CN118126057B - 一种化合物RCPH及其合成方法、作为比率型pH探针的应用和产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化合物RCPH及其合成方法、作为比率型pH探针的应用和产品，属于精子内pH检测技术领域。本发明通过合成一种新的化合物RCPH，将其作为比率型pH探针，并用于精子pH检测试剂中，可实现精子细胞内pH精确定量检测，检出限小于0.15个pH单位，进而区分正常人与弱精患者之间的差异，以及实现药物筛选与遗传学优选。
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物RCPH及其合成方法、作为比率型pH探针的应用和产品，属于精子内pH检测技术领域。
背景技术
临床上的不孕症被定义为夫妇在尝试一年后未能实现受孕，这是一种影响全球约7000万人的普遍状况。根据世界卫生组织（WHO）的数据，大约9%的夫妇全球范围内面临生育挑战，其中男性因素占30-50%。精液分析的不同参数是评估男性生育能力的主要方法，包括精子活力、浓度、形态、氧化应激、DNA损伤。尽管精液分析在不孕症的初步筛查中很重要，但约15%的不育男性仍展示出正常的精子，如世界卫生组织精液分析指南的第六版所示，这表明需要更具体和补充的诊断方法来确定男性不育的原因，预测和改善生殖结果。另一方面，目前对精子功能障碍在生理和病理方面的理解仍然有限。因此，迫切需要对男性不育的基础病因指标及相关个性化干预策略进行更多的研究。
在精子中，（CO2++ H2O）与（HCO3-+ H+）之间的平衡对其活力和能力化至关重要。精子细胞内pH（简称pHi）的增加是精子能力化的一个众所周知的标志。精子从睾丸释放后，“唤醒”从休眠状态，并经历一个复杂的pH依赖的成熟过程。在这一过程中，环境的pH值经历了显著变化，从附睾中的酸性环境（pH在6.5到6.8之间）到女性生殖系统的更碱性环境（pH约为7.6到7.8）。这种碱性环境富含碳酸氢盐（HCO3-）和钙离子（Ca2+），将导致精子pHi增加并触发精子活力的转变（也称为“能力化”）。在这一阶段，精子将经历一个“超活化”的活力状态，为其目标做准备。这些转变中的一个关键因素是精子的pHi。精子中pHi的调节对其功能至关重要，最终决定其受精潜力。一旦精子内部的pH值发生变化，连同其他种类依赖的因素，一系列保守的离子通道、转运蛋白和可溶性胞质酶将被激活，这些都是以pHi依赖的方式功能耦合的，并主要位于精子的“尾部”或鞭毛中。从根本上说，精子的pHi作为一个调节开关，碱化的干扰严重损害精子活力和生殖能力。几十年来，研究人员探索了影响精子功能的pH依赖机制，揭示了对活力和能力化至关重要的通道和蛋白。尽管存在种类差异，这些研究确定pHi是精子受精旅程中一个至关重要的保守元素。因此，了解精子pHi在受精前后的变化为男性生育能力和潜在的不育治疗提供了关键见解。
尽管，现有研究已经建立了异常精子pHi与男性不育之间的强联系，但精子pHi作为诊断标志物在临床上的应用仍然有限。这一差距主要是由于缺乏精确测量pHi的有效工具，这突显了在男性生殖健康领域未来研究和开发的一个重要领域。检测精子pHi的方法仍然存在固有的局限性。时间分辨率对于实时精子细胞内pH测量至关重要，但现有技术无法很好地呈现。例如，现有技术AuNPs pH探针（如：CN112014367A）在孕酮刺激后需要超过10分钟才能检测到精子pHi的变化。同时，还缺乏能够提供理想空间分辨率（对于在特定细胞内区域精确定位pH值是一个重要参数）的检测方法，几乎所有现有方法只能提供整个精子的平均pH读数，这可能会丢失关于局部pH变化的关键信息。一个尚未完全理解的关键方面是精子与女性生殖微环境的复杂时空动态的相互作用。这种相互作用对于控制能力化的开始和转变为超活化活力至关重要，这两者都是成功穿越输卵管所必需的。能够准确监测精子pHi的高时空分辨率将为这些过程提供关键见解。更重要的是，目前精子pH检测技术面临的主要限制是灵敏度，这极大地阻碍了对微妙的精子生理变化的研究。开发高灵敏度pHi探针以满足生育研究中的精子监测需求的两个主要因素。首先，尽管成功和未成功的体外受精（IVF）组之间的pHi值存在显著变异，但观察到的差异仅为0.11个pH单位。另一个因素是，评估pHi与受精潜力的相关性，动态变化更为重要。例如，在人类精子的能力化过程中，pHi值通常上升约0.11-0.14单位，从大约6.70上升到6.84。因此，为了加速使用pHi作为检测精子不育的病因指标，迫切需要开发更敏感、准确和可靠的检测技术，提供更高的时空分辨率以及更准确的测量精子内pH的信息。还迫切需要开发能够提供改进的时空分辨率以及更准确、可靠的内精子pH测量技术。
