CN118119701A - 用于生产乳样产物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生产哺乳动物乳样产物例如人乳样产物的方法，该方法包括：生成源自哺乳动物乳腺上皮细胞例如人乳腺上皮细胞的乳细胞，以及从乳细胞中表达哺乳动物乳样产物例如人乳样产物。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于体外生产哺乳动物乳样产物的方法，例如，生产人乳样产物的方法，该方法包括：通过培养和分化，和/或包括此类乳细胞(lactocytes)的乳腺样腺体类器官，生成源自哺乳动物乳腺上皮细胞的乳细胞，以及从此类乳细胞和/或乳腺样腺体类器官中表达哺乳动物乳样产物，例如，人乳样产物。本发明还涉及由此类方法可获得的哺乳动物乳样产物，例如，人乳样产物。
背景技术
哺乳动物的尤其是人类的乳汁是具有多种组分的复杂流体，每种组分可充分地有助于婴儿和甚至母体的健康。越来越多证据表明人母乳在至少前6个月中是最合适的营养来源。人乳中许多组分在牛奶中要么完全缺乏，要么含量很低，要么不太活跃，而这些组分是生产婴儿配方食品的基础。其包括，例如，乳铁蛋白、生长因子、长链多价不饱和脂肪酸或低聚糖。虽然最近在婴儿配方食品组分方面有了重大发展，人乳组分当前一直被用作开发婴儿配方食品的黄金标准，要想实现人造母乳在当前制造工艺下是根本无法实现的。
目前，人乳的唯一来源是人类供体(进行母乳喂养的母亲)。用于非商业用途(人乳库(human milk biobank))和商业用途的捐赠均有报道。然而，母乳捐赠是有限的，并且受到监管和安全方面的严格管控，有时还受到来自伦理或宗教的约束。
在哺乳动物的尤其是人乳中发现的干细胞称为母乳干细胞(hBSC)。hBSC表现出高度适于人造并可在培养中分化为多种类型细胞的特点，更重要地是，hBSC可分化为形成人类乳腺腺体的小叶肺泡结构所需的三种细胞系(Hassiotou F.等人，Stem Cells，2012年)。然而，使用hBSC生产人母乳既不现实也不可持续，因为它需要人类供体。
目前已知一种具有干细胞功能的细胞系，这项技术被称为诱导多能干细胞(iPSC)。目前已提出一种可靠的用以由人类iPSC(hiPSC)生成人乳腺样类器官的两步方案(Ying Qu等人，Stem Cell Report，第8卷，第205-215页，2017年2月14日)。
相应地，本发明的目的在于提供生产乳腺腺体细胞的替代和改进的方法并且在培养的细胞中再现哺乳动物乳汁例如人乳的表达，而不使用早期的未分化干细胞。本发明的目的还在于在培养的细胞中制备针对定制的哺乳动物乳样产物，例如人乳样产物，培养的细胞可适应于受体的特定需求和/或生成人乳生物活性物质，以补充基于牛奶的现有婴儿营养解决方案，再次地不使用干细胞。
发明内容
本发明解决了上述技术问题。
本文提供了一种用于生产哺乳动物乳样产物的方法，该方法包括：
A)在培养基中培养乳腺上皮细胞以生成乳细胞乳腺样腺体类器官；以及
B)从所述乳细胞分泌所述哺乳动物乳样产物。
本文还提供了是根据本文任何地方所述的可方法获得的人乳样产物。
本文还提供了根据用于治疗的如本文任何地方所述的方法的人乳样产物。
本文还提供了根据本文任何地方所述的方法的人乳样产物作为人乳替代物、任选的母乳喂养替代物的用途。
具体实施方式
定义
在本发明的上下文中，术语“体外”指在试管、培养皿、生物反应器或生物体外其他地方进行或发生。
在本发明的上下文中，术语“哺乳动物”指属于哺乳类动物物种的动物，例如，人、牛、猴、骆驼、绵羊和山羊等。
在本发明的上下文中，术语“乳细胞”或“乳腺样细胞”指表达CK18细胞标记物并源自哺乳动物乳腺上皮细胞尤其是人乳腺上皮细胞的分泌型上皮细胞。如本文所用，人乳腺上皮细胞是可商购获得的并可选自任何合适的细胞系。在本发明的上下文中，合适的人乳腺上皮细胞系是例如非致瘤性细胞系诸如MCF-10，或者可以是致瘤性细胞系诸如MCF-7。
在本发明的上下文中，术语“乳腺腺体样类器官”或“乳腺样类器官”指小型和简化的乳腺腺体，其以二维或三维(2D/3D)生长并包含如上文所定义的乳细胞。
在本发明的上下文中，术语“人乳样产物”是细胞培养的乳制品。它是由根据本发明的方法生成的乳细胞和/或乳腺腺体样类器官表达的可食用产物。
根据本发明的“人乳样产物”可具有与营养良好的母亲的人乳相同的组分(例如在生物活性物质、常量和微量营养素及其水平方面)。这在本文中称为“标准人乳产物”。另选地，根据本发明的“人乳样产物”可具有在营养良好的母亲的人母乳中天然存在的组分的改变的比例和浓度。这在本文中称为“非标准乳样产物”。根据本发明的“人乳样产物”可被修饰，使得其包括在营养良好的母亲的人母乳中未天然存在的组分(“修饰的乳样产物”)。人乳样产物的非限制性示例选自：补充剂、强化剂、人母乳替代物(或代用品)和仅富含一种和/或一部分通常可在营养良好的母亲的母乳中发现的生物活性物质和常量及微量营养物质的成分。
“人乳样产物”可用于替代天然乳汁的消耗(“人乳替代物”)。乳替代物产品可用作补充剂(“人乳补充剂”)或作为强化剂(“人乳强化剂”)与天然乳汁结合食用。
在一个实施方案中，根据本发明的标准人乳样产物至少包括通常可在营养良好的母亲的人母乳中发现的常量和微量营养物质。在一个实施方案中，根据本发明的人乳样产物包含：蛋白质、肽、脂质(包括亚油酸和α-亚麻酸)、碳水化合物、维生素(包括维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素B6、维生素B12、泛酸、叶酸、维生素C和生物素)、矿物质(包括铁、钙、磷、镁、钠、氯化物、钾、锰、碘、硒、铜和锌)、胆碱、肌醇和左旋肉碱。在一个实施方案中，根据本发明的人乳样产物还包括选自以下的至少一种生物活性物质：生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡(例如乳脂球和/或外泌体)和来自外泌体(例如miRNA)和分泌型IgA的生物活性物质。根据本发明的标准人乳样产物不是天然存在的人类乳房分泌的产物。
在另一个实施方案中，根据本发明的人乳样产物可适应于将接收该产物的婴儿的特定需求。该产物可以仅包括一种和/或一部分通常可在营养良好的母亲的母乳中发现的生物活性物质和常量及微量营养物质。在此类实施方案中，人母乳样产物也可称为术语“非标准人乳样产物”。在一个实施方案中，根据本发明的非标准人乳样产物包含选自以下的营养物质或生物活性物质中的一种或多种：蛋白质、肽、脂质(包括亚油酸和α-亚麻酸)、碳水化合物(包括人乳低聚糖)、维生素(包括维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素B6、维生素B12、泛酸、叶酸、维生素C和生物素)、矿物质(包括铁、钙、磷、镁、钠、氯化物、钾、锰、碘、硒、铜和锌)、胆碱、肌醇、左旋肉碱、生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡(例如乳脂球和/或外泌体)、来自外泌体(例如miRNA)的生物活性物质和分泌型IgA。
