CN118119592A - 用于细胞标记的供体-受体共轭寡聚电解质及其方法 - Google Patents

用于细胞标记的供体-受体共轭寡聚电解质及其方法 Download PDF

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周城
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Abstract

本公开涉及式(I)的化合物及其使用方法。式(I)的化合物是共轭寡聚电解质，并且适合用作标记和/或检测细胞和/或脂质囊泡的膜探针，从而用于流式细胞术应用。本公开还涉及用于检测和/或定量细胞和/或脂质囊泡的流动系统。

Description

用于细胞标记的供体-受体共轭寡聚电解质及其方法
技术领域
本公开涉及共轭寡聚电解质及其使用方法。特别地，共轭寡聚电解质适合用作膜探针，因此可以用于流式细胞术应用。
背景技术
流式细胞术是种快速计数、识别和分类单个细胞、微生物和颗粒的高通量实验室技术。它被用于许多学科的临床和研究表征，包括癌症生物学、免疫学、微生物学和病毒学。流式细胞术利用微流体系统，在该系统中，单个细胞或颗粒流入流中，并快速通过激光光源，然后通过荧光或光散射进行分析。荧光蛋白、荧光标记的抗体或结构特异性染料，如DNA或脂质膜特异性染料，可用于测量单个细胞或颗粒的独特性质。荧光标记之所以重要，有多种原因，包括了解细胞生存力、鉴定异质混合物中的不同细胞类型、测量抗原或蛋白质的表达、细胞周期分析和了解膜完整性等。
由于流式细胞术在很大程度上依赖于荧光标记，根据所使用的荧光标记，或者如果需要多个荧光标记，技术人员可能面临许多问题。例如，荧光强度可能较弱，或者如果荧光标记由于暴露于光而劣化。此外，识别探针上的荧光基团结合位点很少，或染料的有效数量很少。荧光标记与所需细胞组分的偶联可能较弱。当荧光标记没有被细胞适当内化时，荧光信号可能过度饱和。在不适当的孵育条件下，荧光标记可能聚集并因此自猝灭。高背景或非特异性染色也会阻碍检测方法。当使用一个以上的荧光标记时，发射的信号可能重叠，导致结果令人困惑甚至无法解释。一些荧光标记对细胞也有毒性，因此仅提供短工作窗口来进行流式细胞术。
因此，需要能够用作流式细胞术中使用的荧光标记或染料的分子。还需要能够优先靶向微生物，特别是细菌细胞的荧光分子。
因此，希望克服或改善上述问题中的至少一个。
发明内容
本发明的前提是发现某些共轭寡聚电解质(COE)具有不同的膜结合，因此有利于用作荧光膜探针。特别地，发明人已经发现，当沿着COE主链的共轭部分被修饰时，发射的荧光信号可以被调谐到特定波长。此外，可以调谐斯托克斯位移(峰值激发和峰值发射之间的差)。通过进一步修饰共轭主链末端的侧链，可以调节对某些细胞膜的选择性。这些COE化合物渗透到细胞膜中允许使用流式细胞术分析细胞、脂质体、囊泡和其他含有膜的宏观结构。
本发明提供了式(I)的化合物或其盐或溶剂化物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；
其中
每个L2独立地选自任选地经取代的亚乙基或任选地经取代的苯亚乙基；
L1是包含单体单元A和单体单元D的π共轭核：
其中
每个A独立地选自任选地经取代的亚烯基、任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基；
每个D独立地选自亚烯基、亚苯基、任选地经取代的稠合亚芳基、任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基；
n是选自1至5的整数；
m是选自1至5的整数；
其中*表示与另一单体单元或与L2连接的键；
其中单体单元A和单体单元D彼此交替键合；
其中式(I)的化合物具有基本线性的拓扑结构；和
其中L1不是亚丁二烯基、聚亚烯基、苯基亚烯基、聚苯基亚烯基。
式(I)的共轭化合物包括交替的供体(D)/受体(A)组合的结构单元(相对于彼此)，其允许其发射、量子产率和斯托克斯位移在比单独依赖聚亚烯基或聚苯基亚烯基的π共轭的那些更宽的范围内可调。此外，分子的分子拓扑结构使其能够在各种细胞和脂质类型的膜内实现快速自组装。特定的分子片段，例如亚苯基，可以是单体单元D或单体单元A，这取决于相邻基团的电子亲和力或电离电势。
在一些实施方案中，A是接受电子的部分。
在一些实施方案中，A选自：
其中表示与D或与L2连接的键；
每个X1独立地选自C、O、N、S和Se；
每个X2如果存在则独立地选自C、O、N、S和Se；
当X2存在时，X1和X2中的至少一个为O、N或S；
每个R独立地选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
在一些实施方案中，A是式(II)的部分：
其中表示与D或与L2连接的键；
R2、R3、R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R2和R3连接以形成任选地经取代的杂环基、任选地经取代的杂芳基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。
在一些实施方案中，A是其中R4和R5如本文所公开。
在一些实施方案中，A是
在一些实施方案中，D是提供电子的部分。
在一些实施方案中，D是选自以下的部分：
其中表示与A或与L2连接的键；
每个X1独立地选自C、O、N、S和Se；
每个X2如果存在则独立地选自C、O、N、S和Se；
当X2存在时，X1和X2中的至少一个为O、N或S；
R独立地选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
在一些实施方案中，D为任选地经取代的5元环杂亚芳基。
在一些实施方案中，D是式(III)的部分：
其中Y是NR、O或S；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；和
R选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
在一些实施方案中，D是其中R6和R7如本文所公开。
在一些实施方案中，D是
在一些实施方案中，L1选自：
在一些实施方案，每个R1独立地选自任选地经取代的烷基或任选地经取代的烷氧基；
在一些实施方案，每个R1独立地选自烷基和烷氧基，每个烷基和烷氧基任选地经氨基或烷基氨基取代。
在一些实施方案中，每个R1独立地为经氨基或烷基氨基取代的C3至C8烷氧基。
在一些实施方案中，L1上的任选的取代基独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ia)的化合物：
其中L1、A、D、R1、n、m和q如本文所公开。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ib)的化合物：
其中L1、A、D、R1、n、m和q如本文所公开。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ib)的化合物，其中
A是式(II)的部分：
其中表示与D或与L2连接的键；
R2、R3、R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R2和R3连接以形成任选地经取代的杂环基、任选地经取代的杂芳基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；和
D是式(III)的部分：
其中Y是NR、O或S；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ib)的化合物，其中
A是其中R4和R5如本文所公开；和
D是其中R6和R7如本文所公开。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ic)的化合物：
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
R2、R3、R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R2和R3连接以形成任选地经取代的杂环基、任选地经取代的杂芳基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
每个R8独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基；
Y是NR、O或S；
每个p是独立地选自0至4的整数；
q是选自1至5的整数；和
q’是选自1至5的整数。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Id)的化合物：
其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、Y、p、q和q’如本文所公开。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ie)的化合物：
其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、p、q和q’如本文所公开。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(If)的化合物：
其中R4、R5、R6、R7、R8、R9、p、q和q’如本文所公开；
每个R9独立地为H或任选地经取代的烷基；和
每个t是独立地选自1至8的整数。
在一些实施方案中，式(I)的化合物选自
本发明还提供式(Ig)的化合物或其盐或溶剂化物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；和
r是选自1至5的整数。
本发明还提供了标记细胞和/或脂质囊泡的方法，其包括：
a)将式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育。
本发明还提供了使用荧光检测器检测细胞和/或脂质囊泡的方法，其包括：
a)将式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育；和
b)使细胞通过荧光检测器。
本发明还提供了使用流式细胞仪检测细胞和/或脂质囊泡的方法，其包括：
a)将式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育；
其中
R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
R2独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基；
u是选自3至15的整数；
每个s是独立地选自0至4的整数；和
q是选自2至5的整数；
q’是选自2至5的整数；和
b)使细胞和/或脂质囊泡流经流式细胞仪。
在一些实施方案中，细胞和/或脂质囊泡处于混悬状态。
在一些实施方案中，细胞是黏附细胞。
在一些实施方案中，孵育期约为1分钟至12天。
在一些实施方案中，细胞和/或脂质囊泡在不经纯化步骤的情况下流经流式细胞仪。
在一些实施方案中，式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物在波长为约300nm至约1000nm处具有荧光激发。
在一些实施方案中，式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物在波长为约300nm至约2000nm处具有荧光发射。
在一些实施方案中，与式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物一起孵育的细胞和/或脂质囊泡相对于式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物的对照样品具有大于约2倍至约500倍的发射强度。
在一些实施方案中，方法还包括使细胞和/或脂质囊泡与另一种染料接触的步骤。
本发明还提供了用于检测和/或定量细胞和/或脂质囊泡的流动系统，其包括：
a)用于标记细胞和/或脂质囊泡的式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物；
b)用于将经标记的细胞和/或脂质囊泡引入流动系统的入口；
c)用于检测来自经标记的细胞和/或脂质囊泡的荧光发射的与入口流体连通的检测装置；和
d)任选地，用于定量经标记的细胞和/或脂质囊泡的计数装置。
附图说明
现在将通过非限制性示例，参照附图描述本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明的共轭低聚电解质的实例。
图2示出了使用式(I)和/或式(IV)的化合物选择性标记革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的流式细胞术测量。
图3示出了式(I)和/或式(IV)的化合物(a至f)和未标记的外泌体(h)的流式细胞术测量。
图4示出了用式(I)和/或式(IV)的化合物标记的外泌体的流式细胞术测量。
图5显示了外泌体(a)、用式(I)和/或式(IV)的化合物标记的外泌体(b)和用式(I)和/或式(IV)的化合物标记的外泌体在FACS后收集(c)的TEM显微照片。
图6示出了用式(I)和/或式(IV)的化合物标记的RBC的流式细胞术测量。
图7示出了不同比例下的用式(I)和/或式(IV)的化合物标记的RBC与未染色RBC的门控区域中发生的流式细胞术事件的百分比。
图8示出了用式(I)和/或式(IV)的化合物标记的Hep-G2细胞的流式细胞术测量。
图9示出了不同比例下的用式(I)和/或式(IV)的化合物染色的Hep-G2与未染色的Hep-G2的门控区域中发生的流式细胞术事件的百分比。
图10示出了用式(I)和/或式(IV)的化合物标记的A549细胞和未标记细胞的两个不同群体的流式细胞术测量。
图11示出了用式(I)和/或式(IV)的化合物标记的A54细胞传代的流式细胞术测量。
图12示出了经4μM式(I)的化合物和4μM市售膜染料FM4-64染色后的HepG2细胞的共聚焦显微照片：(a)式(I)的化合物通道，(b)FM4-64通道，(c)明场通道，(d)合并通道。比例尺为20μm。
图13示出了用式(I)和/或式(IV)的化合物染色的A549细胞的荧光显微镜图像。
图14示出了(a至b)SUV、式(I)和/或式(IV)的化合物以及PBS缓冲液中的SUV和化合物的组合的光致发光(PL)光谱，(c)在PBS中添加SUV后具有不同发射峰的三种式(I)和/或者式(IV)的化合物。
图15示出了式(I)和/或式(IV)的化合物的不同发射波长。
图16示出了不含(灰色实线)和用(深色虚线)式(I)和/或式(IV)的化合物标记的脂质体的动态光散射尺寸分布曲线。
图17示出了仅染料对照的粒度分布图及其相应的门控点图。
图18示出了COE标记的SW480外泌体(10μM)的粒度分布图及其相应的门控点图。
图19示出了使用超速离心纯化过量染料后，染料标记的SW480外泌体(10μM和20μM)的粒度分布图及其相应的门控点图。
图20示出了经COE-Ben染色的外泌体染色的A549细胞在不同处理和时间下的成像流式细胞术图像及其相应的流式细胞仪分析。
图21示出了A549细胞与2μM COE-BT孵育后的共定位然后用早期或晚期内体-GFP试剂(BacMam 2.0)或100nM溶酶体特异性染料Green DND-26染色的显微照片。
图22示出了COE-BT染色的A549细胞分泌的EV的透射电子显微镜图像和第一次24小时孵育后COE-BT染色的A549细胞分泌的EV的流式细胞术分析。
图23a至b示出了超滤前后PBS中50μMCOE或DiR溶液的照片和吸收光谱。
图24示出了通过动态光散射(DLS)测量的纯PBS、1μM COE-BT、1μM DiR、1mM SUV的PBS溶液或1μM其他COE的PBS溶液的相关系数曲线和DLS测量的推导平均计数率。
图25示出了使用红色激光指示器照射后纯PBS或10μM COE的PBS溶液的丁达尔效应照片。
图26示出了在室温下静置16小时前后，96孔微孔板中200μL COE溶液和PBS中染料溶液的照片。
图27示出了具有不同的混合比的COE-BT染色的和COE-Ben染色的SUV(130nm)在PBS中的混合物，并在Cytoflex上孵育1小时和24小时的流式细胞术测量。
图28示出了混合1小时或24小时后，图27中不同门中SUV种群的百分比。
图29示出了染料阳性事件点图，其中在Cytoflex上分析了用0.5摩尔％COE-Ben和COE-BT标记的100nm、200nm、400nm和800nm大小的POPC脂质体。
图30显示了6.25mg mL-1LMV(大的多层囊泡)在室温下用15μM COE-Ben和15μM FM4-64在PBS中染色30分钟后的共聚焦显微照片，灰度值曲线表示左侧荧光显微照片中白线的位置两个通道荧光强度分布。
图31示出了使用手持式紫外线灯在紫外线(365nm)照射下，在PBS中未进行(-)或进行(+)1mM SUV处理的COE的照片。
图32示出了在DI水中用5μM不同COE染色的1mM POPC纯SUV的ζ电位测量结果，在DI水中用5μM不同COE染色的1mm POPC纯SUV的DLS测量的Z-平均尺寸和PDI。