荧光探针是一种强大的工具，具有非侵入性、无辐射、高灵敏度、高选择性和高时空分辨率的优点，能够从复杂的生物系统中获得包括疾病相关信息在内的丰富参数，用于体外和体内重要物种的可视化。然而大多数pH探针无法进行定量检测（具有开启型荧光响应），并且具有比值荧光变化的探针通常灵敏度较低（通常表现出约2个pH单位的宽pH响应荧光），同时，大多数公开的pH探针也存在同样的问题，限制了精子内pH映射和检测的准确性。此外，现有技术CN111533761A中公开一类具有优异细胞器靶向性的荧光染料，其主要实现细胞器的可视化和研究细胞器pH对细胞生理活动的影响，并举例衰老细胞器中的酶活性监测，而其pH灵敏响应范围为6-8。
因此，需要一种高时空分辨率、高灵敏度、实时动态监测、高精度、pH灵敏响应范围更窄、能定量测量的pH探针，用于精子内pH映射。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提出了一种化合物RCPH及其合成方法、作为比率型pH探针的应用和产品。其中，涉及的探针具有出色的时空分辨率能力，此外，其不仅能够进行精子细胞内pH的精确定量测量，而且还能显著区分正常精子和弱精子个体之间细胞内pH的差异；以及，该探针对于通过改善pHi来增强精子受精能力的药物筛选具有潜力，其通过调节pHi来减少精子DNA突变频率，为精子选择提供了可能性。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
本技术方案第一目的，在于提出：一种化合物，命名为“RCPH”，其结构式如下：
。
本技术方案第二目的，在于提出：一种化合物RCPH的合成方法，包括如下步骤：
S1：将7-（二乙胺基）-2-氧代-2-苯并吡喃-3-羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐溶于二氯甲烷溶剂中，在室温下进行羧基活化反应，得到第一中间体；
S2：将荧光素溶于氢氧化钠水溶液（溶剂）中，在155-165℃下进行水解反应，得到第二中间体；
S3：将所得第二中间体和3-羟基苯基哌嗪溶于三氟乙酸溶剂中，在155-165℃下进行环化和取代反应，得到第三中间体；
S4：将所得第一中间体、所得第三中间体和三乙胺（三乙胺作碱，中和上一步骤中剩余的三氟乙酸）加入至二氯甲烷溶剂中，在室温下进行取代反应，得到化合物RCPH（Ratio）；
其中，涉及的化学反应路线为：
。
进一步的，在步骤S1中，所述7-（二乙胺基）-2-氧代-2-苯并吡喃-3-羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺及1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐三者之间的配比关系为1:1-1.2:1。
进一步的，在步骤S2中，氢氧化钠水溶液中氢氧化钠浓度为45-55%。
进一步的，在步骤S3中，第二中间体与3-羟基苯基哌嗪之间的配比关系为1-2:1。
进一步的，在步骤S4中，第一中间体与第三中间体之间的配比关系为1-1.4:1。
本技术方案第三目的，在于提出：一种化合物RCPH作为比率型pH探针在制备精子pH检测试剂中的应用。
其中，所述应用以该pH探针定量测量精子细胞内pH，区分正常精子及弱精子之间细胞内pH的差异，以及，通过可通过改善pHi来增强精子受精能力的药物筛选；同时，通过调节pHi来减少精子DNA突变频率，为精子选择提供了可能性。
本技术方案第四目的，在于提出：一种由化合物RCPH作为比率型pH探针制备的精子pH检测的试剂，其中，试剂包括化合物RCPH。
进一步的，所述试剂中，化合物RCPH的终浓度为2-20μM。