在本发明的上下文中，术语“未修饰的人乳样产物”指经过根据本发明的方法的步骤A)和B)生成的乳细胞和/或乳腺样腺体类器官表达的但未受根据本发明的方法的任选步骤C)的进一步处理的人乳样产物。未修饰的人乳样产物可以包括标准人乳样产物和非标准人乳样产物。非标准人乳样产物的非限制性示例选自：补充剂、强化剂和仅富含一种和/或一部分通常可在营养良好的母亲的母乳中发现的生物活性物质和常量及微量营养物质的成分。
在本发明的上下文中，术语“修饰的人乳样产物”指经过根据本发明的方法的步骤A)和B)生成的乳细胞和/或乳腺腺体样类器官表达的并经受根据本发明的方法的任选步骤C)的进一步处理的人乳样产物。
修饰的人乳样产物可以包括标准人乳样产物和非标准人乳样产物。
在本发明的上下文中，术语“EB”指类胚体。
在本发明的上下文中，术语“mEB”指“MammoCult培养基培养的类胚体”。
MammoCult培养基是指包含基础培养基、至少一种增殖补充剂、肝素和氢化可的松的无血清培养基。
在本发明的上下文中，术语“类胚体(EB)”、“MammoCult培养基培养的类胚体(mEB)”、“乳腺球”和/或“球体”指在本发明的方法的步骤A)中悬浮形成的三维聚集体。
在本发明的上下文中，术语“婴儿”指的是年龄在12个月以下的儿童，诸如年龄在9个月以下的儿童，特别是年龄在6个月以下的儿童。
在本发明的上下文中，婴儿可为任何足月婴儿或早产婴儿。在本发明的一个实施方案中，该婴儿选自早产婴儿和足月婴儿。
术语“足月婴儿”是指以足月或37周龄或更大的胎龄出生的婴儿。
术语“早产婴儿”是指以小于37周的胎龄出生的婴儿。
在本发明的上下文中，术语“出生体重”指出生后获得的胎儿或新生儿的首个体重。
在本发明的上下文中，术语“低出生体重”意指小于2500g(最重至并且包括2499g)的出生体重。
在本发明的上下文中，术语“非常低出生体重”意指小于1500g(最重至并且包括1499g)的出生体重。
在本发明的上下文中，术语“极低出生体重”意指小于1000g(最重至并且包括999g)的出生体重。
术语“小于胎龄婴儿”是指出生体重低于妊娠期增长图表中出生体重参考平均值超过2个标准差的婴儿，或是出生体重低于从同一胎龄婴儿获得的人群体重数据的第10百分位的婴儿。术语“小于胎龄婴儿”包括由于组成型起因或遗传起因或者因宫内生长受限而造成出生时个头偏小的婴儿。
在本发明的上下文中，术语“幼儿”或“学步儿童”指的是年龄在1岁和3岁之间的儿童。
如本文所用，术语“婴儿配方食品”是指旨在用于婴儿的营养组合物，如CodexAlimentarius，(Codex STAN 72-1981)(《食品法典》(法典标准72-1981))中所定义以及Codex Alimentarius，(Codex STAN 72-1981)(《食品法典》(法典标准72-1981))中定义的婴儿特制品(包括特殊医疗用途食品)(Infant Specialities(incl.Food for SpecialMedical Purpose))中所定义。它也指旨在为出生后头几个月内的婴儿提供特定营养用途的食品，所述食品本身即可满足这类婴儿的营养需求(符合2006年12月22日颁布的针对婴儿配方食品和二段配方食品的欧盟委员会指令91/321/EEC2006/141/EC中第2(c)条的规定)。婴儿配方食品涵盖1段婴儿配方食品和2段婴儿配方食品或者较大婴儿配方食品。通常，一段配方食品从婴儿出生起作为母乳替代品，而后续配方食品或者说二段配方食品从婴儿第6个月起作为母乳替代品。
“成长乳”(或GUM)从一岁开始提供。它通常为适合幼儿的特定营养需要的含乳饮料。这些含乳饮料是用于与其他食物结合喂食给12个月至2-3岁儿童的营养组合物。
在本发明的上下文中，术语“强化剂”是指包含一种或多种对婴儿或幼儿具有营养有益效果的营养物质的组合物。
所谓术语“乳强化剂”指用于强化或补充人母乳、婴儿配方食品、成长乳或经其他营养物质强化的人母乳的任何组合物。因此，本发明的人乳强化剂可在溶解于人母乳、婴儿配方食品、成长乳或用其他营养素强化的人母乳中后施用，或者它可以作为独立组合物施用。
当作为独立组合物施用时，本发明的人乳强化剂也可被鉴定为“补充剂”。在一个实施方案中，本发明的乳强化剂是补充剂。
所谓术语“人乳强化剂”指用于强化或补充人母乳或经其它营养物质强化的人母乳的任何组合物。根据本发明的“人乳强化剂”可旨在施用于早产、具有非常低出生体重(VLBW)或具有极低出生体重(ELBW)的婴儿。
根据本发明的乳强化剂可为粉末或液体形式。
液体形式的乳强化剂组合物具有一些特定有益效果。例如，如果要与递送一定重量或体积的校准液滴的包装相连接，那么液体配制物可能更为方便。
此外，液体配制物更易与待强化的组合物混合，而粉末配制物在一些情况下可能结块。
本文提及的EpiCult或EpiCultB培养基是指包含氢化可的松、胰岛素、FGF10和HGF的无血清培养基。
如本文任何地方所公开的培养基是指包含必需营养物的固体、半固体或液体，其被设计用于支持微生物的生长和分化。MammoCult培养基是可用于本发明的培养基的一个示例。
根据本发明的方法和用途
本发明涉及使用在特定条件下培养的哺乳动物上皮细胞生产乳腺腺体细胞的方法，以及使用所述乳腺腺体细胞用于体外生产哺乳动物乳样产物。
在本发明中已经令人惊讶地证明，乳腺上皮细胞可用作生产哺乳动物乳样产物的方案中的起始材料。使用乳腺上皮细胞作为起始材料意味着不需要复杂的分化方案来首先从例如早期未分化干细胞生产乳腺上皮细胞。与干细胞方案相比，这减少了生产哺乳动物乳样产物的方法的总时间，并且具有节约成本的益处。
因此，本发明涉及一种用于生产哺乳动物乳样产物的方法，该方法包括：
A)在培养基中培养乳腺上皮细胞以生成乳细胞乳腺样腺体类器官；以及
B)从所述乳细胞分泌所述哺乳动物乳样产物。
哺乳动物乳样产物生产
本发明涉及用于生产如本文所定义的哺乳动物乳样产物的方法，包括如本文所定义的步骤A)和B)中的任一步骤以及如本文所定义的任选步骤C)。
步骤A-生成乳细胞和/或乳腺样类器官
根据本发明的方法，在步骤A)中生成乳腺样细胞和/或类器官结构。
这包括使乳腺上皮细胞增殖和成熟以产生乳腺样类器官诸如乳细胞。
在本文公开的方法中，使用乳腺上皮细胞作为起始材料，即上皮细胞的培养是该方法的第一步。
通过在特定培养基，例如完全MammoCult培养基(StemCell Technologies)中培养乳腺上皮细胞，发生乳腺上皮细胞的增殖和成熟。优选地，完全MammoCult培养基由基础培养基、增殖补充剂、肝素(通常4μg/mL)和氢化可的松(通常0.48μg/mL)构成。通常每三天更换培养基。然后，上述步骤中获得的mEB(乳腺球)富集非神经外胚层细胞。