图33示出了(a)未染色、(b)用2μM COE-S6标记和(c)1μg/mL Cell Mask Deep Red的新鲜红细胞(RBC)的共聚焦显微镜。
图34示出了储存22天的红细胞(RBC)的共聚焦显微镜和(a)未染色、(b)用2μMCOE-S6标记，(c)1μg/mL Cell Mask Deep Red。
图35示出了(a-c)未染色的用1μM COE-S6和0.5μg mL-1Cell Mask Deep Red标记的流式细胞术检测的红细胞(RBC)的FSC/SSC点图，和(d)显示当红细胞用增加的COE-S6浓度标记时，荧光增加的直方图和(e)用增加的Cell Mask Deep Red标记红细胞时，由于猝灭作用，荧光降低。直方图数据的方差系数(CV)如(f)所示。
图36示出了通过使用808nm激光激发并使用950nm长通滤波器收集发射的COE-BBT染色的A549细胞的流式细胞术测量。采用未固定的A549细胞作为阴性对照。
图37示出了COE对A549细胞的细胞毒性测量结果。
图38示出了PBS中COE对牛红细胞的溶血测量结果。
具体实施方式
“烷基”是指单价烷基，其可以是直链或带支链的，优选具有1个至10个碳原子或更优选1个至6个碳原子。这种烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正己基等。
“烯基”是指单价烯基，其可以是直链或带支链的，优选具有2个至10个碳原子，更优选2个至6个碳原子并且具有至少1个、优选1个至2个碳-碳双键。实例包括乙烯基(-CH＝CH2)、正丙烯基(-CH2CH＝CH2)、异丙烯基(-C(CH3)＝CH2)和丁-2-烯基(-CCH2CH＝CCH3)等。
“炔基”是指优选具有2个至10个碳原子，更优选2个至6个碳原子并具有至少1个、优选1个至2个碳-碳三键的炔基。炔基的实例包括乙炔基(-C≡CH)、炔丙基(-CH2C≡CH)、戊-2-炔基(-CH2C≡CCH2-CH3)等。
“烷氧基”是指烷基-O-，其中烷基如上所述。实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1,2-二甲基丁氧基等。
“烯基氧基”是指烯基-O-基团，其中烯基如上所述。
“炔氧基”是指炔基-O-基团，其中炔基如上所述。
“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
“酰基”是指基团H-C(O)-、烷基-C(O)-、环烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-和杂环基-C(O)-，其中烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基如本文所述。
“氧酰基”是指基团HOC(O)-、烷基-OC(O)-、环烷基-OC(O)-、芳基-OC(O)-、杂芳基-OC(O)-和杂环基-OC(O)-，其中烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基如本文所述。
“氨基”是指-NR”R”基团，其中每个R”独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基，其中烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基中的每一个如本文所述。
“氨酰基”是指-C(O)NR”R”基团，其中每个R”独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基，其中烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基中的每一个如本文所述。
“酰氨基”是指-NR”C(O)R”基团，其中每个R”独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基，其中烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基中的每一个如本文所述。
“酰氧基”是指-OC(O)-烷基、-OC(O)-芳基、-C(O)-O-杂芳基和-C(O)O-杂环基，其中烷基、芳基、杂芳基和杂环基如本文所述。
“氨酰氧基”是指-OC(O)NR”-烷基、-OC(O)NR”-芳基、-OC(O)NR”-杂芳基和-OC(O)NR”-杂环基，其中R”独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基，其中烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基中的每一个如本文所述。
“氰基”指的是基团-CN。
“氧酰氨基”是指-NR”C(O)O-烷基、-NR”C(O)O-芳基、-NR”C(O)O-杂芳基和NR”C(O)O-杂环基，其中R”独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基，其中烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基中的每一个如本文所述。
“氧酰氧基”是指-OC(O)O-烷基、-O-C(O)O-芳基、-OC(O)O-杂芳基和-OC(O)O-杂环基，其中烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基如本文所述。
“含硫基团”是指H-S-、烷基-S-、环烷基-S-、芳基-S-、杂芳基-S-和杂环基-S-，其中烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基如本文所述。
“磷酰基”是指-P(O)(R”’)(OR””)，其中R”’表示OR””或为羟基、烷基或氨基，R””为烷基、环烷基、芳基或芳基烷基，其中烷基、氨基、烯基、芳基、环烷基和芳基烷基如本文所述。
“芳基”是指具有单环的不饱和芳香碳环基团(例如苯基)或多个缩合环(例如，萘基或蒽基)，优选具有6个至14个碳原子。芳基的实例包括苯基、萘基等。
“杂芳基”是指单价芳杂环基团，其符合Hückel芳香性标准(即，包含4n+2π电子)并且环内优选具有2个至10个碳原子和选自氧、氮、硒和硫的1个至4个杂原子(并包括硫、硒和氮的氧化物)。这样的杂芳基可以具有单环(例如，吡啶基、吡咯基或其N-氧化物或呋喃基)或多个缩合环(例如，吲哚嗪基、苯并咪唑基、香豆素基、喹啉基、异喹啉基或苯并噻吩基)。
杂环基的实例包括但不限于唑、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、嘧啶、吡啶、吲哚、吲哚、茚唑、嘌呤、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹啉、喹诺林、喹唑啉、肉桂啉、扑啶、咔唑、卡波林、菲苯啶、吖啶、菲罗啉、异噻唑、吩噻嗪、噻唑、噻二唑、二唑、三唑、四唑、噻吩、苯并[b]噻吩、三唑、咪唑吡啶等。
“亚芳基”是指二价芳基，其中芳基如上所述。
“杂亚芳基”是指二价杂芳基，其中芳基如上所述。
“杂环基”是指具有单个环或多个缩合环的单价饱和或不饱和基团，环内优选1个至8个碳原子和选自氮、硫、氧、硒或磷的1个至4个杂原子。最优选的杂原子是氮原子。应当理解，其中，例如，R2或R’是具有一个或多于一个环杂原子的任选地经取代的杂环基，该杂环基可以通过C-C或C-杂原子键，特别是C-N键连接到本发明化合物的核心分子。
杂环基和杂芳基的实例包括但不限于唑、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吡啶、吲哚、异吲哚、吲哚、茚唑、嘌呤、喹啉、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘吡啶、喹啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异唑、异噻唑、吩嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、苯邻二甲酰亚胺、1,2,3,4-四氢异喹啉、4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻二唑、二唑、三唑、四唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉代、哌啶、吡咯烷、四氢呋喃、三唑等。
“任选地经取代的”是指基团还可以经或不经一个或多于一个选自以下的基团取代或与或不与一个或多于一个选自以下的基团稠合：羟基、酰基、烷基、烷氧基、烯基、烯氧基、炔基、炔氧基、氨基、氨酰基、硫基、芳烷基、芳基烷氧基，芳基、芳氧基、羧基、酰氨基、氰基、卤素、硝基、膦羧基、磺酸基、磷酸氨基、氧膦基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳氧基、杂环基、杂环烷基、杂环基氧基、氧酰基、肟、肟醚、腙、氧酰氨基、氧磺酰基氨基、氨酰氧基、三卤甲基、三烷基甲硅烷基、五氟乙基、三氟甲氧基、二氟甲氧氧基、三氟甲硫基、三氟乙烯基、单烷基氨基和二烷基氨基、单烷基和二(经取代的烷基)氨基、单芳基氨基和二芳基氨基、单杂芳基氨基和二杂芳基氨基以及不对称的二取代胺，所述不对称的二取代胺具有选自烷基、芳基、杂芳基和杂环基等的不同的取代基，并且还可以包括与固体支撑材料连接的键(例如，取代到聚合物树脂上)。例如，“任选地经取代的氨基”可以包括氨基酸和肽残基。
“亲水性”是指与有机溶剂相比，对水具有更大亲和力并因此在水中具有更大溶解度的分子或部分。例如，化合物的亲水性可以通过测量其在水(或缓冲水溶液)和水不混溶的有机溶剂(如辛醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或甲基叔丁基醚)之间的分配系数来量化。如果在平衡后，化合物在水中的浓度比在有机溶剂中的浓度更高，则可以认为该化合物是亲水性的。
“疏水性”是指与水相比，对有机溶剂具有更大亲和力并因此在有机溶剂中具有更大溶解度的分子或部分。例如，化合物的疏水性可以通过测量其在水(或缓冲水溶液)和水不混溶的有机溶剂(如辛醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或甲基叔丁基醚)之间的分配系数来量化。如果在平衡后，有机溶剂中存在的化合物浓度比水中存在的化合物更高，则可以认为该化合物是疏水性的。
共轭寡聚电解质(COE)是一类分子，其疏水共轭核具有末端极性离子侧基。在特定的实施方案中，COE中的疏水性和亲水性部分可以合理地设计到分子中，使得它们反映脂质双层中亲水性和疏水性结构域的组织。这种结构设计通常只涉及在两个末端具有带电基团的无支链内部结构，因此它有利于COE自发嵌入细胞膜，这是由COE和脂质之间的静电和疏水相互作用驱动的。发明人已经假设，由主链中π-π共轭产生的荧光可以在电磁波谱上的不同波长上发生，包括UV、可见光和红外区域。这可以通过结构推导微调共轭核的光电特性来实现。例如，可以基于供体和受体部分来调制主链共轭π系统，以实现从300nm至2000nm的发射波长范围。为此，可以调节荧光激发、发射和斯托克斯位移。此外，可以通过控制其膜嵌入能力的不同化学基团的功能化，对COE进行修饰，使其对特定膜表现出选择性。这提供了目标特异性功能。
特征性地，当COE从水溶液嵌入脂质双层时，其荧光发射显著增强。当COE位于脂质双层的疏水性更强的环境中时，这种“点亮”机制为它们提供了高信噪比。此外，COE具有与许多市售亲脂性染料不同的化学结构，这些染料通常含有类似表面活性剂的结构，即分子的一侧是疏水性的，另一侧是亲水性的。这些表面活性剂样结构将在水溶液中诱导胶束样聚集。例如，常用的膜染料PKH-26已被证明可以形成聚集体，与外泌体等小颗粒相比，其大小和荧光强度相似，从而导致假阳性信号。在COE的情况下，这些现象是可以避免的，因为它们的发射已被证明在嵌入脂质双层后大大增强；即高信噪比。
因此，本发明提供了式(I)的化合物或其盐或溶剂化物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；其中
每个L2独立地选自任选地经取代的亚乙基或任选地经取代的苯亚乙基；
L1是包含单体单元A和单体单元D的π共轭核：
其中
每个A独立地选自任选地经取代的亚烯基、任选地经取代的亚芳基或任选地经取代的杂亚芳基；
每个D独立地选自任选地经取代的亚烯基、任选地经取代的亚芳基或任选地经取代的杂亚芳基；
n是选自1至5的整数；
m是选自1至5的整数；
其中*表示与另一单体单元或与L2连接的键；
其中单体单元A和单体单元D彼此交替键合；
其中式(I)的化合物具有基本线性的拓扑结构。
在一些实施方案中，A和D不都是亚烯基。在一些实施方案中，A和D不都是亚苯基。在其他实施方案中，A和D不都是亚烯基和亚苯基。在一些实施方案中，L1不是亚丁二烯基、聚亚烯基、苯基亚烯基、聚苯基亚烯基。
在一些实施方案中，式(I)的化合物或其盐或溶剂化物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；
其中
每个L2独立地选自任选地经取代的乙烯或任选地经取代的苯乙烯；
L1是包含单体单元A和单体单元D的π共轭核：
其中
每个A独立地选自经氰基取代的亚烯基、任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基；
每个D独立地选自亚烯基、亚苯基、任选地经取代的稠合亚芳基、任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基；
n是选自1至5的整数；
m是选自1至5的整数；
其中*表示与另一单体单元或与L2连接的键；
其中单体单元A和单体单元D彼此交替键合；
其中式(I)的化合物具有基本线性的拓扑结构。
另一个优点是，这些化合物不需要生物偶联化学反应，如标记抗体所需的化学反应，就可以用作荧光标记。
式(I)的化合物具有基本线性的拓扑结构。拓扑结构是指化合物在三维(3D)空间约束下的分子结构。这种线性拓扑结构有两个节点作为终端，没有任何连接节点。线性拓扑结构有利于脂质膜嵌入。
在一些实施方案中，连接L1中的单体单元A和单体单元D的键基本上沿化合物的纵轴排列。在其他实施方案中，L1中的单体单元A和单体单元D基本上沿化合物的纵轴对齐。在这方面，当偏离化合物的纵轴时连接单体单元A和单体单元D的键在本发明的范围内。
式(I)的化合物是线性的，以适应其在脂质双层内的位置。在一些实施方案中，化合物不是支化的；即单体单元仅沿单链延伸。在一些实施方案中，式(I)的化合物在性质上是对称的。化合物的对称性可以用32个点群中的至少一个来描述。点群描述了可以在分子上进行的所有对称操作，这些操作导致构象与原始构象无法区分。在这方面，在一些实施方案中，式(I)的化合物具有C2v点群。
在一些实施方案中，L2独立地选自任选地经取代的乙烯或任选地经取代的苯乙烯。在其他实施方案中，L2独立地选自：
其中*表示式(I)的化合物中与单体单元和末端苯基部分连接的键。
L1是π共轭核。共轭系统是分子中具有离域电子的连接p轨道的系统，通常会降低分子的总能量并增加稳定性。孤对、自由基或碳烯离子可以是系统的一部分，其可以是环状的、非环状的、线性的或混合的。
在一些实施方案中，当L1包括6元芳基或杂芳基时，或者当L1包括具有6元环的稠合芳基或异芳基时时，单体单元在6元环上是1,4共轭的。在其他实施方案中，当L1包括5元芳基或杂芳基时，或者当L1包括具有5元环的稠合芳基或杂芳基时，单体单元在5元环上是1,4共轭的或2,5共轭的。
或者，L1可由至少一个单体单元A和至少一个单体单元D表示。在一些实施方案中，n和m组合为选自2至10、3至10、3至9、3至8、3至10或3至7的整数。
在一些实施方案中，L1选自：
如前所述，每个A和D可以是相同的片段，使得L1是交替的π共轭核。或者，每个A和D可以不同。由于L1包含交替的供体/受体组合(相对于彼此)的结构单元，其中交替的供体/受体组合物未黏附的结构被排除在本发明的范围之外。例如，不包括亚丁二烯基、聚亚烯基、苯基亚烯基和聚苯亚烯基。
在一些实施方案中，L1上的任选的取代基选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基。在其他实施方案中，D上的任选的取代基选自卤素、氰基、烷基、烯基、烷氧基和烯氧基。在一些实施方案中，L1上的任选地取代基独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基。
如本文所用，相对于单体单元A，单体单元D是提给电子(富含)的部分。在这方面，单体单元A是吸电子/接受电子(贫乏)的部分。与相似部分(-Dn-或-An-)共轭的序列相比，当按顺序时，D-A组合产生分子内电荷转移激发态，其光学吸收和发射进一步进入红色。
在一些实施方案中，A是接受电子的部分。电子受体是一种化学实体，它接受从另一部分或化合物转移到它的电子。在一些实施方案中，A具有接受电子的取代基。在一些实施方案中，A具有吸电子的取代基。
