的自养生长，可以为微藻培养过程中更有效地利用光照实现光合自养。积累虾青素阶段，采用开放式NLS全光谱自然光源，最大程度还原左旋反式天然虾青素的自然生成条件。该方法适用于水资源丰富的长江中下游地区进行大规模养殖雨生红球藻，此方法具有周期短，全反式虾青素含量高等方面的优势，具有广阔的产业化应用前景。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种提高雨生红球藻全反式虾青素的养殖方法，包括以下步骤：
S1：培养基配制
所述培养基包括以下组份：
表1
| 成分 | 用量 |
| 硝酸钠 | 250mg |
| 三水合磷酸氢二钾 | 40mg |
| 七水合硫酸镁 | 75mg |
| 二水合氯化钙 | 36mg |
| 柠檬酸铁铵 | 6mg |
| EDTA | 1mg |
| 碳酸钠 | 20mg |
| 硼酸 | 2.86mg |
| 四水合氯化锰 | 1.81mg |
| 七水合硫酸锌 | 0.222mg |
| 五水合硫酸铜 | 0.079mg |
| 二水合钼酸钠 | 0.39mg |
| 六水合硝酸钴 | 0.0494mg |
该培养基的pH值为7.0-8.5。
S2：雨生红球藻生长阶段
将藻种接种于表1中所述培养基后，光照强度为2000Lx，采用红光、白光组合形成的混合光源照射，白光、红光的强度比例为7：3，24小时不间断补光，控制环境温度为20℃，通入二氧化碳，二氧化碳的通入量为0.5L/min，pH控制在7.0-8.0之间，待密度到60万个/ml时，以体积比1：10的接种比例接种到表1中的培养基中，24小时不间断补光，采用红光、白光组合形成的混合光源照射，白光、红光的强度比例为7：3，光照强度为7000Lx，控制环境温度为20℃，通入二氧化碳、空气混合气体，pH在线检测仪自动控制，当pH达到设定范围时就停止供二氧化碳气，pH控制在7.0-8.5之间，培养8天，绿色生长阶段pH值、关照强度、温度等全程智能控制。
S3：虾青素累积阶段
当显微镜观察到藻细胞为不动的厚壁孢子、密度为110万个/ml时，加入3g/L氯化钠、1g/L碳酸氢钠，然后按照体积比1：2的比例放入室外开放式跑道池积累虾青素，开放式NLS全光谱自然光源(Natural Light Source)，积累10-20天，最大程度还原左旋反式天然虾青素的自然生成条件。积累后期添加十二烷基苯磺酸钠起到防止生物污染的作用。
实施例2
本实施例提供了一种提高雨生红球藻全反式虾青素的养殖方法，包括以下步骤：
S1：培养基配制
所用培养基同实施例1。
S2：雨生红球藻生长阶段
将藻种接种后，光照强度为4000Lx，采用红光、白光组合形成的混合光源照射，白光、红光的强度比例为7：3，24小时不间断补光，控制环境温度为23℃，通入二氧化碳，二氧化碳的通入量为0.4L/min，pH控制在7.0-8.5之间，待密度到60万个/ml时，以体积比1：10的接种比例接种到表1培养基中，24小时不间断补光，采用红光、白光组合形成的混合光源照射，白光、红光的强度比例为7：4，光照强度为3000Lx，控制环境温度为23℃，通入二氧化碳混合气体，二氧化碳的通入量为每升培养基中通入0.6L/min，pH控制在7.0-8.5之间，培养7天，绿色生长阶段PH值、光照强度、温度等全程智能控制。
S3：虾青素累积阶段
当显微镜观察到藻细胞为不动的厚壁孢子、密度为120万个/ml，然后按照体积比1：2的比例放入室外开放式跑道池积累虾青素，加入3g/L氯化钠、1g/L碳酸氢钠，开放式NLS全光谱自然光源(Natural Light Source)，最大程度还原左旋反式天然虾青素的自然生成条件。积累后期添加十二烷基苯磺酸钠起到防止生物污染的作用。
对比例1
本对比例提供了一种雨生红球藻全反式虾青素的养殖方法，包括以下步骤：
S1：培养基配制
所述培养基包括以下组份：
表2
S2：雨生红球藻生长阶段
将藻种接种于表1中所示培养基后，光照强度为2000Lx，采用红光、白光组合形成的混合光源照射，白光、红光的强度比例为7:3，24小时不间断补光，控制环境温度为20℃，通入二氧化碳，二氧化碳的通入量为0.5L/min，pH控制在7.0-8.0之间，待密度到60万个/ml时，以体积比1：10的接种比例接种到表2中的培养基中，室外板式光反应器中培养，通入二氧化碳气，二氧化碳气的通入量为每升培养基中通入0.6L/min，pH控制在7.5-8.5之间，培养10天，待密度达到60万个/ml时，以体积比1：4的接种比例接种到表2所示培养基中，室外管式光反应器中培养，通入空气、二氧化碳混合气体，二氧化碳的通入量为每升培养基中通入0.6L/min，pH控制在7.5-8.5之间，培养10天。
S3：虾青素累积阶段
室外管式光反应器中培养8天左右，当显微镜观察到藻细胞为不动的厚壁孢子、密度为120万个/ml，加入3g/L氯化钠、1g/L碳酸氢钠，积累虾青素10-20天。