进一步的，所述试剂的检出限小于0.15个pH单位。
在本技术方案中，“室温”具体是指常温或者一般温度，定义为“25±5℃”的温度。
在本技术方案中，涉及的术语解释有：
比率型pH探针：为一种用于测量溶液pH值的工具，它能够提供pH值的相对变化而不仅仅是绝对值。该探针通常基于某些荧光或吸收特性随pH变化而变化的化合物。比率型探针的关键特点是它们能够在两个或更多的波长上提供信号，这些信号的比率可以用来准确计算出样品的pH值。这种方法的优势在于，它可以减少由于探头局部浓度差异、光源强度变化或样品散射等因素引起的误差，从而提供更精确、可靠的pH测量；
时间分辨率：是指测量系统、仪器或技术能够区分事件发生时间或记录数据变化的最小时间间隔。高时间分辨率意味着能够捕捉到非常快速的事件或变化，对于研究动态过程如化学反应、生物过程或物理现象等特别重要。例如，在本技术方案中，高时间分辨率的pH探针能够帮助捕捉到精子内pH的瞬时变化；
空间分辨率：是指成像系统或技术在物理空间中区分对象的最小距离。高空间分辨率意味着能够清晰地区分或识别非常接近的两个点或物体，这在精密成像领域非常关键，如显微镜成像、遥感探测和医学成像等。空间分辨率的提高可以帮助科学家和工程师观察到更细微的结构细节，从而更好地理解材料、生物组织或地理特征的性质。例如，本技术方案中，高空间分辨率的pH探针主要分辨精子线粒体的pH改变。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
本发明提出了一种新的比率型pH探针，将其用于精子细胞内pH检测，检出限小于0.15个pH单位，能实现精确定量检测pH、区分正常人与弱精患者之间的差异，进一步的实现药物筛选和遗传学优选。对于药物筛选，就如：谷氨酰胺通过提高精子内pH，提高精子活力及受精能力；而采用本发明中的比率型pH探针，可有效的、定量的检测谷氨酰胺引起的精子内pH改变，即进一步改善精子活力及受精能力的药物筛选。具体如下：
1、在本发明中，将化合物RCPH作为比率型pH探针，其对精子活力的影响很小，且对精子活力没有细胞毒性影响。较现有技术中的AuNPs系列探针和BCECF探针的显着改进，这两者探针都会对精子的存活率产生不利影响。此外，与AuNPs系列探针相比，BCECF探针表现出更明显的毒性作用，而化合物RCPH对精子活力的影响微乎其微，突出了其低细胞毒性，关键是在染色后保持精子功能，这一特性使化合物RCPH成为应用于先进生殖技术，特别是体外受精（IVF）的有前途的工具，其中保持精子完整性至关重要；
2、在本发明中，将化合物RCPH作为比率型pH探针，具有较高的灵敏度和特异性，就如：化合物RCPH可以敏感地监测孕激素和4-AP这两种药物引起的精子碱化，相反，添加ZnCl2和NNC导致绿色荧光增强，红色荧光减少，本pH探针的Ratio值明显低于CTL组，表明这些物质引起的精子酸化也可以被RCPH准确监测；
3、在本发明中，将化合物RCPH作为比率型pH探针，可实时动态监测能力，捕捉了精子对各种刺激的反应。其中，本pH探针具有较好的空间分辨率，能够精确检测单个精子头部和中段内的pHi变化；此外，在药物（如：孕激素）刺激后，pH探针及时准确地跟踪了精子细胞内碱化的过程，即展示了其卓越的时间分辨率；
4、现有技术中AuNPs系列探针需要大约10分钟才能检测到孕激素诱导的精子细胞内pH碱化，而本发明中pH探针展示了明显增强的响应性，能够在不到一分钟内捕捉到这种关键的pH变化，即pH探针的快速检测能力突显了其在监测精子动态生理变化方面的卓越效率等；
5、在本发明中，pH探针的pH灵敏响应范围为6-7，较现有技术（如：CN111533761A）而言，pH识别范围更窄。
附图说明
图1为实施例4中不同浓度下的pH探针（化合物RCPH）染色人类精子10min后的结果图（流式细胞仪检测）；
图2为实施例4中不同浓度下的pH探针（化合物RCPH）染色人类精子10min后的结果图（激光共聚焦检测）；
图3为实施例4中20μM浓度下的pH探针（化合物RCPH）染色人类精子染色10min后的CASA分析结果；