在一些实施方案，A独立地选自任选地经取代的亚烯基或任选地经取代的杂亚芳基。在一些实施方案，A独立地选自氰基取代的亚烯基或任选地经取代的杂亚芳基。在一些实施方案中，氰基取代的亚烯基是单取代的亚烯基或二取代的亚烯基。在其他实施方案中，任选地经取代的杂亚芳基是任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基。杂亚芳基可以是5元杂亚芳基或6元杂亚芳基。杂亚芳基可以是稠合的杂亚芳基。在一些实施方案中，杂亚芳基是稠合的5,5元杂亚芳基、稠合的5,6元杂亚芳基、稠合的6,6元杂亚芳基、稠合的5,5,6元杂亚芳基、稠合的5,6,6,杂亚芳基、稠合的6,6,6元杂亚芳基或稠合的5,6,6,6元杂亚芳基或稠合的6,6,6,6元杂亚芳基。
在一些实施方案中，A上的任选的取代基选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基。在其他实施例中，A上的任选的取代基选自卤素、氰基、烷基、烯基、烷氧基和烯氧基。
在一些实施方案中，A选自：
其中表示与D或与L2连接的键；
每个X1独立地选自C、O、N、S和Se；
每个X2如果存在则独立地选自C、O、N、S和Se；
当X2存在时，X1和X2中的至少一个为O、N或S；
R独立地选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
在一些实施方案中，A是式(II)的部分：
其中表示与D或与L2连接的键；
R2、R3、R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基；或
R2和R3连接以形成任选地经取代的杂环基、任选地经取代的杂芳基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R2和R3独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基。在其他实施方案中，R2和R3独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基。在其他实施方案中，R2和R3独立地选自H、卤素、任选地经取代的C1至C6烷基、任选地经取代的C2至C6烯基、任选地经取代的C1至C6烷氧基和任选地经取代的C1至C6烯氧基。在其他实施方案中，R2和R3独立地选自H、卤素和C1至C6烷基。
在一些实施方案中，A是式(II)的部分：
其中表示与D或与L2连接的键；
R2和R3连接以形成任选地经取代的杂环基、任选地经取代的杂芳基；
R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R2和R3连接以形成任选地经取代的杂芳基，使得其与苯基部分形成共轭π体系。
在一些实施方案中，R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基。在其他实施方案中，R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基。在其他实施方案中，R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的C1至C6烷基、任选地经取代的C2至C6烯基、任选地经取代的C1至C6烷氧基和任选地经取代的C1至C6烯氧基。在其他实施方案中，R4和R5独立地选自H、卤素和C1至C6烷基。
在一些实施方案中，R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。在其他实施方案中，R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。在一些实施方案中，R4和R5连接以形成任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。在一些实施方案中，R4和R5连接以形成任选地经取代的杂芳基，使得其与苯基部分形成共轭π体系。
在一些实施方案中，A是其中R4和R5如本文所公开。
在一些实施方案中，A是其中R4和R5如本文所公开。
在一些实施方案中，A是
在一些实施方案中，n是选自1至4、1至3、1至2、2至4、3至4或3至5的整数。
在一些实施方案中，D是提供电子的部分。电子供体是一种化学实体，它将电子从自己转移到另一部分或化合物。在一些实施方案中，D具有提供电子的取代基。
在一些实施方案中，D独立地选自任选地经取代的亚烯基、任选地经取代的亚芳基或任选地经取代的杂亚芳基。在一些实施方案，D独立地选自任选地经取代的亚烯基、亚芳基或任选地经取代的杂亚芳基。在其他实施方案中，亚芳基是亚苯基。在其他实施方案中，任选地经取代的杂亚芳基是任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基。杂亚芳基可以是5元杂亚芳基或6元杂亚芳基。杂亚芳基可以是稠合的杂亚芳基。在一些实施方案中，杂亚芳基是稠合的5,5元杂亚芳基、稠合的5,6元杂亚芳基、稠合的6,6元杂亚芳基、稠合的5,5,6元杂亚芳基、稠合的5,6,6,杂亚芳基、稠合的6,6,6元杂亚芳基或稠合的5,6,6,6元杂亚芳基或稠合的6,6,6,6元杂亚芳基。
在一些实施方案中，D上的任选的取代基选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基。在其他实施方案中，D上的任选的取代基选自卤素、氰基、烷基、烯基、烷氧基和烯氧基。
在一些实施方案中，D是选自以下的部分：
其中表示与A或与L2连接的键；
每个X1独立地选自C、O、N、S和Se；
每个X2如果存在则独立地选自C、O、N、S和Se；
当X2存在时，X1和X2中的至少一个为O、N或S；
R独立地选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
在一些实施方案中，D为任选地经取代的5元环杂亚芳基。
在一些实施方案中，D是式(III)的部分：
其中Y是NR、O、S或Se；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；和
R选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
在一些实施方案中，R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的烷氧基或任选地经取代的烯氧基。在其他实施方案中，R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基或任选地经取代的烯氧基。在其他实施方案中，R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的C1至C6烷基、任选地经取代的C2至C6烯基、任选地经取代的C1至C6烷氧基或任选地经取代的C1至C6烯氧基。在其他实施方案中，R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的C1至C6烷基、任选地经取代的C1至C6烷氧基。在其他实施方案中，R6和R7独立地选自H、卤素或任选地经取代的C1至C6烷基。
在一些实施方案中，R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。在其他实施方案中，R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基或任选地经取代的杂芳基。
在一些实施方案中，D是其中R6和R7如本文所公开。
在一些实施方案中，D是
在一些实施方案中，m是选自1至4、1至3、1至2、2至4、3至4或3至5的整数。
在一些实施方案中，n和m一起至少为3。在其他实施方案中，n和m一起至少为4或5。
在一些实施方案中，每个R1独立地选自任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基。在其他实施方案中，R1是任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的氧酰基或任选地经取代的氨基。在其他实施方案中，R1是任选地经取代的聚乙氧基，其中单体单元为3至10。在其他实施方案中，R1的链长为3至10。在其他实施方案中，R1是任选地经取代的C3至C10烷氧基、任选地经取代的C3至C10烷基氨基、任选地经取代的C3至C10二烷基氨基、任选地经取代的C3至C10烷氧酰基或任选地经取代的聚乙氧基。在一些实施方案，R1独立地选自任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基。在一些实施方案，每个R1独立地选自烷基和烷氧基，每个烷基和烷氧基任选地经氨基或烷基氨基取代。
在一些实施方案中，R1处的任选的取代基独立地选自氧基、氧酰基、酰基、氨基、磷酰基、硫醇、烷基、烯基、炔基、氧烷基、烷基酰氧基、磺酰基、氯酸盐或其带电粒种。在一些实施方案中，R1处的任选的取代基独立地选自羟基、羧基、磷酸盐、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氯酸盐、硫酸盐、乙酸盐或其带电粒种。在一些实施方案中，R1处的任选的取代基是叔氨基。叔氨基可被反离子中和，反离子可为卤化物。
在其他实施方案中，R1处的任选取代基是亲水部分。在一些实施方案中，R1处的任选的取代基是带电部分。亲水部分和/或带电部分的实例是三烷基卤化铵。例如，带电部分可以是三甲基碘化铵。在该实施方案中，R1以三甲基铵终止，从而当被取代到R1(例如烷基)时赋予正电荷。其他带阳离子的基团包括但不限于吡啶、吡咯烷、咪唑、胍、锍、硫脲和。其他带阴离子电荷的基团包括但不限于氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、羧基、氢氧化物。亲水部分和/或带电部分也可以通过共价键以两性离子形式包含阳离子和阴离子带电基团。多余的电荷可以被可接受的阳离子或阴离子中和。
碱性含氮基团可以用低烷基卤化物，如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基，如硫酸二甲基和硫酸二乙酯；和其他试剂等试剂进行季化。R1上任选的取代基的实例可以选自：
例如，为了实现“革兰氏”选择性官能团，本发明的化合物可包含带电荷的铵基。需要一侧穿过疏水双层核心以实现膜跨越配置。一旦达到这一目的，带电部分就能“保持”化合物穿过双分子层，使其不易逃逸。这允许在很长一段时间内观察革兰氏阳性细菌细胞。
为使式(I)的化合物在亲水性和疏水性之间达到平衡，以促进其嵌入脂质双分子层，在主链的每一个末端至少应有一个侧链。在这方面，在一些实施例中，q是1至4的整数。在其他实施方案中，q是1至3的整数。在一些实施方案中，q’是1至4的整数。在其他实施方案中，q’是1至3的整数。为此，式(I)或子式(Ia至Ig)的化合物共有至少2个R1基团、至少3个R1基团、至少4个R1基团、至少5个R1基团或至少6个R1基团。
对于式(I)的化合物，为了保持其线性构型，R1优先位于末端苯基的间位和/或对位。在一些实施方案中，R1存在于末端苯基的间位和对位。在其他实施方案中，R1存在于末端苯基的间位或对位。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ia)的化合物：
其中L1、A、D、R1、n、m、q和q’如本文所公开。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ib)的化合物：
其中L1、A、D、R1、n、m、q和q’如本文公开。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ib)的化合物，其中
A是式(II)的部分：
其中表示与D或与L2连接的键；
R2和R3连接以形成任选地经取代的杂环基、任选地经取代的杂芳基；
R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；和
D是式(III)的部分：
其中Y是NR、O或S；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；和
R选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ib)的化合物，其中
A是其中R4和R5如本文所公开；和
D是其中R6和R7如本文所公开。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ic)的化合物：
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
R2和R3连接以形成任选地经取代的杂环基、任选地经取代的杂芳基；
R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基和任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
每个R8独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基；
Y是NR、O或S；
每个p是独立地选自0至4的整数；
q是选自1至5的整数；和
q’是选自1至5的整数；
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Id)的化合物：
其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、Y、p、q和q’如本文所公开。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(Ie)的化合物：
其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、p、q和q’如本文所公开。
在一些实施方案中，式(I)的化合物是式(If)的化合物：
(If)
其中R1、R4、R5、R6、R7、R8、p、q和q’如本文所公开；
每个R9独立地为H或任选地经取代的烷基；和
每个t是独立地选自1至8的整数。
在一些实施方案中，每个R8独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基。在其他实施方案中,每个R8独立地选自卤素、氰基或任选地经取代的烷基。在其他实施方案，每个R8独立地选自卤素、氰基、甲基、乙基或丙基。
在一些实施方案中，每个R8独立地选自H或任选地经取代的C1至C5烷基。在其他实施方案中，R8独立地选自H或C1至C5烷基。在其他实施方案中，每个R8独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。
在一些实施方案中，每个R9是任选地经取代的烷基。在其他实施方案中，R9是C1至C5烷基。在其他实施方案中，每个R9独立地选自甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。
在一些实施方案中，式(I)的化合物或其盐或溶剂化物选自：
在一些实施方案中，式(I)的化合物是其盐。盐的形式可以是质子化盐，也可以由式(I)的化合物与卤代烃烷基化生成。例如，可以使用烷基卤化物(如CH3Br或CH3I)。在一些实施方案中，式(I)的化合物或其盐或溶剂化物是季铵盐。在这方面，当R1任选地经氨基取代时，每个R1可被烷基化以在其各自的末端提供至少正电荷。
例如，式(I)的化合物的季铵盐可以是：
本发明的化合物可以是游离化合物或溶剂化物(例如水合物)的结晶形式，并且这两种形式都在本发明的范围内。溶剂化的方法在本领域内通常是已知的。
本发明的化合物可以以固体或溶液的形式提供。例如，该化合物可以以冻干粉末的形式提供。
本发明的化合物可以作为组合物提供。该组合物可以在极性介质中包含作为单个实体的化合物。如本文所用，“极性介质”包括极性质子溶剂和极性非质子溶剂。极性溶剂具有较大的偶极矩或部分电荷，并包含具有不同电负性的原子之间的键，如氧和氢。质子溶剂有O-H或N-H键。这种键允许参与氢键。此外，这些O-H或N-H键可以作为质子(H+)的来源。非质子溶剂可以在某些地方有氢，但它们缺乏O-H或N-H键，因此不能与自身氢键。极性溶剂包括但不限于二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、氨、丁醇、丙醇、乙醇、甲醇、乙酸和水。该定义中还包括溶剂混合物，其中溶剂混合物的主要成分是极性溶剂。例如，基于水的溶剂或溶剂系统也可以包括溶解的离子、盐和分子，例如氨基酸、蛋白质、糖和磷脂。这种盐可以是但不限于氯化钠、氯化钾、乙酸铵、乙酸镁、氯化镁、硫酸镁、乙酸钾、氯化钾，乙酸钠、柠檬酸钠、氯化锌、HEPES钠、氯化钙、硝酸铁、碳酸氢钠、磷酸钾和磷酸钠。因此，生物流体、生理溶液和培养基也属于该定义范围。
在一些实施方案中，组合物包含式(I)或子式(Ia至Ig)的化合物和极性介质。例如，当MIC值为256μM时，在其他实施方案中，所述组合物包含式(I)或子式(Ia至Ig)的化合物和极性介质，式(I)或子式(Ia至Ig)的化合物的终浓度为约130μM。在其他实施方案中，浓度为约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约100μM、约150μM、约200μM、约250μM、约300μM、约350μM或约400μM。在其他实施方案中，浓度不高于10μM、不高于20μM、不高于30μM、不高于40μM、不高于50μM、μM、不高于100μM、不高于150μM、不高于200μM、不高于250μM、不高于300μM、不高于350μM、或不高于400μM。