在一些实施方案中，增殖和成熟阶段在第0天和第7天之间，其中第0天是乳腺上皮细胞首次添加到培养基中的时间点。在一些实施方案中，增殖和成熟阶段持续7天。在一些实施方案中，增殖和成熟阶段不超过7天。
在增殖和成熟阶段后，诱导细胞表达乳蛋白质。在一些实施方案中，所述诱导期在第7天和第14天之间。在一些实施方案中，诱导期持续7天。在一些实施方案中，诱导期不超过7天。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人乳腺上皮细胞的乳细胞，其中此类步骤A)包括：
i)在合适的培养基(例如，MammoCult培养基)中培养人乳腺上皮细胞，并且7天后生成乳细胞。
在另一个实施方案中，提供了一种用于生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人乳腺上皮细胞的乳细胞，其中此类步骤A)包括：
i)在合适的培养基(例如，MammoCult培养基)中培养人乳腺上皮细胞，在非贴壁条件下培养至少7天以生成乳细胞。
在一个实施方案中，根据本发明的方法提供根据步骤A)的培养条件，该培养条件适应于生成源自能够分泌人乳样产物的人乳腺上皮细胞的乳细胞。
在一个优选的实施方案中，提供了一种用于生产人乳替代物产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人乳腺上皮细胞的乳细胞，其中此类步骤A)包括：在如本文任何地方所述的合适3D培养系统中(例如，3D悬浮条件下)使乳腺上皮细胞增殖和成熟以分化为乳腺腺体细胞(例如，乳细胞)。在一些实施方案中，持续至少7天。在一些实施方案中，持续7天或更少。
在另一个优选的实施方案中，提供了一种用于生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人乳腺上皮细胞的乳细胞，其中此类步骤A)包括：
i)在合适的3D培养系统中(例如，3D悬浮条件下)在合适的培养基(例如，MammoCult培养基)中培养乳腺上皮细胞至少7天(第0天至第7天)，以生成乳细胞。
在本发明的特别优选的实施方案中，提供了一种生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人乳腺上皮细胞的乳细胞，其中：
i)在完全MammoCult培养基(StemCell Technologies)中培养乳腺上皮细胞持续7天(第0天至第7天)，该完全MammoCult培养基包含基础培养基、增殖补充剂并补充有肝素(通常为4μg/mL)、氢化可的松(通常为0.48μg/mL)，以及
ii)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FBS、催乳素、孕酮和β-雌二醇的EpiCultB培养基中孵育细胞持续7天(第7天至第14天)，诱导乳蛋白质表达。
步骤ii)优选地导致分化出乳蛋白质表达细胞尤其是乳细胞和/或乳腺样腺体类器官。
在本发明的另一特别优选的实施方案中，提供了一种生产人乳样产物的方法，该方法包括：在步骤A)中生成来自人乳腺上皮细胞的乳细胞，其中：
i)在补充有MammoCult增殖补充剂、氢化可的松、肝素的如本文任何地方所述的MammoCultB培养基中培养乳腺上皮细胞持续7天(第0天至第7天)，以及
ii)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FBS、催乳素、孕酮和β-雌二醇的EpiCultB培养基中孵育细胞持续7天(第7天至第14天)，诱导乳蛋白质表达。
步骤ii)优选地导致分化出乳蛋白质表达细胞尤其是乳细胞和/或乳腺样腺体类器官。
在一个实施方案中，在如上文针对特别优选的实施方案所定义的步骤ii)优选地导致形成/分化出至少乳腺细胞、管腔细胞和基底细胞。在此上下文中，乳腺细胞优选地表达一种或多种、优选地选自以下的所有标记物：β-酪蛋白、乳蛋白质和激素受体。此外，管腔细胞优选地表达一种或多种、优选地选自以下的所有标记物：EpCAM、MUC1、CD49F、GATA3、CK8和CK18。此外，基底细胞优选地表达选自以下的一种或多种标记物：CK14、α-平滑肌肌动蛋白和P63。
在另一个实施方案中，在上述针对特别优选的实施方案定义的步骤ii)之后，可获得乳腺样腺体类器官，其表达选自以下的一种或多种标记物：β-酪蛋白、乳蛋白质和激素受体，管腔细胞，该管腔细胞表达选自以下的一种或多种标记物：EpCAM、MUC1、CD49F、GATA3、CK8、CK18和基底细胞，该基底细胞表达选自以下的一种或多种标记物：CK14、α-平滑肌肌动蛋白和P63。
在本发明的一个实施方案中，提供了上述用于生产人乳样产物的方法。
在(步骤A的)一个实施方案中，控制营养物质和仿生刺激的递送，以影响细胞生长、分化和组织形成。在(步骤A的)一个实施方案中，此类控制在生物反应器中进行。
在一些实施方案中，源自步骤A的乳腺样腺体类器官或乳细胞具有乳腺腺体特异性标记物的高表达。在一些实施方案中，源自步骤A的乳腺样腺体类器官或乳细胞表达角蛋白18(KRT-18)。在一些实施方案中，源自步骤A的乳腺样腺体类器官或乳细胞表达雌激素受体(ER)。在一些实施方案中，源自步骤A的乳腺样腺体类器官或乳细胞表达超过59％的KRT-18和ER作为雌激素受体阳性的管腔乳腺腺体群体。
在一些实施方案中，源自步骤A的乳腺样腺体类器官或乳细胞具有关键乳生物活性物质的高表达。在一些实施方案中，源自步骤A的乳腺样腺体类器官或乳细胞具有关键乳生物活性物质的增加的表达。在一些实施方案中，与诱导前(例如，在第7天)相比，源自步骤A的乳腺样腺体类器官或乳细胞在诱导后(例如，在第14天)具有关键乳生物活性物质的增加的表达。在一些实施方案中，与诱导前相比，源自步骤A的乳腺样腺体类器官或乳细胞在诱导后具有乳铁蛋白(LTF)的增加的mRNA表达。在一些实施方案中，与诱导前相比，源自步骤A的乳腺样腺体类器官或乳细胞在诱导后具有乳脂肪球-EGF因子8(MFGE8)的增加的mRNA表达。
应当理解，本文公开的任何方法或方法步骤可在3D悬浮培养物中进行，而不是使用膜基质作为支持物。因此，在一些实施方案中，在所有分化过程期间，细胞维持在悬浮培养物中。
步骤B-表达人母乳样产物
在本发明的一个实施方案中，上述方法包括：从源自优选地根据步骤A)制备的人乳腺上皮细胞的乳腺样类器官表达人乳样产物。优选地，在诱导表达来自此类乳细胞和/或乳腺样腺体类器官的人乳样产物后表达人乳样产物。
在一个实施方案中，通过应用补充有催乳因子(例如，催乳素、氢化可的松和胰岛素)的特定培养基(例如，EpiCultB)，诱导泌乳的乳细胞。
具体地讲，从源自优选地根据步骤A)制备的人乳腺上皮细胞的乳腺样类器官获得的人乳样产物含有人乳中的生物活性物质，其选自包括以下项的组或由以下项组成的组：蛋白质、脂质或低聚糖，优选地，人乳低聚糖等。具体地讲，发明人设法与根据如上文所执行的步骤A)i)至iv)的特别优选的方案保持一致，尤其就低聚糖(包括乳糖和一些HMO)、脂质(包括4种脂肪酸)、蛋白质(7种检测到的，包括酪蛋白)和miRNA(75种检测到的，包括11种通常在HBM中检测到的)而言。