图4为实施例4中用已知物质（ZnCl2、NNC-550396、孕酮和4-AP）刺激人类精子，再经20μM化合物RCPH染色后，共聚焦荧光图像。其中，展示了精子不同区域的荧光强度、经刺激后的精子与顶体距离及特定发射强度；
图5为实施例4中用已知物质（ZnCl2、NNC-550396、孕酮和4-AP）刺激人类精子，再经20μM化合物RCPH染色后，精子Ired/Igreen比值的统计分析结果。其中，p≤0.05，n≥15，显著性水平分别用p<0.05，p<0.01，**p<0.001表示；
图6为实施例4中用已知物质（ZnCl2、NNC-550396、孕酮和4-AP）刺激人类精子，再经20μM化合物RCPH染色后，精子群体之间FITC至PB450的中位荧光强度比值的群体差异。其中，p≤0.05，n≥15；
图7为实施例4中用已知物质（ZnCl2、NNC-550396、孕酮和4-AP）刺激人类精子，再经2μM化合物RCPH染色后，精子的流式细胞分析结果；
图8为实施例4中用已知物质（ZnCl2、NNC-550396、孕酮和4-AP）刺激人类精子，再经5μM的pH荧光探针-BCECF染色后，精子流式细胞分析结果；
图9为实施例4中5μM尼日利亚菌素处理30min后，化合物RCPH在不同pH（5.98-7.45）下的细胞内的定量染色效果（激光共聚焦仪检测）；
图10为实施例4中5μM尼日利亚菌素处理30min后，化合物RCPH在不同pH（5.98-7.45）下的细胞内的定量染色效果的标准曲线图。其中，展示了红色与绿色通道之间的平均荧光强度比值（y轴）与不同精子细胞内pH梯度（x轴）之间的关系；以及，每个数据点代表三次重复实验；
图11为实施例4中5μM尼日利亚菌素处理30min后，化合物RCPH在不同pH（6.39-7.5）下的细胞内的定量染色效果（流式细胞仪检测）；
图12为实施例4中5μM尼日利亚菌素处理30min后，化合物RCPH在不同pH（6.39-7.5）下的细胞内的定量染色效果的标准曲线图，由FITC和PB450通道的中位荧光强度比值的标准曲线y轴与不同精子细胞内pH梯度x轴绘制。其中，涉及的曲线方程为y=190.3x−1217，R²=0.9908；以及，每个数据点代表三次重复实验；
图13为实施例4中5μM尼日利亚菌素处理30min后，现有技术中BCECF探针在不同pH（6.19-8.0）下的细胞内的定量染色效果（流式细胞仪检测）；
图14为实施例4中5μM尼日利亚菌素处理30min后，现有技术中BCECF探针在不同pH（6.19-8.0）下的细胞内的定量染色效果的标准曲线图，FITC通道的中位荧光强度y轴与不同精子细胞内pH梯度x轴的标准曲线绘制。其中，涉及的曲线方程为y=363694x−2248910，R²=0.9898；以及，每个数据点代表三次重复实验；
图15为现有技术中BCECF探针与化合物RCPH分别染色精子后的pHi之间的差异（其中，a-1为现有技术中BCECF探针染色精子后的pHi结果，a-2为a-1中对应的样品名称及计数统计；b-1为本化合物RCPH染色精子后的pHi结果，b-2为b-1中对应的样品名称及计数统计；）；
图16为实施例4中正常精子和弱精患者的精子分别采用浓度为2 μM的化合物RCPH进行精子细胞内pH检测的结果。其中，以p≤0.05的阈值确定68个正常精子症样本和30个少动精子症样本的精子细胞内pH。显著性水平为**p<0.01；
图17为实施例4中正常精子和弱精患者的精子分别采用浓度为2 μM的化合物RCPH进行精子细胞内pH检测的结果（流式细胞仪检测）。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在下述实施例中，涉及的设备包括：
激光共聚焦仪（蔡司，LZM780，美国）；
流式细胞仪（贝克曼，Cytoflex-s，美国）；
CASA仪器（成都朴华生命科技有限公司，中国）；
涉及的实试剂包括：尼日利亚菌素、孕酮、ZnCl2、NNC-550396、4-AP（MCE，美国）；
涉及的实验样本包括：
人类精子，来源于四川大学华西第二医院、四川省妇幼保健院和四川锦欣西囡妇女儿童医院；
SKOV-3细胞系，购买自美国生物标准品资源中心（ATCC）；
HL7702细胞系，购买自美国生物标准品资源中心（ATCC）；