或者，这些化合物可以作为试剂盒提供。试剂盒可以包括化合物和极性介质。化合物和极性介质可以在单独的容器中或作为单独包装的组分，在使用前进行混合。或者，试剂盒可以包括在第一极性介质和单独的第二介质中的化合物的组合物，这两种组分都包含在单独的容器中。试剂盒还可以包括用于对细菌细胞的单独组分进行染色的另一种染料。例如，该试剂盒可以另外包括FM 4-64。该试剂盒可以另外地包含赋形剂。赋形剂可以起到进一步稳定化合物和/或通过在化合物渗透到细菌细胞膜中之前进一步猝灭化合物的荧光来降低背景噪声的作用。
流式细胞术是在学术界和工业界的研究实验室中研究生物细胞、细菌细胞和细胞外囊泡(如脂质囊泡、外泌体)的技术。这些生物样品由脂质双层(膜)的重要性来定义，其中COE被设计为与保持高亲和力。因此，当在脂质双层内缔合时，本发明化合物的物理化学和光电性质允许它们用作流式细胞术应用的染料。
本发明的化合物适合用作荧光探针。例如，可以调节化合物的主链，使其具有一定的长度(≈3.4nm)，并进一步具有用于特定膜嵌入的合适拓扑结构。延长的主链长度可以与脂质双层的厚度相匹配(≈4nm)，因此对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等细胞和细菌的毒性可以忽略不计(MIC值大于256μM)。在这方面，这些化合物可以在不损害细胞生存力的情况下用作活体系统中的染料。第二，六个带正电荷的侧链可以作为端基包含在化合物中，以实现在水性介质中的足够溶解性。研究发现，当疏水共轭核的长度增加时，带电侧链的数量必须平衡，才能为COE化合物提供良好的水溶性。不利的亲水/疏水特性和强烈的聚集趋势将影响有效的膜嵌入和荧光稳定性(易受荧光猝灭的影响)。例如，在两个末端具有4个带正电荷的侧链的5个苯环低聚亚苯基乙烯主链显示出一些聚集趋势。当浓度为1mg mL-1时，肉眼会看到浑浊的水溶液，这表明未完全溶解的混悬液中存在大量聚集体。当用6个带电侧链修饰时，COE化合物在水溶液中表现出优异的溶解度(>50mg mL-1)。COE化合物的清澈均匀的水溶液特性增加了其实用价值，尤其是在稀释和使用前需要以高浓度储存时。第三，COE化合物的延长的主链有望有利于更大的膜稳定性，而富集的亲水基团有望增加水溶性。此外，这些组合的物理特征旨在增加疏水和静电相互作用，以促进双层内的嵌入。因此，当COE化合物用作膜标记染料时，它可以通过长时间染色的强结合力稳定地结合在脂质双层中。
图16显示了化合物的A单元和D单元变化时荧光发射的变化。参考COE-Quin，其中交替的苯基部分是弱电子受体的和电子给体，通过调节A单元和D单元的电子接受和给予性，荧光激发和发射可以校准到特定的波长。这些单元的选择也允许较窄的FWHM，因此具有更大的特异性。
因此，本发明还提供式(Ig)的化合物或其盐或溶剂化物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；和
r是选自1至5的整数。
这些化合物的应用可用于细菌细胞、哺乳动物细胞(包括但不限于A549癌细胞和红细胞)和外泌体(特别是未结合的外泌体)的染色。
因此，本发明提供了标记细胞和/或脂质囊泡的方法，其包括：
a)将式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育。
细胞可以是哺乳动物细胞或细菌细胞。在一些实施方案中，细菌细胞是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞。在其他实施方案中，革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞选自大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠杆菌、单胞菌、巨型芽孢杆菌或其组合。哺乳动物细胞可以来自细胞系，也可以来自来自对象的样本。
在一些实施方案中，细菌细胞的样品是浮游细菌细胞的样品。
本文所称“浮游细菌细胞”，是指混悬状态下自由流动的细菌细胞。这与固着状态(或生物膜)相反，在固着状态下，细菌细胞的结构群落被封闭在自产的聚合物基质中，并附着在惰性或活的表面上。在这方面，浮游细菌是自由生活的细菌，构成了在实验室试管和烧瓶培养物中生长的种群。
脂质囊泡是细胞内或外的结构，由脂质双层包裹的液体或细胞质组成。囊泡在质膜内物质的分泌(胞吐)、摄取(内吞)和运输过程中自然形成。或者，它们可以人工制备，在这种情况下，它们被称为脂质体。单层脂质囊泡具有一个磷脂双层，而多层脂质囊泡具有多于一个双层。囊泡也可以与细胞内的其他细胞器汇合。从细胞中释放的囊泡是细胞外囊泡。例如，脂质囊泡可以是外泌体。外泌体是在大多数真核细胞的内体室中产生的膜结合的细胞外囊泡。这些脂质囊泡包括在范围内。
在一些实施方案中，脂质囊泡是细胞外囊泡。在其他实施方案中，脂质囊泡是外泌体。
在一些实施方案中，方法包括：
在预定义条件下使细胞和/或脂质囊泡样品与式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物接触。
在一些实施方案中，将细胞和/或脂质囊泡与式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物以低于其MIC值的化合物浓度孵育。在其他实施方案中，将细胞和/或脂质囊泡与式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物以小于其MIC值一半的化合物浓度孵育。在一些实施方案中，将细胞和/或脂质囊泡与式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物以小于其MIC值的三分之一的化合物浓度孵育。最小抑制浓度(MIC)是化学物质的最低浓度，它阻止细菌或细菌的可见生长。MIC取决于微生物和化学物质。化合物的MIC可以通过将细胞与各种浓度的化合物在液体培养基或固体生长培养基(如琼脂)平板上孵育并鉴定没有细菌生长的化合物浓度和允许细菌生长的下一个较低剂量来确定。该信息也可以从浊度相对于化合物浓度的曲线图中得出。确定MIC值的其他方法是可用的，如Etest或Kirby-Bauer测试也可以使用。
在一些实施方案中，MIC值大于约1μM。在其他实施方案中，MIC值大于约5μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM、约100μM、约150μM、约200μM、约250μM、约300μM、约350μM、约400μM、或约500μM。
在一些实施方案中，式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物以约1nM至约100μM的浓度提供。在其他实施方案中，浓度为约1nM至约90μM、约1nM至约80μM、约1nM至约70μM、约1nM至约60μM、约1nM至约50μM、约1nM至约40μM、约1nM至约30μM、约1nM至约20μM、约1nM至约10μM、约1nM至约5μM、约1nM至约1μM、约1nM至约900nM、约1nM至约800nM、约1nM至约700nM、约1nM至约600nM、约1nM至约500nM、约1nM至约400nM、约1nM至约300nM、约1nM至约200nM、约1nM至约100nM、约1nM至约50nM、或约1nM至约20nM。
在一些实施方案中，式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡在约5℃至约50℃下孵育。在其他实施方案中，温度在约5℃至约45℃、约5℃至约40℃、约5℃至约35℃、约10℃至约35℃、约15℃至约35℃或约15℃至约30℃。在其他实施方案中，温度为室温或环境温度。
在一些实施方案中，式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育约5分钟至约120分钟。在其他实施方案中，持续时间为约5分钟至约110分钟、约5分钟至约100分钟、约5分钟至约90分钟、约5分钟至约80分钟、约5分钟至约70分钟、约5分钟至约60分钟、约5分钟至约50分钟、约5分钟至约40分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约20分钟、或约5分钟至约10分钟。
将式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物和细胞和/或脂质囊泡在含水介质中孵育。
本文中使用的术语“含水介质”是指主要由水组成的基于水的溶剂或溶剂体系。这样的溶剂可以是极性的或非极性的，和/或质子的或非质子的。溶剂体系是指产生最终单相的溶剂组合。“溶剂”和“溶剂体系”可包括但不限于戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、二烷、三氯甲烷、二乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、硝基甲烷、碳酸亚丙酯、甲酸、丁醇、异丙醇、丙醇、乙醇、甲醇、乙酸、乙二醇、二甘醇或水。水基溶剂或溶剂系统还可以包括溶解的离子、盐和分子，例如氨基酸、蛋白质、糖和磷脂。这种盐可以是但不限于氯化钠、氯化钾、乙酸铵、乙酸镁、氯化镁、硫酸镁、乙酸钾、氯化钾，乙酸钠、柠檬酸钠、氯化锌、HEPES钠、氯化钙、硝酸铁、碳酸氢钠、磷酸钾和磷酸钠。因此，生物流体、生理溶液和培养基也属于该定义范围。
本发明还提供了使用荧光检测器检测细胞和/或脂质囊泡的方法，包括：
a)将式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育；和
b)使细胞和/或脂质囊泡通过荧光监测器。
由于式(I)、子式(Ia至Ig)或其盐或溶剂化物嵌入细胞膜或脂质双分子层时会发出荧光，因此基于荧光的技术可用于检测与式(I)、子式(Ia至Ig)或其盐或溶剂化物结合的细胞和/或脂质囊泡。基于荧光技术的实例包括但不限于荧光显微镜、共聚焦显微镜、平板阅读器、荧光计、荧光光谱学和流式细胞术(如荧光激活细胞分选)。
在一些实施方案中，使用流式细胞仪检测细胞和/或脂质囊泡的方法包括：
a)将式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育；和
b)使细胞和/或脂质囊泡流经流式细胞仪。
当与式(I)、子式(Ia至Ig)或其盐或溶剂化物的化合物结合时，细胞和/或脂质囊泡可由波长范围为约300nm至约1000nm的电磁辐射(源)激发。
本发明还提供了使用流式细胞仪检测细胞和/或脂质囊泡的方法，其包括：
a)将式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育；
其中
R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
R2独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基；
u是选自3至15的整数；
每个s是独立地选自0至4的整数；和
q是选自2至5的整数；
q’是选自2至5的整数；和
b)使细胞和/或脂质囊泡流经流式细胞仪。
在一些实施方案中，R2独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基。在其他实施方案中，R2独立地选自卤素、氰基或任选地经取代的烷基。在其他实施方案，R2独立地选自卤素、氰基、甲基、乙基或丙基。
在一些实施方案中，u是选自3至14的整数。在其他实施方案中，u是选自3至12、3至10、3至9、3至8、3至7或4至6的整数。在其他实施方案中，u为3、4、5、6或7。在一些实施方案中，u为4、5或6。在其他实施方案中，u为4。
下面给出式(IV)的化合物的盐或溶剂化物形式的实例。式(IV)的化合物的实施例也在本公开的范围内。
细胞可以是黏附细胞，也可以处于混悬状态。脂质囊泡可以是外泌体(在真核细胞的内体室中产生的膜结合的细胞外囊泡)、合成脂质体和非合成脂质体，或脂质纳米颗粒(由可电离脂质制成的球形囊泡，在低pH下带正电，在生理pH下为中性)。有利地，发现在荧光探针插入细胞膜之后，荧光探针可以延续到以后的细胞群体。
在孵育步骤后，用式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物对细胞和/或脂质囊泡进行染色。在一些实施方案中，孵育时间为约1分钟至约12天、约1分钟至约10天、约1分钟至约8天、约1分钟至约6天、约1分钟至约5天、约1分钟至约4天、约1分钟至约3天、约1分钟至约2天、约1分钟至约24小时、约1分钟至约20小时、约1分钟至约16小时、约1分钟至约12小时、约1分钟至约10小时、约1分钟至约9小时、约1分钟至约8小时、约1分钟至约7小时、约1分钟至约6小时、约5分钟至约6小时、约5分钟至约5.5小时、约5分钟至约5小时、约5分钟至约4.5小时、约5分钟至约4小时、约5分钟至约3.5小时、约5分钟至约3小时、约5分钟至约2.5小时、约5分钟至约2小时、约5分钟至约1.5小时、约5分钟至约1小时、约5分钟至约50分钟、约5分钟至约40分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约20分钟、或约5分钟至约10分钟。在一些实施方案中，孵育时间为约10分钟。
通过控制式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂的浓度，可以获得足够的时间来分析样品。在一些实施方案中，细胞和/或脂质囊泡在与式(I)和/或式(IV)的化合物接触到样品后30分钟内通过流式细胞仪。在其他实施方案中，时间在10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、10天、或12天内。在其他实施方案中，时间大于约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约10小时、约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约8天、约10天、或约12天。
在一些实施方案中，细胞和/或脂质囊泡可以在不经纯化步骤的情况下流经流式细胞仪流动。这是可能的，因为式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的游离化合物或其盐或溶剂化物是弱发射的并且将产生较少的背景。
通过使细胞和/或脂质囊泡流经流式细胞仪，可以通过电磁辐射激发细胞和/或者脂质囊泡，随后通过检测器检测。因此，该方法可以进一步包括将细胞和/或脂质囊泡暴露于波长小于约2500nm或小于约1000nm的电磁辐射的步骤。
在一些实施方案中，式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物在波长为约300nm至约1000nm或约400nm至约700nm处具有荧光激发。根据D和A的组合，激发可以在这个波长范围内调节。
在一些实施方案中，式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物具有约10nm至约200nm的全宽半最大值(FWHM)的荧光激发峰。在其他实施方案中，FWHM为约10nm至约190nm、约10nm至约180nm、约10nm至约170nm、约10nm至约160nm、约10nm至约150nm、约10nm至约140nm、约10nm至约130nm、约10nm至约120nm、约10nm至约110nm、或约10nm至约100nm。在其他实施方案中，FWHM为约20nm至约200nm、约30nm至约200nm、约40nm至约200nm、约50nm至约200nm、约60nm至约200nm、约70nm至约200nm、约80nm至约200nm、约90nm至约200nm、或约100nm至约200nm。
在一些实施方案中，式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物在波长为约300nm至约2000nm处具有荧光发射。在其他实施方案中，范围为约300nm至约1900nm、约300nm至约1800nm、约300nm至约1700nm、约300nm至约1600nm或约300nm至约1500nm。根据D和A的组合，激发可以在这个波长范围内调节。
在一些实施方案中，式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物具有约10nm至约200nm的全宽半最大值(FWHM)的荧光发射峰。在其他实施方案中，FWHM为约10nm至约190nm、约10nm至约180nm、约10nm至约170nm、约10nm至约160nm、约10nm至约150nm、约10nm至约140nm、约10nm至约130nm、约10nm至约120nm、约10nm至约110nm、或约10nm至约100nm。在其他实施方案中，FWHM为约20nm至约200nm、约30nm至约200nm、约40nm至约200nm、约50nm至约200nm、约60nm至约200nm、约70nm至约200nm、约80nm至约200nm、约90nm至约200nm、或约100nm至约200nm。