在一个实施方案中，从源自优选地根据步骤A)制备的人乳腺上皮细胞的乳腺样类器官获得的人乳样产物含有人乳中的生物活性物质，其选自包括以下项的组或由以下项组成的组：低聚糖、脂质、蛋白质、外泌体和miRNA。
在另一个实施方案中，从源自优选地根据步骤A)制备的人乳腺上皮细胞的乳腺样类器官获得的人乳样产物含有人乳中的生物活性物质，该生物活性物质选自包括以下项的组或由以下项组成的组：乳糖、6’SL、C-4：0脂肪酸、C-8：0脂肪酸、C-10：0脂肪酸、C-14：0脂肪酸、C-15：0脂肪酸、C-16：0脂肪酸、C-16：1n7脂肪酸、C-17：0脂肪酸、C-18：0脂肪酸、C-18：1 n9脂肪酸、C-18：1脂肪酸、C-18：2 n6脂肪酸、C-20：0脂肪酸、C-20：1 n9脂肪酸、C-18：3n3脂肪酸、C-22：0脂肪酸、乳铁蛋白、白蛋白、催乳素、αS1-酪蛋白、血红蛋白β亚基、血红蛋白α亚基、α-乳白蛋白、α-2-巨球蛋白、β-酪蛋白、胆盐激活脂肪酶、κ-酪蛋白、乳凝集素、CD14、脂肪酸合酶、IgA、pIgR、血清白蛋白、黄嘌呤脱氢酶、外泌体、miR-21-5p、miR-181a-5p、miR-30d-5p、miR-30b-5p、miR-22-3p、miR-146b-3p、miR-30c-5p、miR-30a-5p、miR-30e-5p和miR-148b-3p。
在本发明的一个实施方案中，从源自人乳腺上皮细胞的乳腺样类器官中获得的人乳样产物为标准人乳产物。在本发明的另一个实施方案中，从源自人乳腺上皮细胞的乳腺样类器官中获得的人乳样产物为非标准人乳产物。
步骤C-进一步进行处理，以生产修饰的人母乳样产物
在本发明的一个任选的实施方案中，本文所描述的方法包括另外的步骤C)，其针对由步骤B)可获得的人乳样产物执行，并包括：对此类产物执行另外的处理，以提供修饰的人乳样产物。
在一个特定实施方案中，对本发明的人母乳样产物执行的另外的处理步骤C)可选自：纯化步骤、分离过程、提取过程、分级步骤、富集过程、酶处理、添加另外的组分(例如，不可由人类乳腺的腺体类器官表达的组分(诸如例如，免疫球蛋白、益生菌和/或矿物质)或其组合)。
人乳样产物
“标准”人母乳样产物
在本发明的一个实施方案中，人母乳样产物是“标准”人母乳样产物，即包含与营养良好的母亲的人母乳相同的组分。
根据科学研究文献，母乳喂养的有益效果为人们所熟知，而使用人母乳样产物的可能性使其带来许多同样熟知的健康有益效果。
在此类实施方案中，人母乳样产物可在无法实现实际母乳喂养的情况下用作母乳喂养的替代物。
在此类实施方案中，人母乳样产物旨在用于例如支持分泌较少乳汁或在生产6个月后停止泌乳的女性延长母乳喂养的时间。
类似地，人母乳样产物旨在用于例如允许在疾病使母亲无法实际完成母乳喂养的情况下也能实现母乳喂养。
在另一个实施方案中，人母乳样产物旨在在母乳无法自然开始分泌的情况下使用，例如，婴儿是经过领养的。
在一个实施方案中，根据本发明的人乳样产物不是天然形成的人母乳分泌的产物。
在一个实施方案中，人母乳样产物用于为婴儿提供最佳营养。
在一个实施方案中，人母乳样产物用于实现婴儿的健康生长。
在一个实施方案中，人母乳样产物用于预防婴儿感染和过肥以及促进婴儿免疫发展。
在一个实施方案中，人母乳样产物是未修饰的人母乳样产物。
在另一个实施方案中，人母乳样产物是修饰的人母乳样产物。
在一个实施方案中，根据本发明的人乳样产物包含：蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素和矿物质。
在另一个实施方案中，根据本发明的人乳样产物包含：蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和生物活性物质。
在一个实施方案中，根据本发明的人乳样产物包含：蛋白质、脂质(包括亚油酸和α-亚麻酸)、碳水化合物、维生素(包括维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素B6、维生素B12、泛酸、叶酸、维生素C和生物素)、矿物质(包括铁、钙、磷、镁、钠、氯化物、钾、锰、碘、硒、铜和锌)、胆碱、肌醇和左旋肉碱。
在另一个实施方案中，根据本发明的人乳样产物还包含选自以下的至少一种生物活性物质：生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡(例如乳脂球和/或外泌体)和来自外泌体(例如miRNA)的生物活性物质和分泌型IgA。
可以根据本发明的方法，例如，通过包括添加生长因子、细胞因子、益生菌、胞外囊泡(例如，乳脂球和/或外泌体)、来自外泌体(例如miRNA)的生物活性物质和分泌型IgA的步骤C)，制备此类人母乳样产物。
在一个实施方案中，人母乳样产物含有益生菌。
此类人母乳样产物可根据本发明的方法，例如，通过包括添加可从几种可商购获得的来源获得的益生菌(例如，乳双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌)的步骤C)来进行制备。
在此类实施方案中，人母乳样产物可用于优化胃肠道功能和/或促进免疫。
在一个实施方案中，人母乳样产物含有分泌型IgA和益生菌。
此类人母乳样产物可根据本发明的方法制备，例如通过包括步骤C)：添加益生菌和分泌型IgA的组合，其可如例如专利申请WO2009/156301和WO2009/156367中所述制备，这些专利申请据此以引用方式并入。在此类实施方案中，人母乳样产物可用于预防免疫球蛋白缺乏和/或预防婴幼儿的复发性感染。
“非标准”人母乳样产物
在本发明的一个实施方案中，人乳样产物可具有在营养良好的母亲的人母乳中天然存在的组分的改变的比例和浓度。这在本文中称为“非标准乳样产物”。
在一个实施方案中，根据本发明的人乳样产物可选自：乳强化剂、补充剂和/或适应于特殊目的的人母乳代用品。
人乳强化剂和人乳生物活性补充剂
在一个实施方案中，本发明的方法提供了一种人母乳样产物，其可用于强化从哺乳期母亲获得的天然人母乳或用于强化婴儿配方食品。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了一种人母乳样产物，其可用作对其有需要的婴儿或幼儿的补充剂。
在此类实施方案中，人母乳样产物可用于提供健康生长和/或降低发展通常与婴儿或幼儿的特定病状相关的疾病的风险(诸如例如，哮喘、过敏、认知改变)和/或促进赶上生长速度、发展免疫、预防感染。
值得注意的是，结合根据本发明的方法的事实情况，此类强化剂或补充剂中的人类来源的成分(尤其是生物活性成分)应当使此类成分保持完整或更高的功能性。