68例活力正常的精子样本及30例弱精子症的精子样本，来源于四川大学华西第二医院、四川省妇幼保健院和四川锦欣西囡妇女儿童医院；
其他溶剂和试剂除特别说明外，均为市售分析纯且直接使用。
实施例1
本实施例提供一种化合物RCPH的合成方法，包括如下步骤：
1）第一中间体的合成
在100 mL圆底烧瓶中，分别加入7-（二乙胺基）-2-氧代-2-苯并吡喃-3-羧酸（5.00g，19.14mmol）、N-羟基琥珀酰亚胺（2.64g，22.96mmol）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（3.67g，19.14mmol）与50mL二氯甲烷，然后，将该混合液在室温中搅拌过夜，TLC持续监测直至7-（二乙胺基）-2-氧代-2-苯并吡喃-3-羧酸消失。减压蒸馏去除溶剂，通过200-300目硅胶柱层析分离提纯，洗脱剂极性为石油醚：乙酸乙酯=1：1，得第一中间体，该产物为白色片状固体（952mg，49.7%）；
对于第一中间体，1H NMR(400 MHz, CDCl3)：δ (TMS, ppm) 8.53(1 H, s), 7.34(1 H, d,J= 8.9 Hz), 6.60(1 H, d,J= 8.7 Hz), 6.40(1 H, s), 3.44(4 H, dd,J=13.3, 6.4 Hz), 2.86(3 H, s), 1.22(6 H, t,J= 6.7 Hz).13C NMR(101 MHz, CDCl3)：δ(TMS, ppm) 169.5, 159.1, 158.8, 157.0, 154.1, 151.1, 132.0, 110.2, 102.4107.6, 96.7, 45.3, 25.6, 12.4. HRMS [ESI+]m/z 381.1061(381.1063 calcd for[C18H18N2O6+ Na+]).。
2）第二中间体的合成
在250 mL圆底烧瓶中，将荧光素（5.1g，15.3mmol）溶于72 mL氢氧化钠水溶液（50%）。在持续搅拌下将混合液升温至160℃，反应开始一小时后，继续加入荧光素（5.1g，15.3mmol），并在此温度下继续反应3h。待反应结束后将混合液降至室温，并将其分批次投入进80 mL冰水中，滴加浓盐酸直至有大量暗棕色固体析出，此时pH约为7左右。减压抽滤保留滤饼，无水乙醇中重结晶后，将产物置于真空干燥箱中并辅以五氧化二磷干燥过夜，得第二中间体，该产物为灰白色粉末状固体，直接投入下一步反应。
3）第三中间体的合成
在250 mL圆底烧瓶中，分别加入3-羟基苯基哌嗪（2.95g，16.5mmol）、第二中间体（6.39，24.8 mmol）与50mL三氟乙酸。在持续搅拌下将混合液升温至160℃过夜，此时溶液用365 nm便携式紫外手电筒照射会有明显的红色荧光，将反应液降至室温，减压蒸馏去除溶剂，通过200-300目硅胶柱层析分离提纯，洗脱剂极性为二氯甲烷：甲醇=24：1，得第三中间体，该产物为红色固体（3.02g，45.6%）。
4）化合物RCPH（探针Ratio）的合成
在100 mL圆底烧瓶，分别加入第一中间体（1.08g，3.00mmol）、第三中间体（1g，2.50mmol）、30mL二氯甲烷与1mL三乙胺，将混合液在室温下剧烈搅拌约30min。减压蒸馏去除溶剂，残留固体用通过200-300目硅胶柱层析分离提纯，洗脱剂极性为二氯甲烷：甲醇=4：1，得化合物RCPH，该产物为黄色固体（6.86g, 51.7%）；
对于化合物RCPH，1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6)：δ (TMS, ppm) 10.14(1 H, s),8.03 - 7.97(2 H, m), 7.78(1 H, d,J= 6.8 Hz), 7.72(1 H, d,J= 7.1 Hz), 7.50(1H, d,J= 9.1 Hz), 7.26(1 H, d,J= 7.2 Hz), 6.83(2 H, s), 6.75(2 H, d,J= 8.7Hz), 6.67(1 H, s), 6.55(4 H, s), 3.45(6 H, d,J= 6.6 Hz), 3.26(6 H, d), 1.13(6H, t,J= 