在一些实施方案中，当式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物插入细胞和/或脂质膜中时，式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物相对于式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物的对照样品具有大于约2倍至约500倍的发射强度。在其他实施方案中，发射强度大于约10倍至约500倍、约20倍至约500倍、约30倍至约500倍、约40倍至约500倍、约50倍至约500倍、约60倍至约500倍、约70倍至约500倍、约80倍至约500倍、约90倍至约500倍、约100倍至约500倍、约100倍至约450倍、约150倍至约450倍、约200倍至约450倍、约250倍至约450倍、约300倍至约450倍、或约350倍至约450倍。
实验中的对照组是与实验的其余部分分开的组，其中被测试的自变量不会影响结果。当测试细胞和/或脂质囊泡的样品时，至少一种对照样品可包含在含水介质/水介质中的式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物。在这方面，对照样品不包含细胞和/或脂质囊泡。
有利地，式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物在溶解于含水介质中时具有低(或可忽略的)光致发光。然而，当分配到脂质双层中时，增强了式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物的光致发光。据信，局部环境向疏水环境(脂质双层的烷基链)的变化允许荧光的增强。荧光是吸收了光或其他电磁辐射的物质发出的光。一般来说，发射的光的波长比吸收的光长。
因为式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物有利地无毒(或具有低毒性)和/或者对激发稳定，所以当在恒定激发下时，光致发光强度可以保持一段时间。在这方面，当化合物在适当的波长下被激发用于成像时，光致发光强度在一段时间内不会降低。这被认为是由于共轭系统，它允许能量的耗散和转移，从而防止化合物的局部加热和降解。在一些实施方案中，光致发光强度可以保持至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少1.5小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少6小时、至少10小时或至少24小时。
式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物可以与其他染料例如膜染料组合使用。例如，可以添加市售染料FM4-64，以在细菌混合物中原位识别细菌包膜类型。在这方面，还公开了可以识别多微生物样品的双染料系统。这些方法易于使用，只需要简单地应用染料混合物，而不需要固定或其他预处理要求，并且式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物在水溶液中是稳定的，并且可以用于监测生命系统中的细胞。
因此，在一些实施方案中，方法还包括使细胞和/或脂质囊泡与另一种染料接触的步骤。该染料可用于染色细胞膜、细胞核、DNA、RNA或细胞中的其他细胞器。染料可以是荧光探针，如FM4-64、FM 2-10、FM 1-43、碘化丙啶、SYTO 82、SYTO 83、SYTO 84、SYTO 85、-3碘化物、YO-PROTM-3碘化物，BOBOTM-3碘化物、同二聚乙二酯-1、同二聚乙二酯-2、单叠氮化乙二酯、吖啶橙、CellMaskTM质膜染色剂或Di-4-ANEPPS。
本发明还提供了用于检测和/或定量细胞和/或脂质囊泡的流动系统，其包括：
a)用于标记细胞和/或脂质囊泡的式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物；
b)用于将经标记的细胞和/或脂质囊泡引入流动系统的入口；
c)用于检测来自经标记的细胞和/或脂质囊泡的荧光发射的与入口流体连通的检测装置；和
d)任选地，用于定量经标记的细胞和/或脂质囊泡的计数装置。
流动系统例如可以是微流控芯片。
在一些实施方案中，流动系统还包括孵育装置。所述孵育装置允许式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物嵌入细胞膜或嵌入脂质双分子层。
在一些实施方案中，检测装置是荧光检测器。
将理解，所描述的实施方案的各个方面的许多进一步的修改和排列是可能的。因此，所描述的方面旨在包含在所附权利要求书的精神和范围内的所有此类变更、修改和变化。
在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文需要否则单词“包含/包括”、和其变体，将被理解为意味着包括所陈述的整数或步骤或整数或步骤组但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤组。
本说明书中对任何在先出版物(或由其衍生的信息)或任何已知内容的引用，不是也不应被视为承认或认可或以任何形式暗示该在先出版物(或由其衍生的信息)或已知内容构成本说明书所涉及领域的公知常识的一部分。
实施例
用于合成式(I)的化合物的通用规程
化合物COE-BT的合成路线
化合物COE-BBT的合成路线
化合物COE-EDOT的合成路线
(E)-1，2，，3-三((6-溴己基)氧基)-5-(4-溴苯乙烯基)苯(化合物3)
在氮气气氛保护下，将化合物1(5.69g，8.46毫摩尔)、化合物2(4.07g，13.27毫摩尔)、叔丁二氧化钾(0.99g，8.46毫摩尔)和100mL干THF加入圆形烧瓶中。在室温下搅拌反应16小时后，将反应混合物倒入水中，并用三氯甲烷萃取。将透明有机相用Na2SO4干燥，然后通过旋转蒸发器除去有机溶剂。使用己烷和二氯甲烷作为洗脱剂，用柱色谱法纯化粗产物，然后获得白色固体的产物(6.63g，94％产率)。
1H NMR(400MHz，三氯甲烷-d)δ7.49-7.44(m，2H)，7.37-7.33(m，2H)，6.99(d，J＝16.2Hz，1H)，6.90(d，J＝16.2Hz，1H)，6.70(s，2H)，4.06-4.00(m，4H)，3.99-3.95(m，2H)，3.49-3.39(m，6H)，1.96-1.71(m，12H)，1.60-1.47(m，12H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ153.56，138.68，136.62，132.69，132.12，129.82，128.18，126.95，121.51，105.65，73.58，69.27，34.25，34.12，33.20，33.07，30.48，29.61，28.44，28.27，25.70，25.68。
(E)-2-(4-(3，4，5-三((6-溴己基)氧基)苯乙烯基)苯基)噻吩(化合物5)
在氮气气氛的保护下，将化合物3(4.44g，5.58毫摩尔)、化合物4(4.16g，11.15毫摩尔)、Pd(PPh3)2Cl2(157mg，0.223毫摩尔)加入到圆烧瓶中。用氮气吹扫后，向反应混合物中加入50mL干甲苯，然后在120℃下搅拌加热16小时。冷却至室温后，将反应混合物倒入水中，并用三氯甲烷萃取。将有机相用Na2SO4干燥，然后通过旋转蒸发器除去有机溶剂。使用己烷和二氯甲烷作为洗脱液，用硅胶柱色谱法纯化粗产物，然后获得浅黄色固体的产物(4.02g，90％产率)。
1H NMR(400MHz，三氯甲烷-d)δ7.63-7.58(m，2H)，7.52-7.48(m，2H)，7.33(dd，J＝3.6，1.2Hz，1H)，7.28(dd，J＝5.1，1.1Hz，1H)，7.09(dd，J＝5.1，3.6Hz，1H)，7.03(d，J＝16.2Hz，1H)，6.97(d，J＝16.3Hz，1H)，6.72(s，2H)，4.09-3.95(m，6H)，3.49-3.39(m，6H)，1.97-1.73(m，12H)，1.62-1.48(m，12H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ153.55，144.48，138.57，136.85，133.85，133.03，129.11，128.44，127.64，127.20，126.45，125.15，123.34，105.65，73.59，69.29，34.24，34.11，33.21，33.09，30.50，29.64，28.46，28.28，25.72，25.70。
(E)-三甲基(5-(4-(3，4，5-三((6-溴己基)氧基苯乙烯基)苯基)噻吩-2-基)锡烷 (化合物6)
将化合物5(2.88g，3.60毫摩尔)和40mL干THF加入到具有氮气保护的烧瓶中。使用超低温反应浴将混合物冷却至-80℃。然后，将3.6mL正丁基锂的环己烷溶液(2M，7.2毫摩尔)逐滴加入反应混合物中。在-80℃下搅拌2小时后，加入14.4mL三甲基氯化锡的己烷溶液(1M，14.4毫摩尔)，然后将反应混合物加热至室温。室温下搅拌过夜(约16小时)后，将反应混合物倒入水中，用己烷萃取。有机相用水洗涤四次，然后用Na2SO4干燥。用旋转蒸发器和真空泵除去溶剂后，得到的粗产物为无色油，无需进一步提纯即可用于后续反应(3.34，96％产率)。
1H NMR(400MHz，三氯甲烷-d)δ7.63-7.58(m，2H)，7.52-7.47(m，2H)，7.44(d，J＝3.3Hz，1H)，7.17(d，J＝3.3Hz，1H)，7.05-6.93(m，2H)，6.72(s，2H)，4.09-3.92(m，6H)，3.51-3.36(m，6H)，1.97-1.71(m，12H)，1.62-1.47(m，12H)，0.40(s，9H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ153.54，150.19，138.51，138.18，136.61，136.59，133.97，133.09，128.92，127.74，127.17，126.47，124.59，105.60，73.59，69.27，34.25，34.12，33.22，33.09，30.50，29.64，28.46，28.29，25.72，25.70，-7.87。
4，7-二(5-(4-((E)-3，4，5-三((6-溴己基)氧基)苯乙烯基)苯基)噻吩-2-基)苯并 [c][1，2，5]噻二唑(化合物8)
在氮气气氛的保护下，将化合物6(2.76g，2.87毫摩尔)、化合物7(281mg，0.88毫摩尔)、Pd(PPh3)2Cl2(27mg，0.038毫摩尔)加入到圆烧瓶中。用氮气吹扫后，向反应混合物中加入10mL干甲苯，然后在120℃下搅拌加热16小时。冷却至室温后，将反应混合物倒入水中，并用三氯甲烷萃取。将有机相用Na2SO4干燥，然后通过旋转蒸发器除去有机溶剂。以己烷和二氯甲烷为洗脱剂，采用硅胶柱层析法对粗产物进行纯化。产品用三氯甲烷溶解，用甲醇沉淀，沉淀物经过滤收集，用甲醇洗涤。在真空中干燥后，得到深红色固体(1.29g，78％产率)。
1H NMR(500MHz，三氯甲烷-d)δ8.12(d，J＝3.9Hz，2H)，7.89(s，2H)，7.69(d，J＝8.4Hz，4H)，7.53(d，J＝8.5Hz，4H)，7.43(d，J＝3.8Hz，2H)，7.05(d，J＝16.2Hz，2H)，6.99(d，J＝16.2Hz，2H)，6.73(s，4H)，4.08-4.02(m，8H)，4.01-3.96(m，4H)，3.47-3.40(m，12H)，1.96-1.74(m，24H)，1.60-1.47(m，24H).13C NMR(126MHz，CDCl3)δ153.55，152.90，145.65，138.96，138.57，137.22，133.48，132.96，129.31，129.03，127.54，127.26，126.30，126.06，125.64，124.36，105.60，73.60，69.26，34.28，34.15，33.21，33.09，30.50，29.64，28.46，28.29，25.72，25.71。
化合物COE-BT
向单颈圆烧瓶中加入化合物8(557mg，0.322毫摩尔)和三氯甲烷(40mL)。化合物8溶解后，将5mL三甲胺在THF中的溶液(2M)加入反应混合物中，并在55℃下搅拌16小时。反应后，沉淀粗产物并将其附着在烧瓶底部。倒出颜色较浅的溶液，并用三氯甲烷轻轻冲洗固体沉淀五次。然后，使用40mL甲醇溶解固体沉淀。将5mL三甲胺在甲醇中的溶液(3.2M)加入反应混合物中，并在55℃下再搅拌16小时。通过旋转蒸发除去溶剂，并在真空中干燥固体。最终产物为暗红色固体(605mg，90％产率)。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ8.29-8.18(m，4H)，7.81(d，J＝8.0Hz，4H)，7.75(d，J＝3.9Hz，2H)，7.68(d，J＝8.2Hz，4H)，7.27(s，4H)，6.96(s，4H)，4.12-4.00(m，8H)，3.95-3.87(m，4H)，3.37-3.27(m，12H)，3.09(s，54H)，1.84-1.62(m，24H)，1.58-1.47(m，12H)，1.42-1.28(m，12H).13C NMR(126MHz，DMSO)δ153.57，152.56，145.89，138.53，138.02，137.88，133.42，133.28，129.93，129.76，128.01，127.88，126.56，126.49，125.68，125.60，106.00，73.27，69.11，66.13，60.82，53.09，30.40，29.56，26.54，26.42，26.02，25.97，23.01。
化合物10
在氮气气氛的保护下，将化合物6(2.54g，2.64毫摩尔)、化合物9(0.31g，0.88毫摩尔)、Pd(PPh3)2Cl2(25mg，0.035毫摩尔)加入到圆烧瓶中。用氮气吹扫后，向反应混合物中加入10mL干甲苯，然后在120℃下搅拌加热16小时。冷却至室温后，将反应混合物倒入水中，并用三氯甲烷萃取。将有机相用Na2SO4干燥，然后通过旋转蒸发器除去有机溶剂。以己烷和二氯甲烷为洗脱剂，采用硅胶柱层析法对粗产物进行纯化。产品用三氯甲烷溶解，用甲醇沉淀，沉淀物经过滤收集，用甲醇洗涤。在真空中干燥后，得到棕色固体(0.69g，44％产率)。
1H NMR(500MHz，三氯甲烷-d)δ8.91(d，J＝4.1Hz，2H)，7.71(d，J＝8.0Hz，4H)，7.49(d，J＝8.5Hz，4H)，7.46(d，J＝4.2Hz，2H)，7.03(d，J＝16.2Hz，2H)，6.96(d，J＝16.1Hz，2H)，6.72(s，4H)，4.11-3.94(m，12H)，3.51-3.39(m，12H)，1.97-1.73(m，24H)，1.63-1.45(m，24H).13C NMR(126MHz，CDCl3)δ153.56，151.49，149.12，138.58，137.90，137.43，134.40，133.48，132.94，129.36，127.50，127.23，126.32，124.54，113.50，105.58，73.61，69.26，34.29，34.17，33.22，33.11，30.53，29.66，28.48，28.32，25.74，25.72。
化合物COE-BBT
向单颈圆烧瓶中加入化合物10(196mg，0.110毫摩尔)和三氯甲烷(20mL)。化合物10溶解后，将2mL三甲胺在THF中的溶液(2M)加入反应混合物中，并在55℃下搅拌16小时。反应后，沉淀粗产物并将其附着在烧瓶底部。倒出颜色较浅的溶液，并用三氯甲烷轻轻冲洗固体沉淀五次。然后，使用20mL甲醇溶解固体沉淀。将2mL三甲胺在甲醇中的溶液(3.2M)加入反应混合物中，并在55℃下再搅拌16小时。通过旋转蒸发除去溶剂，并在真空中干燥固体。最终产物为棕色固体(219mg，93％产率)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.13-9.04(m，2H)，7.97-7.83(m，6H)，7.77-7.66(m，4H)，7.29(br，4H)，6.97(br，4H)，4.12-3.99(m，8H)，3.95-3.85(m，4H)，3.39-3.23(m，12H)，3.09(s，54H)，1.86-1.63(m，24H)，1.59-1.47(m，12H)，1.43-1.28(m，12H).13C NMR(126MHz，DMSO)δ153.57，151.50，148.78，138.24，138.06，137.70，134.93，133.40，133.29，130.12，128.08，127.89，126.72，125.98，113.24，106.01，73.27，69.10，66.11，58.48，55.32，55.29，55.26，53.07，30.41，29.56，26.55，26.43，26.02，25.98，23.00.