对比例2
一种提高雨生红球藻全反式虾青素的养殖方法，包括以下步骤：
S1：培养基配制
所用培养基同实施例1。
S2：雨生红球藻生长阶段
将藻种接种于表1中所述培养基后，光照强度为2000Lx，采用红光、白光组合形成的混合光源照射，白光、红光的强度比例为7：3，24小时不间断补光，控制环境温度为20℃，通入二氧化碳，二氧化碳的通入量为0.5L/min，pH控制在7.0-8.0之间，待密度到60万个/ml时，以体积比1：10的接种比例接种到表1所示培养基中，室外板式光反应器中培养，通入二氧化碳、空气，二氧化碳的通入量为每升培养基中通入0.6L/min，pH控制在7.5-8.5之间，培养10-13天，待密度达到70万个/ml时，以体积比1：4的接种比例接种到培养基中，室外管式光反应器中培养，通入二氧化碳、空气，二氧化碳的通入量为每升培养基中通入0.7L/min，pH控制在7.5-8.5之间，培养12天。
S3：虾青素累积阶段
室外管式光反应器中培养8天左右，当显微镜观察到藻细胞为不动的厚壁孢子、密度为120万个/ml，加入3g/L氯化钠、1g/L碳酸氢钠，积累虾青素10-20天。
实验例1
生物量的测定：
细胞密度用血球计数板进行显微镜计数，将藻液摇匀后取10ml，用戊二醛固定后摇散，在显微镜下计数。另取1L藻液，离心弃上清后，于102℃烘箱中烘干至恒重，取出，称重，计算单位体积中藻细胞的单位体积干质量。实验结果见表3。
采用高效液相色谱法测定虾青素的含量，结果参见表3。
表3
速率用的是μ＝ln(X/Xi)/t；
X--末期干重或细胞密度；
Xi----初期干重或细胞密度；
T——时间；
初始密度：4×105个/ml；
整个绿色繁殖阶段的时间：12天。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种提高雨生红球藻全反式虾青素的养殖方法，其特征在于，所述养殖方法包括以下步骤：
(1)雨生红球藻生长阶段
①将藻种接种后，光照强度设为2000-4000Lx，采用红光、白光组合形成的混合光源照射，白光、红光的强度比例为7：3-4，24小时不间断补光，环境温度为20-23℃，通入二氧化碳，二氧化碳的通入量为0.4-0.6L/min，pH控制在7.0-8.5之间；
②待雨生红球藻密度到55-65万个/ml时，以体积比1：9-11的接种比例接种到培养基中，24小时不间断补光，采用红光、白光组合形成的混合光源照射，白光、红光的强度比例为7：3-4，光照强度为3000-8000Lx，环境温度为20-23℃，通入二氧化碳混合气体，二氧化碳的通入量为每升培养基中通入0.5-0.7L/min，pH控制在7.0-8.5之间，培养7-10天；
所述培养基包括以下组份：
；
(2)虾青素累积阶段
当观察到藻细胞为不动的厚壁孢子、密度为110-120万个/ml，加入2.5-3.5g/L氯化钠、0.8-1.2g/L碳酸氢钠，然后放入室外开放式跑道池积累虾青素，采用开放式NLS全光谱自然光源。
2.根据权利要求1所述的养殖方法，其特征在于，所述步骤①中光照强度为3000Lx。
3.根据权利要求2所述的养殖方法，其特征在于，所述步骤①中环境温度为21℃。
4.根据权利要求3所述的养殖方法，其特征在于，所述步骤①中二氧化碳的通入量为0.5L/min。
5.根据权利要求4所述的养殖方法，其特征在于，所述步骤②中雨生红球藻密度到60万个/ml。
6.根据权利要求5所述的养殖方法，其特征在于，所述步骤②中雨生红球藻的接种比例为1:10。
7.根据权利要求6所述的养殖方法，其特征在于，所述步骤②中光照强度为5000Lx。
8.根据权利要求7所述的养殖方法，其特征在于，所述步骤②中环境温度为22℃。
9.根据权利要求8所述的养殖方法，其特征在于，所述步骤②中二氧化碳的通入量为0.6L/min。
10.权利要求1-9中任一项所述的养殖方法在提高雨生红球藻全反式虾青素中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202410428153.XA CN118127113A (zh) | 2024-04-10 | 2024-04-10 | 一种提高雨生红球藻全反式虾青素的养殖方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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- 2024-04-10 CN CN202410428153.XA patent/CN118127113A/zh active Pending
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