6.3 Hz).13C NMR(101 MHz, DMSO-d 6)：δ (TMS, ppm) 169.2, 164.6, 160.0,158.9, 157.1, 152.7, 152.3, 151.7, 144.4, 135.9, 130.6, 130.5, 129.5, 128.9,126.7, 125.0, 124.5,116.2, 112.4, 110.1, 109.9, 109.1, 107.6, 102.7, 101.9,96.8, 60.2, 55.3, 44.6, 21.2, 14.5, 12.7. HRMS [ESI+]m/z 644.2365(644.2397calcd for [C18H18N2O6+ Na+]).。
其中，化合物RCPH涉及的合成路线如下：
。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例将经实施例1所得的化合物RCPH作为比率型pH探针在制备精子pH检测试剂中的应用。其中，应用以该pH探针定量测量精子细胞内pH，区分正常精子及弱精子之间细胞内pH的差异，以及，通过改善pHi来增强精子受精能力的药物筛选；同时，通过调节pHi来减少精子DNA突变频率，为精子选择提供了可能性。
实施例3
在实施例1的基础上，本实施例提供一种用于精子pH检测的试剂，该试剂包括化合物RCPH，也就是说，将化合物RCPH作为比率型pH探针，而该比率型pH探针用于制备精子pH检测的试剂。
实施例4
在实施例1-3的基础上，本实施例将化合物RCPH作为比率型pH探针应用于精子细胞内，进行精子染色、pH定量检测等，并进行如下讨论，以对本技术方案作进一步的说明。
一、讨论化合物RCPH在人类精子内的染色效果，并确定了其在人类精子内的最佳染色浓度
1）设置0-10μM范围下的不同浓度梯度（具体为：0μM、1μM、2μM、3μM、5μM、10μM）化合物RCPH对应的pH探针染色人类精子，染色10min后，采用流式细胞仪（Cytoflex-s，贝克曼，美国）检测精子内染色效果，其中，设置激发波长λex = 405nm。利用流式细胞术分析活体人类精子内部pH变化，以评估单个精子内的pH动态；
可知，在流式细胞仪上的最佳染色的pH探针浓度为2μM（图1）。
2）设置0-40μM范围下的不同浓度梯度（具体为：0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM）化合物RCPH对应的pH探针染色人类精子，染色10min后，采用激光共聚焦仪（LSM780，蔡司，美国）检测精子内染色效果，其中，设置激发波长λex = 405nm，精子图像的标尺=20μm；
可知，激光共聚焦显微镜的最佳染色的pH探针浓度为20 μM（图2）。
3）设置空白对照组：不做处理；
实验组：选用浓度在20μM下的化合物RCPH对应的pH探针染色人类精子，染色10min；
然后，空白对照组和实验组的精子进行CASA检测（CASA仪器，成都朴华生命科技有限公司）。其中，CASA检测具体包括精子总活力、前向运动活力、平均路径速度/VAP、直线性/LIN、侧摆幅度/ALH、直线运动速度/VSL、曲线运动速度/VCL、侧向摆动幅度/WOB）、前向性/STR和平均鞭打频率/BCF。其中，CASA检测参数由三次独立实验所得，涉及的数据均以均值±SD形式展示；通过t检验分析，这些参数的变化在统计学上有的表现为不显著（NS），有的则表现出显著性，分别以()P<0.05，()P<0.01，以及(*)P<0.001表示；
可知，该浓度下的pH探针对精子活力没有影响（图3）。
进而，得出：①pH探针在对人类精子进行染色中，化合物RCPH的终浓度为2-20μM；
②化合物RCPH对精子活力的影响较小，这较本发明人之前开发的AuNPs系列探针和BCECF探针，有着显着改进，这两者（AuNPs系列探针和BCECF探针）都会对精子的存活率产生不利影响。其中，化合物RCPH对精子活力的影响微乎其微，突出了其低细胞毒性，尤其是在染色后，仍保持精子功能（运动活力），这一特性使化合物RCPH成为应用于辅助生殖的先进技术，特别是体外受精（IVF）的检测/监测工具，其中，保持精子功能完整性至关重要。