优选地，人母乳样产物旨在用作强化剂。此类人母乳样产物旨在用作强化剂，并且可根据本发明的方法，例如，通过包括从由步骤B)可获得的人母乳样产物中分离和/或富集(某些)生物活性物质的步骤C)进行制备。此类分离步骤可通过对由步骤B)可获得的未修饰的类似人母乳的产物进行经典的分级、富集和/或纯化来进行。
旨在用作补充剂的人母乳样产物可包含选自以下的一种或多种生物活性物质：人乳低聚糖(例如，2FL、3FL、LNT、LnNT、DiFl、6SL和/或3SL)、脂质、生长因子(例如，表皮生长因子(EGF)、肝素结合表皮生长因子)、细胞因子(例如，转化生长因子β2(TGFβ-2))和IL-1。IL-2、IL-6、IL-10、IL-18、干扰素γ(INF-γ)、TNF-α、胞外囊泡(例如，乳脂球和/或外泌体)、包括微RNA的外泌体和抗微生物/保护生物活性物质(例如，IgA、乳铁蛋白、溶菌酶、乳凝集素)。此类旨在用作补充剂的人母乳样产物可根据本发明的方法，例如，通过包括从由步骤B)可获得的未修饰的人母乳样产物中分离这些生物活性物质的步骤C)进行制备。此类分离步骤可通过对由步骤B)可获得的未修饰的类似人母乳的产物进行经典的分级、富集和/或纯化来进行。
在一个实施方案中，人母乳样产物是一种补充剂或乳强化剂，其含有岩藻糖基化人乳低聚糖，例如，2FL和/或3FL。此类补充剂或乳强化剂用于使因FUT2基因不活跃而不分泌岩藻糖基化低聚糖的女性的人母乳特性更完整。
此类旨在用作强化剂或补充剂的人母乳样产物可根据本发明的方法，例如，通过包括从由步骤B)可获得的未修饰的人母乳样产物中分离和/或富集岩藻糖基化低聚糖(例如，2FL和/或3FL)的步骤C)进行制备。
在此类实施方案中，人母乳样产物可用于优化胃肠道功能和/或促进免疫。
用于患有遗传疾病的婴儿的类似人母乳的产物
在一个实施方案中，根据本发明的人母乳样产物可适应于解决先天患有遗传疾病的婴儿的特定需求。
半乳糖血症
在此类实施方案中，人母乳样产物可适应于患有半乳糖血症的婴儿的需要。半乳糖血症是影响婴儿半乳糖代谢能力的罕见遗传疾病。
在此类实施方案中，人母乳样产物应不含乳糖和/或含有乳糖的糖类。在此类实施方案中，人母乳样产物可用于使受半乳糖血症影响的婴儿健康生长。
在一个实施方案中，可根据本发明的方法，通过包括针对由步骤B)可获得的未修饰的人母乳样产物进行的酶处理(乳糖酶处理)或膜分级和超滤处理的步骤C)，获得不含乳糖和/或含有乳糖的糖类的人母乳样产物。
苯丙酮尿症
在此类实施方案中，人母乳样产物可适应于患有苯丙酮尿症(PKU)的婴儿的需要。PKU的出现是由于将苯丙氨酸转化为酪氨酸的苯丙氨酸羟化酶缺失或无法作用。如不予治疗，此症将使大脑中毒而导致重度精神发育迟滞。
在此类实施方案中，人母乳样产物应不含或减少苯丙氨酸。
在此类实施方案中，人母乳样产物可用于使受PKU影响的婴儿健康生长。
在一个实施方案中，人母乳样产物减少了苯丙氨酸，其方式使得苯丙氨酸含量相对于接收苯丙氨酸的受试者的体重保持在20mg/kg以下。
在一个实施方案中，可根据本发明的方法，通过包括针对由步骤B)可获得的未修饰的人母乳样产物进行酶处理(蛋白质水解)或过滤处理的步骤C)，获得减少或不含苯丙氨酸的人母乳样产物。
在一个实施方案中，可根据本发明的方法，通过包括针对由步骤B)可获得的未修饰的人母乳样产物进行酶处理(蛋白质水解)或过滤处理的步骤C)，获得减少苯丙氨酸的人母乳样产物。
在另一个实施方案中，可根据本发明的方法，通过在步骤B)中提供可提供有限量的或不提供苯丙氨酸的培养基(诸如例如，来自乳清的含有糖巨肽(GMP)的培养基)，获得减少苯丙氨酸的人母乳样产物。
本发明的附加实施方案
本文提供了：
S1.用于生产哺乳动物乳样产物的方法，所述方法包括：
A)在培养基中培养乳腺上皮细胞以生成乳细胞乳腺样腺体类器官；以及
B)从所述乳细胞分泌所述哺乳动物乳样产物。
S2.根据陈述2所述的方法，其中步骤A)的持续时间不超过14天，任选地为14天。
S3.根据陈述1或2所述的方法，其中来自步骤A)的所述乳细胞乳腺样腺体类器官表达一种或多种乳腺腺体阳性细胞标记物，任选地选自KRT-18和ER。
S4.根据陈述1至3中任一项所述的方法，其中与诱导前相比，来自步骤A)的所述乳细胞乳腺样腺体类器官在诱导后具有一种或多种乳生物活性标记物的增加的mRNA表达。
S5.根据陈述1至4中任一项所述的方法，其中与诱导前相比，来自步骤A)的所述乳细胞乳腺样腺体类器官在诱导后具有LTF的增加的mRNA表达。
S6.根据陈述1至5中任一项所述的方法，其中与诱导前相比，来自步骤A)的所述乳细胞乳腺样腺体类器官在诱导后具有MFGE8的增加的mRNA表达。
S7.根据陈述1至6中任一项所述的方法，其中所述培养基是在合适的3D培养系统中，例如在3D悬浮条件下的MammoCult培养基。
S8.根据陈述1至7中任一项所述的方法，其中步骤A)还包括：
i)培养所述乳腺上皮细胞，以及
ii)诱导乳蛋白质表达。
S9.根据陈述8所述的方法，其中步骤Ai)持续不超过7天，并且任选地持续7天。
S10.根据陈述8或9所述的方法，其中步骤Aii)持续不超过7天，并且任选地持续7天。
S11.根据陈述1至10中任一项所述的方法，其中步骤A)还包括：
i)在包含所述基础培养基、增殖补充剂并补充有肝素和氢化可的松的完全MammoCult培养基中培养所述乳腺上皮细胞持续7天，以及
ii)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FBS、催乳素、孕酮和β-雌二醇的EpiCultB培养基中孵育所述细胞持续7天，诱导乳蛋白质表达。
S12.根据陈述1至10中任一项所述的方法，其中步骤A)还包括：
i)在补充有MammoCult增殖补充剂、氢化可的松和肝素的MammoCultB培养基中培养所述乳腺上皮细胞持续7天，以及
ii)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FBS、催乳素、孕酮和β-雌二醇的EpiCultB培养基中孵育持续7天，诱导乳蛋白质表达。
S13.根据陈述1至12中任一项所述的方法，所述方法任选地包括步骤C)，其中所述乳样产物进一步经过处理，以生成修饰的哺乳动物乳样产物。
S14.根据陈述1至13中任一项所述的方法，其中所述乳腺上皮细胞是人乳腺上皮细胞。
S15.人乳样产物，所述人乳样产物是根据陈述14所述的方法可获得的。
S16.根据陈述15所述的人乳样产物，所述人乳样产物用于治疗。
S17.根据陈述15所述的人乳样产物作为人乳替代物，任选地作为母乳喂养替代物的用途。
应当理解，本文所公开的详细说明的各个方面和实施方案是制造和使用本发明的具体方式的示例，当结合权利要求书和本文的详细说明进行考虑时这些内容并不限制本发明的范围。还应当理解，本发明的各方面和实施方案的特征可与本发明的相同或不同的方面和实施方案的其他特征组合。
如在具体实施方式和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。
附图说明