化合物12
合成和纯化过程与化合物5相似。将反应物三丁基(噻吩-2-基)锡烷(化合物4)改为(3，4-亚乙基二氧噻吩-2-基)三甲基锡烷(化合物11)，但投料比不变。获得无色油状的产物(5.49g，86％产率)。
1H NMR(500MHz，三氯甲烷-d)δ7.70(d，J＝8.4Hz，2H)，7.48(d，J＝8.5Hz，2H)，7.00(d，J＝16.2Hz，1H)，6.96(d，J＝16.2Hz，1H)，6.72(s，2H)，6.31(s，1H)，4.36-4.31(m，2H)，4.29-4.23(m，2H)，4.08-4.01(m，4H)，3.99-3.94(m，2H)，3.48-3.39(m，6H)，1.96-1.72(m，12H)，1.62-1.46(m，12H).13C NMR(126MHz，CDCl3)δ153.50，142.61，138.62，138.36，135.80，133.13，132.72，128.67，127.87，126.93，126.42，117.68，105.48，98.04，73.57，69.22，65.14，64.79，34.28，34.16，33.20，33.07，30.48，29.61，28.44，28.27，25.70，25.69。
化合物13
合成和纯化过程与化合物6相似。粗产物为无色油状，无需进一步纯化即可用于后续反应(2.55g，94％产率)。
1H NMR(500MHz，三氯甲烷-d)δ7.72-7.68(m，2H)，7.49-7.45(m，2H)，6.99-6.95(m，2H)，6.71(s，2H)，4.34-4.20(m，4H)，4.07-3.94(m，6H)，3.47-3.39(m，6H)，1.96-1.79(m，12H)，1.60-1.45(m，12H)，0.38(s，9H).
化合物14
合成和纯化过程与化合物8相似。获得的产物为深绿色固体(431mg，40％产率)。
1H NMR(500MHz，三氯甲烷-d)δ7.85(d，J＝8.5Hz，4H)，7.53(d，J＝8.6Hz，4H)，7.04(d，J＝16.2Hz，2H)，6.98(d，J＝16.1Hz，2H)，6.73(s，4H)，4.53-4.46(m，4H)，4.39-4.32(m，4H)，4.09-3.95(m，12H)，3.48-3.40(m，12H)，1.96-1.72(m，24H)，1.60-1.48(m，24H).13C NMR(126MHz，CDCl3)δ153.51，152.84，142.17，138.93，138.45，136.43，133.07，132.35，129.01，127.80，126.97，126.90，122.06，113.41，109.52，105.55，73.57，69.23，65.03，64.87，34.26，34.14，33.19，33.07，30.48，29.61，28.44，28.27，25.70，25.68.
化合物COE-EDOT：
合成和纯化过程与化合物COE-BBT相似。获得的产物为深绿色固体(181mg，93％产率)。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6，353K)δ7.85-7.80(m，4H)，7.69-7.65(m，4H)，7.21(br，4H)，6.94(br，4H)，4.50(br，4H)，4.37(br，4H)，4.13-4.04(m，8H)，3.99-3.91(m，4H)，3.45-3.35(m，12H)，3.13(s，54H)，1.86-1.66(m，24H)，1.60-1.49(m，12H)，1.46-1.34(m，12H).13CNMR(126MHz，DMSO-d6，353K)δ153.30，152.36，142.64，139.29，138.53，136.80，133.09，132.01，129.49，127.77，127.38，126.53，120.37，112.86，109.21，106.52，73.05，69.29，66.19，65.34，64.90，53.04，53.01.30.05，29.26，26.23，26.10，25.58，25.53，22.70.
其他COE化合物(如COE-BO和COE-QX)也可以使用上述规程类似地合成，其结构如图1所示。
流式细胞术中细菌细胞的标记和检测
COE染料的应用可以扩展到流式细胞术测量中的细菌标记。如图2所示，使用5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4和0∶5的不同比例，将PBS中的革兰氏阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，MRSA)和革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)按体积预混合。使用具有革兰氏选择性并能特别标记革兰氏阳性菌的COE染料对这些细菌混合物进行染色。在流式细胞术测量过程中，观察到两个分离的群体。随着革兰氏阳性菌百分比的降低，当细菌混合物中只含有革兰氏阴性菌时，具有阳性信号的群体逐渐减少并消失。这些结果不只证明该化合物能够区分每种革兰氏类型的细菌比例，而且还揭示了该化合物可用于在流式细胞术中标记细菌样品。
外泌体的标记和使用流式细胞术的检测
外泌体通过以下方案制备：将单个等分试样从-80℃温度下取出并放置在冰上。外泌体在细胞培养级PBS中稀释10倍。在8μL的外泌体混悬液中加入25μM至1μM的COE化合物。将其置于冰上10分钟，然后在PBS中稀释100倍，使其达到约6x106个颗粒/mL的外泌体和25nM至1nM的COE的最终浓度。将样品短暂涡旋并用于流式细胞术。流式细胞术测量是通过测量紫色激光上的侧散射(x轴)和通过测量荧光强度(y轴：λ激发＝405nm、488nm，λ发射＝525nm、690nm)获得的。图3和图4中的实验表明，使用COE化合物可以成功标记和检测外泌体。使用COE化合物，外泌体可以用低浓度的染料染色，并且可以在没有额外纯化的情况下直接使用。图1显示了这些化合物的结构。
表1：用于流式细胞术的外泌体
表2：外泌体流式细胞术测定的事件数。
在另一个实施例中，从SW480结肠癌癌症细胞系分离并使用大小排阻色谱纯化的外泌体由NanoFCM(英国)善意地提供。标记和流式细胞术分析也由NanoFCM(英国)训练有素的技术人员进行。简言之，外泌体以每毫升约10e10个颗粒的颗粒浓度进行标记，其中向9μL样品中加入1μL的10μM COE染料溶液或PKH-26(在稀释剂C中)，以获得最终的1μM染色浓度。将混合物在室温下孵育30分钟，然后在NanoAnalyzer(NanoFCM)上分析之前使用PBS稀释100倍。在小阈值设置(68-155S16M-Exo)上进行外泌体的检测，并在PC5通道(Ex488/Em670)上进行标记群体的分析。通过用PBS代替9μL外泌体溶液，然后按照与外泌体样品相同的步骤进行流动分析，制备染料对照样品。通过至少两次重复验证了结果。在单独的实验中，在如上所述进行分析之前，还使用标准超速离心方法纯化标记的外泌体中的过量染料。
图17显示了COE-BO、COE-BT、COE-QX、COE-BSe和PKH26(10μM)染料纯对照的粒径分布图(a至e)和对应的门控点图(f-j)。图18显示了COE标记的SW480外泌体(10μM)的粒度分布图(a至d)和它们相应的门控点图(e-h)。表3和表4总结了使用NanoAnalyzer分析时仅COE缓冲液对照和COE标记的外泌体的结果。
表3：在NanoAnalyzer上分析仅染料对照的样品的颗粒计数。
表4：在NanoAnalyzer上分析COE标记的SW480外泌体的阳性事件百分比。
图19和表5显示了从COE标记的SW480外泌体中纯化过量COE化合物后的结果。
表5：使用COE标记的SW480外泌体(10μM和20μM)进行超离心纯化多余染料后，在NanoAnalyzer上分析阳性事件百分比。
外泌体的透射电镜(TEM)
将制备用于流式细胞术或从荧光活化细胞分选(FACS)收集的样品浸没在液氮中并冻干。将粉末重新悬浮在50μL的冷MiliQ水中。添加戊二醛至2.5％的最终浓度。将10μL样品添加到新的辉光放电200目Cu Carbon/Formvar网格中，并使其黏附10分钟。用滤纸吸出多余的液体，并用MiliQ水洗涤网格两次。用2.5％三乙酸钆染色剂将网格染色1分钟，然后用滤纸吸出多余的液体。样品用Tecnai G2在100kV、30000X放大倍率下成像。图5显示了FACS后收集的(a)外泌体、用COE-BT标记的外泌体、和c)用COE-S6标记的外泌体的TEM显微照片。
用流式细胞术标记和检测红细胞(RBC)
COE化合物可用于标记用于流式细胞术的RBC，如图6所示。将RBC(从牛全血中分离，Innovative Research,Inc)从原液中稀释10倍到PBS中，并在3000RPM下离心5分钟。除去上清液，将沉淀重悬于PBS中。重复该步骤3次。将最终的沉淀重悬于PBS中，使其为1体积％。将10μM的COE化合物添加到RBC混悬液中，并在RT下孵育20分钟。然后将RBC COE化合物混合物再次以3000RPM离心5分钟。取出上清液，将沉淀重悬在新鲜PBS中。将COE化合物染色和未染色的RBC分别以0:5、1:4、2:3、3:2、4:1和5:0的不同体积比混合。将所得的RBC混合物在PBS中稀释100倍用于流式细胞术实验。通过测量前向散射(x轴)和测量荧光强度((y轴：λ激发＝405nm，λ发射＝525nm)获得流式细胞术测量结果。图6表明，对于COE化合物标记的和未标记的RBC，可以看到两个不同的群体。随着用COE化合物染色的RBC的比例增加，具有较高荧光强度的群体的百分比也增加，这表明用COE化合物成功标记了RBC，并通过流式细胞术成功检测(图6)。
表6：流式细胞术测量了不同比例的COE-S6染色的RBC与未染色的RBC门控区域的事件数。
用流式细胞术标记和检测哺乳动物细胞
COE可用于流式细胞术标记哺乳细胞，如图8至图11所示。Hep-G2和A549(ATCC HB-8065,CCL-185)购自ATCC。收到冷冻细胞后，在37℃的水浴中轻轻搅拌解冻细胞，然后转移到含有9mL DMEM+10％FBS的预热培养基的离心管中。将管在200xg离心5分钟。丢弃上清液，将细胞沉淀与培养基一起重悬于培养瓶中。细胞在37℃、5％ CO2条件下孵育。当细胞汇合度达到90％左右时，用1×胰蛋白酶提起细胞，并用相同体积的培养基中和。在200xg离心5分钟后，弃去上清液，用含有5μM至10μM COE的温热PBS重悬细胞沉淀。使混悬液在RT下孵育20分钟，然后以1000rpm离心5分钟以除去过量的COE化合物。弃去上清液，然后将沉淀重悬于温热的PBS中。将COE化合物染色和未染色的细胞分别以0:5、1:4、2:3、3:2、4:1和5:0的不同体积比混合。将得到的混悬液直接用于流式细胞术实验。通过测量前向散射(x轴)和测量荧光强度((y轴：λ激发＝561nm，λ发射＝610nm)获得流式细胞术测量结果。图8表明，对于COE标记的和未标记的细胞，可以看到两个不同的群体。随着用每个COE化合物染色的细胞的比例增加，具有较高荧光强度的群体的百分比也增加，这表明用COE成功标记了细胞，并通过流式细胞术成功检测(图8和图10)。图9显示了在不同比例的式(I)的化合物染色的Hep-G2与未染色的Hep-G2的门控区域中发生的流式细胞术事件的百分比。图11显示了用5μM COE-BSe标记的A549细胞的流式细胞术测量结果。通过测量前向散射(x轴)和测量荧光强度((y轴：λ激发＝638nm，λ发射＝712nm)获得流式细胞术测量结果。将汇合的细胞用5μM COE的PBS溶液的在RT下染色20分钟。抽吸COE溶液，并用新鲜PBS洗涤汇合的细胞。用1×胰蛋白酶提起细胞，并用相同体积的培养基中和。在200×g离心5分钟后，弃去上清液，用温热的PBS重悬细胞沉淀并用于流式细胞术。接种20％的COE标记的细胞混悬液并使其达到90％的汇合度。收获细胞并接种，然后在不添加额外COE的情况下用于流式细胞术4通道。(图11)
表7：不同比例下的染色的Hep-G2细胞和未染色的Hep-G2细胞的门控区域中用流式细胞术测量事件的数量。
哺乳动物细胞的荧光显微镜检查
上述实验已经证实，COE染料可以用于流式细胞术中标记细胞外囊泡(包括外泌体)、细菌、RBC和哺乳动物细胞。在这些样品中，它们的膜中都含有脂质双层结构。为了进一步鉴定COE染料的结合靶标是脂质膜，使用共聚焦显微镜在COE化合物和市售的膜染料FM4-64之间进行共定位。如图12所示，哺乳动物Hep-G2细胞被4μM COE化合物(绿色通道)和4μM FM 4-64(红色通道)染色，通过收集405nm激发后450nm至490nm范围内COE化合物的发射，观察到清晰的细胞膜染色模式。COE化合物与FM4-64之间的良好匹配的共位证明了COE染料的结合靶标是脂质膜。A549细胞用5μM COE化合物在PBS中染色，在37℃和5％ CO2下孵育1小时，然后在荧光显微镜上观察。(图13)
用荧光仪评价COE嵌入脂质双分子层
使用如下方案制备脂质体。将三氯甲烷溶液中的磷脂(例如POPC、POPE和POPG)混合到适当的摩尔比，并在温和的氮气流下干燥。将干燥的脂质在真空中进一步干燥过夜以获得薄的脂质膜。为了制备小的单层囊泡(SUV)，通过添加浓度为5mg mL-1的磷酸盐缓冲盐水(PBS)对干燥膜进行再水合，然后在35℃下以≈300rpm的恒定搅拌下孵育2小时。然后，使用100nm膜在45℃下挤出囊泡21次，以获得SUV样品。囊泡保持在4℃，直到进一步使用。
在COE插入脂质双层后，COE的发射将显著增强。因此，水相中的游离染料将是弱发射的，并且将产生较少的背景，这对于获得高信噪比是理想的。如图14所示，PBS中的SUV(1mg/mL)和COE-BT(10μM)都表现出弱发射(λ激发＝520nm)。当将SUV与COE-BT混合时，COE将插入脂质双层中。这是由COE和脂质之间的静电和疏水相互作用自发驱动的。结果，观察到显著的发射增强。例如，相对于COE-BT溶液，SUV和COE-BT复合物的发射强度在600nm至630nm之间增加了400倍以上。COE-BT也出现了同样的现象(图14和图15)。通过调整不同的化学结构，COE可以实现不同的发射波长，从“绿色”到“红色”，甚至“红外”(图14和图15)。不同的颜色选择赋予COE染料在同时使用多种染料时具有很高的兼容性。
COE添加对脂质体尺寸和均匀性的影响
为了确定COE处理是否会改变脂质体的形态(例如，诱导脂质体的融合或分裂)，使用脂质SUV模型进行了动态光散射(DLS)测量(图16)。SUV是在使用100nm膜挤出后获得的。DLS测量期间，1mg/mL SUV样品的Z平均尺寸为104.5±29.45nm，PDI为0.048。在1mg/mL SUV样品中加入10μM COE-BBT后，Z平均尺寸为104.8±32.65nm，PDI为0.054。该DLS结果表明，添加COE不会改变脂质体的形态。
结果表明，本发明的化合物可用于广泛的样品，包括外泌体、红细胞、哺乳动物细胞和细菌细胞。这些化合物通过其增加的荧光强度显示出更高的标记效率和灵敏度。这些结果表明，COE可在流式细胞术中用作荧光标记，这主要取决于其与脂质双层的相互作用。COE分子结构的可调性和合成的容易性为适应排放检测需求提供了广泛的可能性和灵活性。
COE标记的外泌体及其进入哺乳动物细胞的成像流式细胞术