二、讨论化合物RCPH（pH探针）测量的灵敏度和特异性：使用已知物质（ZnCl2、NNC-550396、孕酮和4-AP，主要用于调节精子细胞内pH）刺激人类精子
在四份受精介质（G-IVF PLUS）中，分别采用ZnCl2、NNC-550396、孕酮和4-AP刺激精子，以及，设置空白对照组（在受精介质中，不采用物质刺激精子）；
1）用20μM的化合物RCPH染色10min，然后采用激光共聚焦仪（LSM780，蔡司，美国）检测精子内染色效果，其中，设置激发波长λex=405nm、绿色=发射波长λem=465nm、红色=发射波长λem=543nm，精子图像的标尺=20μm，结果如图4-6所示；
2）用2μM的化合物RCPH染色10min，然后进行流式细胞分析（流式细胞仪，Cytoflex-s，贝克曼，美国），其中，设置激发波长λex=405nm、PB450=发射波长λem=465 nm、FITC=发射波长λem=543nm，结果如图7所示；
3）结论
1、与空白对照组（CTL）相比，添加孕激素和4-AP，荧光强度比Ratio值（Ired/Igreen）高于CTL组，表明化合物RCPH可以敏感地监测孕激素和4-AP这两种物质引起的精子碱化。相反，添加ZnCl2和NNC，pH探针的荧光强度比Ratio值（Ired/Igreen）明显低于CTL组，表明这些物质引起的精子酸化也可以被RCPH准确监测。
最终，得出：在暴露于刺激物后，化合物RCPH展示了实时动态监测能力，捕捉了精子对各种刺激的反应。这些反应与我们使用BCECF探针验证的pHi变化一致（图8）。在上述实验中，化合物RCPH表现出较好的空间分辨率，能够精确检测单个精子头部和中段内的pHi变化（如图4）。正如化合物RCPH所显示的，主要的pH变化发生在中段，而我们结果表明，孕激素激活了线粒体内的pH增加。此外，在孕激素刺激后，本化合物RCPH（pH探针）及时地、准确地跟踪了精子细胞内碱化的过程，证明了其卓越的时间分辨率。
以及，使用相同的程序协议，现有技术中的AuNPs系列探针需要约10min才能检测到孕激素诱导的精子细胞内pH碱化，而本化合物RCPH展示了明显增强的响应性，能在1min内捕捉到该关键的pH变化。即本化合物RCPH的快速检测能力突显了其在监测精子动态生理变化方面的高效率。
2、进一步通过使用化合物RCPH验证了由上述物质诱导的精子细胞内pH变化的流式细胞术检测。即，在添加孕激素和4-AP后，与空白对照组（CTL）相比，比值（FITC/PB450）显著增加，超过90%的精子群体集中在Q1区域（强FITC荧光，相对较弱的PB450荧光），而空白对照组仅有74%（如图6-7），这表明化合物RCPH可以捕捉精子群体中每个精子的细胞内碱化状态。相反，在添加ZnCl2和NNC后，比值（FITC/PB450）显著降低，约20%的精子集中在PB450荧光相对较强的Q2+Q3区域，而空白对照组仅有10%（如图6-7），这表明化合物RCPH可以捕捉精子群体中每个精子的细胞内酸化状态；
最终，得出：化合物RCPH展示了对精子群体中每个精子的pHi变化具有出色的区分能力，而不是平均pH读数，有效监测精子对外部刺激的细胞内pHi波动。
三、验证化合物RCPH在精子细胞内的pH定量检测效果
1、利用5μM尼日利亚菌素（MCE，美国）分别处理SKOV-3细胞系（ATCC购买）和HL7702细胞系（ATCC购买），然后，将对应的细胞暴露于不同pH梯度（5.98-7.45）下的PBS缓冲液中；再使用化合物RCPH（pH探针）对SKOV-3细胞和HL7702细胞进行染色；最后，使用激光共聚焦仪（LSM780，蔡司，美国）检测细胞内染色效果，其中，设置激发波长λex = 405nm，精子图像的标尺=20μm；
结果如图9-10所示，可知：化合物RCPH对应的pH探针可以在细胞内实现pH的定量检测。
2、利用5μM尼日利亚菌素（MCE，美国）处理精子，然后，将对应的精子暴露于不同pH梯度（6.39-7.5）下的PBS缓冲液中；再使用化合物RCPH（pH探针）对精子进行染色；最后，使用流式细胞仪（Cytoflex-s，贝克曼，美国）检测；
结果如图11-12所示，化合物RCPH可在pH梯度（6.39-7.5）的情况下，定量检测精子内pH，得到标准曲线y=190.3x−1217，R²=0.9908；
3、利用5μM尼日利亚菌素（MCE，美国）处理精子，然后，使用现有技术中的BCECF对精子进行染色，并将对应的精子暴露于不同pH梯度（6.19-8.0）下的PBS缓冲液中；最后，使用流式细胞仪（Cytoflex-s，贝克曼，美国）检测；
结果如图13-15所示，与已报道的可定量的BCECF探针对比，尽管同样用尼日利亚菌素处理并用流式细胞仪检测后可得到pH定量的标准曲线（图13-14），但BCECF的pH检出限均超过0.15个pH，当ΔpHi小于0.15时，则对精子内pH难以识别准确（图15）。而本技术方案中pH探针检出限则小于0.15个pH，ΔpHi相同的情况下，BCECF无法识别的条件我们的探针可进行区分（图15）。
四、验证该探针在临床诊断的可行性
收集68例活力正常的精子样本及30例弱精子症的精子样本（来源于四川大学华西第二医院、四川省妇幼保健院和四川锦欣西囡妇女儿童医院），其中，弱精子症是指精子前向运动能力小于32%，已知精子内pH与精子运动能力及受精能力密切相关。
将各精子样本分别置于pH 7.4的PBS缓冲液，然后，采用浓度为2μM的化合物RCPH（pH探针）对精子进行染色；最后，使用流式细胞仪（Cytoflex-s，贝克曼，美国）检测；
结果如图16-17所示，可知：本化合物RCPH 对应的pH探针可以显著区分活力正常精子与弱精的精子内pH差异（图16），并通过已知标曲的定量结果可发现弱精子症患者的精子内pH平均值低于活力正常精子0.15个单位（如图17）；
综上，本pH探针可以定量精子内的pH，检出限小于0.15，并且可区分正常人及弱精病人精子内pH的差异，可作为临床上精子内pH诊断的试剂。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种化合物RCPH的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）第一中间体的合成
在100 mL的圆底烧瓶中，分别加入19.14mmol 的7-（二乙胺基）-2-氧代-2-苯并吡喃-3-羧酸、22.96mmol的N-羟基琥珀酰亚胺、19.14mmol的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐与50mL的二氯甲烷，然后，将所得的混合液Ⅰ在室温中搅拌，过夜；减压蒸馏，通过200-300目硅胶柱层析分离提纯，洗脱剂极性为石油醚：乙酸乙酯=1：1，得第一中间体；
2）第二中间体的合成
在250mL的圆底烧瓶中，将15.3mmol的荧光素溶于72 mL的氢氧化钠水溶液中，氢氧化钠水溶液的浓度为50%；在持续搅拌下，将该混合液Ⅱ升温至160℃，反应开始一小时后，继续加入15.3mmol的荧光素，并在160℃下继续反应3h；待反应结束后，将所得的反应液Ⅰ降至室温，然后，分批次投入进80 mL冰水中，滴加浓盐酸直至pH为7；减压抽滤，保留滤饼，于无水乙醇中重结晶后，将产物置于真空干燥箱中，并辅以五氧化二磷干燥过夜，得第二中间体；
3）第三中间体的合成
在250mL的圆底烧瓶中，分别加入16.5mmol 的3-羟基苯基哌嗪、24.8mmol的第二中间体与50mL的三氟乙酸；在持续搅拌下，将该混合液Ⅲ升温至160℃，过夜；然后，将所得的反应液Ⅱ降至室温，减压蒸馏，通过200-300目硅胶柱层析分离提纯，洗脱剂极性为二氯甲烷：甲醇=24：1，得第三中间体；
4）化合物RCPH的合成
在100mL的圆底烧瓶中，分别加入3.00mmol的第一中间体、2.50mmol的第三中间体、30mL的二氯甲烷与1mL的三乙胺，将该混合液Ⅳ在室温下搅拌30min，减压蒸馏，将所得的残留固体通过200-300目硅胶柱层析分离提纯，洗脱剂极性为二氯甲烷：甲醇=4：1，得化合物RCPH；
所述化合物RCPH的结构式如下：
。
2.由权利要求1所得的化合物RCPH作为比率型pH探针在制备精子pH检测试剂中的应用，所述试剂中，化合物RCPH的终浓度为2-20μM。
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