图1：示出了根据Ying Qu论文中概述的方案并如本发明方法的步骤A)中的一个替代方案所应用的人诱导多能干细胞(hiPSC)的分化。
图2：示出了根据步骤A)的人诱导多能干细胞(hiPSC)的分化。
图3：示出了根据图2的方法生产的hiPSC的三维器官型培养物高度允许乳腺腺体特化。显示了用于3D分化(42天)方案的Nanog、TUBB3、FOXA2、TP63、KR-14、EpCAM、KRT8和CSN2的mRNA表达。从左至右的标记物：多能性的阶段(Nanog)、细胞系(外胚层和内胚层)(TUBB3、FOXA2)、基底细胞/肌上皮标记物(TP63、KR-14)、管腔上皮标记物(EpCAM、KRT8)和乳蛋白质(CSN2(酪蛋白β))。
图4：示出了作为比较例生产的hiPSC的二维器官型培养。显示了用于2D分化(31天)方案的Nanog、TUBB3、FOXA2、TP63、KR-14、EpCAM、KRT8和CSN2的mRNA表达。从左至右的标记物：多能性的阶段(Nanog)、细胞系(外胚层和内胚层)(TUBB3、FOXA2)、基底细胞/肌上皮标记物(TP63、KR-14)、管腔上皮标记物(EpCAM、KRT8)和乳蛋白质(CSN2(酪蛋白β))。
图5：显示在乳腺上皮细胞的三维(3D)培养物中的泌乳诱导。a，乳腺上皮细胞的培养方案和泌乳诱导的示意图(第7-14天)。b，在乳腺上皮细胞培养物的增殖阶段期间，通过流式细胞术分析乳腺腺体标记物角蛋白18和雌激素受体。c，增殖(第7天)和泌乳诱导阶段(第14天)期间的人乳铁蛋白(LTF)和乳脂肪球-EGF因子8(MFGE8)/乳凝集素的RNA表达(ΔCt)水平。在小组演示中使用ΔCt方法，通过基于候选参考基因的相对表达计算平均标准差(SD)来对LTF和MFGE8基因进行排序。具有最低SD的指定基因被鉴定为最稳定或表达最多的基因。
图6：示出了使用NanoString技术进行基因表达谱分析的乳腺上皮细胞中不同乳 腺上皮标记物的表达(a-h)。
实验部分
实施例1
将hiPSC培养和分化为乳细胞，以获得人乳样产物
根据Ying Qu等人在Stem Cell Report(2017年2月14日第8卷第205至215页)中所描述的过程从ihPSC开始培养乳细胞，从而收集由此分泌的人乳样产物，其能够用于治疗和/或作为根据本发明的母乳喂养替代物。
实施例2
将hiPSC培养和分化为3D乳细胞，以获得人乳样产物
根据本发明的方法中的上述步骤A)和步骤B)从hiPSC开始培养乳细胞，从而收集由此分泌的人乳样产物，其能够用于治疗和/或作为根据本发明的母乳喂养替代物。
实施例3
另选的将hiPSC培养和分化为乳细胞，以获得人乳样产物的方法
可从另选的培养条件下高效从hiPSC获得乳细胞的分化，该条件包括如下所描述的条件1至条件4：
1.涂覆有玻连蛋白的培养皿上的作为单层细胞的2D培养物源自EB并在含有以下成分的培养基中培养至少28天：含L-谷氨酰胺的RPMI 1640；胎牛血清(FBS)；胰岛素；表皮生长因子(EGF)；氢化可的松；青链霉素混合物(青霉素/链霉素：抗生素-抗真菌溶液)。
2.涂覆有玻连蛋白的培养皿上的粘附的细胞聚集体(EB)的2D培养物源自EB并在含有以下成分的培养基中培养至少28天：含L-谷氨酰胺的RPMI 1640；胎牛血清(FBS)；胰岛素；表皮生长因子(EGF)；氢化可的松；青链霉素混合物(抗生素-抗真菌溶液)。
3.3D培养物在MammoCult培养基中悬浮培养至少10天，然后，在甲状旁腺激素的存在下，在特定培养基(例如，EpiCultB)中，在混合漂浮凝胶(例如基质凝胶和I型胶原蛋白)中再培养5天，然后在胰岛素、HGF、氢化可的松和FGF10的存在下再培养25天；
4.EB的3D培养物在MammoCult培养基中悬浮(超低贴壁培养皿)培养至少10天，然后，在甲状旁腺激素的存在下，在特定培养基(例如，EpiCultB)中，在悬浮培养基中再培养5天，然后在胰岛素、HGF、氢化可的松和FGF10的存在下再培养25天。
实施例4
基于人诱导多能干细胞(hiPSC)系603的2D和3D乳细胞分化
(a)基于人诱导多能干细胞(hiPSC)系603的3D乳细胞分化：
人诱导多能干细胞(hiPSC)系603用于3D乳细胞的分化。人诱导多能干细胞(hiPSC)系603购自Fujifilm Cellular Dynamics公司(FCDI)。
(i)针对(根据本发明的)3D分化方案，通过在37℃、5％的CO2和95rpm振荡培养的条件下在含有10uM ROCK抑制剂的E8培养基中孵育hiPSC的单细胞一夜，形成EB(球体)。
第二天，用E8替换培养基(第-2天至第0天)。
接下来的一天，用Mammol培养基(MammoCult培养基，具有增殖补充剂、肝素(4μg/mL)和含有青霉素/链霉素的氢化可的松(0.48μg/mL))替换培养基培养10天(第0天至第10天)。每两天更换一次培养基。
(ii)在Mammo2培养基(EpiCultB+补充剂、100ng/ml的pTHrP，加青
霉素/链霉素)中培养5天之后进行上述分化。(在第10天至第15天)每三天更换一次培养基。
(iii)为了诱导分支的上皮结构、肺泡分化和乳腺细胞特化，用Mammo3培养基(完全EpiCultB，氢化可的松(1μg/ml)、胰岛素(10μg/ml)、FGF10(50ng/ml)、HGF(50ng/ml)和青霉素/链霉素)喂养mEB(球体/乳腺球)20天。(在第15天至第35天)每三天更换一次培养基。
(iv)最后，为了诱导乳汁生物活性物质的生产(3D)，使用Mammo4培养基(完全EpiCultB，10％的FBS、催乳素(10μg/ml)、氢化可的松(1μg/ml)、胰岛素(10μg/ml)、孕酮、β-雌二醇和青霉素/链霉素)培养7天，并且(在第35天至第42天)每三天更换一次培养基。在所有分化过程中，将球体维持在悬浮培养物中(以95rpm振荡)。分化过程在第42天结束。结果在图3中示出。
(b)基于人诱导多能干细胞(hiPSC)系603的2D乳细胞分化
人诱导多能干细胞(hiPSC)系603还可用于2D乳细胞的分化。人诱导多能干细胞(hiPSC)系603购自Fujifilm Cellular Dynamics公司(FCDI)。
针对(用于比较的)2D分化方案，在所有分化阶段中使用乳糖培养基(RPMI 1640，20％的FBS、1mM的谷氨酰胺、4μg/ml的胰岛素、20ng/ml的EGF、0.5μg/ml的含青霉素/链霉素的氢化可的松)。细胞在37℃、5％CO2下孵育。每两天更换一次培养基。结果在图4中示出。
(c)结果