A549细胞在含有10％ FBS的DMEM培养基中以1×105个细胞mL-1的浓度接种在6孔板中，并在实验前黏附过夜。第二天，将4.5mL 10μgmL-1PC-3外泌体或对照(仅PBS)与COE-Ben混合至1μM的最终染料浓度，或将DiD混合至2.5μM的最终染料浓度。样品在室温下在黑暗中孵育1小时。使用100KDa截止离心过滤装置(Ultra)过滤洗涤样品，并在2000×g下离心15分钟以去除游离染料。回收浓缩的样品并将其重悬在不含FBS的DMEM培养基中，将其分为3等分试样。在收获细胞前的不同时间点，如2小时、4小时和8小时，加入染色的外泌体或对照(残留染料溶液)之前，使用不含FBS的DMEM培养基冲洗微孔板中的细胞。在外泌体或染料吸收后，用温热的PBS(37℃)洗涤细胞，并加入1×胰蛋白酶-EDTA。将细胞在37℃的5％ CO2室中孵育5分钟。将含有10％FBS的DMEM添加到微孔板中，并将细胞以200×g离心4分钟。取出上清液，将细胞重悬于DMEM培养基(含有10％FBS)中，并使用AmnisImageStreamX Mk II成像流式细胞仪进行成像流式细胞学。使用明场通道的面积与纵横比设置收集门，以仅选择完整的细胞事件。对于COE-Ben通道(即Ch02)，使用405nm激光激发细胞，并在505nm至560nm范围内收集发射。对于DiD通道(即Ch05)，使用638nm激光激发细胞，并在642nm至745nm范围内收集发射。整个细胞的明场面积被用作尺寸的指示，即M04或M01通道。数据使用IDEAS v6.3进行处理。明场通道上应用梯度RMS(均方根)来排除焦点外的细胞。流式细胞术结果使用M04通道(尺寸)与Ch02通道(COE-Ben)或Ch05通道(DiD)进行比较。根据未染色的对照样品设置阈值。IDEAS 6.3软件中内置的“点计数算法”功能用于计算细胞内亮点的数量，并用作外泌体吸收的指标。每组至少统计1000个细胞。
图20显示了(a)经COE-Ben染色的外泌体染色的A549细胞在不同处理时间的代表性成像流式细胞术图像，以及(b-d)它们相应的流式细胞仪分析。(e)每个细胞中COE-Ben或DiD探针(1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二碳花青、4-氯苯磺酸酯)的平均斑点计数。(f)A549细胞在使用超滤洗涤后用COE-Ben或DiD染料的残余物染色后的代表性成像流式细胞术图像，以及(g-h)它们相应的流式细胞仪分析。在成像流式细胞术中，使用405nm激发COE-Ben通道，并在505nm至560nm范围内收集发射，在638nm处激发DiD通道，并在642nm至745nm范围内收集发射，整个细胞的明场面积用作尺寸的指示。
使用COE标记预染色的外泌体
为了区分A549细胞产生的外泌体和源自血清的外泌体，通过用外泌体贫化的胎牛血清补充DMEM来制备用于外泌体产生的新细胞培养基(CCM Exo-Dep)(SystemsBiosciences，目录：Exo-FBS-250A-1)。将A549细胞以5×105细胞mL-1接种在T75烧瓶内的10mL CCM Exo-Dep中，并在将2μM COE-BT引入细胞培养物之前保持黏附1小时。将细胞孵育至少24小时，然后回收细胞培养上清液用于第一轮外泌体生产，并在纯化前储存在4℃。在不使标记的细胞传代的情况下，将新鲜的10mL CCM Exo-Dep添加到细胞中，并使其再孵育至少24小时。24小时后回收用于第二轮外泌体生产的细胞培养上清液。收集的细胞培养物首先在室温下以10000×g离心30分钟，以去除任何细胞碎片。将纯化的外泌体的等分试样储存在-80℃下。然后通过在4℃下以100000×g超速离心(OptimaTMXPN-100，Beckman-Coulter)进行外泌体分离1小时。小心地去除上清液，并用PBS冲洗离心管的底部三次，预计沉淀将位于离心管底部。洗涤后，在相同条件下再次将外泌体沉淀，然后重悬于100μL PBS中。在进行下游分析(流式细胞术或透射电镜)之前，将纯化的外泌体等份保存在-80℃下。
图21显示了A549细胞与2μM COE-BT孵育后，然后用早期或晚期内体-GFP试剂(BacMam 2.0)或100nM溶酶体特异性染料Green DND-26染色的共定位显微照片。通过在561nm处激发并在570nm至620nm范围内收集发射，观察到COE-BT通道(以绿色表示)。通过在488nm处激发并在500nm至540nm范围内收集发射，观察到GFP(绿色荧光蛋白)和LysoTracker绿色通道(以红色表示)。使用ImageJ分析作为共定位度量的Pearson相关系数(R)。
使用透射电子显微镜(TEM)对外泌体样品进行分析。简言之，从预染色的A549细胞获得的外泌体在室温下使用PBS中的2.5％戊二醛固定30分钟。将10μL外泌体溶液添加到新辉光放电的formvar碳涂层200目铜EM网格上15分钟。使用滤纸吸干样品，并用MiliQ水洗涤3次。用2％乙酸钆对样品进行阴性染色30秒。在使用80kV在FEI TENCAI G2仪器上成像之前，用滤纸吸干样品并将其储存在干燥器真空室内的网格盒中过夜。
图22显示了(a)COE-BT染色的A549细胞分泌的EV的透射电子显微镜图像。(b)COE-BT染色的A549细胞在第一次24小时孵育后分泌的EV的流式细胞术分析。B690通道的激发和发射波长为488nm/690nm。
用COE缺乏纳米颗粒形成
图23显示了使用100K MWCO蛋白质浓缩管(PierceTM，Thermo ScientificTM)在4000相对离心力下进行超滤前后，PBS中50μM COE或DiR(1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚三碳菁碘化物)溶液的照片和吸收光谱。COE样品吸收光谱的轻微降低可能是由于带正电的COE和基于聚醚砜的超滤膜之间的非特异性结合。
图24显示了(a)通过动态光散射(DLS)测量纯PBS、1μM COE-BT或1μM DiR或1mMSUV在PBS中的相关系数曲线。(b)DLS测量纯PBS、或PBS中1μM COE-BT、或1μM DiR或1mM SUV的衍生平均计数率；实验进行五次重复。(c)DLS测量PBS中1μM其他COE的相关系数曲线。(d)DLS测量PBS中1μM其他COE的衍生平均计数率；实验进行五次重复。
图25显示了用红色激光笔照射纯PBS或10μM COE的PBS溶液后的丁达尔效应照片。
图26显示了(a)在室温下静置16小时前后，96孔微孔板(聚苯乙烯基，Ref：3599)中200μL COE的PBS溶液的照片。(b)在室温下静置16小时前后，96孔微孔板(聚苯乙烯基，Ref：3599)中200μL PBS染料溶液的照片。COE溶液通过从PBS中的1mM储备溶液中稀释而获得。DiI溶液通过将DiI-DMSO溶液(1mM)分散到PBS中并剧烈混合而获得。使用相同体积的PBS作为阴性对照。
流式细胞术检测标记囊泡中COE的稳定性
如前所述，将包含15％POPG和85％POPC的脂质体制备为PBS中的5mg/mL(或6.564mM)储备。脂质体通过200nm膜过滤器挤出，并通过DLS进一步表征为尺寸约140nm。然后将储备脂质体的单独等分试样稀释至1mM，并分别用PBS中的20μM COE-Ben(或DiO)和40μM COE-BT(或DiD)处理，在温和加热至60℃下处理30分钟。然后将标记的脂质体在4℃下储存，然后用于流式细胞术实验。为了证明嵌入后染料在脂质体中的稳定性，首先将COE-Ben标记的脂质体和COE-BT脂质体的两种单独的工作溶液标准化为每毫升107个颗粒的相同颗粒浓度。然后将这两种工作溶液以0:5、1:4、2:3、3:2、4:1和5:0的不同比例混合，并使混合物在室温下孵育1小时。然后在CytoFLEX LX(Beckman Coulter)上分析未稀释的混合物，其中在紫侧散射(VSSC>4000)上触发检测。关于未染色的脂质体，分别在V525通道(Ex405/Em525)和B690通道(Ex488/Em690)上对COE-Ben标记的脂质体和COE-BT标记的脂质进行门控。使用点图的双阳性区域中事件的百分比来分析可能同时含有COE-Ben和COE-BT染料的脂质体，这表明染料从一个群体转移到另一个群体。此外，在进行相同的流式细胞术分析以检查染料的稳定性和染料的交叉溢出程度之前，将样品在室温下孵育过夜(24小时)。这个实验是重复进行的。
图27显示了具有不同的混合比的COE-BT染色的和COE-Ben染色的SUV(130nm)在PBS中的混合物和在Cytoflex上孵育1小时(a至f)和24小时(g至l)的流式细胞术测量。
图28显示了混合(a)1小时或(b)24小时后，图27中不同门中SUV种群的百分比。
用COE标记不同尺寸的脂质体
将POPC在三氯甲烷中的溶液与0.5摩尔％的COE-Ben或COE-BT三氯甲烷溶液混合，然后在玻璃小瓶中在温和的氩气流下干燥。将干燥的脂质在真空中进一步干燥过夜以获得薄的脂质膜。为了制备小的单层囊泡(SUV)，通过添加浓度为5mg mL-1的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)对干燥的膜进行再水合，然后在约300rpm的恒定搅拌下在45℃下孵育2小时。然后，使用100nm、200nm、400nm和800nm膜在45℃下挤出囊泡21次，以获得SUV样品。然后将标记的脂质体稀释至每毫升107个颗粒，然后在Cytoflex上进行分析。
图29显示了在Cytoflex上分析了用0.5摩尔％COE-Ben(a至d)和COE-BT(e至f)标记的100nm、200nm、400nm和800nm大小的POPC脂质体的染料阳性事件的点图。
图30显示了(a)6.25mg mL-1LMVs(大的多层囊泡)在室温下用15μM COE-Ben和15μMFM 4-64在PBS中染色30分钟后的共焦显微照片。在共聚焦成像之前，使用PBS将混合物稀释5次。通过在405nm激发下观察COE-Ben荧光通道并收集范围在450nm至490nm的发射(以绿色表示)，通过在561nm激发下观察FM 4-64荧光通道并收集范围在640nm至700nm的发射(以红色表示)。比例尺为20μm。(b)灰度值曲线表示两个通道的左侧荧光显微照片中白线的荧光强度分布。
图31显示了使用手持式紫外线灯(UVLS-24EL，4瓦特)在紫外线(365nm)照射下，在PBS中未进行(-)或进行(+)1mM SUV处理的COE的照片。COE-Quin的浓度为0.25μM；对于COE-S6和COE-Ben为0.5μM；对于COE-QX、COE-BO和COE-BT为1μM；对于COE-BSe为5μM。相机(SONY，Alpha 7R)参数设置为ISO值8000，光圈F2.8，曝光时间1/20。
图32显示了(a)在DI水中用5μM不同COE染色的1mM POPC纯SUV的ζ电位测量结果。(b)在DI水中用5μM不同COE染色的1mM纯POPC SUV的DLS测量的Z-平均尺寸和PDI。
用COE标记红细胞用于显微镜和流式细胞术分析
通过离心除去血浆后，从捐献者的血液中获得红细胞。RBC要么新鲜使用，要么保存22天。在用2μM COE-S6或1μg/mL Cell Mask Deep Red标记之前，将填充的RBC稀释500X到PBS中。将细胞与染料一起孵育10分钟，然后以700g离心3分钟以去除游离染料。然后将标记的细胞沉淀重悬于1mL PBS中。然后将细胞在PBS中进一步稀释10倍，然后在8孔ibidi室载玻片上成像，并在流式细胞仪(Cytoflex)上分析尺寸和荧光。
图33显示了(a)未染色、(b)用2μM COE-S6标记和(c)1μg/mL Cell Mask Deep Red标记的新鲜红细胞(RBC)的共聚焦显微镜。在Ex405/Em525通道、Ex638/Em660通道和明场通道上采集图像。
图34显示了储存22天的红细胞(RBC)的共聚焦显微镜，(a)未染色，(b)用2μM COE-S6标记，(c)1μg/mL Cell Mask Deep Red。在Ex405/Em525通道、Ex638/Em660通道和明场通道上采集图像。
图35显示了在流式细胞仪上测量的(a)未染色，(b)用1μM COE-S6标记，(c)0.5μgmL-1Cell Mask Deep Red标记的红细胞(RBC)的FSC/SSC点图。与Cell Mask Deep Red不同，COE-S6标记不会给RBC的形态带来伪影。(d)直方图显示了当用增加的COE-S6浓度标记RBC时荧光的增加，以及(e)当用由于猝灭效应而增加的Cell Mask Deep Red标记RBC时，荧光的减少。从方差系数(CV)，即直方图数据(f)的分布来看，COE-S6标记也更均匀。
NIR-IICOE作为哺乳动物细胞荧光探针
对于使用近红外荧光的细胞检测，将细胞直接在DMEM培养基中用20μM COE-BT染色并孵育过夜。使用温热的PBS(37℃)冲洗染色的细胞，然后加入1×胰蛋白酶-EDTA。将细胞在37℃的5％CO2室中孵育5分钟。加入含有10％FBS的DMEM培养基，并将细胞以200×g离心4分钟。去除上清液后，将细胞重悬于培养基中并进行流式细胞术。使用808nm激光激发COE-BBT染色的细胞。为了收集来自COE-BT的发射信号，根据CytoFLEX平台滤光器规范(长度14.5±0.1mm，宽度6.1±0.1mm、厚度2.0±0.1mm)，定制了基于UV熔融石英玻璃的900nm长通滤光器(Chroma，INC.中国)。将该过滤玻璃安装在支架中，并代替IR885通道(Ex808/Em885)使用。检测COE-BBT荧光的新通道被命名为“IR1000”。
图36显示了通过使用808nm激光激发并使用950nm长通滤波器收集发射的COE-BBT染色的A549细胞的流式细胞术测量，该滤波器被命名为IR1000通道。采用未固定的A549细胞作为阴性对照。
COE的细胞毒性和溶血活性
A549细胞常规维持在补充有10％FBS的DMEM中，即细胞培养基(CCM)中。通过将固体溶解在PBS中以达到2mM的储备浓度来制备COE的储备溶液。通过在CCM中稀释储备溶液，进一步制备256μM的工作COE溶液。DiR的储备溶液是在乙醇中制备的，因为它的水溶性较差。通过稀释到CCM中制备256μM的工作溶液，最终乙醇含量为12.8％(体积/体积)。为了测试细胞毒性，将1000个细胞接种到具有透明光学底部的96孔黑色板中，并在37℃的5％的CO2室中放置过夜以黏附。第二天，通过在CCM中进行两倍连续稀释(浓度范围为0.5μM至256μM)，获得不同浓度的COE/DiR溶液，然后用于替换井中用过的CCM。为了描述可能来自乙醇的毒性作用，还用纯乙醇代替乙醇DiR染料溶液进行了相同的稀释步骤，以在各个孔中获得相似的乙醇含量。然后将细胞与添加剂一起孵育24小时，然后根据制造商的方案使用(COE-Quin、COE-S6、COE-Ben、COE-BBT、DiR)或CCK-8(COE-BT、COE-BO、COE-QX、COE-BSe)测量细胞生存力。使用TECAN读板器记录发光(测定)和吸光度(CCK-8测定)测量值。细胞毒性试验分三次进行。
图37显示了COE对A549细胞的细胞毒性测量结果。6个COE的IC50值均大于100μM。
牛全血购自Innovative Research，美国。将2mL血液与10mL PBS混合，并以1000rpm离心5分钟。收集红细胞颗粒，随后用PBS洗涤三次，然后用PBS稀释至2％(体积/体积)的浓度。本研究仅选择了COE-Quin、COE-S6和COE-Ben，因为它们在540nm处具有不显著的吸收干扰。将每个COE溶解在PBS中，并在96孔微孔板中连续稀释两倍。将100μL红细胞混悬液与100μL COE溶液在每个孔中混合，并在37℃下振荡(200rpm)孵育1小时。将微孔板以1000rpm离心10分钟。将150μL等分上清液转移到新的96孔微孔板中。通过使用多模微孔板读取器(Tecan)测量540nm处的吸光度来计算溶血活性。将能够完全裂解红细胞的Triton X-100(在PBS中为0.1％)用作阳性对照，而将PBS中的牛红细胞用作阴性对照。使用以下公式计算溶血百分比：