使用定量RT-PCR(图3：3D分化，图4：2D分化)捕捉乳细胞衍生期间的不同分化阶段。在2D和3D的设置中均减少作为多能性标记物的NaNog表达，同时细胞变得成熟和进行分化。神经外胚层和内胚层标记物TUBB3(微管蛋白β3 III类)和叉头框蛋白A2(FOXA2)未以3D格式显著表达，并且TUBB3的提高仅在2D设置中可捕捉。这表明，hiPSC的模式向非神经外胚层细胞系发展，从而富集3D格式的乳腺祖细胞。发明人研究了常用基底细胞/肌上皮标记物诸如p63(p53-同源核蛋白)和细胞角蛋白14(KRT-14)的表达模式。两种系统中均可明显检测到两种标记物。另外，上皮细胞粘附分子(EpCAM)和细胞角蛋白8(KRT8)仅在3D系统中进行追踪，并且KRT8在2D格式下仅部分得以表达。因此，在器官型设置中的3D平台表达了共同的乳腺组织、管腔和基底的标记物。此类乳腺样类器官表达人母乳特异性的蛋白质，其包括CSN2(酪蛋白β)、乳蛋白肽和激素受体。管腔细胞特异性表达EpCAM、MUC1、CD49F、GATA3、CK8和CK18，而基底细胞将特异性表达CK14、α-平滑肌肌动蛋白和P63。最终，EpCAM和CD49F双阳性细胞可在第10天和第35天之间的较早祖细胞阶段检测到。有趣的是，CSN2的表达仅在3D器官型系统的最后一个时间点(第42天)进行捕捉而不可在2D引导分化平台中进行捕捉。
如下文所描述，乳腺样类器官分泌体的分析示出了人乳特异性生物活性物质的分泌，该生物活性物质包含低聚糖(包括乳糖和一些HMO)、脂质(包括4种脂肪酸)、蛋白质(7种检测到的，包括酪蛋白)和miRNA(75种检测到的，包括11种通常在HBM中检测到的)。
根据“Austin and Benet，Quantitative determination of non-lactose milkoligosaccharides，Analytica Chimica Acta 2018，1010，86-96”中所描述的过程以极小的改动分析原代细胞上清液中是否存在乳糖或人乳低聚糖。用UHPLC分析样本，并且针对乳糖的校准曲线和7种HMO(2’FL、3FL、DFL、LNT、LNnT、3’SL和6’SL)的混合物定量检测到的乳糖或人乳低聚糖(HMO)。上述方法的估计限值为0.1mg/L。在原代细胞上清液中，乳糖(0.22mg/l)和6’SL(0.32mg/l)在第42天进行检测。
通过与火焰电离检测器耦合的气相色谱在培养基和细胞上清液中分析脂肪酸。简单来说，分析在第42天获得的上清液，以研究几种脂质中是否有脂肪酸存在。配备7693自动取样机的7890A气相色谱仪配备有熔融石英CP-Sil 88毛细管柱(100％氰丙基聚硅氧烷)，该自动取样机配备有制备性站点模块；使用100m×0.25mm ID×0.25mm的膜厚度，同时使用以250℃加热的分流进样器(1∶25的比率)和在300℃下被操作的火焰电离检测器。通过甲醇氯酸(methanolic chloridric acid)直接对样本进行酯交换反应来进行脂肪酸甲酯(FAME)的制备。使用毛细管气相色谱(GC)FID法进行FAME的分离。FAME的识别通过保留时间(RT)进行，并与外标进行比较。脂肪酸的定量通过使用甲基C11：0作为内标进行计算。用TAGC13：0作为第二内标来控制上述方法的酯交换性能。添加内标后，将溶液与2mL甲醇、2mL甲醇/HCl(3N)和1mL己烷进行混合。以100℃加热60分钟后，使样本冷却至室温(约15分钟)，然后通过添加2mL水停止上述反应。离心后，将有机相直接注入GC中。
来自实施例4a的方案在第42天的脂肪酸结果在表1(观察到的培养基与上清液之间的差异)中报告。
下文在表1中列出了细胞上清液样本中的表达的脂肪酸。
使用SDS-PAGE特性分析法，然后针对通过LC-MSMS法为进行同一性确认进行的胶条分离，分析细胞上清液中的蛋白质。针对SDS-PAGE分析法，将所制备的样本的总体积装载到凝胶上。添加人乳样本作为对照，以用于比较。通过LC-MSMS法切割所选的胶体区(胶条)，以查看人类蛋白质。最终，将胶条提交进行胶内胰蛋白酶消化，并通过LC-MSMS法进行分析。用Peaks Studio分析LC-MSMS的数据，并与UniProt的人类蛋白质数据库进行匹配。
下文中的表2列出了所有切除的胶条的最佳候选。
使用ExoQuick聚合物网进行外泌体分离和miRNA特性分析。ExoQuick聚合物通过形成网络并收集一定大小的所有外泌体来使外泌体沉淀。一旦形成ExoQuick网格，便可容易地使用简单低速的离心法将外泌体沉淀为球粒。该外泌体是完整的，随时可进行蛋白质或RNA分析，并对功能研究而言具有生物活性。将沉淀缓冲液以0.25倍的比例添加至样本，然后涡旋。将混合物以4℃孵育一夜。在孵育后，将样本在1,500xg下进行离心30分钟。通过在具有用于QC的缓冲液XE(QIAGEN)或来自HTG EdgeSeq公司用于miRNA特性分析的miRNAWhole Transcriptome Assay裂解缓冲液的初始体积中涡旋，重新悬浮上述外泌体的球粒。为了评估胞外囊泡(EV)分离，首先将上清液以3000g离心15分钟，以去除细胞球粒和碎片。然后，使用100微升的培养基和ExoQuick缓冲液(0.25倍的比例)以4℃进行过夜沉淀。通过以1500g离心30分钟回收EV沉淀物。对每个样本进行两次沉淀，将一次EV沉淀重新悬浮于缓冲液XE(QIAGEN)中，以进行进一步可能的分析，第二次仅在50μl的HTG裂解缓冲液中进行，以在通过HTG进行miRNA特性分析之前以10倍进行缩。
对于miRNA特性分析，在裂解的第一步中直接使用样本。因此，直接使用全样本并用等离子体裂解缓冲液以比率1∶1进行裂解。接下来，添加蛋白酶K(1/10)，并且在Thermomixer上将样本以50℃和600rpm孵育3小时。将EV重新悬浮于裂解缓冲液中并在相同条件下进行裂解，在裂解孵育之前，增加以95℃孵育10分钟的步骤。在HTG EdgeSeq公司的miRNA Whole Transcriptome Assay的V2过程后，在HTG处理器上使用70μl的油对26μl的溶胞产物进行处理。对于索引和扩增文库，用Illumina衔接子标记样品，并用HotStart 2X Master Mix GC缓冲液(95℃-4分钟；16个循环：95℃-15秒，56℃-45秒，68℃-45秒；68℃10分钟；保持在4℃)通过PCR进行索引，并且在机器人液体处理器SciClone NGS工作站(Perkin Elmer)上进行AMPure清洁(2.5的比例)。在Hamilton机器人上使用定制的池化程序获得池。基于GX Touch Chip HS定量来池化样本。通过AMPure磁珠(1.8的比例)第二次手动纯化池，以去除可能剩余的痕量的引物二聚体，并用Qubit定量池，以调整最终浓度为2nM。作为最后一步，对于MiSeq测序，以20pM和5％的PhiX峰在MiSeq上装载池，并且使用150V3试剂盒针对MiSeq上50个碱基单读段进行测序。
简单而言，在细胞上清液中检测到974种miRNA，其中超过75种为乳汁样本中高度表达的miRNA。
下文的表3列出了十大高度表达的miRNA。
| miRNA的名称 | log2计数 | CV |