其中Oc是COE处理的样品的吸光度，Ob是阴性对照的吸光度，Ot是阳性对照的吸光度。溶血试验分四个重复进行。
图38显示了PBS中COE对牛红细胞的溶血测量结果。

Claims (39)

1.一种式(I)的化合物或其盐或溶剂化物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；
其中
每个L2独立地选自任选地经取代的亚乙基或任选地经取代的苯亚乙基；
L1是包含单体单元A和单体单元D的π共轭核：
其中
每个A独立地选自任选地经取代的亚烯基、任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基；
每个D独立地选自亚烯基、亚苯基、任选地经取代的稠合亚芳基、任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基；
n是选自1至5的整数；
m是选自1至5的整数；
其中*表示与另一单体单元或与L2连接的键；
其中单体单元A和单体单元D彼此交替键合；
其中式(I)的化合物具有基本线性的拓扑结构；和
其中L1不是亚丁二烯基、聚亚烯基、苯基亚烯基和聚苯基亚烯基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中A是接受电子的部分。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中A选自
其中表示与D或与L2连接的键；
每个X1独立地选自C、O、N、S和Se；
每个X2如果存在则独立地选自C、O、N、S和Se；
当X2存在时，X1和X2中的至少一个为O、N或S；
每个R独立地选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中A是式(II)的部分：
其中表示与D或与L2连接的键；
R2、R3、R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R2和R3连接以形成任选地经取代的杂环基、任选地经取代的杂芳基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中A是其中R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中A是
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中D是提供电子的部分。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中D是选自以下的部分
其中表示与A或与L2连接的键；
每个X1独立地选自C、O、N、S和Se；
每个X2如果存在则独立地选自C、O、N、S和Se；
当X2存在时，X1和X2中的至少一个为O、N或S；
每个R独立地选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中D是任选地经取代的5元杂亚芳基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中D是式(III)的部分：
其中Y是NR、O或S；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；和
R选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中D是其中R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的化合物，其中D是
13.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中L1选自：
*-A-D-A-* *-D-A-D-*
*-A-D-A-D-* *-D-A-D-A-*
*-A-D-A-D-A-* *-D-A-D-A-D-*
*-A-D-A-D-A-D-* *-D-A-D-A-D-A-*
*-A-D-A-D-A-D-A-* *-D-A-D-A-D-A-D-*
*-A-D-A-D-A-D-A-D-* *-D-A-D-A-D-A-D-A-*。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中R1独立地选自任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中R1独立地选自烷基和烷氧基，每个烷基和烷氧基任选地经氨基或烷基氨基取代。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的化合物，其中R1独立地为经氨基或烷基氨基取代的C3至C8烷氧基。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中L1上的任选的取代基独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中式(I)的化合物是式(Ia)的化合物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；
L1是包含单体单元A和单体单元D的π共轭核：
其中
每个A独立地选自任选地经取代的亚烯基、任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基；
每个D独立地选自亚烯基、亚苯基、任选地经取代的稠合亚芳基、任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基；
n是选自1至5的整数；
m是选自1至5的整数；
其中*表示与另一单体单元或与L2连接的键；
其中单体单元A和单体单元D彼此交替键合；
其中式(I)的化合物具有基本线性的拓扑结构；和
其中L1不是亚丁二烯基、聚亚烯基、苯基亚烯基和聚苯基亚烯基。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中式(I)的化合物是式(Ib)的化合物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；
L1是包含单体单元A和单体单元D的π共轭核：
其中
每个A独立地选自任选地经取代的亚烯基、任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基；
每个D独立地选自亚烯基、亚苯基、任选地经取代的稠合亚芳基、任选地经取代的单环杂亚芳基或任选地经取代的稠合杂亚芳基；
n是选自1至5的整数；
m是选自1至5的整数；
其中*表示与另一单体单元或与L2连接的键；
其中单体单元A和单体单元D彼此交替键合；
其中式(I)的化合物具有基本线性的拓扑结构；和
其中L1不是亚丁二烯基、聚亚烯基、苯基亚烯基和聚苯基亚烯基。
20.根据权利要求1至17和19中任一项所述的化合物，其中式(I)的化合物是式(Ib)的化合物，其中
A是式(II)的部分：
其中表示与D或与L2连接的键；
R2和R3连接以形成任选地经取代的杂环基、任选地经取代的杂芳基；
R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；和
D是式(III)的部分：
其中Y是NR、O或S；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；和
R选自H、卤素、氰基和任选地经取代的烷基。
21.根据权利要求1至17、19和20中任一项所述的化合物，其中式(I)的化合物是式(Ib)的化合物，其中
A是其中
R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；和
D是其中
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基。
22.根据权利要求1至17和19至21中任一项所述的化合物，其中式(I)的化合物是式(Ic)的化合物：
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
R2、R3、R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R2和R3连接以形成任选地经取代的杂环基、任选地经取代的杂芳基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
每个R8独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基；
Y是NR、O或S；
每个p是独立地选自0至4的整数；
q是选自1至5的整数；和
q’是选自1至5的整数。
23.根据权利要求1至17和19至22中任一项所述的化合物，其中式(I)的化合物是式(Id)的化合物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；
R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
每个R8独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基；
Y是NR、O或S；
每个p是独立地选自0至4的整数。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的化合物，其中式(I)的化合物是式(Ie)的化合物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；
R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
每个R8独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基；
每个p是独立地选自0至4的整数。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的化合物，其中式(I)的化合物是式(If)的化合物：
其中
q是选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；
R4和R5独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R4和R5连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
R6和R7独立地选自H、卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基；或
R6和R7连接以形成任选地经取代的环烷基、任选地经取代的环烯基、任选地经取代的环炔基、任选地经取代的杂环基、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基；
每个R8独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基；
每个p是独立地选自0至4的整数；
每个R9独立地为H或任选地经取代的烷基；和
每个t是独立地选自1至8的整数。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的化合物，其中式(I)的化合物选自
27.一种式(Ig)的化合物或其盐或溶剂化物：
其中
每个R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
每个q是独立地选自1至5的整数；
q’是选自1至5的整数；和
r是选自1至5的整数。
28.一种用于标记细胞和/或脂质囊泡的方法，其包括：
a)将式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育。
29.一种使用荧光检测器检测细胞和/或脂质囊泡的方法，其包括：
a)将式(I)、子式(Ia至Ig)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育；和
b)使细胞通过荧光检测器。
30.一种使用流式细胞仪检测细胞和/或脂质囊泡的方法，其包括：
a)将式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物与细胞和/或脂质囊泡一起孵育；
其中
R1独立地选自卤素、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烯氧基、任选地经取代的炔氧基、任选地经取代的酰基、任选地经取代的氧酰基、任选地经取代的酰氧基、任选地经取代的氨基、任选地经取代的氨酰基、任选地经取代的酰氨基、任选地经取代的氨酰氧基、任选地经取代的氧酰氨基、任选地经取代的氧酰氧基或任选地经取代的含硫基团或任选地经取代的磷酰基；
R2独立地选自卤素、氰基、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基或任选地经取代的炔基；
u是选自3至15的整数；
每个s是独立地选自0至4的整数；和
q是选自2至5的整数；
q’是选自2至5的整数；和
b)使细胞和/或脂质囊泡流经流式细胞仪。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中细胞和/或脂质囊泡处于混悬状态。
32.根据权利要求29或30所述的方法，其中细胞为黏附细胞。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中孵育期为约1分钟至约12天。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中细胞和/或脂质囊泡在不经纯化步骤的情况下流经流式细胞仪。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物在波长为约300nm至约1000nm处具有荧光激发。
36.根据权利要求29至35中任一项所述的方法，其中式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物在波长为约300nm至约2000nm处具有荧光发射。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的方法，其中，与式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物一起孵育的细胞和/或脂质囊泡相对于式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物的对照样品具有大于约2倍至约500倍的发射强度。
38.根据权利要求29至37中任一项所述的方法，其中方法还包括使细胞和/或脂质囊泡与另一种染料接触的步骤。
39.一种用于检测和/或定量细胞和/或脂质囊泡的流动系统，其包括：
a)用于标记细胞和/或脂质囊泡的式(I)、子式(Ia至Ig)和/或式(IV)的化合物或其盐或溶剂化物；
b)用于将经标记的细胞和/或脂质囊泡引入流动系统的入口；
c)用于检测来自经标记的细胞和/或脂质囊泡的荧光发射的与入口流体连通的检测装置；和
d)任选地，用于定量经标记的细胞和/或脂质囊泡的计数装置。
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