| miR-21-5p | 9.76 | 0.01 |
| miR-181a-5p | 9.07 | 0.03 |
| miR-30d-5p | 8.63 | 0.01 |
| miR-30b-5p | 8.63 | 0.01 |
| miR-22-3p | 8.49 | 0.01 |
| miR-146b-3p | 8.40 | 0.01 |
| miR-30c-5p | 8.12 | 0.04 |
| miR-30a-5p | 7.63 | 0.02 |
| miR-30e-5p | 7.26 | 0.01 |
| miR-148b-3p | 6.77 | 0.04 |
本文的研究成果提供了一种新颖的基于iPSC的3D器官型模式，其用于研究正常乳腺细胞命运和功能以及母乳生物活性物质的生产如何调节和发展。
实施例5
使用分化培养基M1/M4，将乳腺上皮细胞在有和没有基质的情况下以3D格式培养进行7天增殖和7天诱导阶段(图5a)。也可使用其他分化培养基。简单来说，使用平面摇床平台将100-500万个解离的上皮细胞铺板于含有4.5mL培养基的6孔板(超低吸附)中。使用流式细胞术定量，培养的细胞可表达乳腺腺体特异性标记物诸如角蛋白18和雌激素受体(图5b)，并且能够在增殖期(第7天)和诱导期(第14天)期间表达mRNA水平的人乳铁蛋白(LTF)和乳脂肪球-EGF因子8(MFGE8)或乳凝集素(图5c，图5d)。
使用NanoString技术进行基因表达谱分析，我们评估了乳腺上皮细胞中不同乳腺上皮标记物的表达(图6)。乳腺上皮祖细胞标记物CD24的表达是一致的，并且在泌乳期有更高的表达趋势(图6a)。有趣的是观察到，随着泌乳进展，细胞显示出乳腺基底样细胞标记物(诸如KRT5、KRT14和ITGA6(CD49f))表达的降低(图6b至图6d)。似乎细胞在使用不同标记物(诸如EpCAM、KRT8、KRT18和MUC1)泌乳期间和之后维持管腔样表型(图6e至图6h)。诱导后期的特征在于引发不同蛋白质(诸如乳铁蛋白(LTF)、簇集蛋白和脂肪酸合酶(FASN))的乳细胞(管腔样细胞)特异性分泌谱(表1a)。在泌乳后从纯化的上皮细胞分离的外泌体也显示出乳特异性miRNA的大量表达，其在表1b中列出。使用替代的分化条件也观察到泌乳后乳腺上皮细胞中乳腺上皮标记物的表达和外泌体纯化的上皮细胞中乳特异性miRNA的表达。
表1：
a
b.
应当理解，对本文所述的目前优选的实施方案作出的各种变化和修改对于本领域的技术人员将为显而易见的。可在不脱离本发明的实质和范围并在不减少所伴随的优点的情况下作出这些变化和修改。因此，此类变化和修改旨在由所附权利要求书涵盖。
Claims (17)
1.用于生产哺乳动物乳样产物的方法，所述方法包括：
A)在培养基中培养乳腺上皮细胞以生成乳细胞乳腺样腺体类器官；以及
B)从所述乳细胞分泌所述哺乳动物乳样产物。
2.根据权利要求2所述的方法，其中步骤A)的持续时间不超过14天，任选地为14天。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中来自步骤A)的所述乳细胞乳腺样腺体类器官表达一种或多种乳腺腺体阳性细胞标记物，任选地选自KRT-18和ER。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中与诱导前相比，来自步骤A)的所述乳细胞乳腺样腺体类器官在诱导后具有一种或多种乳生物活性标记物的增加的mRNA表达。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中与诱导前相比，来自步骤A)的所述乳细胞乳腺样腺体类器官在诱导后具有LTF的增加的mRNA表达。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与诱导前相比，来自步骤A)的所述乳细胞乳腺样腺体类器官在诱导后具有MFGE8的增加的mRNA表达。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述培养基是在合适的3D培养系统中，例如在3D悬浮条件下的MammoCult培养基。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤A)还包括：
i)培养所述乳腺上皮细胞，以及
ii)诱导乳蛋白质表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤Ai)持续不超过7天，并且任选地持续7天。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中步骤Aii)持续不超过7天，并且任选地持续7天。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤A)还包括：
i)在包含所述基础培养基、增殖补充剂并补充有肝素和氢化可的松的完全MammoCult培养基中培养所述乳腺上皮细胞持续7天，以及
ii)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FBS、催乳素、孕酮和β-雌二醇的EpiCultB培养基中孵育所述细胞持续7天，诱导乳蛋白质表达。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤A)还包括：
i)在补充有MammoCult增殖补充剂、氢化可的松和肝素的MammoCultB培养基中培养所述乳腺上皮细胞持续7天，以及
ii)通过在补充有EpiCult增殖补充剂、氢化可的松、胰岛素、FBS、催乳素、孕酮和β-雌二醇的EpiCultB培养基中孵育持续7天，诱导乳蛋白质表达。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，所述方法任选地包括步骤C)，其中所述乳样产物进一步经过处理，以生成修饰的哺乳动物乳样产物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述乳腺上皮细胞是人乳腺上皮细胞。
15.人乳样产物，所述人乳样产物是根据权利要求14所述的方法可获得的。
16.根据权利要求15所述的人乳样产物，所述人乳样产物用于治疗。
17.根据权利要求15所述的人乳样产物作为人乳替代物，任选地作为母乳喂养替代物的用途。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21205094.2 | 2021-10-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118119701A true CN118119701A (zh) | 2024-05-31 |
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication |